Summary
捕虜の動物の福祉を評価する基本的な側面は、動物が彼らが望むものを持っているかどうかを尋ねることです。ここでは、環境の豊かさの有無と水の流れへのアクセスに関してゼブラフィッシュ(Danio rerio)の住宅の好みを決定するためのプロトコルを提示します。
Abstract
動物福祉評価技術は、問題の動物の特定のニーズと希望を考慮に入れようとします。豊かさ(住宅環境における物理的な物体や特異性の追加)を提供することは、多くの場合、捕虜の動物に誰と何をやり取りし、どのように時間を費やすかを選択する機会を与える方法です。しかし、捕虜に見過ごされがちな水生環境の基本的な構成要素は、動物が身体運動に従事することを選択する能力です。魚を含む多くの動物にとって、運動は彼らの人生史の重要な側面であり、脳や行動の肯定的な変化を含む多くの健康上の利点を持うことが知られています。ここでは、捕虜動物の生息地の好みを評価する方法を紹介します。このプロトコルは、さまざまな水生種における様々な環境要因(例えば、砂利対砂を基質として、プラスチック植物対生植物、低流量対水の高流量)を見たり、陸上種との使用のために容易に適応させることができる。好みの統計的評価は、-1(回避)から+1(最も好ましい)に生息地をランク付けするJacobの好み指数を使用して行われます。この情報を使用して、動物が希望する場所を含む福祉の観点から何を望んでいるかを決定することができます。
Introduction
実験動物を飼育する方法を規定する規制は、明示的かつ明確に定義されています。実験動物ケア評価認定協会(AAALAC)インターナショナルは、研究動物と協力するすべての組織と機関を監督および管理し、種に適した畜産および住宅に関する具体的なガイドラインを設けています。例えば、ゼブラフィッシュの住居とケアに関するAAALACのガイダンスであるDanio Rerio1は、ゼブラフィッシュを飼育する際の濃縮(住宅環境における物理的な物体または特異性の追加)の使用を「強く奨励する」。ガイドは、「ゼブラフィッシュの生息地を模倣する人工植物や構造物を提供することで、動物が環境内で選択できるようになる」と述べています。
証拠は、エンリッチメントが空間情報2の処理に関与する脳の領域における新しいニューロン(神経新生)の成長を刺激し得ることを示唆し、これらの神経変化は学習能力3の強化に関連していると考えられている。神経新生と学習に対する豊かさの影響は、魚4、5、鳥6、爬虫類7、哺乳類8を含む様々な分類で広く研究されています。これらのタイプの研究は、脳と行動に対する豊かさの影響を理解するために重要であるが、彼らは別の上に特定の環境のための動物の特定の選択や好みを考慮していません。
捕虜の動物の福祉を評価する際に尋ねる基本的な質問は、動物が彼らが望むものを持っているかどうかです9.具体的な証拠を提供するこの質問を調査する方法は、私たちが彼らの主観的な好みを理解することを可能にする選択肢を動物に提供することです。例えば、ゼブラフィッシュが濃縮環境または平易な環境へのアクセスを好むかどうかを調査した2つの研究があり、両方の研究はエンリッチメント10、11を含む領域の好みを示している。しかし、ゼブラフィッシュは環境エンリッチメント12に無関心に見えることも示唆されているので、質問に対する答えは明らかに明確ではありません。動物の福祉に関連する好みのテストの別のアプリケーションは、豊かな環境の異なる側面が個々の動物が行う選択にどのように役割を果たすかを理解しようとすることにまで及びます。魚だけでも、異なる種類の富化は脳と行動に差異を及ぼし、人格特性13の個人差によってこの関係はさらに複雑である。さらに、優先試験は環境富化の比較研究に役立つ可能性がある。異なる魚種間でも、エンリッチメントは、攻撃性14、大胆さ15、移動16、リスクテイク行動17を含む多くの異なるタイプの行動に影響を及ぼすことを示している。
ジェイコブの嗜好指数は、住宅の好みを定量化するために頻繁に使用される統計的検定である18.Jacob の優先インデックスは、各生息地タイプに存在する動物の数に基づいて、各生息地の種類に対して、-1 (回避) から +1 (最も優先される) までの範囲の各生息地に値を割り当てます。ここでは、魚の住宅の好みを調査するためにヤコブの好み指数を使用し、水生環境の2つの重要な特性を評価する例を使用する方法を説明します: 1) 濃縮の有無;そして2)水の流れ19。しかし、このプロトコルは、さまざまな種や風景(水生および陸上など)を横断する様々な環境要因(例えば、基質としての砂利対砂、生きた植物、低対高水流)を見るために容易に適応することができる。
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Protocol
現在の研究は承認を持っており、動物のケアのすべての要件に準拠し、ペンシルベニア州立大学のプロトコルを使用します。IACUC No. 46466.
1. 優先装置のセットアップ
- 実験を開始する前に、生きている動物を含むすべての実験および畜産手順について、研究所の動物ケア委員会(または同等の組織)の承認を得る。
- 不透明な白いプラスチック製の実験槽を使用してください。ゾーン間の壁は、シリコンシーラントで固定されている灰色のアクリルから作られています。
注:実験用タンクのサイズは、対象種の大きさと使用される個体数に依存します(例えば、8つの大人のゼブラフィッシュの場合、76cm L x 76 cm W x 30 cm Hのタンクが推奨されます)。 - 実験用タンクを、テスト対象の特定の生息地パラメータに従って変化する4つのゾーンに分割します。調査するさまざまな種類の濃縮の例には、砂と岩の基質、人工植物対避難所、または人工植物の存在に対する水の流れがあります(図1)。
- 水の流れを対象のパラメータとして使用する場合は、小さなポンプを使用して水のジェットを供給します(材料の表を参照)。選択した速度でポンプを設定し、一定の指示された水の流れを提供するようにします。興味のある生態と生命履歴の種(ゼブラフィッシュの場合は14 cm/sなど)に基づいて希望の速度を選択します。
- 実験槽の途中に、食料が届く中央アリーナを持っている(図1)。各ゾーンから中央のアリーナへのアクセスは、分離壁の小さな開口部を介してです。開口部は、関心のある種が妨げられないゾーン間を移動するのに十分な大きさですが、魚が他のゾーンから経験する可能性のある視覚的な手がかりを減らすのに十分な小ささです。
- タンクの各コーナーにバイオフィルターとヒーターを置きますが、水の流れを乱さないように実験エリアの外に置き、すべてのゾーンにわたって一定の水温を確保します。
- スペースが指示するに応じて、追加の実験タンクを設定します。各実験タンク内の異なるゾーンを回転させて、シーケンシャルバイアスを制限します。すべての反復タンクが均一な条件(同じ光レベル、水温など)を持っていることを確認します。
- 各実験用タンクの真上にある三脚にカメラ(材料の表を参照)を配置して、すべてのゾーンが表示されるようにします。広角レンズを避け、メモリカードに記録用の十分なスペースがあることを確認します。
- 部屋の照明を徐々に(例えば、1/2時間)12 L:12 Dサイクルに設定して、日の出と日没をシミュレートします。水温を25±1°Cに保つ。
2. 捕獲、順応、および手順
- 彼らはテストされていないときに家庭のタンクに魚を保ちます。自分の家のタンクからすべてのテスト魚をネットし、実験タンク(1日目)の中央アリーナに配置します。応力を軽減するためにキャプチャ時間を最小限に抑えます(例:30 s未満)。
注:ストレスを最小限に抑える可能性のある実験タンクに魚を自宅のタンクから移す別の手順は、タンク水のビーカーで魚を輸送することです。 - 各実験タンク内の魚の数と性別を複製タンク全体で一定に保ち、種の大きさと生態に基づいて選択します。
- 1-4日目には、魚はさまざまなゾーンに順応し、探索する時間を費やします。これらの日にデータを収集しないでください。
注: 特定の実験プロトコルに応じて、昇順の日数を延長または短縮します。しかし、順応期間は、取り扱いの影響を最小限に抑えるだけでなく、魚を装置内で餌に慣れさせるのに十分であるべきである。 - 順応期間中は、定期的な水質試験(pH、硝酸塩、亜硝酸塩レベルなど)を実施して水質を注意深く監視し、問題が検出された場合は水を交換します(材料表を参照)。
- 水面の中央アリーナの壁に取り付けられたフローティングフードリング(材料の表を参照)を使用して、中央アリーナのフィッシュフレーク食品(材料の表を参照)を使用して、魚のフレーク食品を供給します。フードリングは、食品粒子が中央アリーナ内にとどまることを保証し、食品の漂流によるゾーンのバイアスを提示しません。
- 魚に.5 hを与えてアドリビタムを与え、残った食べ物をディップネットで実験タンクから取り除きます。午前中に1回、午後に1回魚に餌を与えます。
- 5 日から 7 日の動作を評価します。カメラをオンに切り替え、スケジュールされた午前と午後の給餌後に2時間の魚の行動を記録します。8日目にディップネットで実験タンクからすべての魚を取り出し、それらを自宅のタンクに戻します。
- 利用可能なサンプ水の量に応じて、実験タンクの水の少なくとも1/3を新鮮なサンプ水に置き換えて、次の複製でストレスホルモンが魚に及ぼす影響を減らします。
- その週のゾーン回転スケジュールに従って実験用タンクを設定します。ゾーンを回転すると、どのゾーンの配置も互いに相対的に発生する可能性が低くなります。次に、魚の新しいバッチでテストプロセスを再度開始します。
3. 測定とデータ分析
- 各録画日の終わりにビデオをコンピュータにダウンロードします。これにより、メモリカードに使用する前にスペースが確保されます。
- ビデオソフトウェア(「マテリアルの一覧」を参照)を使用して、ゾーンの設定を定量化します。各2時間の記録期間で5分間隔で各ゾーン内の魚の数を手動でカウントします(これらのカウントに中央アリーナを含めます)。ビデオ映像から男性と女性の区別が可能な場合は、分析中に魚の性別を定義します。
- 生息地の嗜好を分析するには、各反復タンクのゾーンあたりの魚の平均数を計算します(つまり、3日間のすべてのデータを平均化します)。構造体使用の優先スコアを取得するために、Jacobsの優先インデックス15を次のように計算します。
J = (rx - p)/[rx + p) – 2*rx*p]
ここで、xは対象のゾーンであり、rxはすべてのゾーンの魚の総数に対するゾーンxの魚の比率であり、pは実験槽内のすべてのゾーンの利用可能な割合です。インデックスの範囲は、最大優先値は +1、回避の最大値は -1 です。 - 観察期間中に魚がゾーン間で切り替わる速度に変化があるかどうかを判断するには、すべての観測期間の最初と最後の5分でスイッチ率r rrを計算します。
- 魚の全身がゾーンを隔てる開口部を横切るときに、魚がゾーンに入ったとします。各反復タンクの開始および仕上げ平均スイッチレートを計算します。実験者の観察バイアスを低減するために、同じ実験者によるすべての行動観測を行う。
- 統計ソフトウェア (資料表を参照) を使用して、関連する統計分析を行います。推奨される分析には、一方向の分散分析(優先指数を従属変数、予測変数としてゾーン)、各タンクの開始平均スイッチレートと終了平均スイッチレートに対するペアのt検定が含まれます。
- 各ゾーンが互いに比較されるゾーン比較をさらに調査するために、Tukeyの複数比較ポストホックテストを適用します。より複雑な統計解析には、時間効果、アリーナ効果、性影響、または行動の個人差を評価する混合モデルが含まれます。
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Representative Results
私たちは、1)プラスチック植物や砂質基板を含む様々な濃縮の間の選択肢を与えられたゼブラフィッシュの住宅の好みを調査するために好みのテストを使用しました。そして2)水の流れ。これらは4つのゾーンに分かれました: (i) エンリッチドのみ;(ii) フローのみ;(iii) 濃縮および流れ(iv) プレーン;そして食料が届けられたセントラルアリーナ19.ゼブラフィッシュは、他のすべてのゾーン(エンリッチドのみ、フローのみ、プレーン、セントラルアリーナ)とは大きく異なるエンリッチドゾーンとフローゾーンに対して最も高い好みを示しました。p < 0.01)。フィッシュはフローのみゾーンと平野ゾーンの両方を避け、中央アリーナ19(図2A)でより多くの時間を費やしました。また、ゼブラフィッシュは、観察期間の開始時に、終わりよりも異なる生息地の間を移動する方が多い(図2B)。
図1:生息地の好みをテストするさまざまな実験計画の例。(A) 砂質と岩の基板の好みをテストする実験タンクのセットアップ。(B) 濃縮(プラスチック植物)対避難所の好みをテストする実験タンクのセットアップ。(C) 水の流れに対して濃縮(プラスチック植物)の好みをテストするための実験タンクのセットアップ。すべての図のパネルでは、4つのコーナーコンパートメントは魚にアクセスできなく、ヒーターとフィルターしか含まれていませんでした。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ゼブラフィッシュの生息地優先試験の結果を示す代表的なデータ。(A) 各ゾーンのジェイコブスの優先インデックス: (i) エンリッチドのみ;(ii) エンリッチドとフロー;(iii) フローのみ;(iv) プレーン;そしてニュートラルセントラルアリーナ。正の値と負の値は、それぞれ優先と回避を示します。ボックスは25±75パーセンタイル範囲を示し、中央値の線を含みます。バーは10パーセンタイルと90パーセンタイル値を表します。オープンドットは、これらの値の外側の点を表します。a = すべてのゾーン (p < 0.05) との有意差。b = エンリッチドアンドフロー、エンリッチドオン、セントラルアリーナ(p < 0.05)とは大きく異なります。観測期間の始まりと終わりの切り替え速度を示す(ボックスは25±75パーセンタイル範囲を示し、中央値の線を含み、バーは10番目と90番目の百分位値を表す)。図2Aは、デパスクアーレら19から修正された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、さまざまな種類の生息地に対する魚の好みを調査できる実験的な設計を紹介します。優先テストで重要ないくつかの重要なステップは次のとおりです:1)異なる反復(例えば、外部の騒音や動き、実験者、水化学、光レベル)間で均一な条件が維持されていることを確認します。2)ゾーンが反復の間で回転し、かなりの量の水がバイアスを減らすためにテストの間に新鮮なサンプ水に置き換えられることを保証する。(3)各グループの個体数と複製タンクの数の両方で、重要な結果を検出するために適切なサンプルサイズが使用されることを保証する。そして4)試験が記録された場合、最適化し、適切なビデオ録画とファイル転送を確保します。
現在のプロトコルに対する変更には、異なる濃縮アイテム、異なる基板、または異なる流量など、さまざまな生息地タイプに魚をさらすことが含まれます。さらに、動物追跡ソフトウェアを使用して、魚が各ゾーンのスペースをどのように使用しているかをさらに理解することができます(例えば、魚は流れゾーンの水の流れに逆らって泳ぐのに時間を費やすか、または生息地のその部分を完全に避けますか)。しかし、実験槽の壁は、このタイプの追跡ソフトウェアに対応するように修正する必要があるかもしれません。最後に、ここで説明する好みのテストは、任意の魚種、または実験者が調査したい可能性のある水生生物に適応することができます。
現在のプロトコルの制限は、好みのテストは、動物に提示されるリソースによって制限されるということです。したがって、動物は好ましい選択を選択していないかもしれないが、提示されたものの中で最も不快ではない20.しかし、そもそも選択肢を持つことは、限られた選択肢(すなわち、最も好ましい生息地へのアクセスのみ)を与えられるよりも、福祉にとって良いということである。また、ゼブラフィッシュは、回避的な光背景を見つけることが示唆されているが、したがって代替タンク色(例えば、黒)がより適している可能性がある。さらに、優先テストは、多くの場合、問題の動物が将来のニーズ21、22ではなく、即時の手がかりに作用している可能性がある時間の小さなウィンドウで行われた観察に限定されます。さらに、性別、グループサイズ、社会的文脈は、グループダイナミクスに影響を与える要因であり、したがって魚の生息地の好みにも影響を与えるため、これらの要因を反復間で一貫して保つことが重要です。
我々の代表的な結果では、ゼブラフィッシュが優先的にエンリッチドゾーンとフローゾーンとエンリッチドゾーンの両方を選択し、フローのみゾーンとプレーンゾーンを避けることを示しました。つまり、エンリッチドゾーンとフローゾーンは他のすべてのゾーンよりも優先されました。濃縮された環境、特にエンリッチド・アンド・フロー・ゾーンの好みは、感覚刺激(探査)の必要性が高まった結果である場合や、隠れる場所を見つける必要がある場合(特異性との競争が減少する)可能性があります。興味深いことに、フローオンリーゾーンとプレーンゾーンよりもセントラルアリーナの好みはわずかにあり、食べ物が配達される可能性が水泳よりも高いモチベーション要因であることを示唆しています。ゾーン間の移動の面では、観測期間の初めにゾーン間の切り替えが終わりよりも多かった。観察期間の初めに動きの増加は、餌を与えるタイミング(魚は記録開始の30分前に餌を与えられた)に対応している可能性があり、したがって、彼らは移動し、追加の食べ物を探すためによりやる気があったかもしれません。要約すると、現在の研究で説明されているプロトコルは、魚の生息地の好みを見るための効果的なツールです。
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Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、ペンシルベニア州立大学の研究コラボレーションフェローシップとハック研究所、およびUSDA AES 4558によってサポートされました。研究は、動物のケアのすべての要件を遵守し、ペンシルベニア州立大学のプロトコルを使用します。IACUC No. 46466.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Aquarium Plants | Smarlin | B07PDZQ5M5 | |
| Artificial Seaweed Water Plants for Aquarium | MyLifeUNIT | PT16L212 | |
| Experimental tanks | United State Plastic Corporation | 6106 | |
| Floating food ring | SunGrow | B07M6VWH9V | |
| Flow meter | YSI | BA1100 | |
| Jager Aquarium Thermostat Heater | Ehiem | 3619090 | |
| Master Water Quality Test Kit | API | 34 | |
| SPSS Statistics for Macintosh | IBM | Version 25.0 | |
| Submersible Pump, SL- | Songlong | SL-381 | |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 16106 | |
| Triple Flow Corner Biofilter | Lee's | 13405 | |
| Video camera | Coleman | TrekHD CVW16HD | |
| Windows Media Player (video software) | Microsoft | Windows Media Player 12 |
References
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