Summary
Um aspecto fundamental da avaliação do bem-estar dos animais em cativeiro é perguntar se os animais têm o que querem. Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a preferência habitacional no zebrafish (Danio rerio) no que diz respeito à presença/ausência de enriquecimento ambiental e acesso ao fluxo de água.
Abstract
Técnicas de avaliação do bem-estar animal tentam levar em consideração as necessidades e desejos específicos do animal em questão. Proporcionar enriquecimento (a adição de objetos físicos ou conespecificidades no ambiente habitacional) é muitas vezes uma forma de dar aos animais em cativeiro a oportunidade de escolher com quem ou com o que interagem e como passam seu tempo. Um componente fundamental do ambiente aquático que muitas vezes é negligenciado em cativeiro, no entanto, é a capacidade do animal optar por se envolver em exercícios físicos. Para muitos animais, incluindo peixes, o exercício é um aspecto importante de sua história de vida, e é conhecido por ter muitos benefícios para a saúde, incluindo mudanças positivas no cérebro e comportamento. Aqui apresentamos um método para avaliar as preferências do habitat em animais em cativeiro. O protocolo poderia ser facilmente adaptado para olhar para uma variedade de fatores ambientais (por exemplo, cascalho versus areia como um substrato, plantas plásticas versus plantas vivas, baixo fluxo versus alto fluxo de água) em diferentes espécies aquáticas, ou para uso com espécies terrestres. A avaliação estatística da preferência é realizada utilizando o índice de preferência de Jacó, que classifica os habitats de -1 (evasão) a +1 (mais preferido). Com essas informações, pode-se determinar o que o animal quer de uma perspectiva de bem-estar social, incluindo sua localização preferida.
Introduction
Os regulamentos que regem como os animais de laboratório devem ser alojados em cativeiro são explícitos e bem definidos. A Associação de Avaliação e Acreditação da Atenção Animal Laboratorial (AAALAC) International supervisiona e gerencia todas as organizações e instituições que trabalham com animais de pesquisa e possui diretrizes específicas para a pecuária e habitação adequadas às espécies. Por exemplo, a Orientação sobre a Habitação e Cuidado de Zebrafish da AAALAC, Danio Rerio1 "incentiva fortemente" o uso de enriquecimento (a adição de objetos físicos ou conespecificidades no ambiente habitacional) ao abrigar zebrafish em cativeiro. O guia continua a afirmar: "Fornecer plantas artificiais ou estruturas que imitam o habitat dos zebrafish permitem aos animais uma escolha dentro de seu ambiente".
Evidências sugerem que o enriquecimento pode estimular o crescimento de novos neurônios (neurogênese) em áreas do cérebro envolvidas no processamento de informações espaciais2, e acredita-se que essas alterações neurais estão associadas à capacidade de aprendizagem aprimorada3. Os efeitos do enriquecimento na neurogênese e na aprendizagem têm sido amplamente estudados em várias taxas, incluindopeixes 4,5, aves6,répteis7e mamíferos8. Embora esses tipos de estudos sejam importantes para entender os efeitos do enriquecimento no cérebro e no comportamento, eles não levam em consideração as escolhas ou preferências particulares dos animais para um determinado ambiente em vez de outro.
Uma pergunta fundamental a ser questionada ao avaliar o bem-estar dos animais em cativeiro é se os animais têm ou não o que querem9. Uma forma de investigar essa questão que fornece evidências tangíveis é fornecer aos animais escolhas que nos permitam entender suas preferências subjetivas. Por exemplo, dois estudos investigaram se os zebrafish preferem o acesso a um ambiente enriquecido ou simples, com ambos os estudos indicando preferência por áreas que contenham enriquecimento10,11. No entanto, também foi sugerido que os zebrafish parecem indiferentes ao enriquecimento ambiental12, de modo que a resposta à pergunta obviamente não é clara. Outra aplicação de testes de preferência associados ao bem-estar animal se estende a tentar entender como diferentes aspectos de um ambiente enriquecido desempenham um papel nas escolhas que um animal faz. Só no peixe, diferentes tipos de enriquecimento têm efeitos diferenciais no cérebro e no comportamento, e essa relação é ainda mais complicada por diferenças individuais nos traços de personalidade13. Além disso, os testes de preferência podem ser úteis para estudos comparativos de enriquecimento ambiental. Mesmo em diferentes espécies de peixes, o enriquecimento tem se mostrado um efeito em muitos tipos diferentes de comportamento, incluindo agressão14, ousadia15, locomoção16, e comportamento de risco17.
O índice de preferência de Jacob é um teste estatístico que é usado com frequência para quantificar as preferências habitacionais18. O índice de preferência de Jacob atribui um valor a cada habitat diferente com base no número de animais presentes em cada tipo de habitat em diferentes pontos de tempo, onde a preferência varia de -1 (evasão) a +1 (mais preferida). Aqui descrevemos um método de uso do índice de preferência de Jacó para investigar as preferências habitacionais em peixes e usar o exemplo de avaliação de duas características importantes do ambiente aquático: 1) a presença ou ausência de enriquecimento; e 2) o fluxo de água19. No entanto, o protocolo poderia ser facilmente adaptado para olhar para uma variedade de fatores ambientais (por exemplo, cascalho versus areia como um substrato, plantas plásticas versus plantas vivas, baixo versus alto fluxo de água) em diferentes espécies e paisagens (por exemplo, aquáticas e terrestres).
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Protocol
O presente estudo tem aprovação e cumpre todos os requisitos dos protocolos de cuidados e uso de animais da Universidade Estadual da Pensilvânia; IACUC nº 46466.
1. Configuração do aparelho de preferência
- Obter aprovação do Comitê de Cuidados Com Animais (ou organização equivalente) do instituto para todos os procedimentos experimentais e de criação envolvendo animais vivos antes de começar o experimento.
- Use um tanque experimental feito de plástico branco opaco. As paredes entre as zonas são feitas de acrílico cinza que é fixado no lugar com selante de silício.
NOTA: O tamanho do tanque experimental depende do tamanho das espécies de interesse e recomenda-se o número de indivíduos utilizados (por exemplo, para 8 zebrafish adultos, recomenda-se um tanque de 76 cm L x 76 cm W x 30 cm H). - Divida o tanque experimental em quatro zonas que variam de acordo com os parâmetros específicos de habitat a serem testados. Exemplos de diferentes tipos de enriquecimento para investigar incluem substrato arenoso vs. rochoso, plantas artificiais versus abrigos, ou fluxo de água versus presença de plantas artificiais(Figura 1).
- Se usar o fluxo de água como parâmetro de interesse, use pequenas bombas para abastecer jatos de água (ver Tabela de Materiais). Coloque as bombas em uma velocidade escolhida para que elas forneçam um fluxo constante e direcionado de água. Escolha a velocidade desejada com base na ecologia e história da vida das espécies de interesse (por exemplo, 14 cm/s para zebrafish).
- No meio do tanque experimental, tenha uma arena central onde a comida é entregue(Figura 1). O acesso à arena central de cada zona é através de uma pequena abertura nas paredes separadas. A abertura é grande o suficiente para que as espécies de interesse se movam entre zonas sem obstáculos, mas pequenas o suficiente para reduzir quaisquer pistas visuais que o peixe possa experimentar de outras zonas.
- Coloque um biofiltro e um aquecedor em cada canto do tanque, mas fora da área experimental para não perturbar o fluxo de água e garantir uma temperatura constante da água em todas as zonas.
- Configure tanques experimentais adicionais à medida que o espaço dita. Gire as diferentes zonas em cada tanque experimental para limitar qualquer viés sequencial. Certifique-se de que todos os tanques de replicação tenham condições uniformes (mesmos níveis de luz, temperatura da água, etc.)
- Coloque as câmeras (ver Tabela de Materiais)em tripés diretamente acima de cada tanque experimental, para que todas as zonas sejam visíveis. Evite lentes de grande angular e certifique-se de que os cartões de memória tenham espaço suficiente para gravação.
- Coloque a iluminação da sala em um gradual (por exemplo, 1/2 h) 12 L: ciclo 12 D para simular nascer do sol e pôr do sol. Mantenha a temperatura da água em 25 ± 1 °C.
2. Captura, aclimatação e procedimento
- Mantenha peixes em tanques domésticos quando não estiverem sendo testados. Rede todos os peixes de teste de seus tanques domésticos e coloque na arena central do tanque experimental (Dia 1). Minimizar os tempos de captura para reduzir o estresse (por exemplo, menos de 30 s).
NOTA: Um procedimento alternativo para transferir peixes de seu tanque de casa para o tanque experimental que pode minimizar o estresse é transportar o peixe em um feixe de água do tanque. - Mantenha o número e o sexo dos peixes em cada tanque experimental constante em tanques de replicação e escolha com base no tamanho da espécie e ecologia.
- Nos dias 1 a 4, os peixes passam um tempo aclimatando e explorando as diferentes zonas. Não colete dados nestes dias.
NOTA: Estender ou reduzir o número de dias para aclimatação, dependendo do protocolo experimental específico. No entanto, o período de aclimatação deve ser suficiente para minimizar os efeitos do manuseio, bem como para que o peixe esteja acostumado a se alimentar no aparelho. - Durante o período de aclimatação, monitore a qualidade da água de perto realizando testes regulares de qualidade da água (por exemplo, pH, nitrato ou níveis de nitrito) e substitua a água se houver algum problema (ver Tabela de Materiais).
- Alimente os alimentos do floco de peixe (ver Mesa de Materiais) na arena central usando um anel de alimento flutuante (ver Mesa de Materiais) preso à parede da arena central na superfície da água. Um anel alimentar garante que as partículas de alimentos permaneçam dentro da arena central e não apresentem um viés para zonas devido à deriva alimentar.
- Dê ao peixe .5 h para alimentar o libitum de anúncio antes de remover o alimento restante do tanque experimental com uma rede de mergulho. Alimente o peixe uma vez pela manhã e uma vez à tarde.
- Avalie os comportamentos nos dias 5 e 7. Ligue as câmeras e grave comportamentos de peixe por 2h depois de cada alimentação programada de manhã e tarde. No dia 8 remover todos os peixes dos tanques experimentais com uma rede de mergulho e colocá-los de volta em seus tanques domésticos.
- Dependendo da quantidade de água sump disponível, substitua pelo menos um 1/3 da água no tanque experimental por água fresca para reduzir quaisquer efeitos dos hormônios do estresse nos peixes nas seguintes réplicas.
- Configure os tanques experimentais de acordo com o cronograma de rotação da zona para essa semana. A rotação das zonas diminui a chance de qualquer viés comportamental ocorrer como resultado da colocação de qualquer zona em relação uma si. Em seguida, comece o processo de teste novamente com um novo lote de peixes.
3. Medições e análise de dados
- Baixe os vídeos para um computador no final de cada dia de gravação. Isso garante que há espaço no cartão de memória antes de cada uso.
- Use software de vídeo (ver Tabela de Materiais) para quantificar a preferência da zona. Conte manualmente o número de peixes em cada zona em intervalos de 5 minutos em cada período de gravação de 2h (inclua a arena central nessas contagens). Defina o sexo do peixe durante a análise se a diferenciação entre machos e fêmeas é possível a partir do vídeo.
- Para analisar a preferência do habitat, calcule o número médio de peixes por zona para cada tanque de replicação (ou seja, média de todos os dados ao longo dos 3 dias). Para obter uma pontuação de preferência para uso da estrutura, calcule o índice de preferência de Jacobs15 como
J =(rx − p)/[(rx + p) – 2*rx*p]
onde x é a zona de interesse, rx é a razão do peixe na zona x para o número total de peixes em todas as zonas, e p é a proporção disponível de todas as zonas no tanque experimental. O índice varia entre +1 para preferência máxima e −1 para máxima evasão. - Para determinar se há alguma alteração na taxa em que os peixes alternam entre as zonas durante um período de observação, calcule a taxa de switch, rsr,no primeiro e último 5 min de cada período de observação, onde rsr é o número de vezes que um peixe entra em cada zona da arena central, dividido pelo número total de peixes.
- Considere um peixe ter entrado em uma zona quando todo o corpo do peixe cruza a abertura separando as zonas. Calcule uma taxa de switch média de partida e acabamento para cada tanque de replicação. Realize todas as observações comportamentais do mesmo experimentador para reduzir qualquer viés de observação experimentador.
- Utilizando software estatístico (ver Tabela de Materiais),realizar análises estatísticas relevantes. As análises sugeridas incluem uma ANOVA unidirecional, com índice de preferência como variável dependente e zona como variável preditor, e um teste t emparelhado na taxa de switch média inicial e de acabamento para cada tanque.
- Aplique o teste pós-hoc pós-comparação múltipla de Tukey para investigar ainda mais comparações de zonas, onde cada zona é comparada entre si. Análiseestatística mais complexa inclui modelos mistos que avaliam efeitos do tempo, efeitos de arena, efeitos sexuais ou até mesmo diferenças individuais de comportamento.
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Representative Results
Usamos o teste de preferência para investigar preferências de moradia em zebrafish dada uma escolha entre o enriquecimento variável, incluindo 1) plantas plásticas e substrato arenoso; e 2) fluxo de água. Estas foram divididas em quatro zonas: (i) Somente Enriquecida; (ii) Somente fluxo; (iii) Enriquecimento e Fluxo; (iv) Planície; e uma arena central onde a comida foi entregue19. Os zebrafish apresentaram a maior preferência pela zona Enriquecida e Flu, que era significativamente diferente de todas as outras zonas (Somente Enriquecida, Somente Fluxo, Planície e Arena Central; p < 0,01). O Peixe evitou as zonas Flow Only e Plain, passando mais tempo na Arena Central19 (Figura 2A). Além disso, os zebrafish se moviam entre diferentes zonas de habitat com mais frequência no início do período de observação do que no final (Figura 2B).
Figura 1: Exemplos de diferentes projetos experimentais para testar preferências de habitat. (A)Configuração de um tanque experimental para testar a preferência de um substrato arenoso versus um substrato rochoso. (B)Configuração de um tanque experimental para testar a preferência de enriquecimento (plantas plásticas) versus um abrigo. (C)Configuração de um tanque experimental para testar a preferência de enriquecimento (plantas plásticas) versus um fluxo de água. Em todos os painéis de figuras, os quatro compartimentos de canto não eram acessíveis aos peixes e continham apenas aquecedores e filtros. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Dados representativos mostrando os resultados de um teste de preferência de habitat em zebrafish. (A) O índice de preferência de Jacobs para cada zona: (i) Somente enriquecido; (ii) Enriquecido e Fluxo; (iii) Somente fluxo; (iv) Planície; e uma Arena Central neutra. Valores positivos e negativos indicam preferência e evasão, respectivamente. As caixas indicam a faixa de 25 ± 75º percentil e contêm a linha mediana; as barras representam os valores 10º e 90º percentil; pontos abertos representam pontos fora desses valores. a = diferença significativa de todas as zonas (p < 0,05); b = significativamente diferente de Enriquecimento e Fluxo, Somente Enriquecido e da Arena Central (p < 0,05); e (B) parcelas de caixa mostrando a taxa de switch no início e o final do período de observação (as caixas indicam a faixa de 25 ± 75º percentl e contêm a linha mediana; as barras representam os valores 10º e 90º percentil). A Figura 2A foi modificada a partir de DePasquale et al.19. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
Aqui apresentamos um projeto experimental que nos permite investigar as preferências dos peixes para diferentes tipos de habitats. Algumas etapas críticas que são importantes nos testes de preferência incluem: 1) garantir que as condições uniformes sejam mantidas em diferentes réplicas (por exemplo, ruídos externos ou movimento, experimentador, química da água, níveis de luz); 2) garantir que as zonas sejam giradas entre réplicas e uma quantidade significativa de água seja substituída por água fresca entre os testes para reduzir vieses; (3) garantir que um tamanho amostral adequado seja usado para detectar resultados significativos, tanto em termos de número de indivíduos em cada grupo quanto no número de tanques de replicação; e 4) se os ensaios forem gravados, otimizando e garantindo a gravação adequada de vídeo e transferência de arquivos.
Modificações no protocolo atual incluem expor peixes a uma variedade de outros tipos de habitat, como diferentes itens de enriquecimento, diferentes substratos ou até mesmo diferentes taxas de fluxo. Além disso, pode ser possível usar software de rastreamento animal para entender melhor como os peixes estão usando o espaço em cada zona (por exemplo, os peixes passam tempo nadando contra o fluxo de água nas zonas de fluxo, ou evitam completamente essa parte do habitat). No entanto, as paredes do tanque experimental podem precisar ser modificadas para acomodar esse tipo de software de rastreamento. Finalmente, o teste de preferência descrito aqui pode ser adaptado a qualquer espécie de peixe, ou potencialmente qualquer organismo aquático que o experimentador queira investigar.
Uma limitação do protocolo atual é que o teste de preferência é limitado pelos recursos que são apresentados aos animais. Portanto, o animal pode não estar escolhendo uma escolha preferida, mas o menos desagradável daqueles apresentados20. No entanto, pode ser que ter uma escolha em primeiro lugar seja melhor para o bem-estar do que apenas receber opções limitadas (ou seja, acesso apenas ao habitat preferido). Além disso, foi sugerido que os zebrafish acham que os fundos leves são de23,portanto, uma cor alternativa do tanque (por exemplo, preto) pode ser mais adequada. Além disso, o teste de preferência é muitas vezes limitado a observações feitas em uma pequena janela de tempo, onde o animal em questão pode estar agindo em pistas imediatas em vez de necessidades futuras21,22. Além disso, gênero, tamanho do grupo e contexto social são fatores que afetam a dinâmica do grupo e, portanto, potencialmente habitam as preferências em peixes, por isso é importante tentar manter esses fatores consistentes entre as replicações.
Com nossos resultados representativos mostramos que os zebrafish escolhem preferencialmente as zonas Enriquecidas e Flue e Enriquecidas Somente e evitem zonas de fluxo e planícies. Em suma, a zona Enriquecida e Flufoi preferida em todas as outras zonas. Uma preferência por ambientes enriquecidos, e em particular a Zona enriquecida e de fluxo, pode ser o resultado de uma necessidade crescente de estimulação sensorial (exploração) ou poderia ser a necessidade de encontrar lugares para se esconder (concorrência reduzida de condomínios). Curiosamente, havia uma ligeira preferência pela Arena Central sobre as zonas Flow Only e Plain, sugerindo que o potencial de entrega de alimentos era um fator motivacional maior do que a natação. Em termos de movimento entre as zonas, houve mais troca entre zonas no início do período de observação do que no final. O aumento do movimento no início do período de observação pode corresponder ao tempo de alimentação (os peixes foram alimentados meia hora antes do início da gravação), portanto, eles podem ter sido mais motivados a se mover e procurar alimentos adicionais. Em resumo, o protocolo descrito no presente estudo é uma ferramenta eficaz para olhar as preferências do habitat nos peixes.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma Bolsa de Colaboração de Pesquisa e o Instituto Huck na Universidade Estadual da Pensilvânia, bem como usda AES 4558. A pesquisa cumpriu todos os requisitos dos protocolos de cuidados e uso de animais da Universidade Estadual da Pensilvânia; IACUC nº 46466.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Aquarium Plants | Smarlin | B07PDZQ5M5 | |
| Artificial Seaweed Water Plants for Aquarium | MyLifeUNIT | PT16L212 | |
| Experimental tanks | United State Plastic Corporation | 6106 | |
| Floating food ring | SunGrow | B07M6VWH9V | |
| Flow meter | YSI | BA1100 | |
| Jager Aquarium Thermostat Heater | Ehiem | 3619090 | |
| Master Water Quality Test Kit | API | 34 | |
| SPSS Statistics for Macintosh | IBM | Version 25.0 | |
| Submersible Pump, SL- | Songlong | SL-381 | |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 16106 | |
| Triple Flow Corner Biofilter | Lee's | 13405 | |
| Video camera | Coleman | TrekHD CVW16HD | |
| Windows Media Player (video software) | Microsoft | Windows Media Player 12 |
References
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