Summary
En grundläggande aspekt av bedömningen av djurens välbefinnande i fångenskap är att fråga om djuren har det de vill ha. Här presenterar vi ett protokoll för att bestämma bostäder preferens i zebrafisk(Danio rerio) med avseende på förekomsten / avsaknad av miljöberikning och tillgång till vattenflöde.
Abstract
Metoder för bedömning av djurens välbefinnande försöker ta hänsyn till djurets särskilda behov och önskemål. Att tillhandahålla anrikning (tillägg av fysiska föremål eller conspecifics i bostadsmiljön) är ofta ett sätt att ge fångenskap djur möjlighet att välja vem eller vad de interagerar med och hur de tillbringar sin tid. En grundläggande del av vattenmiljön som ofta förbises i fångenskap är dock djurets förmåga att välja att delta i fysisk träning. För många djur, inklusive fisk, motion är en viktig aspekt av deras livshistoria, och är känd för att ha många hälsofördelar, inklusive positiva förändringar i hjärnan och beteende. Här presenterar vi en metod för att bedöma livsmiljöpreferenser hos djur i fångenskap. Protokollet skulle lätt kunna anpassas för att titta på en mängd olika miljöfaktorer (t.ex. grus kontra sand som substrat, plastväxter kontra levande växter, lågt flöde jämfört med högt vattenflöde) i olika vattenlevande arter eller för användning med marklevande arter. Statistisk bedömning av preferens utförs med hjälp av Jakobs preferensindex, som rankar livsmiljöerna från -1 (undvikande) till +1 (mest föredragen). Med denna information kan det bestämmas vad djuret vill ha ur ett välfärdsperspektiv, inklusive deras föredragna plats.
Introduction
Bestämmelserna om hur försöksdjur ska inhysas i fångenskap är uttryckliga och väldefinierade. Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) International övervakar och förvaltar alla organisationer och institutioner som arbetar med forskningsdjur och har särskilda riktlinjer för artanpassad djurhållning och bostäder. Till exempel AAALAC: s vägledning om bostäder och vård av Zebrafish, Danio Rerio1 "starkt uppmuntrar" användning av anrikning (tillägg av fysiska föremål eller conspecifics i bostadsmiljön) när bostäder zebrafisk i fångenskap. Guiden fortsätter med att ange, "Att tillhandahålla konstgjorda växter eller strukturer som imiterar zebrafisk livsmiljö tillåter djur ett val i sin miljö."
Bevis tyder på att berikning kan stimulera tillväxten av nya nervceller (neurogenes) i områden i hjärnan som deltar i bearbetning rumslig information2, och det är tänkt att dessa neurala förändringar är förknippade med förbättrad inlärningsförmåga3. Effekterna av anrikning på neurogenes och lärande har studerats i stor utsträckningöver olika taxa, inklusive fisk4,5, fåglar 6 , reptiler7, och däggdjur8. Även om dessa typer av studier är viktiga för att förstå effekterna av anrikning på hjärnan och beteende, tar de inte hänsyn till särskilda val eller preferenser av djur för en viss miljö över en annan.
En grundläggande fråga att ställa vid bedömningen av husdjurens välbefinnande är huruvida djuren har vad de villha 9. Ett sätt att undersöka denna fråga som ger konkreta bevis är att ge djur val som gör det möjligt för oss att förstå deras subjektiva preferenser. Två studier har till exempel undersökt om zebrafisk föredrar tillgång till antingen en berikad eller en vanlig miljö, med båda studierna som visar en preferens för områden som innehåller anrikning10,11. Men det har också föreslagits att zebrafisk verkar likgiltig för miljöberikning12, så svaret på frågan är uppenbarligen inte entydigt. En annan tillämpning av preferenstester i samband med djurens välbefinnande omfattar att försöka förstå hur olika aspekter av en berikad miljö spelar en roll i de val ett enskilt djur gör. Bara i fisk, olika typer av berikning har differentiella effekter på hjärnan och beteende, och detta förhållande kompliceras ytterligare av individuella skillnader i personlighetsdrag13. Dessutom kan preferenstester vara användbara för jämförande studier av miljöberikning. Även över olika fiskarter, anrikning har visat sig ha en effekt på många olika typer av beteende, inklusive aggression14,djärvhet15, rörelse16, och risktagande beteende17.
Jakobs preferensindex är ett statistiskt test som används ofta för att kvantifiera boendepreferenser18. Jakobs preferensindex tilldelar varje olika livsmiljö baserat på antalet djur som finns i varje livsmiljötyp vid olika tidpunkter, där preferensen sträcker sig från -1 (undvikande) till +1 (mest föredragen). Här beskriver vi en metod för att använda Jakobs preferensindex för att undersöka boendepreferenser i fisk och använda exemplet med att bedöma två viktiga egenskaper hos vattenmiljön: 1) förekomsten eller frånvaron av anrikning; och 2) flödet av vatten19. Protokollet skulle dock lätt kunna anpassas för att titta på en mängd olika miljöfaktorer (t.ex. grus kontra sand som substrat, plastväxter kontra levande växter, lågt kontra högt vattenflöde) över olika arter och landskap (t.ex. vattenlevande och markbundna).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den aktuella studien har godkännande och uppfyller alla krav i djurvård och användning protokoll av Pennsylvania State University; IACUC nr 46466.
1. Inställning av preferensapparater
- Uppnå godkännande från institutets djurvårdskommitté (eller motsvarande organisation) för alla experimentella och djurhållningsförfaranden som involverar levande djur innan experimentet inleds.
- Använd en experimentell tank av ogenomskinlig vit plast. Väggarna mellan zonerär gjorda av grå akryl som är fast på plats med kisel tätningsmedel.
OBS: Storleken på den experimentella tanken är beroende av storleken på arten av intresse och antalet individer som används (t.ex. för 8 vuxna zebrafiskar, en tank på 76 cm L x 76 cm W x 30 cm H rekommenderas). - Dela upp den experimentella tanken i fyra zoner som varierar i enlighet med de specifika livsmiljöparametrar som ska testas. Exempel på olika typer av anrikning att undersöka är sandiga vs stenigsubstrat, konstgjorda växter vs skydd, eller flöde av vatten kontra förekomsten av konstgjorda växter(figur 1).
- Om du använder flöde av vatten som en parameter av intresse, använd små pumpar för att leverera vattenstrålar (se Table of Materials). Ställ in pumparna med en vald hastighet så att de ger ett konstant och riktat flöde av vatten. Välj önskad hastighet baserat på arten av intressets ekologi och livshistoria (t.ex. 14 cm/s för zebrafisk).
- I mitten av den experimentella tanken, har en central arena där mat levereras (figur 1). Tillgång till den centrala arenan från varje zon är genom en liten öppning i de separerande väggarna. Öppningen är tillräckligt stor för de arter av intresse att flytta mellan zoner obehindrat, men tillräckligt liten för att minska alla visuella ledtrådar fisken kan uppleva från andra zoner.
- Placera ett biofilter och en värmare i varje hörn av tanken, men utanför det experimentella området för att inte störa vattenflödet och för att säkerställa en konstant vattentemperatur över alla zoner.
- Ställ in ytterligare experimentella tankar som utrymme dikterar. Rotera de olika zonerna i varje experimentell tank för att begränsa eventuella sekventiella fördomar. Se till att alla replikattankar har enhetliga förhållanden (samma ljusnivåer, vattentemperatur osv.)
- Placera kameror (se Materialbord)på stativ direkt ovanför varje experimentell tank, så att alla zoner är synliga. Undvik vidvinkelobjektiv och se till att minneskorten har tillräckligt med utrymme för inspelning.
- Ställ in rumsbelysningen på en gradvis (t.ex. 1/2 h) 12 L: 12 D cykel för att simulera soluppgång och solnedgång. Håll vattentemperaturen vid 25 ± 1 °C.
2. Fånga, acklimatisering och förfarande
- Förvara fisk i hemtankar när de inte testas. Net alla testa fisk från sina hem tankar och placera i centrum arenan för den experimentella tanken (dag 1). Minimera fångsttider för att minska stress (t.ex. mindre än 30 s).
OBS: Ett alternativt förfarande för överföring av fisk från sin hemtank till den experimentella tanken som kan minimera stress är att transportera fisken i en bägare av tankvatten. - Håll antalet och kön et av fisken i varje experimentell tank konstant över replikera tankar och välj baserat på artens storlek och ekologi.
- På dag 1–4, spenderar fisken tid med acklimatisering och utforska de olika zonerna. Samla inte in data på dessa dagar.
Obs: Utöka eller minska antalet dagar för acklimatisering beroende på det särskilda experimentella protokollet. Acklimatiseringsperioden bör dock vara tillräcklig för att minimera effekterna av hantering samt för att vänja fisken vid utfodring i apparaten. - Under acklimatiseringsperioden övervakar du noga vattenkvaliteten genom regelbundna vattenkvalitetstester (t.ex. pH-, nitrat- eller nitritnivåer) och byt ut vattnet om några problem upptäcks (se materialtabell).
- Mata fiskflake mat (se Table of Materials)i den centrala arenan med hjälp av en flytande matring (se Table of Materials)fäst vid väggen i den centrala arenan vid vattenytan. En matring säkerställer att matpartiklar stannar kvar på den centrala arenan och inte utgör en partiskhet för zoner på grund av matdrifting.
- Ge fisken 0,5 h att mata ad libitum innan du tar bort överblivna mat från den experimentella tanken med ett dip net. Mata fisken en gång på morgonen och en gång på eftermiddagen.
- Bedöma beteenden på dag 5–7. Slå på kameror och spela in fiskbeteenden för 2 h efter varje planerad morgon- och eftermiddagsmatning. På dag 8 ta bort all fisk från experimentella tankar med ett dip net och placera dem tillbaka i sina hem tankar.
- Beroende på hur mycket sumpvatten finns tillgängligt, ersätta minst en 1/3 av vattnet i den experimentella tanken med färskt sumpvatten för att minska eventuella effekter av stresshormoner på fisk i följande replikat.
- Ställ in försökstankarna i enlighet med zonrotationsschemat för den veckan. Rotera zonerminskar risken för beteendemässiga fördomar som uppstår som ett resultat av placeringen av någon zon i förhållande till varandra. Börja sedan testprocessen igen med ett nytt parti fisk.
3. Mätningar och dataanalys
- Ladda ner videorna till en dator i slutet av varje inspelningsdag. Detta säkerställer att det finns utrymme på minneskortet före varje användning.
- Använd videoprogramvara (se Materialförteckning)för att kvantifiera zoninställningar. Räkna manuellt antalet fiskar i varje zon med 5 minuters mellanrum under varje 2 h inspelningsperiod (inkludera den centrala arenan i dessa räknas). Definiera fiskens kön under analys om differentiering mellan män och kvinnor är möjlig från videomaterialet.
- För att analysera livsmiljöpreferensen beräknar du medelvärdet av fisk per zon för varje replikattank (dvs. genomsnitt alla data under de 3 dagarna). För att få en preferenspoäng för strukturanvändning, beräkna Jacobs preferensindex15 som
J = (rx − p)/[(rx + p) – 2*rx*p]
Där x är intressezonen är rx förhållandet mellan fisk i zon x och det totala antalet fiskar i alla zoner, och p är den tillgängliga andelen av alla zoner i försökstanken. Indexet varierar mellan +1 för maximal prioritet och −1 för maximal undvikande. - För att avgöra om det sker några förändringar i den hastighet med vilken fisk växlar mellan zoner under en observationsperiod, beräkna omkopplaren, rsr,under den första och sista 5 min varje observationsperiod, där rsr är antalet gånger en fisk kommer in i varje zon från den centrala arenan, dividerat med det totala antalet fiskar.
- Tänk på att en fisk har gått in i en zon när fiskens hela kropp korsar genom öppningen som skiljer zonerna. Beräkna en start- och efterbehandlingmedelshastighet för varje replikattank. Utför alla beteendemässiga observationer av samma experimentör för att minska eventuella experimenter observation bias.
- Med hjälp av statistisk programvara (se Materialförteckning)utför du relevanta statistiska analyser. Föreslagna analyser inkluderar en enkelriktad ANOVA, med preferensindex som beroende variabel och zon som prediktorvariabel, och ett parat t-test på start- och efterbehandlingmedelshastighet för varje tank.
- Använd Tukeys flera jämförelsepost hoc-test för att ytterligare undersöka zonjämförelser, där varje zon jämförs med varandra. Mer komplex statistisk analys omfattar blandade modeller som bedömer tidseffekter, arenaeffekter, könseffekter eller till och med individuella skillnader i beteende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi använde preferenstestet för att undersöka boendepreferenser i zebrafisk ges ett val mellan varierande anrikning inklusive 1) plastanläggningar och sandsubstrat; och 2) vattenflöde. Dessa delades in i fyra zonplanerar: i) Berikat Only; ii) Endast flöde. iii) Berikad och flöde. iv) Klartext. och en central arena där mat levererades19. Zebrafish visade högsta preferens för zonen Berikade och Flow, som var betydligt annorlunda än alla andra zoner (berikad endast, Flow Only, Plain och Central Arena; p < 0,01). Fisk undvek både Flow Only och Plain zoner, spendera mer tid i Central Arena19 (Figur 2A). Dessutom flyttade zebrafiskar mellan olika livsmiljözoner oftare i början av observationsperioden än i slutet (figur 2B).
Figur 1: Exempel på olika experimentella mönster för att testa för livsmiljöpreferenser. (A)Installation av en experimentell tank för att testa preferensen hos ett sandigt jämfört med ett stenigt substrat. (B)Installation av en experimentell tank för att testa preferensen för anrikning (plastväxter) kontra ett skydd. (C)Installation av en experimentell tank för att testa preferensen för anrikning (plastväxter) jämfört med ett flöde av vatten. I alla figurpaneler var de fyra hörnfacken inte tillgängliga för fisken och innehöll endast värmare och filter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa uppgifter som visar resultaten av ett livsmiljöpreferenstest på zebrafisk. A) Jacobs preferensindex för varje zon:i)Endast berikat. ii)Berikad och flöde. iii)Endast flöde. iv) Slätt; och en neutral Central Arena. Positiva och negativa värden anger preferens respektive undvikande. Rutorna anger 25 ± 75:e percentilintervallet och innehåller medianlinjen. staplar representerar de 10: e och 90: e percentilen värden; öppna punkter representerar punkter utanför dessa värden. a = betydande skillnad från alla zoner(p < 0,05); b = väsentligt annorlunda än berikad och flöde, berikad endast, och Central Arena(p < 0,05); och (B)fältdiagram som visar kopplingshastigheten i början och slutet av observationsperioden (rutorna anger 25 ± 75:e percentilintervallet och innehåller medianlinjen, staplarna representerar de 10: e och 90:e percentilvärdena). Figur 2A har ändrats från DePasquale et al.19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi en experimentell design som gör att vi kan undersöka preferenser fisk för olika typer av livsmiljöer. Några kritiska steg som är viktiga i preferenstestningär: 1) se till att enhetliga förhållanden upprätthålls mellan olika replikat (t.ex. yttre ljud eller rörelser, experimentörer, vattenkemi, ljusnivåer); 2) se till att zonerna roteras mellan replikat och en betydande mängd vatten ersätts med sötvatten sumpvatten mellan provningarna för att minska fördomar. (3) Se till att en lämplig urvalsstorlek används för att upptäcka betydande resultat, både när det gäller antalet individer i varje grupp och antal replikattankar. och 4) om försök spelas in, optimerar och säkerställer korrekt videoinspelning och filöverföring.
Ändringar av det nuvarande protokollet omfattar utsätta fisk för en mängd andra livsmiljötyper, såsom olika anrikningsobjekt, olika substrat eller till och med olika flöden. Dessutom kan det vara möjligt att använda djurspårningsprogram för att ytterligare förstå hur fisken använder utrymmet i varje zon (t.ex. tillbringar fisken tid med att simma mot vattenflödet i flödeszonerna, eller undviker de den delen av livsmiljön helt och hållet). Emellertid, väggarna i den experimentella tanken kan behöva ändras för att rymma denna typ av spårningsprogram. Slutligen kan preferenstestet som beskrivs här anpassas till alla fiskarter, eller potentiellt alla vattenlevande organismer som experimentören vill undersöka.
En begränsning av det nuvarande protokollet är att preferenstestning begränsas av de resurser som presenteras för djuren. Därför kan djuret inte välja ett föredragen val, men det minst obehagliga av dem som presenteras20. Det kan dock vara så att det är bättre att ha ett val i första hand för välfärden än att bara få begränsade alternativ (dvs. endast tillgång till den mest föredragna livsmiljön). Det har också föreslagits att zebrafiskar hittar ljusbakgrunder aversive23, alltså en alternativ tank färg (t.ex. svart) kan vara mer lämplig. Dessutom är preferenstester ofta begränsade till observationer som gjorts i ett litet tidsfönster, där djuret i fråga kan agera på omedelbara ledtrådar snarare än framtida behov21,22. Dessutom är kön, gruppstorlek och sociala sammanhang faktorer som påverkar gruppdynamiken och därför potentiellt livsmiljöpreferenser inom fisk, så det är viktigt att försöka hålla dessa faktorer konsekventa över replikat.
Med våra representativa resultat visade vi att zebrafisk företrädesvis väljer både Berikade och Flow och Berikade Endast zoner och undviker Flow Only och Plain Zones. Sammanfattningsvis föredrogs zonen Berikade och Flöde över alla andra zoner. En preferens för berikade miljöer, särskilt anrikat och flödeszon, kan vara resultatet av ett ökat behov av sensorisk stimulering (prospektering) eller det kan vara behovet av att hitta platser att dölja (minskad konkurrens från conspecifics). Intressant nog fanns det en liten preferens för Central Arena över Flow Only och Plain zoner, vilket tyder på att potentialen för mat levereras var en högre motiverande faktor än simning. När det gäller förflyttning mellan zonerna var det mer omkoppling mellan zonerna i början av observationsperioden än i slutet. Ökningen av rörelse i början av observationsperioden kan motsvara tidpunkten för utfodring (fisk matades en halvtimme innan inspelningen började), vilket innebär att de kan ha varit mer motiverade att flytta och leta efter ytterligare mat. Sammanfattningsvis är det protokoll som beskrivs i den aktuella studien ett effektivt verktyg för att titta på livsmiljöpreferenser i fisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en Research Collaboration Fellowship och Huck Institute vid Pennsylvania State University, samt USDA AES 4558. Forskningen uppfyllde alla krav i djurvårds- och användningsprotokollen från Pennsylvania State University. IACUC nr 46466.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Aquarium Plants | Smarlin | B07PDZQ5M5 | |
| Artificial Seaweed Water Plants for Aquarium | MyLifeUNIT | PT16L212 | |
| Experimental tanks | United State Plastic Corporation | 6106 | |
| Floating food ring | SunGrow | B07M6VWH9V | |
| Flow meter | YSI | BA1100 | |
| Jager Aquarium Thermostat Heater | Ehiem | 3619090 | |
| Master Water Quality Test Kit | API | 34 | |
| SPSS Statistics for Macintosh | IBM | Version 25.0 | |
| Submersible Pump, SL- | Songlong | SL-381 | |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 16106 | |
| Triple Flow Corner Biofilter | Lee's | 13405 | |
| Video camera | Coleman | TrekHD CVW16HD | |
| Windows Media Player (video software) | Microsoft | Windows Media Player 12 |
References
- Reed, B., Jennings, M. Guidance on the housing and care of zebrafish, Danio rerio. AAALAC International. , 36 (2010).
- van Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Neural consequences of environmental enrichment. Nature Reviews Neuroscience. 1, 191-198 (2000).
- Oomen, C. A., Berkinschtein, P., Kent, B. A., Sakisda, L. M., Bussey, T. J. Adult hippocampal neurogenesis and its role in cognition. Wiley Interdisciplinary Reviews - Cognitive Science. 5 (5), 573-587 (2014).
- DePasquale, C., Neuberger, T., Hirrlinger, A. M., Braithwaite, V. A. The influence of complex and threatening environments in early life on brain size and behaviour. Proceeedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 283 (1823), 1-8 (2016).
- Salvanes, A. G. V., et al. Environmental enrichment promotes neural plasticity and cognitive ability in fish. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 280, 1-7 (2013).
- Barnea, A., Pravosudov, V. V. Birds as a model to study adult neurogenesis: bridging evolutionary, comparative and neuroethological approaches. European Journal of Neuroscience. 34 (6), 884-907 (2011).
- LaDage, L. D., et al. Interaction between territoriality, spatial environment, and hippocampal neurogenesis in male side-blotched lizards. Behavioral Neuroscience. 127 (4), 555-565 (2013).
- Kempermann, G. Why New Neurons? Possible Functions for Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Neuroscience. 22 (3), 635-638 (2002).
- Dawkins, M. S. Using behaviour to assess animal welfare. Animal Welfare. 13, 3-7 (2004).
- Kistler, C., Hegglin, D., Würbel, H., König, B. Preference for structured environment in zebrafish (Danio rerio) and checker barbs (Puntius oligolepis). Applied Animal Behaviour Science. 135, 318-327 (2011).
- Schroeder, P., Jones, S., Young, I. S., Sneddon, L. U. What do zebrafish want? Impact of social grouping, dominance and gender on preference for enrichment. Laboratory Animals. 48 (4), 328-337 (2014).
- Matthews, M., Trevarrow, B., Matthews, J. A virtual guide for zebrafish users. Lab Animal. 31 (3), 34-40 (2002).
- Näslund, J., Johnsson, J. I. Environmental enrichment for fish in captive environments: Effects of physical structures and substrates. Fish and Fisheries. 17 (1), 1-30 (2016).
- Oliveira, K. V., Barreto, R. E. Environmental enrichment reduces aggression of pearl cichlid, Geophagus brasiliensis, during resident-intruder interactions. Neotropical Ichthyology. 8 (2), 329-332 (2010).
- Brydges, N. M., Braithwaite, V. A. Does environmental enrichment affect the behaviour of fish commonly used in laboratory work. Animal Behaviour Science. 118, 137-143 (2009).
- Ahlbeck Bergendahl, I., Miller, S., Depasquale, C., Giralico, L., Braithwaite, V. A. Becoming a better swimmer: structural complexity enhances agility in a captive-reared fish. Journal of Fish Biology. 90 (3), 1112-1117 (2017).
- Roberts, L. J., Taylor, J., de Leaniz, C. G. Environmental enrichment reduces maladaptive risk-taking behavior in salmon reared for conservation. Biological Conservation. 144 (7), 1972-1979 (2011).
- Jacobs, J. Quantitative measurement of food selection. Oecologia. 14, 413-417 (1974).
- DePasquale, C., Fettrow, S., Sturgill, J., Braithwaite, V. A. The impact of flow and physical enrichment on preferences in zebrafish. Applied Animal Behaviour Science. 215, 77-81 (2019).
- Bekoff, M. Encyclopedia of Animal Rights and Animal Welfare, 2nd edition. , Greenwood Press. Santa Barbara, CA. 53 (2009).
- Fraser, D., Nicol, C. J. Preference and motivation research. Animal Welfare. , 183-199 (2011).
- Franks, B. What do animals want. Animal Welfare. 28, 1-10 (2019).
- Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PLoS One. 7 (5), 1-8 (2012).
