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Neuroscience

पूर्व वीवो दबाव हिप्पोकैम्पल केशिका-Parenchymal Arteriole कार्यात्मक अध्ययन के लिए तैयारी

Published: December 18, 2019 doi: 10.3791/60676
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Anesthesiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Neurological Sciences, University of Vermont Larner College of Medicine, 3Department of Pharmacology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

वर्तमान पांडुलिपि विवरण कैसे माउस मस्तिष्क से हिप्पोकैम्पस आर्टेरियोल्स और केशिकाओं को अलग करने के लिए और कैसे दबाव myography, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, जैव रसायन, और आणविक अध्ययन के लिए दबाव बनाने के लिए ।

Abstract

सूक्ष्म व्यवहार परिवर्तन से देर से चरण मनोभ्रंश के लिए, संवहनी संज्ञानात्मक हानि आम तौर पर मस्तिष्क इस्केमिया के बाद विकसित करता है । स्ट्रोक और हृदय की गिरफ्तारी उल्लेखनीय यौन मंदरोगहैं, और दोनों सेरेब्रल इस्केमिया को प्रेरित करते हैं। हालांकि, संवहनी संज्ञानात्मक हानि को समझने में प्रगति, और फिर सेक्स-विशिष्ट उपचार विकसित करना, कार्यात्मक अध्ययनों में माउस मॉडल से मस्तिष्क माइक्रोसर्कुलेशन की जांच करने में चुनौतियों से आंशिक रूप से सीमित रहा है। यहां, हम माउस मस्तिष्क से एक पूर्व वीवो हिप्पोकैम्पल केशिका-पैरान्चिमल आर्टेरियोल (HiCaPA) तैयारी में केशिका-टू-आर्टेरियोल सिग्नलिंग की जांच करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। हम वर्णन कैसे अलग करने के लिए, cannulate, और केशिका उत्तेजना के जवाब में arteriolar व्यास को मापने के लिए माइक्रोसर्कुलेशन दबाव । हम दिखाते हैं कि HiCaPA तैयारी अखंडता को मान्य करने और विशिष्ट परिणामों को प्रदर्शित करने के लिए किस उपयुक्त कार्यात्मक नियंत्रण का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें एक न्यूरोवैस्कुलर युग्मन एजेंट के रूप में पोटेशियम का परीक्षण करना और किर2 आवक के हाल ही में विशेषता अवरोधक के प्रभाव को प्रदर्शित करना शामिल है। इसके अलावा, हम पुरुष और महिला चूहों से प्राप्त तैयारियों में प्रतिक्रियाओं की तुलना करते हैं। हालांकि ये डेटा कार्यात्मक जांच को दर्शाते हैं, हमारे दृष्टिकोण का उपयोग आणविक जीव विज्ञान, इम्यूनोकेमिस्ट्री और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययनों में भी किया जा सकता है।

Introduction

मस्तिष्क की सतह पर पियाल परिसंचरण बहुत अध्ययन की वस्तु रही है, आंशिक रूप से इसकी प्रायोगिक पहुंच के कारण। हालांकि, सेरेब्रल वैस्कुलचर की टोपोलॉजी अलग क्षेत्र बनाती है। रक्त प्रवाह को पुनः निर्देशित करने के लिए पर्याप्त क्षमता के साथ एनास्टोमूसा में समृद्ध मजबूत पियाल नेटवर्क के विपरीत, इंट्रासेरेब्रल पैरान्चिमल आर्टेरियोल्स (पीए) सीमित संपाश्र्वक आपूर्ति करते हैं, उनमें से प्रत्येक तंत्रिका ऊतक1,2की एक असतत मात्रा को व्याप्त करता है। यह रक्त प्रवाह पर एक अड़चन प्रभाव पैदा करता है, जो अद्वितीय शारीरिक विशेषताओंकेसाथ संयुक्त3,4,5,6,7,8,इंट्रारेब्रल आर्टेरियोल्स को मस्तिष्क रक्त प्रवाह (सीबीएफ) विनियमन9,10के लिए एक महत्वपूर्ण साइट बनाता है। पीए के अलगाव और कैनुलेशन के लिए निहित तकनीकी चुनौतियों के बावजूद, पिछले दशक में दबाव वाले जहाजों11,12 ,13,14,15,16,17का उपयोग करके पूर्व वीवो कार्यात्मक अध्ययनों में रुचि बढ़ी है । इस बढ़ी हुई रुचि का एक कारण न्यूरोवैस्कुलर युग्मन (एनवीसी) पर किया गया काफी शोध प्रयास है, जो मस्तिष्क कार्यात्मक हाइपरमिया18को बनाए रखने वाला तंत्र है।

क्षेत्रीय रूप से, सीबीएफ स्थानीय तंत्रिका सक्रियण19के बाद तेजी से बढ़ सकता है। एनवीसी को नियंत्रित करने वाले सेलुलर तंत्र और सिग्नलिंग गुणों को अधूरा समझा जाता है। हालांकि, हमने तंत्रिका गतिविधि को भांपते हुए एनवीसी के दौरान मस्तिष्क केशिकाओं के लिए पहले से अप्रत्याशित भूमिका की पहचान की और इसे अपस्ट्रीम आर्टेरियोल्स20,21,22को फैलाने के लिए हाइपरपोलार्फायरिंग इलेक्ट्रिकल सिग्नल में अनुवाद किया। कार्रवाई क्षमता23,24 और एस्ट्रोसाइटिक एंडफीट25,26 पर बड़े संचालन सीए2 +-सक्रिय कश्मीर+ (बीके) चैनलों के उद्घाटन के लिए मध्यवर्ती पोटेशियम आयन एकाग्रता [कश्मीर+]ओ,जो मजबूत आवक सुधारक कश्मीर+ (कीर) चैनलों के सक्रियण में परिणाम कैपिलर के संवहनी एंडोथेलियम में वृद्धि । यह चैनल बाहरी K + द्वारा सक्रियहै, लेकिन यह भी हाइपरपोलीकरण से ही है। गैप जंक्शनों के माध्यम से फैलते हुए, हाइपरपोलाइज़िंग वर्तमान फिर आर्टेरियोल तक आसन्न केशिका एंडोथेलियल कोशिकाओं में पुनर्जीवित होता है, जहां यह मायोसाइट छूट का कारण बनता है और सीबीएफ20,21में वृद्धि करता है। इस तंत्र के अध्ययन ने हमें वासोएक्टिव एजेंटों के साथ केशिका उत्तेजना के दौरान आर्टेरियोलर व्यास को मापने के लिए एक दबाव वाले केशिका-पैरान्चिमल आर्टेरियोल (सीएपीए) तैयारी विकसित करने के लिए प्रेरित किया। CaPA तैयारी एक अक्षुण्ण, डाउनस्ट्रीम केशिका असर के साथ एक cannulated इंट्रासेरेब्रल आर्टिकुल खंड से बना है । केशिका सिरों को एक माइक्रोपाइपेट द्वारा कक्ष ग्लास बॉटम के खिलाफ संकुचित किया जाता है, जो पूरे संवहनी गठन20,21को रोकता है और स्थिर करता है।

हमने पहले माउस कॉर्टेक्स20,21 और रैट एमिग्डाला 13 और हिप्पोकैम्पस16 ,17से आर्टेरियोल्स से सीएपीए की तैयारी की इमेजिंग करके महत्वपूर्ण नवाचार किए । चूंकि हिप्पोकैम्पल वास्कुल्चर रोग की स्थिति के प्रति अपनी संवेदनशीलता के कारण अधिक ध्यान प्राप्त करता है, यहां हम माउस हिप्पोकैम्पस (HiCaPA) से CaPA तैयारी के लिए एक कदम-दर-कदम विधि प्रदान करते हैं जिसका उपयोग न केवल कार्यात्मक एनवीसी अध्ययन में बल्कि आणविक जीव विज्ञान, इम्यूनोकेमिस्ट्री और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में भी किया जा सकता है।

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Protocol

सभी प्रयोगों को कोलोराडो विश्वविद्यालय, Anschutz मेडिकल कैंपस की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के दिशा-निर्देशों के अनुसार किया गया था ।

1. समाधान

  1. विच्छेदन के लिए एमओपीएस-बफरेड नमकीन का उपयोग करें और उनके उपयोग से पहले नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए। समाधान गैस मत करो। निम्नलिखित संरचना के साथ एमओपीएस बफरेड खारा तैयार करें: 135 एमएम एनएसीएल, 5 एमएम केसीएल, 1 एमएम एम एचएएच2पीओ4,1 एमएम एमजीएसओ4,2.5 एमएम सीएसीएल2,5 एमएम ग्लूकोज, 3 एमएम एमओपीएस, 0.02 एम एम ईटीए, 2 एमएम पायरुवेट, 10 एमजी/एमजीएल बोवाइन सीरम एल्बुमिन, पीएच 7.3 डिग्री
  2. स्नान समाधान और पिपेट समाधान के रूप में कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ (एसीएसएफ) का उपयोग करें। गैस दोनों एसीएसएफ और सीए2 +-5% सीओ2,20% ओ2,और एन2 बैलेंस के साथ मुफ्त एसीएसएफ। निम्नलिखित संरचना के साथ समाधान तैयार करें: 125 एमएम एनएसीएल, 3 एमएम केसीएल, 26 एमएम नाहको3,1.25 एमएम एनएएच2पीओ4,1 एमएम एमजीसीएल2,4 एमएम ग्लूकोज, 2 एमएम सीएसीएल2,पीएच 7.3 (5% सीओ2,20% ओ2और एन2 बैलेंस के साथ वात्सलन के साथ)।
  3. नाममात्र सीए2 +-मुक्त एसीएसएफ (0 एमएम [सीए2 + ]ओ,5 एमएम ईजीटीए) में अधिकतम फैलाव प्राप्त करें।

2. अंग कक्ष तैयार

  1. एक ग्लास पुलर में बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका (बाहर व्यास = 1.2 मिमी; अंदर व्यास = 0.69 मिमी; लंबाई = 10 सेमी) डालें। एक छोर पर एक लंबी, पतली टिप बनाने के लिए केशिका खींचें।
  2. कक्ष के एक तरफ, एक कैनुला जोड़ें जो पोत पर चमकदार रूप से दबाव बनाने के लिए एक लघु पेरिटैटिक पंप से जुड़ सकता है। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, कैनुला की नोक को तोड़ें ताकि यह ब्याज के पोत को फिट करने के लिए पर्याप्त छोटा हो, लेकिन समाधान को टिप के माध्यम से प्रवाहित करने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त बड़ा हो। सुनिश्चित करें कि टिप व्यास में लगभग 10-15 माइक्रोन है।
  3. ऑक्सीजनयुक्त एसीएसएफ के साथ संलग्न 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ एक सिरिंज का उपयोग कर के कैनुला भरें। सुनिश्चित करें कि कैनुला में कोई हवा बुलबुले या मलबे नहीं हैं।
  4. कक्ष के विपरीत दिशा में दो और कैनुला जोड़ें। उनके टिप्स न तोड़ें।

3. हिप्पोकैम्पस विच्छेदन और अलगाव

  1. इच्छामृत्यु और एक माउस काटना। इस प्रयोग के लिए, पुरुषों और महिलाओं के बीच मतभेदों की तुलना करने के लिए 8 सप्ताह पुराने C57BL6/J माउस का उपयोग करें । माउस को पेंटोबार्बिटल के साथ इंजेक्ट करें और सर्जिकल कैंची के साथ काट लें।
  2. छोटे विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, त्वचा को उसके सिर के शीर्ष पर मिडलाइन के साथ काट लें। त्वचा को किनारों पर ले जाएं।
  3. खोपड़ी के कौडल पक्ष से शुरू होकर, मिडलाइन के साथ खोपड़ी को तब तक काट ें जब तक कि घ्राण बल्ब तक पहुंच न जाए। सेरेब्रम उजागर होने तक खोपड़ी के कुछ हिस्सों को हटा दें।
  4. धीरे-धीरे मस्तिष्क को हटा दें, माउस की नाक के पास शुरू करें। छोटी विच्छेदन कैंची के साथ संरचनाओं के माध्यम से काटकर घ्राण बल्ब, कपाल नसों और रीढ़ की हड्डी से मस्तिष्क को अलग करें।
  5. मस्तिष्क को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए पर्याप्त एमओपीएस समाधान के साथ विच्छेदन प्लेट में रखें। विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, मस्तिष्क को विच्छेदन प्लेट के केंद्र में वेंट्रल साइड का सामना करने के साथ रखें।
  6. रेजर ब्लेड का उपयोग करके, अनुदैर्ध्य दरार के साथ मस्तिष्क को आधे में काट लें। ब्लेड को पकड़ें ताकि तेज धार विच्छेदन प्लेट के नीचे के समानांतर हो। एक झटके में मस्तिष्क के माध्यम से ब्लेड दबाएं। एक गोलार्द्ध को थाली के किनारे ले जाएं।
  7. प्रत्येक गोलार्द्ध के लिए निम्नलिखित चरणों को अलग से या समानांतर रूप से करें।
    1. थाली के केंद्र में एक गोलार्द्ध रखें ताकि मिडलाइन नीचे का सामना कर रही हो। फिर सेरिबैलम और ब्रेन स्टेम को हटाने के लिए ट्रांसवर्स फिशर के साथ काटने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें। ब्लेड को सीधे ऊतक के माध्यम से पुश करें।
    2. गोलार्द्ध को घुमाएं ताकि मध्यस्थ पक्ष का सामना करना पड़ रहा हो(चित्रा 1ए)। मस्तिष्क को रखने के लिए एक स्पैटुला का उपयोग करें। एक दूसरे स्पैटुला का उपयोग करके, हिप्पोकैम्पस(चित्रा 1बी)को कवर करते हुए थैलेसीमिया, पट और हाइपोथैलेमस को हटाने के लिए नीचे कॉर्पस कैलोसम और स्कूप के नीचे टिप डालें।
    3. सुनिश्चित करें कि हिप्पोकैम्पस अब सेरेब्रम के पीछे की ओर के पास एक घुमावदार संरचना के रूप में दिखाई दे रहा है। सेरेब्रम को पकड़ने के लिए एक स्पैटुला का उपयोग करके, हिप्पोकैम्पस को सेरेब्रम(चित्रा 1सी)से बाहर निकालने के लिए दूसरे स्पैटुला का उपयोग करें।
  8. हिप्पोकैम्पी को मोपीएस समाधान के साथ आधे रास्ते से भरी एक नई विच्छेदन प्लेट में स्थानांतरित करें। बाकी मस्तिष्क को त्याग दें।

4. हिप्पोकैम्पल आर्टेरियोल अलगाव

  1. प्रत्येक हिप्पोकैम्पस के लिए निम्नलिखित चरणों को पूरा करें।
    1. खंड के प्रत्येक छोर पर छोटे पिन का उपयोग करके हिप्पोकैम्पी में से एक को पिन करें। हिप्पोकैम्पस धमनी का सामना करना पड़ रहा है ।
    2. बहुत तेज संदंश का उपयोग करना, धीरे-धीरे हिप्पोकैम्पस के छोटे वर्गों को फैलाएं। इससे आर्टेरियोल के आसपास के ऊतक ढीले हो जाएंगे, जिससे उन्हें विच्छेदन करना आसान हो जाएगा।
    3. बाहरी ट्रांसवर्स धमनी (चित्रा 1सी)16,27की पहचान करने के लिए पृष्ठीय हिप्पोकैम्पल ऊतक के माध्यम से खोजें ।
    4. धीरे-धीरे बाहरी ट्रांसवर्स धमनी को पकड़ें और धीरे-धीरे इसे ऊतक से दूर खींचें ताकि हिप्पोकैम्पस के सीए3 क्षेत्र का उपयोग करने वाले आर्टेरियोल और केशिकाओं को इकट्ठा किया जा सके।
    5. एक बार ऊतक से हटाने के लिए और अधिक जहाजों नहीं हैं, हिप्पोकैम्पी को त्याग दें। उपयोग में नहीं रहते हुए प्लेटों में बर्फ पर जहाजों रखें।

5. हिप्पोकैम्पल केशिका-पैरेंचिमल आर्टिकुल कैन्युलेशन

  1. केशिकाओं के साथ समाप्त होने वाली शाखा के साथ एक धमनी का पता लगाएं। इसे ऑर्गन चैंबर में ट्रांसफर करें। सुनिश्चित करें कि आर्टेरियोल पूरी तरह से फैली हुई(चित्रा 1डी)होने पर लगभग 15-30 माइक्रोन है।
  2. ध्यान से लक्ष्य क्षेत्र के नीचे धमनी दीवार के माध्यम से कैनुला टिप धक्का द्वारा रक्त वाहिका माउंट । ध्यान से कैनुला पर पोत स्लाइड जब तक वहां पर्याप्त ऊतक पर टाई जगह है ।
  3. 12-0 नायलॉन टांके के साथ एक ढीला गाँठ बनाओ ताकि यह रक्त वाहिका और cannula पर फिट बैठता है। संबंधों को सुरक्षित करने के लिए आधा अड़चन गांठ का प्रयोग करें। फिर गाँठ को कसने और कैनेला में आर्टेरियोल को सुरक्षित करने के लिए सिरों को खींचें। टाई के नीचे किसी भी बाहरी पोत शाखाओं को धीरे-धीरे संदंश के साथ खींचकर निकालें।
  4. एक और टाई बनाओ और इसे सील करने के लिए धमनी के दूसरे छोर पर सुरक्षित करें।
  5. संलग्न पोत के साथ कैनुला को कम करें जब तक कि यह कक्ष के नीचे कवरस्लिप के खिलाफ सपाट न हो जाए। सावधान रहें कि कैनुला को बहुत ज्यादा कम न करें वरना यह टूट जाएगा।
  6. कक्ष के विपरीत दिशा में एक कैनुला का उपयोग करना, इसे कम करें ताकि इसका बिंदु आर्टेरियोल के अंत में टाई को पिन कर सके।
  7. कवरस्लिप के लिए केशिका शाखा को पिन करने के लिए तीसरे कैनुला का उपयोग करें। केशिकाओं के सिरों को उजागर करते समय टिप को शाखा के अंत के करीब रखें (कैनुला के नीचे नहीं)।

6. प्रेशर मायोग्राफी

  1. रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर के साथ विच्छेदन गुंजाइश से माइक्रोस्कोप के लिए चैंबर ले जाएँ।
  2. आमद और बहिर्वाह टयूबिंग को परफ्यूजन के लिए चैंबर से कनेक्ट करें। 4 mL/min की प्रवाह दर पर गर्म एसीएसएफ (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ परफ्यूजन शुरू करें।
  3. दबाव कैनुला को प्रेशर ट्रांसड्यूसर के साथ जोड़े गए पेरिटैटिक पंप से अटैच करें और आंतरिक दबाव को 20 मिमी एचजी तक लाएं।
  4. रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर शुरू करें। स्पष्ट छवि संभव प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप और इमेजिंग सेटिंग्स को समायोजित करें। एक बार सेटिंग का पता लगाने के लिए अनुकूलित कर रहे है रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं ।
  5. एज डिटेक्शन सॉफ्टवेयर के साथ धमनी व्यास रिकॉर्ड करते समय 40 एमएम एचजी तक पोत का दबाव बढ़ाएं।
  6. एआईएसएफ के साथ कक्ष से बाहर एमओपीएस समाधान धोने के लिए ~ 15-20 मिन की अनुमति दें, और HiCaPA तैयारी को समतुल्य और मायोजेनिक टोन विकसित करने के लिए दें।
  7. एक पोत की व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए, स्नान परफ्यूजन के लिए 1 μM NS309 समाधान लागू करें (चित्रा 2ए, बी और प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें)। आर्टेरियोलर सेगमेंट को फैलाना चाहिए, लगभग 30-40% मायोजेनिक टोन का प्रदर्शन करना चाहिए जैसा कि पहले3,14,20वर्णित था।

7. केशिका का फोकल उत्तेजना समाप्त होता है

  1. एक बार आर्टेरियोल के लिए बेसलाइन टोन की स्थापना की गई है और एंडोथेलियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन किया गया है, तो केशिका उत्तेजना की प्रतिक्रिया का परीक्षण करें।
  2. कांच के पुलर का इस्तेमाल करके कैनुला बनाएं ताकि एक छोर पर बारीक बात हो। एक कैनुला से टिप को तोड़ें ताकि परीक्षण की गई दवा 5 साई पर आसानी से टिप के माध्यम से प्रवाहित हो सके।
  3. ब्याज के दवा समाधान के साथ कैनुला भरें और इसे माइक्रोस्कोप से जुड़े 3-एक्सिस माइक्रोजोड़क में जोड़ें। ट्यूबिंग को प्रेशर रिजेक्शन सिस्टम से कैनुला से कनेक्ट करें।
  4. धीरे-धीरे केशिकाओं के पास स्नान में कैनुला को कम करें, सावधान रहें कि कक्ष में पोत या हार्डवेयर के किसी भी हिस्से को न मारा जाए। केशिकाओं के सिरों के बगल में कैनुला की नोक को बिना छुए पैंतरेबाज़ी करें। कैनुला लीक होने पर पोत को उत्तेजित होने से रोकने के लिए कवरस्लिप से सिर्फ कैनुला की नोक रखें।
  5. जब केशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए तैयार करें, तो कैनुला को कवरस्लिप में कम करें और केशिकाओं के ठीक बगल में। वांछित रिजेक्शन समय (यहां 20 एस) के साथ दबाव रिजेक्शन सिस्टम को सक्रिय करें। एक बार उत्तेजना समाप्त हो जाने के बाद, आगे उत्तेजना से बचने के लिए कैनुला को थोड़ा बढ़ाएं।
  6. आवश्यक के रूप में उत्तेजना दोहराएं। विभिन्न दवा यौगिकों का परीक्षण करने के लिए दबाव रिजेक्शन सिस्टम कैनुला बदलें।
  7. इस बात की पुष्टि करने के लिए कि केवल केशिकाओं को उत्तेजित किया जा रहा है, 1 μM NS309 समाधान के साथ कैनुला भरें और उपरोक्त चरणों को दोहराएं।
    नोट: केशिका एंडोथेलियल कोशिकाएं NS309 द्वारा सक्रिय K+ चैनलों को व्यक्त नहीं करती हैं, इसलिए धमनी को उत्तेजना का जवाब नहीं देना चाहिए। यदि आर्टेरियोल डिलेट्स करते हैं, तो कैनुला को फिर से तैनात करने की आवश्यकता होगी या छेद के व्यास को छोटा होना चाहिए (चित्रा 2ए, बी और प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें)।

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Representative Results

एंडोथेलियल स्मॉल-कंडक्टेंस (एसके) और इंटरमीडिएट-कंडक्टेंस (इरफान) सीए2 +-संवेदनशील कश्मीर+ चैनल पीए के व्यास पर दिलसे प्रभाव डालते हैं। 1 μM NS309, एक सिंथेटिक इरफान और एसके चैनल एगोनिस्ट के स्नान आवेदन, अधिकतम फैलाव के पास हुई(चित्रा 2ए, बी)। हालांकि, केशिका एंडोथेलियल कोशिकाओं में इरफान और एसके चैनलों की कमी है और NS30920के जवाब में हाइपरपोलार्फायर नहीं किया गया था। नतीजतन, उत्तेजित केशिका फोकल प्रेशर रिजेक्शन (20 एस, 5 साई) द्वारा 1 माइक्रोन NS309 के साथ समाप्त होता है अपस्ट्रीम आर्टेरियोलर फैलाव(चित्रा 2ए, बी)का कारण नहीं था । इस परिणाम से पता चलता है कि NS309 HiCaPA तैयारी में धमनी तक नहीं पहुंचा और दबाव इंजेक्शन द्वारा केशिकाओं पर लागू यौगिक के स्थानिक प्रतिबंध का आकलन करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस तैयारी को मौलिक रूप से केशिकाओं से पीए तक अंदर-बाहर विद्युत सिग्नलिंग के माप के लिए डिज़ाइन किया गया था। HiCaPA तैयारी का उपयोग करके, हमने केशिका सिरों पर 10 एमएम के+ युक्त एसीएसएफ लागू किया और एक अपस्ट्रीम आर्टेरियोलर फैलाव(चित्रा 2ए, सी)मापा जैसा कि हमने पहले कॉर्टिकल वास्कुलचर20से सीएपीए की तैयारी में किया था। हम तो जांच की, हमारे ज्ञान के लिए पहली बार के लिए, केशिका-से-arteriole बिजली के लिए महिला चूहों में HiCaPA तैयारी का उपयोग कर । 10 एमएम के+ के साथ केशिका उत्तेजना द्वारा पैदा किए गए आर्टेरियोलर फैलाव पुरुष और महिला चूहों(चित्रा 2ए, सी)से तैयारी के बीच अलग नहीं था।

अंत में, इस दृष्टिकोण का एक और मौलिक लाभ केशिका उत्तेजना से पहले स्नान में औषधीय उपकरण लागू करने की संभावना है। यहां हमने ML133 के प्रभाव का परीक्षण किया, जो हाल ही में विकसित किर2 अवरोधक28है। स्नान के लिए 10 μM ML133 के अलावा लगभग समाप्त केशिका-प्रेरित arteriolar फैलाव 10 mM कश्मीर + के जवाब में 10 mM कश्मीर+ दोनों पुरुष और महिला चूहों से HiCaPA तैयारी में(चित्रा 2ए, सी)। इस अंतिम परिणाम से पता चलता है कि Kir2.1 चैनल महिला मस्तिष्क वास्कुलचर में विद्युत संकेत मध्यस्थता के रूप में हम पहले पुरुष मस्तिष्क के कॉर्टिकल माइक्रोसर्कुलेशन में वर्णित है ।

Figure 1
चित्रा 1: माउस से हिप्पोकैम्पल केशिका-पैरान्चिमल आर्टेरियोल्स (HiCaPA) तैयारी के अलगाव और दबाव के लिए कार्यप्रणाली। (क)हौसले से अलग मस्तिष्क को इंटरफेमिस्फेरिक फिशर के बाद सजिटल विमान में आधे में काटा जाता है और मध्यदिशा की ओर से सामने रखा जाता है । (ख)हिप्पोकैम्पस को प्रकट करने के लिए थैलेसीमिया, पट और हाइपोथैलेमस को धीरे से हटा दिया जाता है । (ग)हिप्पोकैम्पस को सावधानी से हटा दिया जाता है। (डी)केशिका वृक्षों के साथ आर्टेरियोल्स हिप्पोकैम्पस से अलग हैं और आर्टेरियोलर सेगमेंट का एक छोर दबाव प्रणाली से जुड़े माइक्रोपाइपेट के साथ परिणय रूप से होता है, और दूसरा छोर होजाता है। केशिका सिरों को सील कर दिया जाता है और ग्लास पिपेट की नोक के साथ कवरस्लिप के खिलाफ बनाए रखा जाता है। आंतरिक व्यास धमनी के एक या कई क्षेत्रों में एक बढ़त का पता लगाने प्रणाली के साथ निगरानी की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: 1 μM NS309 के साथ केशिकाओं की फोकल उत्तेजना अपस्ट्रीम आर्टेरियोलर व्यास पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है, एएससीएफ के साथ उत्तेजना के विपरीत 10 mM K+युक्त । (A)अपस्ट्रीम आर्टेरियोलर व्यास की प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग 1 माइक्रोन NS309 के स्नान आवेदन के प्रभाव को दर्शाती है और उसके बाद लगातार केशिका के साथ उत्तेजना (20 एस, 5 साई) समाप्त होती है और एसीएसएफ के साथ किर2 चैनल अवरोधक ML133 की अनुपस्थिति या उपस्थिति में 10 मीटर केएम के + युक्त है। केशिकाओं पर 10 एमएम कश्मीर+ के आवेदन ने एक तेजी से अपस्ट्रीम आर्टेरियोलर फैलाव का उत्पादन किया जिसे 10 माइक्रोएम ML133 द्वारा अवरुद्ध कर दिया गया था। NS309 ने फैलाव का कारण नहीं बना । NS309 के साथ केशिका उत्तेजना के जवाब में अपस्ट्रीम आर्टेरियोलर फैलाव की अनुपस्थिति यह दर्शाती है कि दबाव से बाहर निकाले गए यौगिक आर्टेरियोल तक नहीं पहुंचते हैं। (ख)सारांश डेटा जिसमें स्नान में या केशिका सिरों पर या केशिका सिरों पर लागू 1 माइक्रोएम NS309 द्वारा प्रेरित व्यास परिवर्तन ों को दिखाया गया है (n = 14; ****पी एंड एलटी; 0.0001, बनती टी-टेस्ट)। (C)सारांश डेटा 10 एमएम कश्मीर+ द्वारा प्रेरित आर्टेरियोलर व्यास परिवर्तन दिखा सीधे HiCaPA तैयारी में केशिकाओं पर लागू पुरुष (n = 6) या महिला (n = 8) चूहों से पहले और बाद में 10 μM ML133 स्नान में लागू किया गया था (***पी & ०.०००५, n.s = nonतुच्छ, unpaired टी परीक्षण) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

वर्तमान पांडुलिपि में वर्णित दबाव हिकापा (हिप्पोकैम्पल केशिका-पैरान्चिमल आर्टेरियोल) तैयारी हमारी सुस्थापित प्रक्रिया का एक विस्तार है जो पैरान्चिमल आर्टेरियोल्स29को अलग-थलग करने, दबाव और अध्ययन करने के लिए है। हमने हाल ही में बताया कि मस्तिष्क केशिका एंडोथेलियल कोशिकाओं में Kir2.1 चैनल तंत्रिका सक्रियण से जुड़े [कश्मीर+]ओ में बढ़ जाती है, और एक आरोही हाइपरपोलार्राइजिंग संकेत उत्पन्न करते हैं जो अपस्ट्रीम आर्टेरियोल्स20को फैलाता है। केशिकाओं के लिए पहले से अप्रत्याशित भूमिका का खुलासा करते हुए कैपा तैयारी को कॉर्टिकल माइक्रोसर्कुलेशन20,21से विकसित करके संभव हो पाया है । यह पांडुलिपि एक समान प्रयोगात्मक दृष्टिकोण प्रस्तुत करती है लेकिन माउस मस्तिष्क की एक गहरी और अधिक प्रतिबंधित संरचना से न्यूरोवैस्कुलर युग्मन के दौरान केशिका-से-आर्टेरियोल सिग्नलिंग की जांच करने के लिए एक सरल और प्रजनन योग्य दृष्टिकोण का वर्णन करती है।

मस्तिष्क माइक्रोसर्कुलेशन अति कमजोर है और कुछ प्रथाओं, विशेष रूप से खींच और जहाजों की हैंडलिंग को कम करने, arterioles और केशिकाओं के अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । मायोजेनिक टोन का सहज विकास तैयारी की व्यवहार्यता30का पहला संकेतक है। एंडोथेलियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन एसके और आईके चैनल्स के एगोनिस्ट NS309 को स्नान समाधान में जोड़कर किया जा सकता है, जो अधिकतम फैलाव के पास होना चाहिए। NS309 के स्नान आवेदन के लिए टोन या प्रतिक्रिया विकसित करने में विफलता के मामले में, तैयारी को दूसरे के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। NS309 का उपयोग फोकल केशिका उत्तेजना के प्रसार का परीक्षण करने के लिए भी किया जाता है। क्योंकि केशिका एंडोथेलियल कोशिकाओं में एसके और आईके चैनलों की कमीहै 20,दबाव इंजेक्शन द्वारा केशिकाओं पर NS309 के स्थानीय वितरण का अपस्ट्रीम आर्टेरियोलर व्यास पर कोई प्रभाव नहीं होना चाहिए जैसा कि चित्र 2में प्रदर्शित किया गया है, यह दर्शाते हुए कि यौगिक गलती से आर्टिरियोल को उत्तेजित नहीं करते हैं। एक बार जब इन चरणों को मान्य किया जाता है, तो केशिका-से-आर्टेरियोल सिग्नलिंग का परीक्षण किया जा सकता है।

यहां हमने 10 एमएम के+युक्त एसीएसएफ के साथ केशिकाओं को उत्तेजित करके विद्युत सिग्नलिंग की जांच की । हालांकि, विभिन्न ज्ञात वैसोएक्टिव एजेंटों या न्यूरोट्रांसमीटर के साथ केशिकाओं को उत्तेजित करके वर्तमान दृष्टिकोण का उपयोग करके विभिन्न सिग्नलिंग तौर-तरीकों का पता लगाया जा सकता है। इस तैयारी का एक और लाभ जांच करने और अंततः विभिन्न जानवरों के बीच और विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच एनवीसी की तुलना करने की संभावना है। यह विशेष रूप से दिलचस्प है क्योंकि मस्तिष्क को मस्तिष्क की विकृतियों31,32से समान रूप से लक्षित नहीं किया जाता है । यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण की एक सामान्य सीमा यह है कि माइक्रोसर्कुलेशन को अलग करके, न्यूरोवैस्कुलर यूनिट के महत्वपूर्ण घटक, जैसे न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स, खो जाते हैं। अन्य तैयारी, जैसे कि वीवो सीबीएफ इमेजिंग में कपाल खिड़की, अक्षुण्ण न्यूरोवैस्कुलर इकाई की संरचना को बनाए रखते हैं और एक अक्षुण्ण प्रणाली में एनवीसी का अध्ययन करने के लिए अधिक उपयुक्त हैं। हालांकि, कपाल खिड़की की तैयारी में, पैरान्चिमल आर्टेरियोल विशिष्ट उपकरणों के बिना छवि करना मुश्किल है, जैसे मल्टीफोर्न माइक्रोस्कोप, और हिप्पोकैम्पस जैसे गहरे क्षेत्र, छवि के लिए मुश्किल बने हुए हैं। इस संबंध में, मस्तिष्क स्लाइस में मायोजेनिक टोन को प्रेरित करने के लिए चमकदार प्रवाह का उपयोग करके फिलोसा प्रयोगशाला में विकसित दृष्टिकोण मस्तिष्क के स्लाइस और वीवो दृष्टिकोण33के बीच एक सुरुचिपूर्ण कड़ी का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, आसपास के तंत्रिका ऊतक एक दवा के प्रवेश को सीमित कर सकते हैं, जो इसकी ऑफ-टारगेट क्षमता को बढ़ा सकता है और व्याख्याओं को मुश्किल बना सकता है, क्योंकि कई सेल प्रकार दवाओं के संपर्क में हैं। हमने मुख्य रूप से इन संभावित मुद्दों के समाधान के लिए अपने पूर्व वीवो दृष्टिकोण विकसित किए । निष्कर्ष में, एनवीसी का पूरी तरह से अध्ययन करने के लिए संयोजन के रूप में कई दृष्टिकोणों का उपयोग किया जाना चाहिए।

संक्षेप में, वर्तमान रिपोर्ट दबाव हिप्पोकैम्पस आर्टेरियोल और केशिकाओं की एक पूर्व वीवो बरकरार तैयारी का वर्णन करती है जो औषधीय और जैविक एजेंटों के प्रभावों को केशिका-आर्टेरियोल सातत्य के साथ असतत स्थितियों पर कार्यात्मक मापदंडों पर परीक्षण करने की अनुमति देती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि पर व्यावहारिक टिप्पणियों के लिए जुल्स मोइन का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस शोध को CADASIL से पुरस्कारों द्वारा वित्त पोषित किया गया था एक साथ हम आशा है कि गैर लाभ संगठन, महिला ओं के स्वास्थ्य और अनुसंधान के लिए केंद्र है, और NHLBI R01HL136636 (एफडी) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22µm Syringe Filters CELLTREAT Scientific Products 229751
12-0 Nylon (12cm) Black Microsurgery Instruments, Inc S12-0 NYLON
Automatic Temperature Controller Warner Instruments TC-324B
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm Sutter Instruments B120-69-10
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7030
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C3881
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767
Dissection Scope Olympus SZ11
ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head Ismatec ISM 1090
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Fine Scissors - Sharp Fine Science Tools 14063-09
Inline Water Heater Warner Instruments SH-27B
Integra™ Miltex™Tissue Forceps Fisher Scientific 12-460-117
KCl Sigma-Aldrich P9333
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M1880
MgCl Anhydrous Sigma-Aldrich M8266
Micromanipulator Narishige MN-153
ML 133 hydrochloride Tocris 4549
MOPS Sigma-Aldrich M1254
NaCl Sigma-Aldrich S9625
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich S8875
NS309 Tocris 3895
Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel Parker Hannifin 052-0500-900
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump Living Systems Instrumentation PS-200
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P3662
Super Fine Forceps Fine Science Tools 11252-20
Surgical Scissors - Sharp-Blunt Fine Science Tools 14001-13
Vertical Micropipette Puller Narishige PP-83

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References

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पूर्व वीवो दबाव हिप्पोकैम्पल केशिका-Parenchymal Arteriole कार्यात्मक अध्ययन के लिए तैयारी
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Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study. J. Vis. Exp. (154), e60676, doi:10.3791/60676 (2019).

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