Summary
Dieses Protokoll beschreibt die CryoAPEX-Methode, bei der ein APEX2-markiertes Membranprotein durch Transmissionselektronenmikroskopie innerhalb optimal konservierter Zell-Ultrastruktur lokalisiert werden kann.
Abstract
Wichtige zelluläre Ereignisse wie Signaltransduktion und Membranhandel sind auf die richtige Proteinposition in zellulären Kompartimenten angewiesen. Das Verständnis einer präzisen subzellulären Lokalisation von Proteinen ist daher wichtig, um viele biologische Fragen zu beantworten. Die Suche nach einem robusten Etikett zur Identifizierung der Proteinlokalisierung in Kombination mit einer angemessenen zellulären Konservierung und Färbung war historisch anspruchsvoll. Jüngste Fortschritte in der Elektronenmikroskopie (EM) haben zur Entwicklung vieler Methoden und Strategien zur Erhöhung der Zellerhaltung und Kennzeichnung von Zielproteinen geführt. Ein relativ neues peroxidasebasiertes genetisches Tag, APEX2, ist ein vielversprechender Marktführer bei klonbaren EM-aktiven Tags. Auch die Probenvorbereitung für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) hat sich in den letzten Jahren mit dem Aufkommen der Kryofixierung durch Hochdruckgefrieren (HPF) und Niedertemperatur-Dehydrierung und Färbung mittels Gefriersubstitution (FS) weiterentwickelt. HPF und FS bieten eine hervorragende Konservierung der zellulären Ultrastruktur für die TEM-Bildgebung, an zweiter Stelle nur zur direkten Kryo-Bildgebung von Glaskörperproben. Hier stellen wir ihnen ein Protokoll für die cryoAPEX-Methode vor, das die Verwendung des APEX2-Tags mit HPF und FS kombiniert. In diesem Protokoll wird ein Protein von Interesse mit APEX2 markiert, gefolgt von chemischer Fixierung und der Peroxidase-Reaktion. Anstelle der traditionellen Färbung und Alkoholaustrocknung bei Raumtemperatur wird die Probe kryokoniert und wird bei niedriger Temperatur über FS dehydriert und gefärbt. Mit kryoAPEX kann nicht nur ein von Interesse sinddes Protein in subzellulären Kompartimenten identifiziert werden, sondern auch zusätzliche Informationen in Bezug auf seine Topologie innerhalb einer strukturell erhaltenen Membran gelöst werden. Wir zeigen, dass diese Methode eine hohe Auflösung bieten kann, um Proteinverteilungsmuster innerhalb eines Organellelumens zu entschlüsseln und die Abschottung eines Proteins innerhalb einer Organelle in unmittelbarer Nähe zu anderen unbeschrifteten Organellen zu unterscheiden. Darüber hinaus ist cryoAPEX verfahrenstechnisch unkompliziert und für Zellen zugänglich, die in der Gewebekultur angebaut werden. Es ist technisch nicht anspruchsvoller als typische Cryofixations- und Gefriersubstitutionsmethoden. CryoAPEX ist weit verbreitet für die TEM-Analyse jedes Membranproteins, das genetisch markiert werden kann.
Introduction
Biologische Studien beinhalten oft Fragen der Lösung subzellulärer Proteinlokalisierung in Zellen und Organellen. Die Immunfluoreszenzmikroskopie bietet eine nützliche Ansicht der Proteinlokalisierung mit niedriger Auflösung, und die jüngsten Fortschritte in der Super-Resolution-Bildgebung schieben die Auflösungsgrenzen für fluoreszierend markierte Proteine1,2,3. Die Elektronenmikroskopie (EM) bleibt jedoch der Goldstandard für die Bildgebung hochauflösender zellulärer Ultrastruktur, obwohl die Kennzeichnung von Proteinen eine Herausforderung darstellt.
Historisch gesehen wurden mehrere EM-Methoden verwendet, um Fragen der ultrastrukturellen Proteinlokalisierung zu angehen. Eine der am häufigsten verwendeten Methoden ist die Immunelektronenmikroskopie (IEM), bei der antigenspezifische Primärantikörper verwendet werden, um das Protein von Interesse zu erkennen. EM-Signal wird durch die Anwendung von sekundären Antikörpern mit elektronendichten Teilchen konjugiert erzeugt, am häufigsten kolloidales Gold4,5. Alternativ können Antikörper, die mit Enzymen wie Pferderettichperoxidase (HRP) konjugiert sind, verwendet werden, um einen elektronendichten Niederschlag6,7,8zu erzeugen. Für IEM gibt es zwei Hauptansätze, die als Voreinbettung und Etikettierung nach dem Einbetten bezeichnet werden. Bei der Voreinbettung von IEM werden Antikörper direkt in Zellen eingebracht, was eine Lichtfixierung und Permeabilisierung der Zellen9,10,11erfordert. Beide Stufen können Ultrastruktur12,13beschädigen. Die Entwicklung von deutlich kleineren Antikörpern, bestehend aus einem Antikörper Fab-Fragment konjugiert mit 1,4 nm Nanogold ermöglicht sehr sanfte Permeabilisierungsbedingungen zu verwenden; Nanogold ist jedoch zu klein für die direkte Visualisierung unter TEM und erfordert zusätzliche Verbesserungsschritte, um sichtbar zu werden14,15,16. Bei der Nacheinbettung von IEM werden Antikörper auf dünne Zellabschnitte aufgetragen, die durch Fixierung, Dehydrierung und Einbettung in Harz vollständig verarbeitet wurden17. Während dieser Ansatz den Permeabilisierungsschritt vermeidet, ist die Erhaltung des Epitops von Interesse während der Probenvorbereitung eine Herausforderung18,19,20. Die Tokuyasu-Methode der Lichtfixierung, gefolgt von Gefrieren, Kryo-Sektionen und Antikörper-Erkennung bietet verbesserte Epitopkonservierung21,22. Die technischen Anforderungen der Kryo-Ultramikrotomie sowie der in der Zelle erreichte suboptimale Kontrast sind jedoch Nachteile23.
Die Verwendung von genetisch kodierten Tags beseitigt viele der Schwierigkeiten von IEM im Zusammenhang mit dem Nachweis des Proteins von Interesse. Eine Vielzahl von Tags sind verfügbar, einschließlich HRP, Ferritin, ReAsH, miniSOG und Metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Jede dieser Methoden hat Vorteile gegenüber früheren Methoden, aber jede hat auch Nachteile, die eine weit verbreitete Verwendung verhindern. Diese Nachteile reichen von der Inaktivität von HRP im Cytosol bis zur großen Größe des Ferritin-Tags, der Lichtempfindlichkeit von ReAsH und der geringen Größe und mangelnder Kompatibilität mit der zellulären Färbung von Metallothionein. Kürzlich wurde ein Protein aus Ascorbatperoxidase als EM-Tag mit dem Namen APEX233,34entwickelt. Als Peroxidase kann APEX2 die Oxidation von 3,3' Diaminobenzidin (DAB) katalysieren und einen Niederschlag erzeugen, der mit Osmiumtetroxid reagiert, um lokalen EM-Kontrast mit minimalem Em-Kontrast aus dem Protein von Interesse (weniger als 25 nm)33,35zu liefern. Im Gegensatz zu herkömmlichen HRP-basierten Methoden ist APEX2 extrem stabil und bleibt in allen Zellfächern aktiv33. Proben können für TEM mit traditionellen EM-Probenfärbungen und Methoden verarbeitet werden, die eine gute Visualisierung der umgebenden Strukturen33,34,36ermöglichen. Aufgrund seiner geringen Größe, Stabilität und Vielseitigkeit hat sich APEX2 als EM-Tag mit großem Potenzial herauskristallisiert.
Viele der oben diskutierten Ansätze können oder sind nicht mit dem aktuellen Stand der Technik in den Jahren ultrastrukturelle Konservierung, Kryofixation und Niedertemperatur-Gefriersubstitution kombiniert worden. So leiden sie unter einem Mangel an Membrankonservierung und/oder Zellfärbung, um eine genaue Proteinlokalisierung zu bestimmen. Dies schränkt notwendigerweise die Auflösung und Interpretation der erhaltenen Daten ein. Die Kryofixierung durch Hochdruckgefrieren (HPF) beinhaltet das schnelle Einfrieren von Proben in flüssigem Stickstoff bei hohem Druck (ca. 2.100 bar), was zu einer Verglasung statt kristalliner Bildung von wässrigen Proben führt und somit Zellen in einem nahezu nativen Zustand37,38,39. Auf HPF folgt die Gefriersubstitution (FS), eine Niedertemperatur-Dehydrierung (-90 °C) in Aceton in Kombination mit Inkubation mit typischen EM-Färbungen wie Osmiumtetroxid und Uranylacetat. HPF und FS bieten zusammen einen deutlichen Vorteil gegenüber der traditionellen chemischen Fixierung (ein längerer Prozess, der zu Artefakten führen kann) und Alkoholdehydrierung bei Raumtemperatur oder auf Eis (was zur Extraktion von Lipiden und Zuckern führen kann) und sind daher wünschenswert, mit den besten EM-Tags für die Proteindetektion zu kombinieren.
Ein Grund dafür, dass HPF/FS nicht mit der APEX2-Kennzeichnung kombiniert wurde, ist, dass die leichte chemische Fixierung eine Voraussetzung für die Peroxidase-Reaktion ist, die die Diffusion des DAB-Reaktionsprodukts begrenzt. In APEX2-Studien folgen bisher Fixierung und Peroxidase-Reaktion auf traditionelle EM-Methoden zur Färbung und Alkoholdehydrierung33,36. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die chemische Fixierung mit HPF/FS einen deutlichen Vorteil bei der Konservierung gegenüber der herkömmlichen chemischen Fixierung und Alkoholdehydrierung alleinbietet 40. Der Verlust der ultrastrukturellen Integrität, der in herkömmlichen TEM-Proben beobachtet wird, scheint weniger mit der Fixierung als mit der Dehydrierung verbunden zu sein, die typischerweise mit Alkohol bei Raumtemperatur oder auf Eis erfolgt und zur Extraktion von Lipiden und Zuckern führen kann40,41. Um die KryoAPEX-Methode zu entwickeln, vermuteten wir, dass chemische Fixierung und Peroxidase-Reaktion, gefolgt von HPF und FS, ein optimales Ergebnis in Bezug auf die ultrastrukturelle Konservierung produzieren würden.
Hier stellen wir das cryoAPEX-Protokoll vor, das APEX2-Tagging mit Cryofixation und Freeze-Substitutionsmethoden kombiniert (Abbildung 1). Dieses einfache Protokoll besteht aus der Transfektion eines APEX2-markierten Proteins von Interesse, der chemischen Fixierung von Zellen und der Peroxidase-Reaktion. HPF und FS werden dann durchgeführt, gefolgt von typischer Harzeinbettung und dünner Schnittung. DIE TEM-Bildgebung zeigt eine hervorragende Konservierung der Ultrastruktur mit dieser Methode. Zusätzlich wurden hochauflösende subzelluläre Lokalisation und räumliche Verteilung eines endoplasmatischen Retikulum (ER) Lumenalproteins beobachtet. Diese Methode ist weithin nützlich für den Nachweis der Membranproteinlokalisierung in Zellen für die Elektronenmikroskopie-Analyse. In unseren Händen hat die Methode erfolgreich für eine Vielzahl von Zelllinien in der Gewebekultur gewachsen, einschließlich HEK-293T (menschliche embryonale Niere), HeLa (menschlicher Gebärmutterhalskrebs), Cos7 (Afrikanische grüne Affen Nierenfibroblast) und BHK (Baby Hamster Niere). Detaillierte Anweisungen werden unten mit HEK-293T-Zellen beschrieben.
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Protocol
1. Zellkultur und Transfektion
- Saat HEK-293T-Zellen auf einer 60 mm Durchmesser oder größeren Gewebekulturschale und wachsen zu 60%–90% Zusammenfluss in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2.
- Transfektionszellen mit APEX2-markierten Säugetierexpressionsplasmiden mit Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle)nach den Anweisungen des Herstellers.
- Bei 12–15 h nach der Transfektion einmal Zellen mit Phosphat gepufferter Saline (PBS) waschen. Entfernen Sie Zellen aus der Schale durch sanftes Waschen mit PBS. Ein Dissoziationsreagenz wie Trypsin kann bei Bedarf für einen bestimmten Zelltyp verwendet werden. Zentrifuge bei 500 x g für 5 min, um ein Pellet zubilden.
2. Chemische Fixierung und Peroxidase-Reaktion
- Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und setzen Sie das Pellet in 2 ml 2% Glutaraldehyd (v/v) in 0,1 M Natriumkakodylatpuffer, pH 7,4, bei Raumtemperatur wieder auf. Probe auf Eis legen und 30 min inkubieren. Pellet die Probe bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Von diesem Punkt bis Schritt 2.3.3, halten Sie die Probe und Die Lösungen auf Eis, und zentrifugieren Sie zentrifugieren bei 4 °C.
VORSICHT: Sowohl Glutaraldehyd als auch Natriumkakodylatpuffer (arsenhaltiger) sind giftig. Bei der Handhabung sollten geeignete Sicherheitsvorkehrungen und persönliche Schutzausrüstungen verwendet werden. Lösungen, die Glutaraldehyd und/oder Natriumkacodylatpuffer enthalten, sollten als gefährliche chemische Abfälle entsorgt werden. - Waschen Sie das Pellet 3x für 5 min mit 2 ml 0,1 M Natrium-Cacodylat-Puffer. Für diese sowie nachfolgende Wähungen das Zellpellet in der gewünschten Lösung vorsichtig wieder aufsetzen, dann 5 min bei 500 x g zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen und entsorgen. Bei den wiederholten Pellet- und Resuspensionsschritten ist Vorsicht geboten, um den Probenverlust zu minimieren.
- Durchführung der Peroxidase-Reaktion
- Bereiten Sie eine frische Lösung mit 1 mg/ml 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) in 0,1 M Natrium-Cacodylat-Puffer vor. Lösen Sie den DAB durch kräftiges Wirbeln für 5-10 min auf.
VORSICHT: DAB ist giftig und potenziell krebserregend und sollte mit geeigneten Sicherheitsverfahren und persönlicher Schutzausrüstung behandelt werden. Lösungen, die DAB enthalten, sollten als gefährliche chemische Abfälle behandelt werden. - Pellet waschen durch Wiederaussetzung in 3 ml DAB-Lösung, gefolgt von Pelletbei 500 x g für 5 min.
- Setzen Sie das Pellet in 3 ml DAB-Lösung, der Wasserstoffperoxid zugesetzt wurde, wieder auf, um eine Endkonzentration von 5,88 mM zu erreichen. Inkubieren Sie für 30 min bei Raumtemperatur. Das Pellet wird sichtbar braun gefärbt, was auf das Vorhandensein des unlöslichen DAB-Reaktionsprodukts hinweist.
HINWEIS: Die DAB-Inkubationszeit muss möglicherweise für jedes Beispiel optimiert werden. Der Farbwechsel kann am Lichtmikroskop überwacht werden. Unserer Erfahrung nach ist eine 15-45 min Inkubation für die meisten Proteine ausreichend. Wasserstoffperoxid sollte aus einer frisch geöffneten Flasche oder einer Flasche gewonnen werden, die nach dem Öffnen gut versiegelt gehalten wurde. - Pellet die Zellen, dann waschen 2x für 5 min mit 0,1 M Natrium-Cacoylatpuffer, gefolgt von einer Wäsche in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) oder Zellmedium der Wahl.
- Bereiten Sie eine frische Lösung mit 1 mg/ml 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) in 0,1 M Natrium-Cacodylat-Puffer vor. Lösen Sie den DAB durch kräftiges Wirbeln für 5-10 min auf.
- Setzen Sie das Zellpellet in 500 l einer kryoschützenden Lösung von DMEM (oder anderen Zellmedien der Wahl) mit 10% fetalem Rinderserum und 15% Rinderserumalbumin wieder auf. Pellet wieder, leicht erhöhung der Zentrifugengeschwindigkeit von 500 x g, wenn erforderlich, um ein Pellet in der dicken kryoschützenden Lösung zu erreichen. Entsorgen Sie den Großteil des Überstandes, um sicherzustellen, dass genügend Flüssigkeit übrig bleibt, damit das Pellet nicht austrocknet. Transportieren Sie das Zellpellet zum Hochdruckgefriergerät.
3. Hochdruck-Gefrieren
- Füllen Sie das Hochdruck-Gefrierreservoir mit flüssigem Stickstoff (LN2) und starten Sie die Pumpe, um die Probenkammer mit LN2zu füllen.
VORSICHT: Verwenden Sie bei der Arbeit mit flüssigem Stickstoff geeignete Sicherheitsverfahren und persönliche Schutzausrüstung.
HINWEIS: Diese Schritte sind spezifisch für den Leica EMPACT2 Hochdruck-Gefrierschrank. - Entfernen Sie alle verbleibenden Flüssigkeiten aus dem Zellpellet mit der Ecke eines Labortuchs oder Papiertuchs. Genügend Flüssigkeit sollte bleiben, dass das Pellet eine Paste bildet, die in der Konsistenz der Zahnpasta ähnelt. Es sollte dünn genug sein, um in eine 20-L-Pipettenspitze angesaugt zu werden.
- Aspirieren Sie 2–3 l des Zellpellets und legen Sie es auf einen Membranträger ab. Füllen Sie den Brunnen des Membranträgers vollständig, so dass die Oberflächenspannung eine leichte Kuppel auf der Oberseite erzeugt, aber die Flüssigkeit nicht aus dem Brunnen ausläuft. Es sollten keine Luftblasen vorhanden sein.
- Schieben Sie den Membranträger in die Patrone und sichern Sie sie. Legen Sie die Patrone in die vorbereitete und grundierte HPF-Maschine, und drücken Sie Start to freeze.
- Prüfen Sie die Temperatur vs. Zeit und Druck vs. Zeitdiagramme, um sicherzustellen, dass der Druck 2100 bar und die Temperatur -196 °C innerhalb von 200 ms erreicht wurde, und beide Parameter blieben für die 600 ms der Messung konstant.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.5, bis das Zellpellet verwendet oder die gewünschte Anzahl von Proben eingefroren wurde.
- Halten Sie die Patronen in LN2eingetaucht, entfernen Sie jeden Membranträger aus ihrer Patrone, legen Sie ihn in eine Plastikkapsel und legen Sie die Plastikkapsel in eine Kryo-Vial voller LN2.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Kryo-Fläschchen mit Proben können in einem LN 2-Dewar in Kryo-Canes oder Kryo-Boxen gelagert werden.
4. Einfrieren der Substitution
VORSICHT: Verwenden Sie bei der Arbeit mit flüssigem Stickstoff geeignete Sicherheitsverfahren und persönliche Schutzausrüstung. Zusätzlich, viele der Chemikalien in Schritt 4 verwendet werden, sind giftig, einschließlich Tanninsäure, Osmiumtetroxid, und Uranylacetat. Diese Chemikalien müssen nach geeigneten Sicherheitsvorkehrungen behandelt und als gefährliche chemische Abfälle entsorgt werden.
- Füllen Sie die automatische Gefriersubstitutionseinheit mit LN2. Bringen Sie die Temperatur auf -90 °C.
- Bereiten Sie FS Mix 1 vor und beginnen Sie FS.
- In einer chemischen Haube eine Lösung von 0,2% Gerinnsäure (w/v) und 5% DI-Wasser in Aceton und Aliquot 1 ml pro Probe in Kryo-Fläschchen zubereiten. Legen Sie in LN2 ein, um einzufrieren.
- Legen Sie die FS Mix 1 Fläschchen und die Kryo-Fläschchen mit den gefrorenen Zellpellets in die Probenkammer der FS-Einheit. Übertragen Sie die innere Kapsel, die den Membranträger aus der LN 2-Durchstechflasche enthält, in die entsprechende Durchstechflasche mit FS Mix 1.
- Starten Sie ein FS-Protokoll mit einem ersten Schritt von 24 h bei -90°C. Nach 24 h die FS anhalten und die Proben 3x 5 min mit aceton, das auf -90 °C abgekühlt wurde, waschen.
- Vorbereiten von FS Mix 2 und komplettem FS
VORSICHT: Osmiumtetroxid ist eine hochgiftige und oxidierende Chemikalie, die nur von geschulten Personen nach etablierten Sicherheitsprotokollen behandelt werden sollte. Es sind Protokolle für die Lagerung und Entsorgung osmiumhaltiger Lösungen sowie die Kennzeichnung von Laborbereichen, in denen Osmiumtetroxid verwendet wird, zu beachten. Osmiumtetroxid sollte in einer chemischen Kapuze mit persönlicher Schutzausrüstung einschließlich Augenschutz, einem Labormantel mit vollem Armschutz, doppelten Nitrile-Handschuhen und einem optionalen Beatmungsgerät behandelt werden.- In einer chemischen Haube eine Lösung von 1% Osmiumtetroxid, 0,2% Uranylacetat und 5% DI-Wasser in Aceton zubereiten. Aliquot 1 ml pro Probe in Kryo-Fläschchen und legen Sie in LN2 ein.
HINWEIS: Stocklösungen von Tanninsäure (10% w/v in Aceton), Osmiumtetroxid (10% w/v in Aceton) und Uranylacetat (8% w/v in Methanol) können in Kryo-Fläschchen in einem LN 2-Dewar hergestellt und gelagert werden, um die Herstellung von FS-Mischungen zu erleichtern. - Legen Sie die Kryo-Fläschchen mit FS Mix 2 in die FS-Einheit und übertragen Sie die Kapseln vom dritten Aceton-Waschmittel in die FS Mix 2-Fläschchen. Inkubieren in FS Mix 2 für 72 h bei -90 °C, gefolgt von einer allmählichen Erwärmung auf 0 °C über 12-18 h.
- In einer chemischen Haube eine Lösung von 1% Osmiumtetroxid, 0,2% Uranylacetat und 5% DI-Wasser in Aceton zubereiten. Aliquot 1 ml pro Probe in Kryo-Fläschchen und legen Sie in LN2 ein.
- Halten Sie die Temperatur bei 0 °C und waschen Sie 3x 30 min mit vorgekühltem Aceton aus einer frisch geöffneten Flasche.
5. Harzinfiltration und Einbettung
VORSICHT: Das hier verwendete Harz (siehe Materialtabelle) ist vor der Polymerisation giftig und sollte mit geeigneten Sicherheitsverfahren und persönlicher Schutzausrüstung behandelt werden. Jedes nicht polymerisierte Harz sollte als gefährlicher chemischer Abfall entsorgt werden.
- Infiltrieren Sie die Proben mit zunehmenden Harzkonzentrationen, die in Aceton aus einer neu geöffneten Flasche gelöst werden. Bereiten Sie eine Mischung aus den Harzkomponenten A, B und D in einem Kunststoffbecher gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und brüten Sie Proben in den folgenden Harzkonzentrationen: 2%, 4% und 8% für je 2 h bei 0 °C. Inkubieren Sie in 15%, 30%, 60%, 90% und 100% Harz für jeweils 4 h bei Raumtemperatur. 4 h in einer Mischung der Komponenten A, B, C und D inkubieren.
- Die Membranträger mit Zellpelletseite in flache Einbettformen legen und mit Harz (A, B, C und D) füllen. Papieretiketten für die Proben können zu diesem Zeitpunkt den Brunnen hinzugefügt werden.
- Im Ofen bei 60 °C für 24-36 h polymerisieren.
HINWEIS: Das Protokoll kann nach der Polymerisation angehalten werden. - Entfernen Sie die Blöcke aus der Form und lassen Sie abkühlen. Um den Membranträger zu entfernen, platzieren Sie zuerst die Probe in das vertikale Futter des Ultramikrotom, wo sie mit Vergrößerung visualisiert werden kann. Trennen Sie den Membranträger vom Block durch eine Kombination aus dabbing flüssigem Stickstoff auf dem Membranträger, um das Metall vom Kunststoff zu trennen, und verwenden Sie eine Rasierklinge, um das Harz um den Membranträger zu zerschipen. Heben Sie bei Trennung den Membranträger vorsichtig ab und lassen Sie die Zellpelletkuppel auf der Fläche des Blocks zurück.
- Platzieren Sie den Block mit dem freiliegenden Zellpellet nach oben in einer flachen Einbettform, die etwas tiefer als die erste Form ist, und füllen Sie ihn mit Harz. Bei 60 °C für 24–36 h polymerisieren.
HINWEIS: Das Protokoll kann nach der Polymerisation angehalten werden.
6. Schnitt
- Schneiden Sie den Block um das Zellpellet mit einer Rasierklinge. Legen Sie dann den Block in das Probenfutter auf den Schnittarm eines Ultramikrotomes. Mit einem Glas- oder Diamantmesser den Block in eine trapezförmige Form schneiden, die das Zellpellet dicht umgibt.
- Erhalten Sie 90 nm ultradünne Abschnitte des Zellpellets mit einem Glas- oder Diamantmesser.
- Nehmen Sie ein Band von Abschnitten auf einem TEM-Raster auf. Formvar-beschichtete Kupferschlitzgitter (1 x 2 mm2 Steckplatz) sind nützlich für die Abbildung von seriellen Profilen. Trocknen Sie das Gitter, indem Sie die Kante auf ein Stück Filterpapier bichen, und lagern Sie es in einer TEM-Gitteraufbewahrungsbox.
HINWEIS: Das Protokoll kann nach dem Abschnitt angehalten werden.
7. TEM Imaging
- Montieren Sie das Gitter am TEM-Halter und legen Sie es in das Mikroskop. Wir verwenden routinemäßig einen Tecnai T12 bei 80 kV zum Screening von KryoAPEX-Proben. Erfassen Sie Bilder von Zellen und subzellulären Strukturen von Interesse mit APEX2-Beschriftung.
- Auf Wunsch erhalten Sie zusätzlichen Membrankontrast durch die Verwendung von Bleinachfärbung. Siehe Abbildung 2 für den Vergleich von nicht nachgefärbten Proben(Abbildung 2I–K) und Bleinachgefärbten(Abbildung 2A–H).
- Trockengitter abschnittsseitig auf einen Tropfen verdünnter Natriumchloridlösung (ca. 1,5 mM), 2x für je 1 min, dann 1x für 10 min.
- FloatGitter auf einem Tropfen von Sato Bleilösung für 1 min. Waschen durch Schwimmen auf Natriumchlorid-Lösung 3x für 1 min, dann auf DI-Wasser 3x für 1 min. Überschüssige Flüssigkeit aus den Gittern bloten und in einer Gitterbox speichern.
VORSICHT: Blei ist eine giftige Chemikalie und sollte mit geeigneten Sicherheitsverfahren und persönlicher Schutzausrüstung behandelt werden. Bleihaltige Lösungen sollten als gefährliche chemische Abfälle entsorgt werden.
- Bild post-gefärbte Proben auf dem TEM.
HINWEIS: Bei der traditionellen Probenvorbereitung für TEM wird der Bleikontrastschritt vor der TEM-Bildgebung durchgeführt. Es wird jedoch empfohlen, dass bei kryoAPEX-Proben zuerst die Bildgebung an nicht kontrastreichen Proben durchgeführt wird. Dadurch wird sichergestellt, dass das Signal des Tags durch seinen starken Kontrast zu den leichter gefärbten Zellstrukturen leicht lokalisiert werden kann. Für viele Proben ist keine weitere Färbung erforderlich; Wenn jedoch ein zusätzlicher Membrankontrast gewünscht wird, kann eine Bleinachfärbung durchgeführt werden (Schritt 7.2) und die Probe neu abgebildet werden.
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Representative Results
Um die ultrastrukturelle Konservierung mit der CryoAPEX-Methode mit der traditionellen Fixierung und Dehydrierung zu vergleichen, haben wir Proben vorbereitet, in denen eine endoplasmatische Retikulummembran (ERM; ER-Membran) Peptid wurde mit APEX2 markiert und in HEK-293T-Zellen transfiziert. ERM-APEX2 lokalisiert die zytoplasmatische Fläche des ER und baut die ER-Struktur in morphologisch unterschiedliche Strukturen um, die als organisierte glatte ER (OSER)34,42,43bekannt sind. Die OSER-Morphologie umfasst Regionen mit glatten, parallelen, dicht gestapelten Membranen, die als optimale Region dienen, um die ultrastrukturelle Konservierung zu vergleichen. Die Herstellung der Probe nach herkömmlichen APEX-Methoden führte zu einer klaren Kennzeichnung von OSER-Strukturen (Abbildung 2A–D). Bei der Untersuchung bei hoher Vergrößerung traten die gestapelten Membranen rüpelhaft auf und es entstanden ungleichmäßige Lücken zwischen konzentrischen Membrandichten, was auf eine schlechte Membrankonservierung und Lipidextraktion hindeutet (Abbildung 2D). Die von cryoAPEX erstellte Probe hatte auch eine klar definierte Kennzeichnung von OSER-Strukturen; die Membranen waren jedoch glatt und parallel, und es wurde kaum bis gar keine Lipidextraktion beobachtet (Abbildung 2E-H). Die Ergebnisse von cryoAPEX waren von ähnlich hoher Qualität wie die ergebnisse einer Probe, die HPF/FS ohne zusätzliche chemische Fixierung und APEX2/DAB-Reaktionsschritte unterzogen wurde (Abbildung 2I–K).
Neben der optisch spürbaren Membrankonservierung bewahrt die CryoAPEX-Methode das Protein von Interesse, so dass in einigen Fällen Aspekte der Proteinverteilungsmuster beobachtet werden können. Um diesen Punkt zu veranschaulichen, verwendeten wir ein anderes ER-lokalisiertes Protein, Huntingtin Hefe interagierendes Protein E (HYPE). HYPE ist ein Membranprotein auf der Leuchtfläche der ER-Membran 44,45,46,47. HYPE-APEX2-Konstrukte wurden in HEK-293T-Zellen überexprimiert. Die TEM-Analyse von 90 nm dünnen Abschnitten ergab, dass HYPE im gesamten peripheren ER sowie in der kerntechnischen Hülle vorhanden war (Abbildung 3A,B). Zusätzlich konnte die HYPE-Dichte entlang der lumenalen ER-Membran in regelmäßig verteilte Brennpunkte aufgelöst werden(Abbildung 3C, Pfeile). HYPE Verteilung und Brennpunkte waren auch in einer Probe mit traditioneller Fixierung und Dehydrierung vorbereitet sichtbar; jedoch waren umfangreiche Membranstörungen und Extraktionen vorhanden, was die Probe suboptimal machte (Abbildung 3D,E).
Um die robuste Organellar-Spezifität und Anwendbarkeit der CryoAPEX-Methode für eine Reihe von markierten Proteinen zu demonstrieren, haben wir apEX2-Kennzeichnung mit drei zellulären Markern durchgeführt. Mitochondrien wurden mit Mito-V5-APEX234gekennzeichnet. Dieser Marker der mitochondrialen Matrix lieferte nur eine spezifische Färbung von Mitochondrien (Abbildung 4A). Ebenso haben wir die Plasmamembrankennzeichnung mit CAAX-APEX234bewertet, die nur eine deutliche Färbung der Plasmamembran erzeugte(Abbildung 4C). Bei intrazellulären Organellen wurde keine Kennzeichnung beobachtet (Abbildung 4C). Zusätzlich haben wir ein neues Konstrukt als Marker für das Golgi-Lumen geschaffen, indem wir die ersten 118 Aminosäuren der Maus-Isoform von '-mannosidase mit dem APEX2-Gen48verschmelzen. Das resultierende MannII-APEX2 wurde vorübergehend in Zellen transfiziert, die anschließend mit der CryoAPEX-Methode hergestellt wurden. Gefärbte Golgi-Stacks waren deutlich von den umgebenden Organellen zu unterscheiden (Abbildung 4B). Einzelne Stapel, Zisternen und einige Vesikel wurden beschriftet, typisch für Golgi Färbung (Abbildung 4B). Insgesamt zeigen diese Marker, dass die CryoAPEX-Methode eine spezifische Kennzeichnung von Membranproteinen in verschiedenen Organellen mit einer hohen Auflösung ermöglicht, um sie von umgebenden subzellulären Strukturen zu unterscheiden.
Abbildung 1: Schematische Der wesentlichen Schritte im CryoAPEX-Protokoll. (A) Zellen werden mit einem APEX2-Plasmid angebaut und transfiziert. (B) Die Zellen werden pelletiert und mit Glutaraldehyd fixiert, gefolgt von (C) Inkubation mit DAB und Wasserstoffperoxid zur Herstellung des Peroxidase-Reaktionsprodukts. (D) Das Pellet wird durch HPF, (E) gefriert durch Schwermetalle und Aceton ersetzt und (F) in Harz eingebettet. Dünne Abschnitte werden auf dem Mikrotom gesammelt. (G) DIE TEM-Bildgebung wird durchgeführt und ein zusätzlicher Kontrast kann durch Nachfärbung hinzugefügt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Vergleich der OSER-Membrankonservierung mit traditioneller chemischer Fixierung, KryoAPEX und HPF/FS. Die reorganisierte ER-Morphologie in chemisch fixierten, DAB-exemitten Zellen, die durch traditionelle chemische Fixierung und Alkoholdehydrierung (A-D) oder durch KryoAPEX (E-H) verarbeitet wurden, wurde mit ERM-APEX2-exemitten Zellen verglichen, die live und ohne die DAB-Reaktion (I-K) kryokoniert wurden. Die lebenden kryokonfixen Zellen stellen die am besten erreichbare ultrastrukturelle Konservierung dar und dienen hier als Metrik für die Bewertung der Membrankonservierung, die über die beiden APEX-basierten Detektionsprotokolle (A–H) erhalten wurde. Das gleichmäßige parallele Lamellenstapeln der ER-abgeleiteten Membranen, die durch CryoAPEX (exemplarisch in den Paneelen G und H) gewonnen werden, im Gegensatz zu den mit herkömmlichen Methoden gewonnenen Rüschenmembranen (Panels C und D), unterstreicht die überlegene Membrankonservierung, die durch cryoAPEX erzielt wird. Diese Zahl wurde von Sengupta et al. 201948geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die Proteinlokalisierung eines APEX2-markierten ER-Membranproteins kann in periodische Brennpunkte aufgelöst werden. (A) Ein Bild eines dünnen Abschnitts einer HEK-293T-Zelle, die HYPE-APEX2 exdrückt und von cryoAPEX verarbeitet wird, zeigt die Färbung des ER in einem gut erhaltenen (dichten) zytoplasmatischen Hintergrund (B,C). Höhere Vergrößerungsbilder eines kleinen Abschnitts des peripheren ER (abgegrenzt durch gelbe Sa in A und gezeigt in B, mit weiterer Vergrößerung des roten Kastens in B in C) zeigt periodische Brennpunkte der APEX2-generierten Dichte (B, roter Kasten und C, weiße Pfeilspitzen, die Periodizität zwischen den HYPE-Brennpunkten zeigen). (D) Das Bild eines dünnen Teils einer Zelle, die HYPE-APEX2 exdrückt und durch traditionelle chemische Fixierung und Dehydrierung hergestellt wird, zeigt eine spezifische Färbung des kortikalen ER und der Kernhülle (rote Pfeile). (E) Bei einer höheren Vergrößerung waren periodische HYPE-spezifische Brennpunkte innerhalb von Abschnitten des ER (gelbe Box und weiße Pfeilköpfe im Einbau) trotz umfangreicher Membranstörungen, die durch rote Pfeile gekennzeichnet waren, sichtbar. NE = Nuklearhülle. Diese Zahl wurde von Sengupta et al. 201948geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Organelle-Marker zeigen spezifität des Signals, das von APEX2-markierten Proteinen erhalten wurde. APEX2-markierte Proteinkonstrukte zur Lokalisierung in die mitochondriale Matrix (Mito-V5-APEX2; in A)oder die Golgi-Lumen (-mannII-APEX2; gezeigt in B) oder die Plasmamembran (CAAX-APEX2; in C)wurden vorübergehend in HEK293-Zellen exprimiert und die mit CryoAPEX verarbeiteten Proben verarbeitet. Jedes Konstrukt ergab organelle spezifische Dichten. Vergrößerte Ansichten von zwei Abschnitten (gelbe oder rote Felder) aus den Zellen, die den Typ "MannIIAPEX2" (Panel B) oder CAAX-APEX2 (Panel C)exdrücken, werden angezeigt. Diese Zahl wurde von Sengupta et al. 201948geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das hier vorgestellte KryoAPEX-Protokoll bietet eine robuste Methode, um die Lokalisierung von Membranproteinen in der zellulären Umgebung zu charakterisieren. Die Verwendung eines genetisch kodierten APEX2-Tags ermöglicht nicht nur eine präzise Lokalisierung eines Proteins von Interesse, sondern die Verwendung von Kryofixation und Niedertemperatur-Dehydrierung bietet eine hervorragende Konservierung und Färbung der umgebenden zellulären Ultrastruktur. Kombiniert sind diese Ansätze ein leistungsfähiges Werkzeug, um ein Protein mit hoher Präzision in seinem subzellulären Kontext zu lokalisieren.
Der Kern der Weiterentwicklung dieser Methode ist die Tatsache, dass der Verlust der Ultrastruktur nach der Vorbereitung durch traditionelle TEM-Methoden in erster Linie aus dem Dehydrierungsschritt und nicht aus dem Fixierungsschritt40resultieren. Früher wurde angenommen, dass peroxidase-basierte Methoden mit HPF/FS nicht kompatibel sind, da sie eine chemische Fixierung vor der Peroxidase-Reaktion erfordern. Um dies zu umgehen, wurde vor kurzem ein Protokoll namens CryoCHEM entwickelt, in dem Proben zunächst kryofixiert werden, gefolgt von Rehydratation und der Peroxidase-Reaktion49. Dieser Ansatz bietet eine hervorragende Ziellokalisierung mit signifikanten Verbesserungen bei der Probenfärbung und -konservierung. Es hat sich als nützlich für Gewebeproben und in Fällen erwiesen, in denen korrelative Fluoreszenz und Elektronenmikroskopie gewünscht ist. Parallel zu cryoCHEM kombiniert unsere Methode Die Glutaraldehydfixierung mit HPF und FS. CryoAPEX bietet ein optimiertes Protokoll, das auch bei kleinen Zellproben effektiv funktioniert.
Der Zugang zu Hochdruck-Gefrier- und Gefriersubstitutionsinstrumenten ist für die cryoAPEX-Methode von entscheidender Bedeutung. Diese Instrumente und Fähigkeiten sind in EM-Einrichtungen immer häufiger. Auch wenn HPF- und FS-Ausrüstung nicht ohne weiteres verfügbar sind, ist die chemisch fixierte Probe stabil genug für eine kurze Zeit, um bescheidene Entfernungen40zu transportieren. Wir haben herausgefunden, dass Proben nach der DAB-Reaktion bei 4 °C mindestens 48 Stunden vor HPF ohne signifikanten Qualitätsverlust gelagert werden können. Ein weiterer kritischer Aspekt des cryoAPEX-Protokolls ist die Einbeziehung von Kontrollen, die für ein robustes Experiment und überzeugende Ergebnisse unerlässlich sind. Proben, die durch transiente Transfektion mit einer Effizienz von weniger als 100 % hergestellt werden, enthalten negative Kontrollzellen sowie beschriftete Zellen innerhalb derselben Probe. Bei Verwendung von Zelllinien mit stabiler ApEX2-Expression sollte eine separate Negativkontrolle durch Transfektion von Zellen mit dem nicht APEX2-markierten Protein von Interesse hergestellt werden. Mehrere Konstrukte, die als Organellar-Steuerelemente dienen können, sind über Addgene verfügbar, und veröffentlichte Bilder sind in dieser und anderen Publikationen verfügbar, die für die Überprüfung33,34,36,48verwendet werden können. Martell et al.36 haben eine eingehende Diskussion über die experimentelle Planung und Verifizierung neuer APEX2-Fusionskonstrukte zur Verfügung gestellt.
Während cryoAPEX im Großen und Ganzen für den Nachweis von Membranproteinen nützlich ist, gibt es einige Einschränkungen. Obwohl APEX2 ein kleines 28 kDa Protein ist, können einige Proteine das Tag33,34möglicherweise nicht integrieren. APEX2 gilt aufgrund des diffusen Reaktionsprodukts33,36als nicht nützlich für die Kennzeichnung löslicher Proteine im Cytosol. Darüber hinaus stellt der Nachweis kleiner Mengen Protein eine Herausforderung aufgrund des Vorhandenseins von Färbungen in der umgebenden Zelle dar. Die Zubereitung durch HPF und FS bewahrt zelluläre Komponenten, die durch traditionelle Fixierung und Dehydrierung extrahiert werden. Dies führt zu einer insgesamt dunkleren Färbung in der Zelle, die möglicherweise mit niedrigen APEX2-Kennzeichnungen konkurriert.
Die KryoAPEX-Technik ist weithin auf viele Proteine anwendbar, mit einer begrenzten Anzahl von Schritten, die eine Optimierung erfordern können. Erstens müssen aufgrund der individuellen Variabilität zwischen Proteinen möglicherweise der Proteinexpressionsgrad und/oder die DAB-Reaktionszeit angepasst werden, damit das Signal über der Hintergrundfärbung der Zelle visualisiert werden kann. Hilfreiche Informationen und Protokolle zur Validierung neuer APEX2-Fusionskonstrukte und zur Optimierung der Expression und DAB-Färbung werden von Martell et al.36 aus zellulärer Färbungsperspektive bereitgestellt, das FS-Protokoll und/oder Chemikalien müssen möglicherweise für eine optimale Visualisierung verschiedener Organellenmembranen innerhalb verschiedener Zelltypen, Gewebe oder Organismen50,51,52,53,54angepasst werden. Nach unserer Erfahrung haben die hier vorgestellten FS-Bedingungen für eine Vielzahl von Säugetierzelllinien gut funktioniert.
Der hybride Ansatz von cryoAPEX hat das Potenzial, auf viele andere genetische Etikettierungstechniken angewendet zu werden. Der Ersatz der traditionellen Alkoholdehydrierung durch HPF/FS dürfte die ultrastrukturelle Konservierung und die Proteinlokalisierungsinformationen erheblich verbessern. Die Verwendung von Saphirscheiben als Zellsubstrat zur Fixierung von Zellen als Monoschicht verbessert die Erhaltung der Zellperipherie, einschließlich des Zytoskeletts und der Zell-Zellkontakte. Für die Verwendung von Saphir-Scheiben wären geringfügige Änderungen am Protokoll erforderlich. Die APEX-Technologie kann verwendet werden, um grüne fluoreszierende Proteine (GFP) mit getaggten Proteinen über ein GFP-bindendes Peptid35zu erkennen. Diese indirekte Methode der Detektion eröffnet das Potenzial, APEX-Technologie für die unzähligen Proteine zu nutzen, die bereits mit GFP markiert sind. Die kürzlich eingeführte Split APEX2 wird für Näherungs- und Interaktionsstudien von Vorteilsein 55. Darüber hinaus können bestehende HRP-basierte Methoden mit HPF/FS kombiniert werden, um die Zellerhaltung zu verbessern. Ein Beispiel ist fluorescent indicator und peroxidasie zur P-Recipitation mit EM resolution (FLIPPER), bei der einzelne Zellmarker sowohl mit einem fluoreszierenden Tag als auch mit HRP verschmolzen wurden, was Lumenmarker für Golgi oder ER56liefert. Die Verwendung verbesserter Peroxidase-Substrate anstelle von DAB ist auch mit dieser Methode möglich, einschließlich Substraten, die für die RNA-Kennzeichnung optimiert sind 57. CryoAPEX bietet auch die in-Zell-Etikettierung und ultrastrukturelle Konservierung, die für die dreidimensionale Analyse der Proteinverteilung durch Elektronentomographie und möglicherweise bei hohen Volumina durch SBF-SEM oder FIB-SEM48,58erforderlich sind.
Insgesamt ist CryoAPEX eine robuste Methode mit breiter Anwendbarkeit. Prinzipiell kann es auf jedes Membranprotein angewendet werden, sei es im Lumenalraum einer Organelle, auf dem zytoplasmatischen Gesicht, in Vesikeln, auf der Plasmamembran der Zelle oder sogar im extrazellulären Raum. Für diese große Auswahl an Membranproteinen bietet die cryoAPEX-Methode das Potenzial, die Lokalisierung und Verteilung eines Proteins in seinem subzellulären Kontext genau zu sehen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Das hier beschriebene Protokoll geht auf eine Veröffentlichung von Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48zurück. Diese Arbeit wird unterstützt durch die Stipendien R01GM10092 (zu S.M.) und AI081077 (R.V.S.) von den National Institutes of Health, CTSI-106564 (zu S.M.) vom Indiana Clinical and Translational Sciences Institute und PI4D-209263 (to S.M.) vom Purdue University Institute for Inflammation, Immunology, and Infectious Disease.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637-1G | |
| Acetone (Glass Distilled) | Electron Microscopy Sciences | 10016 | |
| Beakers; Plastic, Disposable 120 cc | Electron Microscopy Sciences | 60952 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| Cryogenic Storage Vials, 2 mL | VWR | 82050-168 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin | Sigma-Aldrich | 44611-500ML | |
| Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 | Sigma-Aldrich | 44612-500ML | |
| Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) | Sigma-Aldrich | 44613-100ML | |
| Durcupan ACM Fluka,single component D | Sigma-Aldrich | 44614-100ML | |
| Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
| Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm | Electron Microscopy Sciences | 70900 | |
| Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement | Corning | 355104 | |
| Glass Knife Boats, 6.4 mm | Electron Microscopy Sciences | 71008 | |
| Glass Knifemaker | Leica Microsystems | EM KMR3 | |
| Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
| HEK 293 Cells | ATCC | CRL-1573 | |
| High Pressure Freezer with Rapid Transfer System | Leica Microsystems | EM PACT2 | Archived Product Replaced by Leica EM ICE |
| Hydrogen Peroxide 30% Solution | Fisher Scientific | 50-266-27 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000015 | |
| Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm | Mager Scientific | 16707898 | |
| Osmium Tetroxide, crystalline | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade | VWR | 97062-950 | |
| Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm | Mager Scientific | 16702738 | |
| Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film | Electron Microscopy Sciences | FF2010-Cu | |
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 102090-962 | |
| Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) | Avantor Macron Fine Chemicals | 7708-10 | |
| Tannic Acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 | |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm | VWR | 25382-166 | |
| Ultra Glass Knife Strips | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | EM UC7 | |
| Uranyl Acetate Dihydrate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
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