Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

Published: February 27, 2020 doi: 10.3791/60677
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5,6
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 3Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University, 4Bindley Biosciences Center, Purdue University, 5Purdue Institute of Integrative Neuroscience, Purdue University, 6Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

Summary

פרוטוקול זה מתאר את שיטת ה-קריואיפקס, בה חלבון ממברנה APEX2 מתויג יכול להיות מקומי על ידי שידור אלקטרון מיקרוסקופ בתוך מבנה מיטבי משומר התא.

Abstract

מפתח אירועים סלולריים כמו התמרה אותות וסחר בקרום להסתמך על מיקום החלבון הנכון בתוך תאים סלולריים. ובכך חשוב לענות על שאלות ביולוגיות רבות באופן מדויק. החיפוש אחר תווית איתנה לזיהוי לוקליזציה של חלבון בשילוב עם שימור הסלולר נאותה וכתמים כבר מאתגרת היסטורית. ההתפתחויות האחרונות במיקרוסקופיה אלקטרונית (EM) הובילו לפיתוח שיטות ואסטרטגיות רבות כדי להגביר את שימור הסלולר והתווית היעד חלבונים. Peroxidase חדש יחסית מבוסס על תג גנטי, APEX2, הוא מנהיג מבטיח בתגים EM-אקטיב cloneable. הכנה לדוגמה עבור שידור אלקטרון מיקרוסקופ (TEM) יש גם מתקדם בשנים האחרונות עם הופעתו של קריוקיבעון על ידי הקפאת לחץ גבוה (HPF) ו בטמפרטורות נמוכות התייבשות וכתמים באמצעות הקפאת החלפת (FS). Hpf ו-FS לספק שימור מעולה של מבנה האולטרסאונד הסלולרי עבור הדמיה TEM, השני רק ישיר-הדמיה ההקפאה של דגימות אינדקטור. כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור שיטת ה-קריואיפקס, המשלבת את השימוש בתג APEX2 עם HPF ו-FS. בפרוטוקול זה, חלבון של עניין מתויג עם APEX2, ואחריו קיבעון כימי ואת התגובה peroxidase. במקום התייבשות כתמים ואלכוהול בטמפרטורת החדר, המדגם הוא קריוקבוע ועובר התייבשות וכתמים בטמפרטורה נמוכה באמצעות FS. באמצעות קריואיפקס, לא רק יכול להיות חלבון של עניין להיות מזוהה בתוך תאים subcellular, אבל גם מידע נוסף ניתן לפתור ביחס לטופולוגיה שלה בתוך קרום שנשמר מבחינה מבנית. אנו מראים כי שיטה זו יכולה לספק החלטה גבוהה מספיק כדי לפענח דפוסי הפצת חלבונים בתוך אורגל לומן, וכדי להבחין את מידור החלבון בתוך מאורגא אחד בסמיכות לאורגלים אחרים בלתי מסומנים. עוד, קריופיסגה היא תהליכים פשוטה וקלה לתאים גדל בתרבות הרקמה. היא אינה מאתגרת יותר מבחינה טכנית מאשר קריופיציה טיפוסית והקפאת שיטות החלפה. קריואיפקס היא ישימה באופן נרחב ניתוח TEM של כל חלבון ממברנה שניתן לתייג גנטית.

Introduction

מחקרים ביולוגיים כוללים לעתים קרובות שאלות לפתרון לוקליזציה של חלבון תת-תאי בתוך תאים ואורגלים. מיקרוסקופ immunofluorescence מספק תצוגה שימושית ברזולוציה נמוכה של לוקליזציה חלבון, וההתקדמות האחרונה בהדמיה סופר ברזולוציה דוחפים את גבולות הרזולוציה עבור מתויג פלואורוסקופים חלבונים1,2,3. עם זאת, מיקרוסקופ אלקטרוני (EM) נשאר תקן זהב עבור דימות ברזולוציה גבוהה הסלולר מבנה הנייד, למרות תיוג של חלבונים הוא אתגר.

מבחינה היסטורית, מספר שיטות EM שימשו לגישה לשאלות של לוקליזציה של חלבון ultraקונסטרוקטיבי. אחת השיטות הנפוצות ביותר היא מיקרוסקופ חיסוני (IEM), כאשר נוגדנים ספציפיים אנטיגן משמשים כדי לזהות את חלבון הריבית. האות EM מופק על ידי יישום של נוגדנים משני מצועם חלקיקי אלקטרון-צפוף, בדרך כלל הזהב4,5. לחילופין, יש להשתמש בנוגדנים עם אנזימים כגון הסוס צנון peroxidase (hrp) יכול לשמש כדי לייצר מזרז אלקטרון צפוף6,7,8. שתי גישות עיקריות קיימות עבור IEM, כינה הטבעה מראש ושלאחר הטבעה של תוויות. ב-הטבעה מראש של IEM, נוגדנים מוצגים ישירות לתוך תאים, אשר מחייבת קיבוע אור וחדירות של התאים9,10,11. שני השלבים עלולים לגרוםנזק. למבנההאולטרסאונד 12,13 פיתוח של נוגדנים קטנים באופן משמעותי המורכב של נוגדן קטע Fab מצועעם 1.4 ננומטר ננוגולד מאפשר התנאים החדירות עדין מאוד לשמש; עם זאת, ננוגולד קטן מדי להדמיה ישירה תחת TEM ומחייב שלבי שיפור נוספים להפוך לגלויים14,15,16. ב-IEM שלאחר ההטבעה, נוגדנים מוחלים על חלקים דקים של תאים אשר עובדו באופן מלא על ידי קיבוע, התייבשות, והטבעה שרף17. בעוד שגישה זו נמנעת משלב החדירות, שמירה על אפירופה של ריבית לאורך ההכנה לדוגמא היא אתגר של18,19,20. שיטת טויאסו של קיבוע האור ולאחריה הקפאה, הקפאת ההקפאה וזיהוי הנוגדן מספקים שימור אפיפי משופר של21,22. עם זאת, הדרישות הטכניות של כריתת המיקרו-בדיקת ההקפאה, כמו גם הניגודיות התת-אופטימלית שהושגה בתא, הן חסרונות23.

השימוש בתגים מקודדים גנטית מבטל רבים של הקשיים של IEM הקשורים לזיהוי של חלבון הריבית. מגוון של תגים זמינים, כולל hrp, ferritin, reash, minisog, ו מטטידור24,25,26,27,28,29,30,31,32. לכל אחד מהם יש יתרונות על פני שיטות קודמות, אך לכל אחד מהם יש חסרונות המונעים שימוש נרחב. החסרונות הללו נע בין חוסר פעילות של HRP ב ציטוסול לגודל גדול של תג ferritin, רגישות קלה של ReAsH, וגודל קטן וחוסר תאימות עם כתמים סלולריים של מטטימיום. לאחרונה, חלבון נגזר ascorbate peroxidase כבר מהונדסים כמו תג EM, בשם APEX233,34. כמו peroxidase, APEX2 יכול לזרז את החמצון של 3, 3 ' diaminobenzidine (בתוך), הפקת מזרז כי מגיב עם אוסמיום tetroxide כדי לספק ניגודיות EM המקומי עם דיפוזיה מינימלית מן החלבון של עניין (פחות מ 25 ננומטר)33,35. שלא כמו שיטות מבוססות HRP מסורתיות, APEX2 הוא יציב מאוד ונשאר פעיל בכל התאים הסלולריים33. דגימות ניתן לעבד עבור TEM באמצעות כתמים מסורתיים לדוגמה EM ושיטות המאפשרות ויזואליזציה טובה של המבנים שמסביב33,34,36. בשל גודלו הקטן, יציבותו, ו רב-תכליתיות, APEX2 התפתחה כתגית EM עם פוטנציאל גדול.

רבים מהגישות שנדונו לעיל אינן יכולות להיות או עדיין לא בשילוב עם המצב הנוכחי של האמנות בשימור בדיקת אולטרה מבנית, קריוקטיביות והקפאה בטמפרטורות נמוכות. כך, הם סובלים מחוסר שימור ממברנה ו/או כתמים תא כדי לקבוע לוקליזציה חלבון מדויק. הדבר מגביל בהכרח את הרזולוציה והפרשנות של הנתונים שניתן להשיג. קריוקיבעון על ידי הקפאת לחץ גבוה (hpf) כרוכה הקפאה מהירה של דגימות בחנקן נוזלי בלחץ גבוה (~ 2,100 bar), הגורם ויטריפיקציה ולא התגבשות של דגימות מימית, ובכך שמירה על תאים במצב קרוב-יליד37,38,39. Hpf אחריו הקפאת החלפת (FS), טמפרטורה נמוכה (-90 ° c) התייבשות אצטון בשילוב עם דגירה עם כתמי EM אופייני כגון אוסמיום tetroxide ו uranyl אצטט. HPF ו-FS יחד לספק יתרון ברור על גבי קיבעון כימי מסורתי (תהליך ארוך יותר אשר יכול להוביל חפצי אמנות) התייבשות אלכוהול בטמפרטורת החדר או על קרח (אשר יכול להוביל להפקת שומנים וסוכרים), ולכן רצוי לשלב עם תגי EM הטוב ביותר עבור זיהוי חלבון.

אחת הסיבות כי HPF/FS לא בשילוב עם תיוג APEX2 היא כי קיבעון כימי קל הוא תנאי מוקדם עבור התגובה peroxidase, הגבלת הדיפוזיה של המוצר התגובה מחיר. במחקרים APEX2 עד כה, קיבעון והתגובה peroxidase הם ואחריו שיטות EM מסורתיות לצביעת ואלכוהול התייבשות33,36. עם זאת, זה הוכח כי בעקבות קיבעון כימי עם HPF/FS מספק יתרון ברור בשימור על קיבעון כימי מסורתי התייבשות אלכוהול לבד40. הפסד של שלמות ultraקונסטרוקטיבית לראות בדוגמאות TEM מסורתיות נראה פחות מחובר קיבעון מאשר התייבשות, אשר נעשה בדרך כלל באמצעות אלכוהול בטמפרטורת החדר או על קרח, והוא יכול להוביל להפקת שומנים וסוכרים40,41. כדי לפתח את שיטת קריואיפקס, שיערו כי הקיבעון הכימי ואת התגובה peroxidase, ואחריו HPF ו-FS, היה לייצר תוצאה אופטימלית מבחינת שימור ultraקונסטרוקטיבי.

כאן אנו מציגים את פרוטוקול קריואיפקס, המשלב APEX2 תיוג עם קריוקיבוע והקפאת שיטות החלפת (איור 1). פרוטוקול פשוט זה מורכב מגלגול של חלבון APEX2 מתויג של עניין, קיבעון כימי של תאים, ואת התגובה peroxidase. HPF ו-FS מבוצעים לאחר מכן על ידי שתילת שרף אופייני והדקים. הדמיה TEM מגלה שימור מעולה של ultrastructure בנה באמצעות שיטה זו. בנוסף, לוקליזציה ברזולוציה גבוהה subcellular והפצה מרחבית של רשתית העין (ER) לומפלמיק חלבון נצפו. שיטה זו שימושית רבות לאיתור לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני. בידינו, השיטה עבדה בהצלחה עבור מגוון של קווי תאים שגדלו בתרבית רקמות, כולל HEK-293T (כליה עובריים האדם), הלה (סרטן צוואר הרחם האנושי), Cos7 (אפריקה ירוק כליות הקוף פיברוהפיצוץ), ו BHK (כליה אוגר התינוק). הוראות מפורטות מתוארות להלן באמצעות התאים HEK-293T.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבית תאים והעברה

  1. זרעי HEK-293T תאים בקוטר 60 מ"מ או גדול יותר התרבות רקמות ולגדול ל 60% – 90% המפגש בחממה תרבות התא ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  2. תאי העברה עם הבעה מAPEX2-מתויגים באמצעות מגיב (ראו טבלת חומרים) בהתאם להנחיות היצרן.
  3. ב 12-15 h לאחר ההעברה, לשטוף את התאים פעם אחת עם מלוחים מאגור פוספט (PBS). להסיר תאים ממנה על ידי כביסה עדינה עם PBS. מגיב דיסוציאציה כגון טריפסין עשוי לשמש אם נדרש עבור סוג תא נתון. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות כדי ליצור גלולה.

2. קיבעון כימי ותגובת Peroxidase

  1. הסר בזהירות את הסופרנט והשהה מחדש את הגלולה ב 2 מ ל של 2% glutarאלדהיד (v/v) ב 0.1 M נתרן קאבאיחור במאגר, pH 7.4, בטמפרטורת החדר. לדגום את הקרח ואת הביצה במשך 30 דקות. גלולה המדגם ב 500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. מנקודה זו עד שלב 2.3.3, לשמור על המדגם והפתרונות על קרח, ולבצע צנטריפוגה ב 4 ° c.
    התראה: הן הגלוטרלדהיד והן מאגר הנתרן הקשני (המכילים ארסן) רעילים. יש להשתמש בהליכי בטיחות נאותים ובציוד הגנה אישי במהלך הטיפול. יש להיפטר מתמיסות המכילות גלוטרלדהיד ו/או מאגר הנתרן הכימי המכיל כפסולת כימית מסוכנת.
  2. לשטוף את הגלולה 3x עבור 5 דקות עם 2 מ ל של 0.1 M נתרן קא, המאגר המאוחר. עבור אלה, כמו גם שוטף הבאים, בעדינות מחדש את הגלולה התא בפתרון הנדרש, ולאחר מכן צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x g ובזהירות להסיר ולמחוק את supernatant. יש לקחת את הטיפול באמצעות הפלטינג והשלבים החוזרים, על מנת למזער את ההפסד לדוגמה.
  3. לבצע את התגובה הperoxidase
    1. להכין פתרון טרי המכיל 1 מ"ג/mL של 3, 3 '-diaminobenzidine הטהידרוכלוריד (בתוספת) ב 0.1 M נתרן המאגר האחרון. לפזר את התוספת על ידי וורטקנג נמרץ עבור 5 – 10 דקות.
      התראה: הדבר רעיל ומסרטן פוטנציאלי, ויש לטפל בו עם נוהלי בטיחות נאותים וציוד הגנה אישי. יש להתייחס לפתרונות המכילים את הטיפול בחומר כפסולת כימית מסוכנת.
    2. לשטוף את הגלולה על ידי השעיית מחדש 3 מ ל של הפתרון לאחר מכן לאחר מכן לפלטטינג ב 500 x g עבור 5 דקות.
    3. השהה מחדש את הגלולה בתמיסת 3 מ ל שאליה מימן מי חמצן נוספה כדי להשיג ריכוז סופי של 5.88 מ"מ. מודקון עבור 30 דקות ב temp בחדר. הגלולה הופכת בצבע חום בעליל המציין את הנוכחות של המוצר מסיסים התגובה להטיפה.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך למטב את זמן הדגירה עבור כל דוגמה. ניתן לפקח על שינוי הצבע במיקרוסקופ האור. מניסיוננו, הדגירה של 15 עד 45 דקות מספיקה עבור רוב החלבונים. תחמוצת מימן צריך להיות מושגת בקבוק נפתח טרי או אחד שנשמר היטב סגור לאחר פתיחת.
    4. גלולה את התאים, ולאחר מכן לשטוף 2x עבור 5 דקות עם 0.1 M נתרן מאגר באיחור של סודיום, ואחריו לשטוף אחד ב בינונית שונה של הנשר של דולבקה (DMEM) או תא מדיה של בחירה.
  4. השהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-500 μL של פתרון של הגנה על ההקפאה של DMEM (או מדיית תא אחרת של בחירה) המכילה 10% נסיוב בקר עוברי ו 15% סרום שפרה. גלולה שוב, הגדלת מעט את מהירות הצנטריפוגה מ 500 x g אם נדרש כדי להשיג גלולה בתמיסה עבה-הגנה ההקפאה. למחוק את רוב supernatant, להבטיח כי מספיק נוזל נשאר כך הגלולה לא להתייבש. להעביר את הגלולה הסלולרית. לכלי הקפאת הלחץ הגבוה

3. הקפאה בלחץ גבוה

  1. ממלאים את מאגר המקפיא בלחץ גבוה עם חנקן נוזלי (LN2) ולהתחיל את המשאבה כדי למלא את חדר המדגם עם LN2.
    התראה: השתמש בהליכי בטיחות נאותים ובציוד הגנה אישי בעת עבודה עם חנקן נוזלי.
    הערה: צעדים אלה ספציפיים למקפיא EMPACT2 לחץ גבוה לייקה.
  2. הפתיל הרחק כל נוזל שנותר מתוך הגלולה התא באמצעות הפינה של ניגוב מעבדה או מגבת נייר. מספיק נוזל צריך להישאר כי הגלולה יוצרת הדבקה דומה בעקביות למשחת שיניים. זה צריך להיות דק מספיק כדי להיות. מואבקים לתוך התשר של 20 ליטר
  3. מנושף 2 – 3 μL של הגלולה תא ולהפקיד אותו על נושאת קרום. מלא את הבאר של נושאת הקרום לחלוטין, כך שהמתח של פני השטח יוצר כיפה קטנה למעלה, אך הנוזל אינו נשפך מתוך הבאר. אין לקיים בועות אוויר.
  4. החלק את מנשא הקרום לתוך המחסנית ואבטח. הצב את המחסנית במחשב HPF שהיה מוכן ומוכן ולחץ על התחל כדי להקפיא.
  5. בדוק את הטמפרטורה לעומת הזמן והלחץ לעומת גרפים זמן כדי לוודא כי הלחץ הגיע ל2100 בר והטמפרטורה הגיע-196 ° צ' בתוך 200 ms, ושני הפרמטרים נשארו יציבים עבור היקף 600 ms.
  6. חזור על שלבים 3.3 עד 3.5 עד שנעשה שימוש בגלולה הסלולרית או שהמספר הרצוי של הדגימות הוקפא.
  7. שמירה על מחסניות שקוע ב-LN2, להסיר כל נושאת ממברנה ממיכל הדיו שלה, מקום לתוך קפסולה פלסטיק, ולמקם את קפסולת פלסטיק לתוך בקבוקון המקפיא מלא של LN2.
    הערה: ייתכן שהפרוטוקול מושהה כאן. מבחנות ההקפאה עם דגימות ניתן לאחסן ב-LN2 דיואר במקלות ההקפאה או בקופסאות ההקפאה.

4. הקפאת ההחלפה

התראה: השתמש בהליכי בטיחות נאותים ובציוד הגנה אישי בעת עבודה עם חנקן נוזלי. בנוסף, רבים של כימיקלים מנוצל בשלב 4 רעילים, כולל חומצה טאנית, אוסמיום tetroxide, ו uranyl אצטט. הכימיקלים הללו חייבים להיות מטופלים על פי נוהלי בטיחות נאותים ולהיפטר מפסולת כימית מסוכנת.

  1. מלא את יחידת החלפת ההקפאה האוטומטית עם LN2. העלה את הטמפרטורה ל-90 ° c.
  2. הכן את מיקס האלף והתחל ב-FS.
    1. בשכונה כימית, להכין פתרון של 0.2% חומצה טאנית (w/v) ו 5% די מים ב אצטון ו-1 mL לכל מדגם לתוך מבחנות ההקפאה. . מקום לחדרהשני כדי להקפיא
    2. מניחים את ה-FS Mix מבחנות 1 ומבחנות ההקפאה המכילות את כדורי התא הקפוא לחדר המדגם של יחידת FS. העבר את הקפסולה הפנימית המכילה את נושאת הקרום מבקבוקון LN2 לתוך הבקבוקון המתאים המכיל את FS Mix 1.
    3. התחל פרוטוקול FS עם הצעד הראשון שלו להיות 24 h ב-90 ° c. לאחר 24 h, להשהות את ה-FS, ולשטוף את דגימות 3x עבור 5 דקות עם אצטון כי כבר מקורר-90 ° c.
  3. הכנת מיקס FS 2 ו-FS שלם
    התראה: Osmium tetroxide הוא כימיקל רעיל ומחמצן מאוד כי צריך רק להיות מטופלים על ידי אנשים מאומנים על פי פרוטוקולי בטיחות הוקמה. יש לעקוב אחר הפרוטוקולים לאחסון ולסילוק הפתרונות המכילים אוסמיום, כמו גם לתיוג אזורי מעבדה שבהם אוסמיום tetroxide נמצא בשימוש. Tetroxide osmium צריך להיות מטופל בשכונה כימית עם ציוד הגנה אישית כולל הגנה על העין, מעיל מעבדה מתן הגנה מלאה בזרוע, כפפות ניטריל כפול, ו מסכת ההנשמה אופציונלי.
    1. בשכונה כימית, להכין פתרון של 1% אוסמיום tetroxide, 0.2% uranyl אצטט, ו 5% די מים ב אצטון. הפחתה 1 מ ל לכל מדגם לתוך מבחנות ההקפאה ומקום ב-LN2 להקפיא.
      הערה: פתרונות מניות של חומצה טאנית (10% w/v ב אצטון), אוסמיום tetroxide (10% w/v ב אצטון) ו uranyl אצטט (8% w/v ב מתנול) עשוי להיות מוכן ומאוחסן במבחנות in2 דיואר עבור קלות ההכנה של ה-FS Mixes.
    2. הניחו את מבחנות ההקפאה עם FS Mix 2 ליחידת ה-FS והעבירו את הקפסולות מתוך השטיפה השלישית של אצטון לתוך מבחנות ה-FS Mix 2. מודטה ב-FS Mix 2 עבור 72 h ב-90 ° c, ואחריו התחממות הדרגתית ל -0 ° c מעל 12-18 h.
  4. שמרו על טמפרטורה של 0 ° צ' ושטפו את 3x במשך 30 דקות עם אצטון מקורר מבקבוק שנפתח טרי.

5. שרף הסתננות והטבעה

התראה: השרף המשמש כאן (ראה שולחן החומרים) רעיל לפני הפילמור, ויש לטפל בו בהליכי בטיחות נאותים ובציוד הגנה אישי. יש להיפטר משרף שאינו מסוכן. כפסולת כימית מסוכנת

  1. לחדור את הדגימות עם ריכוזים גוברת של שרף מומס של אצטון מבקבוק חדש נפתח. הכינו תערובת של מרכיבי שרף A, B, ו-D בגביע פלסטיק על פי כיווני היצרן, ודגימות דגירה בריכוזים הבאים שרף: 2%, 4%, ו 8% עבור 2 h כל אחד ב 0 ° c. מודטה ב 15%, 30%, 60%, 90%, ו 100% שרף עבור 4 h כל אחד בטמפרטורת החדר. מודטה עבור 4 שעות בתערובת של רכיבים A, B, C ו-D.
  2. מניחים את נושאות הקרום עם כדורית התא בצד לתוך תבניות הטבעה שטוח למלא עם שרף (A, B, C, D). תוויות נייר עבור הדגימות ניתן להוסיף לבארות בשלב זה.
  3. פולימל בתנור ב 60 ° c עבור 24-36 h.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לאחר הפילמור.
  4. להסיר את גושי מהעובש ולתת מגניב. כדי להסיר את נושאת הקרום, במקום הראשון את המדגם את הצ האנכי של ultramicrotome שבו הוא יכול להיות מדמיין עם הגדלה. הפרד את נושאת הקרום מהבלוק על ידי שילוב של חנקן נוזלי על נושאת הקרום כדי להפריד את המתכת מן הפלסטיק, ושימוש להב גילוח כדי לשבב את שרף סביב נושאת הקרום. כאשר מופרדים, להסיר בעדינות את נושאת הקרום משאיר את כיפת הגלולה תא על פני הבלוק.
  5. מניחים את הבלוק עם הגלולה התא חשוף פונה כלפי מעלה בתבנית הטבעה שטוחה כי הוא מעט עמוק יותר העובש הראשון, ומילוי עם שרף. פולימל בגובה 60 ° צלזיוס בשביל 24 עד 36 שעות.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לאחר הפילמור.

6. המשך המכירה

  1. חתוך את הבלוק סביב הגלולה התא באמצעות להב תער. ואז למקם את הבלוק במדגם צ'אק על הזרוע החוסמת של אולטרה מיקרוטום. באמצעות סכין זכוכית או יהלום, לחתוך את הבלוק לתוך הצורה טרפז מקרוב מסביב הגלולה התא.
  2. לקבל 90 ננומטר בעלי מקטעים של הגלולה תא באמצעות זכוכית או יהלום סכין.
  3. לאסוף רצועת הכלים של מקטעים על רשת TEM. Formvar-מצופה רשתות חריצי נחושת (1 x 2 מ"מ2 חריץ) שימושיים עבור מקטעים טוריים הדמיה. יבש את הרשת על ידי לחסום את הקצה על פיסת נייר סינון, ולאחסן בתיבת אחסון רשת TEM.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לאחר הפרייתם.

7. TEM הדמיה

  1. הר את הרשת על המחזיק TEM ומקום לתוך המיקרוסקופ. אנו משתמשים באופן קבוע Tecnai T12 ב 80 kV לסינון דגימות קריואיפקס. לרכוש תמונות של תאים מבנים תת תאיים של עניין עם תיוג APEX2.
  2. אם רצונך בכך, השג ניגוד ממברנה נוסף על-ידי שימוש בהכתמים לאחר הפניה. ראו איור 2 להשוואת דגימות שאינן מוכתמות לאחר מכן (איור 2I-K) ודגימות לאחר הכתמים המובילים (איור 2א – ח).
    1. צפה רשתות יבשות מקטע-בצד למטה על טיפה של תמיסת נתרן כלוריד מדלל (~ 1.5 mM), 2x עבור 1 דקות כל אחד, ואז 1x עבור 10 דקות.
    2. הצפת רשתות על טיפת הפתרון המוביל של סאטו עבור 1 דקות. לשטוף על ידי צף על תמיסת נתרן כלוריד 3x עבור 1 דקות, לאחר מכן על המים די 3x עבור 1 דקות. כתמי נוזלים עודפים מרשתות ולאחסן בתיבת רשת.
      התראה: עופרת היא כימיה רעילה ויש לטפל בה בהליכי בטיחות נאותים ובציוד הגנה אישי. יש להיפטר מפתרונות המכילים עופרת כפסולת כימית מסוכנת.
  3. דגימות תמונה שלאחר הכתמים על TEM.
    הערה: בהכנה לדוגמה המסורתית עבור TEM, השלב המוביל מנוגדים מבוצע לפני הדמיה TEM. עם זאת, מומלץ כי עבור דגימות קריואיפקס, הדמיה מבוצעת תחילה על דגימות שאינן בניגוד. זה מבטיח כי האות מן התג ניתן למקם בקלות על ידי הניגוד החזק שלו עם מבנים סלולריים יותר מוכתם קלות. עבור דגימות רבות, לא יידרש כתמים נוספים; עם זאת, אם הניגודיות הנוספת של הממברנה רצויה, ניתן לבצע כתמים מובילים (Step 7.2) ולדגום את התמונה מחדש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

על מנת להשוות את שימור האולטרה-מבנית בשיטת הקריואיפקס עם קיבעון והתייבשות מסורתיים, הכנו דגימות שבהן קרום הרשתית האנדופלזמית (ה-אמ. סי; ממברנה ER) מתויג עם APEX2 ו העביר לתוך התאים HEK-293T. אה-APEX2 לאתר את הפנים cytoplasmic של er ו remodels מבנה er לתוך מבנים ברורים מורפולוגית המכונה מאורגנת חלקה ER (oser)34,42,43. מורפולוגיה של OSER כוללת אזורים של ממברנות חלקים, מקבילים ומוערמים בצפיפות, המשמשים כאזור אופטימלי להשוואת שימור בדיקת אולטרה-מבנית. הכנת המדגם על ידי שיטות איפקס מסורתיות הביאו לתיוג ברור של מבני OSER (איור 2א – ד). לאחר הבדיקה בהגדלה גבוהה, הקרומים המוערמות הופיעו בפערים שאינם אחידים, בין צפיפות הממברנה, המציינת שימור הממברנה המסכן והפקת השומנים (איור 2ד). המדגם שהוכן על ידי קריואיפקס גם היה מוגדר בבירור תיוג של מבני OSER; עם זאת, הקרומים היו חלקים ומקבילים, ומעט לא נראה שאיבת שומנים (איור 2E – H). התוצאות של קריואיפקס היו דומים שימור באיכות גבוהה לאלה שהתקבלו ממדגם שעברו HPF/FS ללא קיבעון כימי נוסף ו APEX2/בתוספת שלבים התגובה (איור 2I – K).

בנוסף לשימור הממברנה מבחינה חזותית, השיטה קריואיפקס שומרת על חלבון הריבית כגון היבטים של דפוסי הפצת חלבונים ניתן לצפות במקרים מסוימים. כדי להמחיש נקודה זו, השתמשנו בחלבון מקומי נוסף, huntingtin שמרים אינטראקציה חלבון E (הייפ). הייפ הוא חלבון ממברנה הממוקם על פני הלומיאל של קרום ER 44,45,46,47. APEX2 בנייה הייפ-בונה התבטא בתאי HEK-293T. ניתוח TEM של 90 ננומטר מקטעים דקים חשפו כי הייפ היה נוכח ברחבי ER היקפית, כמו גם את המעטפה הגרעינית (איור 3A, B). בנוסף, צפיפות ההייפ היה מסוגל להיפתר לתוך מרווח באופן קבוע לאורך ממברנה לומאל ER (איור 3C, חיצים). התפלגות ההדפ ו וקדי היו גלויים גם במדגם הכין קיבעון המסורתית התייבשות; עם זאת, הפרעה ממברנה נרחבת החילוץ היו נוכחים, מה שהופך את המדגם האופטימלי (איור 3ד, E).

כדי להדגים את הספציפיות הארגונית והישימות של שיטת קריואיפקס עבור מגוון של חלבונים מתויגים, ביצעת תיוג APEX2 באמצעות שלושה סמנים סלולריים. מיטוכונמיטוa סומנו באמצעות mito-V5-APEX234. סמן זה של מטריצה מיטוכונדריאלי סיפק כתמים ספציפיים של המיטו, רק (איור 4א). באופן דומה, העריכו תיוג קרום פלזמה באמצעות CAAX-APEX234, אשר הפיק כתמים ברורים של קרום הפלזמה בלבד (איור 4ג). התיוג לא נצפה באורגלים תאיים (איור 4ג). בנוסף, יצרנו מבנה חדש כסמן עבור לומן Golgi על ידי החדרת הראשון חומצות אמינו 118 של העכבר isoform של α-mannosidase עם APEX2 הגן48. כתוצאה מכך הביטוח העצמי הAPEX2 היה מנוכר לתאים אשר הוכנו לאחר מכן על ידי שיטת קריואיפקס. הערימות המוכתמים ברורים מהאורגלים המקיפים (איור 4ב'). ערימות בודדות, cisternae, וחלק מסוגי השחת היו מסומנים, אופייני לצביעת Golgi (איור 4ב'). לגמרי, סמנים אלה מדגימים כי השיטה הקריואיפקס מספקת תיוג ספציפי של חלבונים ממברנות בתוך אורגלים שונים ברזולוציה גבוהה מספיק כדי להבדיל אותם מתוך מבנים משנה הסלולר שמסביב.

Figure 1
איור 1: סכמטית של הצעדים החיוניים בפרוטוקול קריואיפקס. (א) תאים גדלים ומזוהמים בAPEX2 פלביניים. (ב) תאים הם פלטד וקבוע עם glutarאלדהיד, ואחריו (ג) דגירה עם מימן ותחמוצת המימן כדי לייצר את המוצר התגובה peroxidase. (ד) הגלולה היא קריותיקן על ידי hpf, (E) הקפאת להחליף עם מתכות כבדות אצטון, ו (F) מוטבע שרף. חלקים דקים נאספים על המיקרוטומה. (G) TEM הדמיה מבוצעת וניגודיות נוספת ניתן להוסיף באמצעות לאחר כתמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: השוואה של שימור קרום OSER באמצעות קיבעון כימי מסורתי, קריואיפקס, HPF/FS. המבנה המוסדר מאורגן מחודש כימית קבוע, הגיב APEX2-ביטוי תאים שעובדו באמצעות קיבעון כימי מסורתי והתייבשות אלכוהול (A – D) או על ידי קריופיסגה (E – H) הושוו ל-APEX2 ביטוי תאים שהיו בהקפאה לחיות וללא את התגובה הדקה (I-K). התאים החיים בהקפאה מייצגים את השימור הטוב ביותר בדיקת ultrastructural בנית ולשמש כאן כמדד להערכת שימור הממברנה שהושג באמצעות שני הפרוטוקולים מבוססי איפקס זיהוי (A – H). הערימה המקבילה במקביל לערימת הקרומים הנגזרים מחדר המיון המתקבל על ידי קריופיסגה (למשל בפאנלים G ו- H), בניגוד לקרומים המנעלים שהושגו בשיטות מסורתיות (פאנלים C ו -D), מדגיש את שימור הממברנה המעולה המתקבל על ידי קריואיפקס. דמות זו שונתה מ Sengupta ואח ' 201948. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: לוקליזציה של חלבון של חלבון APEX2 מתויג ER ממברנה יכול להיפתר foci תקופתיים. (א) תמונה של קטע דק של תא hek-293t המבטא הלפ – APEX2 ומעובד על ידי קריואיפקס מגלה כתמים של ER ברקע שהשתמר היטב (צפוף) העין cytoplasmic (ב,ג). תמונות הגדלה גבוהה יותר של קטע קטן של הציוד ההיקפי (מתחת לקופסא הצהובה ב ומוצגת ב- b, עם הגדלה נוספת של התיבה האדומה ב-b המוצג ב- c) מוצגות מסמכים תקופתיים של צפיפות APEX2 (B, קופסה אדומה ו- c, ראשי חץ לבנים המראים תקופתיות בין ההייפ וקדי). (ד) תמונה של קטע דק של תא המבטא הייפ-APEX2 והכין על ידי קיבעון כימי מסורתי התייבשות מראה כתמים ספציפיים של המעטפת הקורטיקלית ואת המעטפה הגרעינית (חיצים אדומים). (ה) בהגדלה גבוהה יותר, המופ התקופתי הספציפי ביותר היו גלויים בתוך מתיחות של ER (התיבה הצהובה וראשי החץ הלבן בכניסה), למרות הפרעה ממברנה נרחבת, המצוין על ידי חיצים אדומים. NE = מעטפה גרעינית. דמות זו שונתה מ Sengupta ואח ' 201948. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: סמנים ארגונית להציג ספציפיות של האות שהתקבל מ APEX2-מתויגים חלבונים. APEX2-tagged חלבון בונה שנועד להתאים את מטריצה מיטוכונדריאלי (mito-V5-APEX2; המוצג ב), או Golgi לומן (α-mannII-APEX2; מוצגב- B), או קרום פלזמה (caax-APEX2; המוצג ב C) הביעו ביטוי בתאי HEK293 ואת הדגימות שעובדו על ידי קריואיפקס כל אחד מהמבנה הניב צפיפויות מסוימות. תצוגות מוגדלות של שני מקטעים (תיבות צהובות או אדומות) מן התאים המבטאים α-mannIIAPEX2 (פאנל B) או caax-APEX2 (פאנל C) מוצגים. דמות זו שונתה מ Sengupta ואח ' 201948. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול קריואיפקס המוצג כאן מספק שיטה איתנה לאפיון הלוקליזציה של חלבונים ממברנות בתוך הסביבה התאית. לא רק שימוש של תג APEX2 מקודד גנטית לספק לוקליזציה מדויק של חלבון של עניין, אבל השימוש קריוקיבעון בטמפרטורות נמוכות מספק שימור מעולה וכתמים של מבנה האולטרה הסלולרי המקיף. בשילוב, גישות אלה הן כלי רב עוצמה לוקליזציה של חלבון בעל דיוק גבוה בתוך הקשר התת-תאי שלו.

עיקר ההתקדמות של שיטה זו היא העובדה אובדן ultrastructure בנה מנוסה לאחר ההכנה על ידי שיטות TEM מסורתיות מגיע בעיקר משלב התייבשות ולא בשלב הקיבעון40. זה היה בעבר האמינו כי שיטות מבוססות peroxidase לא תואמים HPF/FS כי הם דורשים קיבעון כימי לפני התגובה peroxidase. כדי לעקוף את זה, פרוטוקול בשם קריוכימיה פותחה לאחרונה באילו דגימות הם קריוקבוע בתחילה, ואחריו מחדש את התגובה peroxidase49. גישה זו מספקת לוקליזציה יעד מעולה עם שיפורים משמעותיים בצביעת ושימור לדוגמה. זה הוכח להיות שימושי עבור דגימות רקמות ובמקרים שבהם הצורך במיקרוסקופיה ואלקטרון מיקרוסקופ. במקביל קריוכימיה, השיטה שלנו משלבת קיבעון glutarאלדהיד עם HPF ו-FS. קריואיפקס מציעה פרוטוקול יעיל שפועל גם לדגימות סלולר קטנות.

גישה לקיפאון בלחץ גבוה והקפאת מכשירים חלופיים חיונית לשיטת הקריואיפקס. מכשירים וכישורים אלה נפוצים יותר ויותר במתקני EM. גם אם ציוד HPF ו-FS אינו זמין בקלות, הדוגמה הקבועה כימית יציבה מספיק למשך זמן קצר להעביר מרחקים צנועים40. מצאנו כי ניתן לאחסן דגימות לאחר התגובה בשעה 4 ° צ' לפחות 48 שעות לפני HPF ללא אובדן משמעותי של איכות. היבט קריטי נוסף של פרוטוקול קריואיפקס הוא הכללת הפקדים, החיוניים לניסוי חזק ולתוצאות משכנעות. דגימות שהוכנו על-ידי העברה ארעית עם יעילות של פחות מ-100% יכילו תאי בקרה שליליים, כמו גם תאים המסומנים בתווית בתוך אותה דוגמית. אם נעשה שימוש בקווי תאים עם ביטוי יציב של APEX2, יש להכין פקד שלילי נפרד על-ידי העברה של תאים עם החלבון שאינו מAPEX2 המסומן בתווית הריבית. מספר מבנים שיכולים לשמש כפקדים אורגמוניים זמינים דרך addgene, ותמונות שפורסמו זמינים בפרסומים אלה ואחרים שניתן להשתמש בהם עבור אימות33,34,36,48. דיון מעמיק של תכנון ניסיוני ואימות של מבנים APEX2 fusion חדש סופק על ידי מרטל ואח '.36

בעוד קריופיסגה שימושי באופן כללי לאיתור חלבונים ממברנה, מספר מגבלות קיימות. למרות APEX2 הוא קטן 28 kda חלבון, חלבונים מסוימים אולי לא יוכלו לכלול את התג33,34. APEX2 אינו נחשב שימושי עבור תיוג חלבונים מסיסים ב ציטוסול, בשל מוצר התגובה לפזר33,36. בנוסף, זיהוי כמויות קטנות של חלבון מהווה אתגר עקב נוכחות של כתמים בתא שמסביב. הכנה על ידי HPF ו-FS משמר רכיבים סלולריים אשר מופק על ידי קיבעון מסורתי התייבשות. זה מוביל לצביעת כהה הכולל בתא, העלול להתחרות עם רמות נמוכות של תיוג APEX2.

טכניקת ה-קריואיפקס ישימה רבות על חלבונים רבים, עם מספר מצומצם של צעדים שעשויים לדרוש אופטימיזציה. ראשית, בשל שינויים בודדים בין חלבונים, רמת ביטוי החלבון ו/או זמן התגובה של התוספת יש צורך להתאים כדי שהאות יהיה מכוון מעל לצביעת הרקע של התא. מידע ופרוטוקולים מועילים עבור אימות של בנייה APEX2 fusion חדש ואופטימיזציה של הביטוי וכתמים מסופקים על ידי martell etal.36 מנקודת מבט תאית מכתים, פרוטוקול FS ו/או כימיקלים עשויים להיות מותאמים להדמיה אופטימלית של ממברנות ארגונית שונים, בתוך סוגי תאים שונים, רקמות, או אורגניזמים50,51,52,53, לפי הניסיון שלנו, התנאים שהוצגו כאן פעלו היטב עבור מגוון קווים של תאים מהיונקים.

הגישה היברידית של קריואיפקס יש את הפוטנציאל להיות מוחל על טכניקות רבות אחרות תיוג גנטי. החלפת התייבשות אלכוהול מסורתית עם HPF/FS צפוי לשפר במידה ניכרת את שימור ultraקונסטרוקטיבי ואת מידע הלוקליזציה של חלבון. ניצול דיסקים ספיר כמצע התא כדי לתקן תאים כמו mon, משפר את שימור הפריפריה התא, כולל שלד התא ואנשי קשר תא תא. שינויים משניים בפרוטוקול יידרשו להשתמש בדיסקי ספיר. טכנולוגיית איפקס ניתן להשתמש כדי לזהות חלבון פלורסנט ירוק (GFP) מתויג חלבונים באמצעות פפטיד GFP כריכה35. זו שיטה עקיפה של גילוי פותח את הפוטנציאל לנצל את טכנולוגיית איפקס עבור החלבונים הרבים כבר מתויג עם GFP. APEX2 split הציג לאחרונה יהיה יתרון עבור מחקרים קרבה ואינטראקציה55. בנוסף, ניתן לשלב שיטות קיימות המבוססות על HRP עם HPF/FS כדי לשפר את השימור הסלולרי. דוגמה אחת היא למשל flומערכת peroxidase עבור precipitation עם EM rהשקפה (פליפר), בו סמנים תא בודדים כבר התמזגו עם תג פלורסנט ו Hrp, מתן סמנים לומאל עבור golgi או ER56. השימוש של peroxidase משופרת מצעים במקום להשתמש גם אפשרי עם שיטה זו, כולל מצעים אשר ממוטב עבור התיוג RNA 57. קריואיפקס גם מספק תיוג בתוך התא ושימור אולטרה מבנית הדרושים לניתוח תלת מימדי של הפצת חלבונים דרך טומוגרפיה אלקטרון, ופוטנציאל בכמויות גבוהות דרך sbf-sem או פרפור-sem48,58.

בסך הכל, קריופיסגה היא שיטה איתנה עם ישימות רחבה. בעיקרון, זה יכול להיות מיושם על כל חלבון ממברנה, בין אם בתוך מרחב לומאל של אורגונל, על הפנים cytoplasmic, בתוך שלפוחיות, על קרום פלזמה של התא או אפילו בחלל הפריתאי. עבור מגוון עצום זה של חלבונים ממברנות, שיטת קריואיפקס מספקת את הפוטנציאל לראות את הלוקליזציה והפצה של חלבון עם דיוק בתוך הקשר הפנימי התת שלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים

Acknowledgments

הפרוטוקול המתואר כאן נובע מפרסום על ידי Sengupta ואח ', היומן של מדע התא, 132 (6), jcs222315 (2019)48. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים R01GM10092 (כדי ס) ו AI081077 (R.V.S.) מן המכון הלאומי לבריאות, CTSI-106564 (ל ס) מתוך אינדיאנה מכון למדעי המחקר, ו PI4D-209263 (כדי ס) מהמכון האוניברסיטאי Purdue לדלקת, אימונולוגיה, ומחלות זיהומיות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate Sigma-Aldrich D5637-1G
Acetone (Glass Distilled) Electron Microscopy Sciences 10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc Electron Microscopy Sciences 60952
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL VWR 82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin Sigma-Aldrich 44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 Sigma-Aldrich 44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) Sigma-Aldrich 44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D Sigma-Aldrich 44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm Electron Microscopy Sciences 70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm Electron Microscopy Sciences 70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement Corning 355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm Electron Microscopy Sciences 71008
Glass Knifemaker Leica Microsystems EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16120
HEK 293 Cells ATCC CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System Leica Microsystems EM PACT2 Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution Fisher Scientific 50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm Mager Scientific 16707898
Osmium Tetroxide, crystalline Electron Microscopy Sciences 19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade VWR 97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm Mager Scientific 16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film Electron Microscopy Sciences FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) Avantor Macron Fine Chemicals 7708-10
Tannic Acid Electron Microscopy Sciences 21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm VWR 25382-166
Ultra Glass Knife Strips Electron Microscopy Sciences 71012
Ultramicrotome Leica Microsystems EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate Electron Microscopy Sciences 22400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  2. Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies. Trends in Cell Biology. 25, 730-748 (2015).
  3. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6, 022003 (2018).
  4. De Mey, J., Moeremans, M., Geuens, G., Nuydens, R., De Brabander, M. High resolution light and electron microscopic localization of tubulin with the IGS (Immuno Gold Staining) method. Cell Biology International Reports. 5, 889-899 (1981).
  5. Faulk, W., Taylor, G. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Brown, W. J., Constantinescu, E., Farquhar, M. G. Redistribution of Mannose-6-Phosphate Receptors Induced by Tunicamycin and Chloroquine. The Journal of Cell Biology. 99, 320-326 (1984).
  7. Brown, W. J., Farquhar, M. G. The Mannose-6-phosphate Enzymes Is Concentrated Receptor for Lysosomal in Cis Golgi Cisternae. Cell. 36, 295-307 (1984).
  8. Sternberger, L. A., Hardy, P. H., Cuculis, J. J., Meyer, H. G. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 18, 315-333 (1970).
  9. Oliver, C. Pre-embedding Labeling Methods. Immunocytochemical Methods and Protocols. Oliver, C., Jamur, M. C. 588, Humana Press. 381-386 (2010).
  10. Polishchuk, E. V., Polishchuk, R. S. Pre-embedding labeling for subcellular detection of molecules with electron microscopy. Tissue and Cell. 57, 103-110 (2019).
  11. Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Luini, A. Visualizing Live Dynamics and Ultrastructure of Intracellular Organelles with Preembedding Correlative Light-Electron Microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy. Mueller-Reichert, T., Verkade, P. 111, Elsevier. 21-35 (2012).
  12. Humbel, B. M., De Jong, M. D. M., Müller, W. H., Verkleij, A. J. Pre-embedding immunolabeling for electron microscopy: An evaluation of permeabilization methods and markers. Microscopy Research and Technique. 42, 43-58 (1998).
  13. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9, 152-158 (2012).
  14. Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New Frontiers in Gold Labeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 471-480 (2000).
  15. Hainfeld, J. F., Furuya, F. R. A 1.4-nm Gold Cluster Covalently Attached to Antibodies Improves Immunolabeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40, 177-184 (1992).
  16. Baschong, W., Stierhof, Y. Preparation, Use, and Enlargement of Ultrasmall Gold Particles in Immunoelectron Microscopy. Microscopy Research and Technique. 42, 66-79 (1998).
  17. Roth, J., Bendayan, M., Orci, L. Ultrastructural loclaization of intracellular antigens by the use of Protein A-gold complex. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 26, 1074-1081 (1978).
  18. Armbruster, B. L., et al. Specimen preparation for electron microscopy using low temperature embedding resins. Journal of Microscopy. 126, 77-85 (1982).
  19. Fowler, C. B., Leary, T. J. O., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Laboratory Investigation. 88, 785-791 (2008).
  20. Newman, G. R., Hobot, J. A. Modern Acrylics for Post-embedding Immunostaining Techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35, 971-981 (1987).
  21. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. The Journal of Cell Biology. 57, 551-565 (1973).
  22. Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143, 139-149 (1986).
  23. Möbius, W., Posthuma, G. Sugar and ice Immunoelectron microscopy using cryosections according to the Tokuyasu method. Tissue and Cell. 57, 90-102 (2019).
  24. Gaietta, G., et al. Multicolor and Electron Microscopic Imaging of Connexin Trafficking. Science. 296, 503-508 (2002).
  25. Uttamapinant, C., et al. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 10914-10919 (2010).
  26. Porstmann, B., Porstmann, T., Nugel, E., Evers, U. Which of the Commonly Used Marker Enzymes Gives the Best Results in Colorimetric and Fluorimetric Enzyme Immunoassays: Horseradish Peroxidase, Alkaline Phosphatase or Beta-Galactosidase. Journal of Immunological Methods. 79, 27-37 (1985).
  27. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biology. 9, 1001041 (2011).
  28. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160, 70-82 (2007).
  29. Wang, Q., Mercogliano, C. P., Löwe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19, 147-154 (2011).
  30. Risco, C., et al. Specific, sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20, 759-766 (2012).
  31. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. E. Chimeric Molecules Employing Horseradish Peroxidase as Reporter Enzyme for Protein Localization in the Electron Microscope. Methods in Enzymology. Thorner, J., Emr, S. D., Abelson, J. N. 327, 35-45 (2000).
  32. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetrcysteine-tagged proteins in intact cells. Nature Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  33. Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30, 1143-1150 (2012).
  34. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12, (2015).
  35. Ariotti, N., et al. Modular Detection of GFP-Labeled Proteins for Rapid Screening by Electron Microscopy in Cells and Organisms. Developmental Cell. 35, 513-525 (2015).
  36. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12, 1792-1816 (2017).
  37. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130, 877-889 (2008).
  38. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure Freezing for the Preservation of Biological Structure: Theory and Practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  39. McDonald, K. L. High-Pressure Freezing for Preservation of High Resolution Fine Structure and Antigenicity for Immunolabeling. Electron Microscopy Methods and Protocols. Hajibagheri, N. 117, Humana Press. 77-97 (1999).
  40. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  41. Korn, E. D., Weisman, R. A. Loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 116, 309-316 (1966).
  42. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. Journal of Cell Biology. 163, 257-269 (2003).
  43. Sandig, G., et al. Regulation of endoplasmic reticulum biogenesis in response to cytochrome P450 overproduction. Drug Metabolism Reviews. 31, 393-410 (1999).
  44. Faber, P. W., et al. Huntingtin interacts with a family of WW domain proteins. Human Molecular Genetics. 7, 1463-1474 (1998).
  45. Worby, C. A., et al. Article The Fic Domain Regulation of Cell Signaling by Adenylylation. Molecular Cell. 34, 93-103 (2009).
  46. Sanyal, A., et al. A Novel Link between Fic (Filamentation Induced by cAMP) - mediated Adenylylation / AMPylation and the Unfolded Protein Response. The Journal of Biological Chemistry. 290, 8482-8499 (2015).
  47. Mattoo, S., et al. Comparative Analysis of Histophilus somni Immunoglobulin-binding Protein A (IbpA) with Other Fic Domain-containing Enzymes Reveals Differences in Substrate and Nucleotide Specificities. The Journal of Biological Chemistry. 286, 32834-32842 (2011).
  48. Sengupta, R., Poderycki, M. J., Mattoo, S. CryoAPEX - an electron tomography tool for subcellular localization of membrane proteins. Journal of Cell Science. 132, 222315 (2019).
  49. Tsang, T. K., et al. High-quality ultrastructural preservation using cryofixation for 3D electron microscopy of genetically labeled tissues. eLife. 7, 1-23 (2018).
  50. Giddings, T. H. Freeze-substitution protocols for improved visualization of membranes in high-pressure frozen samples. Journal of Microscopy. 212, 53-61 (2003).
  51. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  52. McDonald, K. Cryopreparation methods for electron microscopy of selected model systems. Methods in Cell Biology. 79, 23-56 (2007).
  53. Buser, C., Walther, P. Freeze-substitution: the addition of water to polar solvents enhances the retention of structure and acts at temperatures around -60 degrees C. Journal of Microscopy. 230, 268-277 (2008).
  54. Jiménez, N., et al. Tannic acid-mediated osmium impregnation after freeze-substitution A strategy to enhance membrane contrast for electron tomography. Journal of Structural Biology. 166, 103-106 (2009).
  55. Han, Y., et al. Directed Evolution of Split APEX2 Peroxidase. ACS chemical biology. 14, 619-635 (2019).
  56. Kuipers, J., Van Ham, T. J., Kalicharan, R. D., Schnell, U., Giepmans, B. N. G. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Research. 360, 61-70 (2015).
  57. Zhou, Y., et al. Expanding APEX2 Substrates for Spatial-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins in Living Cells. Angewandte Chemie. , International ed. in English (2019).
  58. Joesch, M., et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy. eLife. 5, 1-13 (2016).

Tags

ביולוגיה סוגיה 156 קריואיפקס חלבון ממברנה APEX2 מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים קריוקיבעון הקפאה בלחץ גבוה הקפאת החלפת
שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin,… More

Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin, R. V., Mattoo, S. The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells. J. Vis. Exp. (156), e60677, doi:10.3791/60677 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter