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Biology

अल्ट्रास्ट्रक्चरल-संरक्षित कोशिकाओं के भीतर झिल्ली प्रोटीन स्थानीयकरण के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए क्रायोएपेक्स विधि

Published: February 27, 2020 doi: 10.3791/60677
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5,6
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 3Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University, 4Bindley Biosciences Center, Purdue University, 5Purdue Institute of Integrative Neuroscience, Purdue University, 6Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

Summary

यह प्रोटोकॉल क्रायोएपेक्स विधि का वर्णन करता है, जिसमें एक एपेक्स2-टैग झिल्ली प्रोटीन को इष्टतम संरक्षित सेल अल्ट्रास्ट्रक्चर के भीतर ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा स्थानीयकृत किया जा सकता है।

Abstract

सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन और झिल्ली तस्करी जैसी प्रमुख सेलुलर घटनाएं सेलुलर डिब्बों के भीतर उचित प्रोटीन स्थान पर भरोसा करती हैं। प्रोटीन के सटीक उपसेलुलर स्थानीयकरण को समझना इस प्रकार कई जैविक सवालों का जवाब देने के लिए महत्वपूर्ण है। पर्याप्त सेलुलर संरक्षण और धुंधला के साथ संयुक्त प्रोटीन स्थानीयकरण की पहचान करने के लिए एक मजबूत लेबल की खोज ऐतिहासिक रूप से चुनौतीपूर्ण रही है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) इमेजिंग में हाल ही में हुई प्रगति ने सेलुलर संरक्षण और लेबल लक्ष्य प्रोटीन को बढ़ाने के लिए कई तरीकों और रणनीतियों का विकास किया है। एक अपेक्षाकृत नए peroxidase आधारित आनुवंशिक टैग, APEX2, क्लोनी EM-सक्रिय टैग में एक होनहार नेता है । ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीएमईएम) के लिए नमूना तैयारी भी उच्च दबाव ठंड (एचपीएफ) और कम तापमान निर्जलीकरण और फ्रीज प्रतिस्थापन (एफएस) के माध्यम से धुंधला द्वारा क्रायोफोक्सेशन के आगमन के साथ हाल के वर्षों में उन्नत है । एचपीएफ और एफएस टेम इमेजिंग के लिए सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर का उत्कृष्ट संरक्षण प्रदान करते हैं, दूसरा केवल विट्रेस नमूनों की क्रायो-इमेजिंग को निर्देशित करने के लिए। यहां हम क्रायोएपेक्स विधि के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जो एचपीएफ और एफएस के साथ एपेक्स 2 टैग के उपयोग को जोड़ती है। इस प्रोटोकॉल में, ब्याज के प्रोटीन को एपेक्स2 के साथ टैग किया गया है, जिसके बाद रासायनिक निर्धारण और पेरोक्सिडेस प्रतिक्रिया होती है। कमरे के तापमान पर पारंपरिक धुंधला और शराब निर्जलीकरण के स्थान पर, नमूना क्रायोफिक्स्ड है और निर्जलीकरण से गुजरता है और एफएस के माध्यम से कम तापमान पर धुंधला हो जाता है। क्रायोकैपेक्स का उपयोग करके, न केवल उपकोशिकी डिब्बों के भीतर ब्याज के प्रोटीन की पहचान की जा सकती है, बल्कि संरचनात्मक रूप से संरक्षित झिल्ली के भीतर इसकी टोपोलॉजी के संबंध में अतिरिक्त जानकारी का समाधान भी किया जा सकता है। हम बताते हैं कि यह विधि एक ऑर्गेनेल लुमेन के भीतर प्रोटीन वितरण पैटर्न को समझने के लिए उच्च पर्याप्त संकल्प प्रदान कर सकती है, और अन्य अवेलेबल ऑर्गेनेल्स के निकट एक ऑर्गेनेल के भीतर प्रोटीन के विभाजक को अलग करने के लिए। इसके अलावा, क्रायोएपेक्स ऊतक संस्कृति में उगाई जाने वाली कोशिकाओं के लिए प्रक्रियात्मक रूप से सरल और उत्तरदायी है। यह विशिष्ट क्रायोफोनिक्सेशन की तुलना में अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण नहीं है और प्रतिस्थापन विधियों को फ्रीज कर रहा है। क्रायोएपेक्स किसी भी झिल्ली प्रोटीन के टेम विश्लेषण के लिए व्यापक रूप से लागू होता है जिसे आनुवंशिक रूप से टैग किया जा सकता है।

Introduction

जैविक अध्ययनों में अक्सर कोशिकाओं और ऑर्गेनेल्स के भीतर उपसेलुलर प्रोटीन स्थानीयकरण को हल करने के प्रश्न शामिल होते हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी प्रोटीन स्थानीयकरण का एक उपयोगी कम संकल्प दृश्य प्रदान करती है, और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग में हाल की प्रगति फ्लोरोसेंटटैग टैग किए गए प्रोटीन1,2,3के लिए संकल्प की सीमा को आगे बढ़ा रही है। हालांकि, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) उच्च-रिज़ॉल्यूशन सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर इमेजिंग के लिए सोने का मानक बना हुआ है, हालांकि प्रोटीन की लेबलिंग एक चुनौती है।

ऐतिहासिक रूप से, अल्ट्रास्ट्रक्चरल प्रोटीन स्थानीयकरण के सवालों के दृष्टिकोण के लिए कई ईएम विधियों का उपयोग किया गया है। सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले तरीकों में से एक इम्यूनोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (आईईएम) है, जहां ब्याज के प्रोटीन का पता लगाने के लिए एंटीजन-विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है। ईएम सिग्नल इलेक्ट्रॉन-घने कणों के साथ संयुगर्चर माध्यमिक एंटीबॉडी के अनुप्रयोग द्वारा उत्पन्न होता है, जो आमतौर पर कोलॉयडल गोल्ड4,5होता है। वैकल्पिक रूप से, हॉर्स मूली पेरोक्सिडेस (एचआरपी) जैसे एंजाइमों के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग इलेक्ट्रॉन-घने उपजी6,7,8का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है। आईईएम के लिए दो मुख्य दृष्टिकोण मौजूद हैं, उन्हें प्री-एम्बेडिंग और पोस्ट-एम्बेडिंग लेबलिंग कहा जाता है। पूर्व-एम्बेडिंग आईईएम में, एंटीबॉडी सीधे कोशिकाओं में पेश किए जाते हैं, जिसके लिए9,10,11कोशिकाओं के प्रकाश निर्धारण और परमीबिलाइजेशन की आवश्यकता होती है। दोनों कदमअल्ट्रास्ट्रक्चर 12,13को नुकसान पहुंचा सकते हैं . 1.4 एनएम नैनोगोल्ड के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी फैब टुकड़े से मिलकर काफी छोटे एंटीबॉडी का विकास बहुत कोमल परमीबिलाइजेशन की स्थिति का उपयोग करने की अनुमति देता है; हालांकि, नैनोगोल्ड TEM के तहत प्रत्यक्ष दृश्य के लिए बहुत छोटा है और अतिरिक्त वृद्धि कदम की आवश्यकता के लिए दिखाई14,15,16हो . पोस्ट-एम्बेडिंग आईईएम में, एंटीबॉडी कोशिकाओं के पतले वर्गों पर लागू होते हैं जिन्हें पूरी तरह से निर्धारण, निर्जलीकरण और रेसिन17में एम्बेड करके संसाधित किया गया है। हालांकि यह दृष्टिकोण परमीबिलाइजेशन के कदम से बचता है, नमूना तैयारी के दौरान ब्याज के प्रतीक को संरक्षित करना18,19,20को चुनौती दे रहा है। प्रकाश निर्धारण की टोकुयासु विधि ठंड, क्रायो-सेक्शनिंग और एंटीबॉडी डिटेक्शन के बाद बेहतर एपिटोप संरक्षण21,22प्रदान करती है। हालांकि, क्रायो-अल्ट्रामाइक्रोटॉमी की तकनीकी आवश्यकताओं के साथ-साथ सेल में हासिल किए गए उप-इष्टतम विपरीत,नुकसान 23हैं।

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड टैग का उपयोग आईईएम की कई कठिनाइयों को समाप्त करता है जो ब्याज के प्रोटीन का पता लगाने से संबंधित हैं। एचआरपी, फेरिटिन, रेहा, मिसोग और मेटललोथिओनिन24,25,26,27,28,29,30,31,32सहित कई तरह के टैग उपलब्ध हैं। इनमें से प्रत्येक के पिछले तरीकों पर फायदे हैं, लेकिन प्रत्येक में व्यापक उपयोग को रोकने वाली कमियां भी हैं। ये कमियां साइटोसोल में एचआरपी की निष्क्रियता से लेकर फेरिटिन टैग के बड़े आकार, रेहा की हल्की संवेदनशीलता और छोटे आकार और धातुके स्नेसिंग के साथ अनुकूलता की कमी तक हैं। हाल ही में, एकोर्बेट पेरोक्सिडेस से प्राप्त प्रोटीन को ईएम टैग के रूप में इंजीनियर किया गया है, जिसका नाम एपेक्स233,34है। एक पेरोक्साइडके रूप में, एपेक्स2 3,3' डिमिनोबेंजिडीन (डीएबी) के ऑक्सीकरण को उत्प्रेरित कर सकता है, जो एक तेज़ का उत्पादन करता है जो ओस्मियम टेट्राऑक्साइड के साथ प्रतिक्रिया करता है ताकि ब्याज के प्रोटीन (25 एनएम से कम)33,35से कम प्रसार के साथ स्थानीय ईएम विपरीत प्रदान किया जा सके। पारंपरिक एचआरपी आधारित तरीकों के विपरीत, एपेक्स2 बेहद स्थिर है और सभी सेलुलर डिब्बों३३में सक्रिय रहता है । पारंपरिक ईएम नमूने और उन तरीकों का उपयोग करके टीईएम के लिए नमूने संसाधित किए जा सकते हैं जो आसपास की संरचनाओं33,34,36के अच्छे दृश्य की अनुमति देते हैं . अपने छोटे आकार, स्थिरता और बहुमुखी प्रतिभा के कारण, एपेक्स2 महान क्षमता के साथ एक ईएम टैग के रूप में उभरा है।

ऊपर चर्चा किए गए कई दृष्टिकोण या तो नहीं हो सकते या अभी तक अल्ट्रास्ट्रक्चरल संरक्षण, क्रायोफिकीकरण और कम तापमान फ्रीज-प्रतिस्थापन में कला की वर्तमान स्थिति के साथ संयुक्त नहीं किए गए हैं। इस प्रकार, वे सटीक प्रोटीन स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए झिल्ली संरक्षण और/या सेल धुंधला की कमी से पीड़ित हैं । यह आवश्यक रूप से प्राप्त किए जा सकने वाले डेटा के संकल्प और व्याख्या को सीमित करता है। उच्च दबाव ठंड (एचपीएफ) द्वारा क्रायोफोनिक्सेशन में उच्च दबाव (~ 2,100 बार) पर तरल नाइट्रोजन में नमूनों की तेजी से ठंड शामिल है, जो जलीय नमूनों के क्रिस्टलीकरण के बजाय विट्रीफिकेशन का कारण बनता है, इस प्रकार लगभग देशी राज्य37,38,39में कोशिकाओं को संरक्षित करता है। एचपीएफ के बाद फ्रीज प्रतिस्थापन (एफएस), एक कम तापमान (-90 डिग्री सेल्सियस) एसिटोन में निर्जलीकरण होता है, जो ओस्मियम टेट्राऑक्साइड और यूरिनल एसीटेट जैसे विशिष्ट ईएम दाग के साथ ऊष्मायन के साथ संयुक्त होता है। एचपीएफ और एफएस एक साथ पारंपरिक रासायनिक निर्धारण (एक लंबी प्रक्रिया जो कलाकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं) और कमरे के तापमान पर या बर्फ पर शराब निर्जलीकरण पर एक अलग लाभ प्रदान करते हैं (जो लिपिड और शर्करा के निष्कर्षण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं), और इस प्रकार प्रोटीन का पता लगाने के लिए सबसे अच्छा EM टैग के साथ गठबंधन करने के लिए वांछनीय हैं ।

एक कारण है कि एचपीएफ/एफएस को APEX2 लेबलिंग के साथ संयुक्त नहीं किया गया है, वह यह है कि प्रकाश रासायनिक निर्धारण पेरोक्सिडेस प्रतिक्रिया के लिए एक शर्त है, जो डीएबी प्रतिक्रिया उत्पाद के प्रसार को सीमित करता है । इस प्रकार अब तक के शीर्ष 2 अध्ययनों में, फिक्सेशन और पेरोक्सिडेस प्रतिक्रिया के बाद धुंधला और अल्कोहल निर्जलीकरण33,36के लिए पारंपरिक ईएम विधियां अपनाई जाती हैं। हालांकि, यह दिखाया गया है कि एचपीएफ/एफएस के साथ रासायनिक निर्धारण के बाद पारंपरिक रासायनिक निर्धारण और अकेले४०पर शराब निर्जलीकरण पर संरक्षण में एक अलग लाभ प्रदान करता है । पारंपरिक TEM नमूनों में देखी गई अल्ट्रास्ट्रक्चरल अखंडता का नुकसान निर्जलीकरण की तुलना में निर्धारण से कम जुड़ा हुआ दिखाई देता है, जो आमतौर पर कमरे के तापमान पर या बर्फ पर शराब का उपयोग करके किया जाता है, और लिपिड और शर्करा40,41को निकालने का कारण बन सकता है। क्रायोएपेक्स विधि विकसित करने के लिए, हमने परिकल्पना की कि एचपीएफ और एफएस के बाद रासायनिक निर्धारण और पेरोक्सिड्स प्रतिक्रिया, अल्ट्रास्ट्रक्चरल संरक्षण के मामले में इष्टतम परिणाम का उत्पादन करेगी।

यहां हम क्रायोकैपेक्स प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जो एपेक्सेशन के साथ एपेक्स 2 टैगिंग को जोड़ती है और प्रतिस्थापन विधियों(चित्रा 1)को फ्रीज करती है। इस सरल प्रोटोकॉल में ब्याज के एपेक्स2-टैग प्रोटीन, कोशिकाओं के रासायनिक निर्धारण और पेरोक्सिडेस प्रतिक्रिया का ट्रांसफेक्शन शामिल है। एचपीएफ और एफएस तो ठेठ रेसिन एम्बेडिंग और पतली अनुभागन के बाद किया जाता है । TEM इमेजिंग इस विधि का उपयोग कर अल्ट्रास्ट्रक्चर के उत्कृष्ट संरक्षण का पता चलता है। इसके अतिरिक्त, उच्च-रिज़ॉल्यूशन उपसेलुलर स्थानीयकरण और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) लुमेनल प्रोटीन का स्थानिक वितरण देखा गया। यह विधि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए कोशिकाओं के भीतर झिल्ली प्रोटीन स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए व्यापक रूप से उपयोगी है। हमारे हाथों में, विधि ने ऊतक संस्कृति में उगाई जाने वाली विभिन्न प्रकार की सेल लाइनों के लिए सफलतापूर्वक काम किया है, जिसमें एचईसी-293T (मानव भ्रूणीय गुर्दे), वाघेला (मानव गर्भाशय ग्रीवा का कैंसर), Cos7 (अफ्रीकी हरी बंदर गुर्दे फाइब्रोब्लास्ट), और बीएचके (बेबी हम्सटर किडनी) शामिल हैं। विस्तृत निर्देश HEK-293T कोशिकाओं का उपयोग कर नीचे वर्णित हैं ।

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Protocol

1. सेल कल्चर और ट्रांसफेक्शन

  1. बीज एचईसी- 60 मिमी व्यास या बड़े ऊतक संस्कृति पकवान पर 293T कोशिकाएं और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 60% -90% संगम तक बढ़जाती हैं।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार ट्रांसफेक्शन रिएजेंट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके एपेक्स 2-टैग स्तनधारी अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफेक्ट कोशिकाएं।
  3. 12-15 घंटे के बाद ट्रांसफेक्शन में, फॉस्फेट बफर्ड लवइन (पीबीएस) के साथ एक बार कोशिकाओं को धोएं। पीबीएस के साथ कोमल धोने से पकवान से कोशिकाओं को हटा दें। दिए गए सेल प्रकार के लिए आवश्यक होने पर ट्राइप्सिन जैसे विसोशन रिएजेंट का उपयोग किया जा सकता है। 5 00 x ग्राम पर 500 x पर एक गोली बनाने के लिए 500 x पर अपकेंद्रित्र।

2. रासायनिक निर्धारण और पेरोक्सिडेस प्रतिक्रिया

  1. ध्यान से सुपरनेट को हटा दें और कमरे के तापमान पर 0.1 एम सोडियम कैकोडिलेट बफर, पीएच 7.4 में 2% ग्लूटाराल्डिहाइड (v/v) के 2 mL में पैलेट को फिर से निलंबित करें। बर्फ पर नमूना रखें और 30 मिन के लिए इनक्यूबेट करें। 500 x ग्राम पर 500 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 x ग्राम पर नमूना रखें। इस बिंदु से कदम 2.3.3 तक, बर्फ पर नमूना और समाधान रखें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रीकरण करें।
    सावधानी: ग्लूटाराल्डिहाइड और सोडियम कैकोडिलेट बफर (आर्सेनिक युक्त) दोनों जहरीले होते हैं। हैंडलिंग के दौरान उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग किया जाना चाहिए। ग्लूटाराल्डिहाइड और/या सोडियम कैकोडिलेट बफर वाले समाधानों को खतरनाक रासायनिक अपशिष्ट के रूप में निपटाया जाना चाहिए ।
  2. 0.1 मीटर सोडियम कैकोडिलेट बफर के 2 mL के साथ 5 मिन के लिए पैलेट 3x धोलें। इन के साथ-साथ बाद के वॉश के लिए, आवश्यक समाधान में सेल पैलेट को धीरे से फिर से निलंबित करें, फिर 500 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्री और ध्यान से हटाने और supernatant त्यागें। नमूना हानि को कम करने के लिए बार-बार पैलेटिंग और पुनर्निलंबन कदमों के साथ देखभाल की जानी चाहिए।
  3. पेरोक्सिडेस प्रतिक्रिया को पूरा करें
    1. 0.1 मीटर सोडियम कैकोडिलेट बफर में 3,3'-डाइमिनोबेंजेडीन टेट्राहाइड्रोक्लोराइड (डीएबी) के 1 मिलीग्राम/एमएल वाले एक ताजा समाधान तैयार करें। 5-10 मिन के लिए जोरदार भंवर द्वारा DAB भंग।
      सावधानी: DAB विषाक्त और एक संभावित कैंसरजन है और उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ संभाला जाना चाहिए । डीएबी युक्त समाधानों को खतरनाक रासायनिक अपशिष्ट माना जाना चाहिए ।
    2. डीएबी समाधान के 3 mL में फिर से निलंबित करके पैलेट को धोएं और उसके बाद 5 00 x g पर 500 x g पर 5 min के लिए गोली मार दी।
    3. 3 एमएल डीएबी समाधान में पैलेट को फिर से निलंबित करें, जिसमें हाइड्रोजन पेरोक्साइड को 5.88 मीटर की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जोड़ा गया है। कमरे में अस्थायी पर 30 मेंस के लिए इनक्यूबेट। गोली अघुलनशील डीएबी प्रतिक्रिया उत्पाद की उपस्थिति का संकेत भूरे रंग की दिख रही हो जाती है।
      नोट: प्रत्येक नमूने के लिए डीएबी ऊष्मायन समय को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। हल्के माइक्रोस्कोप पर रंग परिवर्तन पर नजर रखी जा सकती है। हमारे अनुभव में, अधिकांश प्रोटीन के लिए 15-45 मिन का ऊष्मायन पर्याप्त है। हाइड्रोजन पेरोक्साइड को एक ताजा खुली बोतल या एक से प्राप्त किया जाना चाहिए जिसे खोलने के बाद अच्छी तरह से सील रखा गया है।
    4. कोशिकाओं को गोली मारें, फिर 0.1 एम सोडियम कैकोडिलेट बफर के साथ 5 मिन के लिए 2x धोएं, इसके बाद दुलबेक्को के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) या पसंद के सेल मीडिया में एक धोने के बाद।
  4. डीएमईएम (या पसंद के अन्य सेल मीडिया) के क्रायो-प्रोटेक्टेंट समाधान के 500 माइक्रोन में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 15% गोजातीय सीरम एल्बुमिन शामिल हैं। फिर से गोली, 500 x ग्राम से अपकेंद्रित्र गति को थोड़ा बढ़ाना यदि आवश्यक हो तो मोटी क्रायो-प्रोटेक्टेंट समाधान में एक गोली प्राप्त करने के लिए। अधिकांश अधिनायक को त्यागें, यह सुनिश्चित करते हुए कि पर्याप्त तरल छोड़ दिया जाए ताकि गोली सूख न जाए। सेल पैलेट को हाई प्रेशर फ्रीजिंग इंस्ट्रूमेंट तक पहुंचाएं।

3. उच्च दबाव ठंड

  1. उच्च दबाव फ्रीजर जलाशय तरल नाइट्रोजन (एलएन2)के साथ भरें और एलएन2के साथ नमूना कक्ष को भरने के लिए पंप शुरू करें ।
    सावधानी: तरल नाइट्रोजन के साथ काम करते समय उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें।
    नोट: ये कदम Leica EMPACT2 उच्च दबाव फ्रीजर के लिए विशिष्ट हैं ।
  2. एक प्रयोगशाला पोंछ या कागज तौलिया के कोने का उपयोग कर सेल गोली से किसी भी शेष तरल दूर बाती । पर्याप्त तरल रहना चाहिए कि गोली टूथपेस्ट के लिए स्थिरता में समान पेस्ट बनाती है। यह काफी पतली होना चाहिए एक 20 μL पाइप टिप में aspirated ।
  3. कोशिका गोली के Aspirate 2-3 μL और यह एक झिल्ली वाहक पर जमा। झिल्ली वाहक के कुएं को पूरी तरह से भरें, ताकि सतह तनाव शीर्ष पर एक मामूली गुंबद बनाता है, लेकिन तरल कुएं से बाहर नहीं फैलता है। कोई हवा बुलबुले मौजूद नहीं होना चाहिए।
  4. झिल्ली वाहक को कारतूस में स्लाइड और सुरक्षित। कारतूस को एचपीएफ मशीन में रखें जिसे प्रीपीपी और प्रिमेड किया गया है, और फ्रीज करने के लिए प्रेस स्टार्ट करें।
  5. तापमान बनाम समय और दबाव बनाम समय रेखांकन का निरीक्षण करने के लिए सत्यापित करें कि दबाव २१०० बार तक पहुंच गया और तापमान २०० एमएस के भीतर-१९६ डिग्री सेल्सियस तक पहुंच गया, और दोनों मापदंडों माप के ६०० एमएस के लिए स्थिर रहे ।
  6. सेल पैलेट का उपयोग नहीं किया गया है या नमूनों की वांछित संख्या फ्रीज कर दी गई है जब तक चरण 3.3 से 3.5 दोहराएं।
  7. एलएन2में डूबे कारतूस रखते हुए, प्रत्येक झिल्ली वाहक को अपने कारतूस से हटा दें, प्लास्टिक कैप्सूल में रखें, और प्लास्टिक कैप्सूल को एलएन2से भरे क्रायो-शीशी में रखें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रुका हो सकता है । नमूनों के साथ क्रायो-शीशियों को क्रायो-केन या क्रायो-बॉक्स में एलएन2 देवर में संग्रहित किया जा सकता है।

4. फ्रीज प्रतिस्थापन

सावधानी: तरल नाइट्रोजन के साथ काम करते समय उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें। इसके अतिरिक्त, चरण 4 में उपयोग किए जाने वाले कई रसायन विषाक्त हैं, जिनमें टैनिक एसिड, ओस्मियम टेट्राऑक्साइड और यूरिनल एसीटेट शामिल हैं। इन रसायनों को उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं के अनुसार संभाला जाना चाहिए और खतरनाक रासायनिक अपशिष्ट के रूप में निपटाया जाना चाहिए ।

  1. एलएन2के साथ स्वचालित फ्रीज प्रतिस्थापन इकाई भरें । तापमान को -90 डिग्री सेल्सियस तक लाएं।
  2. एफएस मिक्स 1 तैयार करें और एफएस शुरू करें।
    1. रासायनिक हुड में, 0.2% टैनिक एसिड (डब्ल्यू/वी) और एसीटोन में 5% डीआई पानी का समाधान तैयार करें और क्रायो-शीशियों में प्रति नमूना 1 किलोउद्धन करें। फ्रीज करने के लिए एलएन2 में रखें।
    2. एफएस मिक्स 1 शीशियों और क्रायो-शीशियों को एफएस यूनिट के सैंपल चैंबर में फ्रोजन सेल छर्रों वाले रखें। एलएन2 शीशी से झिल्ली वाहक वाले आंतरिक कैप्सूल को एफएस मिक्स 1 युक्त इसी शीशी में स्थानांतरित करें।
    3. -90 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे होने के साथ एक एफएस प्रोटोकॉल शुरू करें। 24 घंटे के बाद, एफएस को रोकें, और 5 मिन के लिए नमूनों को 3x को एसीटोन के साथ धोएं जो -90 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो गया है।
  3. एफएस मिक्स 2 और पूरा एफएस तैयार करें
    सावधानी: ओस्मियम टेट्रोऑक्साइड एक अत्यधिक विषाक्त और ऑक्सीकरण रसायन है जिसे केवल स्थापित सुरक्षा प्रोटोकॉल के अनुसार प्रशिक्षित व्यक्तियों द्वारा संभाला जाना चाहिए। ओस्मियम युक्त समाधानों के भंडारण और निपटान के लिए प्रोटोकॉल का पालन किया जाना चाहिए, साथ ही प्रयोगशाला क्षेत्रों की लेबलिंग जहां ओस्मियम टेट्रोऑक्साइड का उपयोग किया जा रहा है । ओस्मियम टेट्राऑक्साइड को आंखों की सुरक्षा, पूर्ण हाथ संरक्षण प्रदान करने वाला एक प्रयोगशाला कोट, डबल निट्रिल दस्ताने और एक वैकल्पिक श्वसन यंत्र सहित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ रासायनिक हुड में संभाला जाना चाहिए।
    1. रासायनिक हुड में, एसीटोन में 1% ऑस्मियम टेट्राऑक्साइड, 0.2% यूरिनल एसीटेट और 5% डीआई पानी का समाधान तैयार करें। Aliquot 1 mL प्रति नमूना क्रायो-शीशियों में और एलएन2 में जगह फ्रीज करने के लिए ।
      नोट: टैनिक एसिड के स्टॉक समाधान (एसीटोन में 10% w/v), ओस्मियम टेट्रोऑक्साइड (एसीटोन में 10% w/v) और यूरेनल एसीटेट (मेथनॉल में 8% w/v) को तैयार किया जा सकता है और एफएस मिक्स की तैयारी में आसानी के लिए एलएन2 देवर में क्रायो-शीशियों में संग्रहीत किया जा सकता है ।
    2. एफ एस मिक्स 2 के साथ क्रायो-शीशियों को एफएस यूनिट में रखें और तीसरे एसीटोन वॉश से कैप्सूल को एफएस मिक्स 2 शीशियों में ट्रांसफर करें। एफएस मिक्स 2 में -90 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए इनक्यूबेट, इसके बाद 12-18 घंटे से अधिक 0 डिग्री सेल्सियस तक क्रमिक वार्मिंग हुई।
  4. तापमान 0 डिग्री सेल्सियस पर रखें और एक ताजा खुली बोतल से पूर्व कूल्ड एसीटोन के साथ 30 न्यूनतम के लिए 3x धोएं।

5. रेसिन घुसपैठ और एम्बेडिंग

सावधानी: यहां इस्तेमाल किया राल (सामग्री की तालिकादेखें) बहुलीकरण से पहले विषाक्त है, और उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ संभाला जाना चाहिए । किसी भी अपॉलीमरेज रेसिन को खतरनाक रासायनिक अपशिष्ट के रूप में निपटाया जाना चाहिए।

  1. एक नई खोली गई बोतल से एसीटोन में भंग रेसिन की बढ़ती सांद्रता के साथ नमूनों में घुसपैठ करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्लास्टिक बीकर में रेसिन घटकए, बी और डी का मिश्रण तैयार करें, और निम्नलिखित रेसिन सांद्रता में नमूने इनक्यूबेट करें: 2%, 4%, और 0 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक 2 घंटे के लिए 8%। कमरे के तापमान पर 4 घंटे प्रत्येक के लिए 15%, 30%, 60%, 90%, और 100% रेसिन में इनक्यूबेट। घटकए, बी, सी और डी के मिश्रण में 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. कोशिका पैलेट साइड के साथ झिल्ली वाहकों को फ्लैट एम्बेडिंग मोल्ड्स में रखें और रेसिन (ए, बी, सी और डी) से भरें। नमूनों के लिए पेपर लेबल इस समय कुओं में जोड़े जा सकते हैं।
  3. 24-36 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में बहुलक।
    नोट: पॉलीमराइजेशन के बाद प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।
  4. मोल्ड से ब्लॉक निकालें और शांत होने दें। झिल्ली वाहक को हटाने के लिए, सबसे पहले नमूना को अल्ट्रामाइक्रोटोम के ऊर्ध्वाधर चक में रखें जहां इसे आवर्धन के साथ कल्पना की जा सकती है। झिल्ली वाहक से धातु को अलग करने के लिए झिल्ली वाहक पर तरल नाइट्रोजन को डब करने के संयोजन से ब्लॉक से झिल्ली वाहक को अलग करें, और झिल्ली वाहक के चारों ओर राल को चिप करने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें। अलग होने पर, धीरे-धीरे ब्लॉक के चेहरे पर सेल पैलेट गुंबद छोड़ने वाली झिल्ली वाहक को धीरे से उठाएं।
  5. उजागर सेल पैलेट के साथ ब्लॉक को एक फ्लैट एम्बेडिंग मोल्ड में ऊपर की ओर रखें जो पहले मोल्ड की तुलना में थोड़ा गहरा है, और रेसिन से भरें। 24-36 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर पॉलीमरेज।
    नोट: पॉलीमराइजेशन के बाद प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।

6. सेक्शनिंग

  1. एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर सेल गोली के आसपास ब्लॉक ट्रिम। फिर एक अल्ट्रामाइक्रोटोम के सेक्शनिंग आर्म पर नमूना चक में ब्लॉक रखें। एक गिलास या हीरे के चाकू का उपयोग करना, सेल गोली के आसपास एक ट्रैपेजोइडल आकार में ब्लॉक ट्रिम करें।
  2. एक गिलास या हीरे के चाकू का उपयोग कर सेल गोली के 90 एनएम अल्ट्राथिन वर्गों प्राप्त करें।
  3. टेम ग्रिड पर वर्गों का रिबन उठाएं। फॉर्मवर-लेपित कॉपर स्लॉट ग्रिड (1 x 2 मिमी2 स्लॉट) इमेजिंग सीरियल सेक्शन के लिए उपयोगी हैं। फिल्टर पेपर के एक टुकड़े पर किनारे को दाग करग्रिड को सुखालें, और टेम ग्रिड स्टोरेज बॉक्स में स्टोर करें।
    नोट: अनुभागके बाद प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।

7. टेम इमेजिंग

  1. टेम धारक पर ग्रिड माउंट और माइक्रोस्कोप में जगह है। हम नियमित रूप से क्रायोएपेक्स नमूनों की जांच के लिए 80 केवी पर एक टेकनई टी12 का उपयोग करते हैं। एपेक्स2 लेबलिंग के साथ कोशिकाओं और ब्याज की उपकोशिकी संरचनाओं की छवियां प्राप्त करें।
  2. यदि वांछित है, तो लीड पोस्ट-धुंधला के उपयोग से अतिरिक्त झिल्ली विपरीत प्राप्त करें। गैर-पोस्ट-दाग नमूनों की तुलना के लिए चित्रा 2 देखें(चित्रा 2आई-K) और लीड पोस्ट-दाग नमूने(चित्र ा 2ए-एच)।
    1. सूखी ग्रिड अनुभाग-साइड नीचे पतला सोडियम क्लोराइड समाधान (~ 1.5 mM), 1 मिन प्रत्येक के लिए 2x, तो 10 min के लिए 1x की एक बूंद पर नीचे फ्लोट करें।
    2. 1 मिन के लिए सातो के लीड सॉल्यूशन की एक बूंद पर फ्लोट करें। 1 मिन के लिए सोडियम क्लोराइड सॉल्यूशन 3x पर तैरकर धोएं, फिर 1 मिन के लिए डीआई वॉटर 3x पर। ग्रिड से अतिरिक्त तरल दागें और ग्रिड बॉक्स में स्टोर करें।
      सावधानी: सीसा एक विषाक्त रसायन है और उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ संभाला जाना चाहिए । सीसा युक्त समाधानों को खतरनाक रासायनिक अपशिष्ट के रूप में निपटाया जाना चाहिए ।
  3. इमेज के बाद टेम पर दागदार नमूने ।
    नोट: TEM के लिए पारंपरिक नमूना तैयारी में, लेड विषम कदम TEM इमेजिंग से पहले किया जाता है। हालांकि, यह सिफारिश की जाती है कि क्रायोएपेक्स नमूनों के लिए, इमेजिंग पहले गैर-विषम नमूनों पर की जाती है। यह सुनिश्चित करता है कि टैग से संकेत आसानी से अधिक हल्के दाग सेलुलर संरचनाओं के साथ अपने मजबूत विपरीत द्वारा स्थित किया जा सकता है । कई नमूनों के लिए, कोई और धुंधला की आवश्यकता होगी; हालांकि, यदि अतिरिक्त झिल्ली विपरीत वांछित है, तो लीड पोस्ट-धुंधला प्रदर्शन किया जा सकता है (चरण 7.2) और नमूना फिर से इमेज किया जा सकता है।

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Representative Results

पारंपरिक निर्धारण और निर्जलीकरण के साथ क्रायोएपेक्स विधि का उपयोग करके अल्ट्रास्ट्रक्चरल संरक्षण की तुलना करने के लिए, हमने नमूने तैयार किए जिसमें एक एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम झिल्ली (ईआरएम; ईआर झिल्ली) पेप्टाइड को एपेक्स 2 के साथ टैग किया गया था और एचईसी-293T कोशिकाओं में ट्रांससंक्रमित किया गया था। ईआरएम-एपेक्स2 ईआर के साइटोप्लाज्मिक चेहरे का स्थानीयकरण करता है और ईआर संरचना को संगठित चिकनी ईआर (ओएसईआर)34,42,43के रूप में जाना जाता है। ओसेआर आकृति विज्ञान में चिकनी, समानांतर, घनी खड़ी झिल्ली के क्षेत्र शामिल हैं जो अल्ट्रास्ट्रक्चरल संरक्षण की तुलना करने के लिए एक इष्टतम क्षेत्र के रूप में काम करते हैं। पारंपरिक शीर्ष तरीकों द्वारा नमूने की तैयारी के परिणामस्वरूप OSER संरचनाओं(चित्रा 2ए-डी)की स्पष्ट लेबलिंग हुई। उच्च आवर्धन पर निरीक्षण करने पर, खड़ी झिल्ली झालरदार दिखाई दी और गैर-समान अंतराल गाढ़ा झिल्ली घनत्व के बीच मौजूद थे, जो खराब झिल्ली संरक्षण और लिपिड निष्कर्षण(चित्रा 2डी)का संकेत देते हैं। क्रायोकैपेक्स द्वारा तैयार किए गए नमूने में ओसेआर संरचनाओं की लेबलिंग को भी स्पष्ट रूप से परिभाषित किया गया था; हालांकि, झिल्ली चिकनी और समानांतर थीं, और लिपिड निष्कर्षण के लिए बहुत कम देखा गया था(चित्रा 2ई-एच)। क्रायोएपेक्स से परिणाम एक नमूने से प्राप्त लोगों के लिए समान उच्च गुणवत्ता वाले संरक्षण के थे जो अतिरिक्त रासायनिक निर्धारण और एपेक्स 2/डीएबी प्रतिक्रिया कदम(चित्रा 2I-K)के बिना एचपीएफ/एफएस से गुजरे थे ।

नेत्रहीन प्रशंसनीय झिल्ली संरक्षण के अलावा, क्रायोएपेक्स विधि ब्याज के प्रोटीन को इस तरह बरकरार रखता है कि कुछ मामलों में प्रोटीन वितरण पैटर्न के पहलुओं को देखा जा सके। इस बिंदु को समझाने के लिए, हमने एक और ईआर-स्थानीयकृत प्रोटीन, हंटिंगटिन खमीर इंटरैटिंग प्रोटीन ई (प्रचार) का उपयोग किया। प्रचार ईआरझिल्ली 44,45 ,46,47के चमकीले चेहरे पर स्थित एक झिल्ली प्रोटीन है . प्रचार-एपेक्स 2 निर्माण एचईसी-293T कोशिकाओं में अधिक व्यक्त किए गए थे। 90 एनएम पतले वर्गों के TEM विश्लेषण से पता चला है कि प्रचार परिधीय ईआर के साथ ही परमाणु लिफाफा(चित्रा 3ए, बी)भर में मौजूद था। इसके अतिरिक्त, प्रचार घनत्व को ल्यूमेनल ईआर झिल्ली(चित्रा 3सी,तीर) के साथ नियमित रूप से दूरी वाले फोसी में हल करने में सक्षम था। प्रचार वितरण और फोसी भी पारंपरिक निर्धारण और निर्जलीकरण के साथ तैयार एक नमूने में दिखाई दे रहे थे; हालांकि, व्यापक झिल्ली व्यवधान और निष्कर्षण मौजूद थे, जिससे नमूना उप-इष्टतम(चित्रा 3डी, ई)बन गया था।

टैग किए गए प्रोटीन की एक श्रृंखला के लिए क्रायोएपएप विधि की मजबूत ऑर्गेनेलर विशिष्टता और प्रयोज्यता प्रदर्शित करने के लिए, हमने तीन सेलुलर मार्कर का उपयोग करके एपेक्स 2 लेबलिंग का प्रदर्शन किया। माइटोकॉन्ड्रिया को माइटो-वी5-एपेक्स234का उपयोग करके लेबल किया गया था। माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स के इस मार्कर ने केवल माइटोकॉन्ड्रिया का विशिष्ट धुंधला प्रदान किया(चित्र 4ए)। इसी तरह, हमने CAAX-एपेक्स234का उपयोग करके प्लाज्मा झिल्ली लेबलिंग का आकलन किया, जिसने प्लाज्मा झिल्ली के अलग धुंधला का उत्पादन किया(चित्र4सी)। इंट्रासेलर ऑर्गेनेल्स(चित्रा 4सी)में कोई लेबलिंग नहीं देखी गई। इसके अतिरिक्त, हमने एपेक्स 2 जीन48के साथ α-mannosidase के माउस आइसोफॉर्म के पहले 118 अमीनो एसिड को फ्यूज करके गोलगी लुमेन के लिए एक मार्कर के रूप में एक नया निर्माण बनाया। परिणामस्वरूप मैनी-एपेक्स2 को कोशिकाओं में क्षणिक रूप से ट्रांसफिक रूप से ट्रांसलेट किया गया था जिन्हें बाद में क्रायोएपेक्स विधि द्वारा तैयार किया गया था। दाग गोलगी के ढेर स्पष्ट रूप से आसपास के ऑर्गेनेल्स(चित्र4बी)से अलग थे। व्यक्तिगत ढेर, सिस्टर्न, और कुछ वेसिकल्स लेबल किए गए थे, जो गोलगी धुंधला(चित्र4बी)के विशिष्ट थे। कुल मिलाकर, ये मार्कर यह प्रदर्शित करते हैं कि क्रायोएपेक्स विधि विभिन्न ऑर्गेनेल्स के भीतर झिल्ली प्रोटीन की विशिष्ट लेबलिंग प्रदान करती है ताकि उन्हें आसपास के उप-सेलुलर संरचनाओं से अलग किया जा सके।

Figure 1
चित्रा 1: क्रायोएपेक्स प्रोटोकॉल में आवश्यक चरणों की योजनाबद्ध। (A)कोशिकाएं एक एपेक्स2 प्लाज्मिड से उगाई और ट्रांस्ट्रल होती हैं । (ख)कोशिकाओं को ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ गोली मार दी जाती है और तय की जाती है, जिसके बाद पेराक्सिडास प्रतिक्रिया उत्पाद का उत्पादन करने के लिए डीएबी और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ(सी)ऊष्मायन किया जाता है । (घ)गोली को एचपीएफ द्वारा क्रायोफिक्स्ड किया जाता है,(ई)भारी धातुओं और एसीटोन के साथ प्रतिस्थापित फ्रीज, और(एफ)रेसिन में एम्बेडेड है। माइक्रोटोम पर पतले सेक्शन एकत्र किए जाते हैं। (जी)टेम इमेजिंग किया जाता है और अतिरिक्त विपरीत पोस्ट-धुंधला द्वारा जोड़ा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: पारंपरिक रासायनिक निर्धारण, क्रायोएपेक्स और एचपीएफ/एफएस का उपयोग करके ओएसईआर झिल्ली संरक्षण की तुलना। रासायनिक रूप से तय में पुनर्गठित ईआर आकृति विज्ञान, डीएबी ने ईआरएम-एपेक्स 2-व्यक्त कोशिकाओं पर प्रतिक्रिया व्यक्त की जिन्हें पारंपरिक रासायनिक निर्धारण और अल्कोहल निर्जलीकरण(ए-डी)या क्रायोएपेक्स(ई-एच)द्वारा संसाधित किया गया था, उनकी तुलना ईआरएम-एपेक्स2 द्वारा की गई थी जो उन कोशिकाओं को व्यक्त करते थे जो क्रायोफिक्स्ड लाइव और डीएबी प्रतिक्रिया(आई-के)के बिना थीं। लाइव क्रायोफिक्स्ड कोशिकाएं सर्वश्रेष्ठ प्राप्य अल्ट्रास्ट्रक्चरल संरक्षण का प्रतिनिधित्व करती हैं और दो शीर्ष आधारित डिटेक्शन प्रोटोकॉल(ए-एच)के माध्यम से प्राप्त झिल्ली संरक्षण का मूल्यांकन करने के लिए मीट्रिक के रूप में यहां सेवा करती हैं। क्रायोकैपेक्स (पैनलों जी और एचमें उदाहरण) द्वारा प्राप्त ईआर व्युत्पन्न झिल्ली की समान रूप से दूरी वाले समानांतर लैमेलर स्टैकिंग, पारंपरिक तरीकों (पैनल सी और डी)द्वारा प्राप्त झालरदार झिल्ली के विपरीत, क्रायोएपेक्स द्वारा प्राप्त बेहतर झिल्ली संरक्षण पर प्रकाश डालता है। सेनगुप्ता एट अल. 201948से इस आंकड़े को संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एक एपेक्स2-टैग ईआर झिल्ली प्रोटीन के प्रोटीन स्थानीयकरण को आवधिक फोसी में हल किया जा सकता है। (A)एक एचईसी-293T सेल के एक पतले वर्ग की छवि जिसमें प्रचार-एपेक्स 2 व्यक्त किया गया है और क्रायोकैपेक्स द्वारा संसाधित किया गया है, जो एक अच्छी तरह से संरक्षित (घने) साइटोप्लाज्मिक पृष्ठभूमि(बी,सी)में ईआर के धुंधला होने का पता चलता है । परिधीय ईआर के एक छोटे से वर्ग की उच्च आवर्धन छवियां (ए में पीले बॉक्स द्वारा सीमांकित और बीमें दिखाए गए, बी में लाल बॉक्स के आगे आवर्धन के साथ सीमें दिखाया गया है) एपेक्स 2-जनित घनत्व(बी,रेड बॉक्स और सी,व्हाइट एरोहेड्स के आवधिक फोसी को प्रदर्शित करता है जो प्रचार फोसी के बीच आवधिकता दिखाते हैं)। (D)प्रचार-एपेक्स2 व्यक्त करने वाले सेल के एक पतले खंड की छवि और पारंपरिक रासायनिक निर्धारण और निर्जलीकरण द्वारा तैयार कॉर्टिकल ईआर और परमाणु लिफाफे (लाल तीर) के विशिष्ट धुंधला पन दिखाता है। (ई)एक उच्च आवर्धन पर, आवधिक प्रचार-विशिष्ट फोसी ईआर (इनसेट में पीले बॉक्स और सफेद तीर सिर) के हिस्सों के भीतर स्पष्ट थे, व्यापक झिल्ली व्यवधान के बावजूद, लाल तीर द्वारा इंगित किया गया था। NE = परमाणु लिफाफा। सेनगुप्ता एट अल. 201948से इस आंकड़े को संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ऑर्गेनेल मार्कर एपेक्स2-टैग प्रोटीन से प्राप्त संकेत की विशिष्टता दिखाते हैं। एपेक्स2-टैग किए गए प्रोटीन निर्माण माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स (माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स (माइटो-वी5-एपेक्स2; एमें दिखाए गए), या गोल्गी लुमेन (α-mannII-APEX2; बीमें दिखाए गए), या प्लाज्मा झिल्ली (CAAX-APEX2; सीमें दिखाए गए) को HEK293 कोशिकाओं और क्रायोएपेक्स द्वारा संसाधित नमूनों में क्षणिक रूप से व्यक्त किया गया था। प्रत्येक निर्माण ऑर्गेनेल विशिष्ट घनत्व मिले। α-mannIIAPEX2 (पैनल बी)या CAAX-APEX2 (पैनल सी)व्यक्त कोशिकाओं से दो वर्गों (पीले या लाल बक्से) के बढ़ाया विचार दिखाए जाते हैं । सेनगुप्ता एट अल. 201948से इस आंकड़े को संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां प्रस्तुत क्रायोकैपेक्स प्रोटोकॉल सेलुलर वातावरण के भीतर झिल्ली प्रोटीन के स्थानीयकरण की विशेषता के लिए एक मजबूत विधि प्रदान करता है। न केवल आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड एपेक्स 2 टैग का उपयोग ब्याज के प्रोटीन का सटीक स्थानीयकरण प्रदान करता है, बल्कि क्रायोफिक्सेशन और कम तापमान निर्जलीकरण का उपयोग आसपास के सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर का उत्कृष्ट संरक्षण और धुंधला प्रदान करता है। संयुक्त, ये दृष्टिकोण अपने उपकोशिकीय संदर्भ में उच्च परिशुद्धता के साथ प्रोटीन को स्थानीयकरण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं।

इस विधि की उन्नति की जड़ यह तथ्य है कि पारंपरिक टीएम विधियों द्वारा तैयार ी के बाद अनुभव किए गए अल्ट्रास्ट्रक्चर की हानि मुख्य रूप से निर्धारण चरण40के बजाय निर्जलीकरण कदम से आती है। यह पहले माना जाता था कि peroxidase आधारित तरीकों HPF के साथ असंगत थे/ इसके आसपास काम करने के लिए, क्रायोकेम नाम का एक प्रोटोकॉल हाल ही में विकसित किया गया था जिसमें नमूनों को शुरू में क्रायोफिक्स्ड किया जाता है, जिसके बाद रिहाइड्रेशन और पेरिक्सिडेस रिएक्शन49होता है। यह दृष्टिकोण नमूना धुंधला और संरक्षण में महत्वपूर्ण सुधार के साथ उत्कृष्ट लक्ष्य स्थानीयकरण प्रदान करता है। यह ऊतक के नमूनों के लिए उपयोगी होने के लिए दिखाया गया है और मामलों में जहां corसापेक्ष फ्लोरेसेंस और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी वांछित है । क्रायोकेम के समानांतर, हमारी विधि एचपीएफ और एफएस के साथ ग्लूटाराल्डिहाइड निर्धारण को जोड़ती है। क्रायोकैपेक्स एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल प्रदान करता है जो छोटे सेलुलर नमूनों के लिए भी प्रभावी ढंग से काम करता है।

उच्च दबाव ठंड और फ्रीज प्रतिस्थापन उपकरणों तक पहुंच क्रायोएपेक्स विधि के लिए महत्वपूर्ण है। ये उपकरण और कौशल ईएम सुविधाओं में तेजी से आम हैं। यहां तक कि अगर एचपीएफ और एफएस उपकरण आसानी से उपलब्ध नहीं हैं, तो रासायनिक रूप से निश्चित नमूना मामूली दूरी40ले जाने के लिए थोड़े समय के लिए पर्याप्त स्थिर है। हमने पाया है कि गुणवत्ता के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना एचपीएफ से कम से कम 48 घंटे पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर डीएबी प्रतिक्रिया के बाद नमूने संग्रहीत किए जा सकते हैं। क्रायोएपेक्स प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण पहलू नियंत्रण को शामिल करना है, जो एक मजबूत प्रयोग और ठोस परिणामों के लिए आवश्यक हैं। 100% से कम दक्षता के साथ क्षणिक क्षणिक क्षणिकता द्वारा तैयार नमूनों में नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं के साथ-साथ एक ही नमूने के भीतर लेबल कोशिकाएं होंगी। यदि एपेक्स2 की स्थिर अभिव्यक्ति के साथ सेल लाइनों का उपयोग करते हैं, तो गैर-एपेक्स2 लेबल प्रोटीन ऑफ इंटरेस्ट के साथ कोशिकाओं के ट्रांसफेक्शन द्वारा एक अलग नकारात्मक नियंत्रण तैयार किया जाना चाहिए। कई निर्माण जो ऑर्गेनेलर नियंत्रण के रूप में काम कर सकते हैं, एडजीन के माध्यम से उपलब्ध हैं, और प्रकाशित छवियां इस और अन्य प्रकाशनों में उपलब्ध हैं जिनका उपयोग सत्यापन33,34,36,48के लिए किया जा सकता है। मार्केल एट अल36 द्वारा प्रायोगिक डिजाइन और नए एपेक्स 2 फ्यूजन निर्माणों के सत्यापन की गहन चर्चा प्रदान की गई है।

जबकि क्रायोएपेक्स झिल्ली प्रोटीन का पता लगाने के लिए मोटे तौर पर उपयोगी है, कुछ सीमाएं मौजूद हैं। हालांकि एपेक्स2 एक छोटा 28 केडीए प्रोटीन है, लेकिन कुछ प्रोटीन टैग33,34को शामिल करने में सक्षम नहीं हो सकते हैं। एपेक्स 2 को सिटोसोल में घुलनशील प्रोटीन लेबलिंग के लिए उपयोगी नहीं माना जाता है, क्योंकि डिफ्यूज रिएक्शन उत्पाद33,36। इसके अतिरिक्त, आसपास के सेल में धुंधला की उपस्थिति के कारण प्रोटीन की कम मात्रा का पता लगाना एक चुनौती बन गया है। एचपीएफ और एफएस द्वारा तैयारी सेलुलर घटकों को संरक्षित करती है जो पारंपरिक निर्धारण और निर्जलीकरण द्वारा निकाले जाते हैं। यह सेल में समग्र गहरा धुंधला हो जाता है, संभावित रूप से शीर्ष 2 लेबलिंग के निम्न स्तर के साथ प्रतिस्पर्धा करता है।

क्रायोएपेक्स तकनीक कई प्रोटीन ों पर व्यापक रूप से लागू होती है, जिसमें सीमित संख्या में कदम होते हैं जिन्हें अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। सबसे पहले, प्रोटीन के बीच व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता के कारण, प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर और/या DAB प्रतिक्रिया समय के लिए आदेश में संकेत के लिए कोशिका के पृष्ठभूमि धुंधला से ऊपर कल्पना की जा करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । नए एपेक्स 2 फ्यूजन के सत्यापन के लिए उपयोगी जानकारी और प्रोटोकॉल और अभिव्यक्ति के अनुकूलन और डीएबी धुंधला Martell एट अल द्वारा प्रदान किए जाते हैं ।३६ एक सेलुलर धुंधला परिप्रेक्ष्य से, एफएस प्रोटोकॉल और/या रसायनों के लिए विभिन्न कोशिका प्रकार, ऊतकों, या जीवों५०,५१,५२,५३,५४के भीतर विभिन्न ऑर्गेनेल झिल्ली के इष्टतम दृश्य के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । हमारे अनुभव में, यहां प्रस्तुत एफएस शर्तों स्तनधारी सेल लाइनों की एक किस्म के लिए अच्छी तरह से काम किया है ।

क्रायोएपेक्स के हाइब्रिड दृष्टिकोण में कई अन्य आनुवंशिक लेबलिंग तकनीकों पर लागू होने की क्षमता है। एचपीएफ/एफएस के साथ पारंपरिक अल्कोहल डिहाइड्रेशन की जगह से अल्ट्रास्ट्रक्चरल संरक्षण और प्रोटीन स्थानीयकरण की जानकारी में काफी सुधार होने की उम्मीद है । एक मोनोलेयर के रूप में कोशिकाओं को ठीक करने के लिए एक सेल सब्सट्रेट के रूप में नीलम डिस्क का उपयोग करने से साइटोस्केलेटन और सेल-सेल संपर्कों सहित सेल परिधि के संरक्षण में सुधार होता है। नीलम डिस्क का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल में मामूली संशोधनों की आवश्यकता होगी। एपेक्स तकनीक का उपयोग जीएफपी-बाध्यकारी पेप्टाइड35के माध्यम से ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) टैग किए गए प्रोटीन का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। पता लगाने की यह अप्रत्यक्ष विधि पहले से ही GFP के साथ टैग असंख्य प्रोटीन के लिए शीर्ष प्रौद्योगिकी का उपयोग करने की क्षमता को खोलता है । हाल ही में शुरू की गई विभाजन एपेक्स2 निकटता और बातचीत अध्ययन55के लिए लाभप्रद होगा। इसके अतिरिक्त, सेलुलर संरक्षण में सुधार के लिए मौजूदा एचआरपी आधारित तरीकों को एचपीएफ/एफएस के साथ जोड़ा जा सकता है । इसका एक उदाहरण एफलयूरोसेंट आईएनडीसिएटर और पीएरोक्सिडेस ई एम आरइॉल्यूशन (फ्लिपपर) के साथ पीरिसिपिटेशन के लिए है, जिसमें अलग-अलग सेल मार्कर को फ्लोरोसेंट टैग और एचआरपी दोनों के साथ मिलाया गया है, जो गोलगी या ईआर56के लिए लुमेनल मार्कर प्रदान करता है। डीएबी के स्थान पर बेहतर पेरोक्सिडेस सब्सट्रेट्स का उपयोग भी इस विधि के साथ संभव है, जिसमें सब्सट्रेट्स शामिल हैं जो आरएनए लेबलिंग 57के लिए अनुकूलित हैं। क्रायोकैपेक्स इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के माध्यम से प्रोटीन वितरण के तीन आयामी विश्लेषण के लिए इन-सेल लेबलिंग और अल्ट्रास्ट्रक्चरल संरक्षण भी प्रदान करता है, और संभावित रूप से एसबीएफ-एसईएम या एफआईबी-एसईएम48,58के माध्यम से उच्च मात्रा में।

कुल मिलाकर, क्रायोएपेक्स व्यापक प्रयोज्यता के साथ एक मजबूत तरीका है। सिद्धांत रूप में, इसे किसी भी झिल्ली प्रोटीन पर लागू किया जा सकता है, चाहे ऑर्गेनेल के लुमेनल स्पेस के भीतर, साइटोप्लाज्मिक चेहरे पर, वेसिकल्स के भीतर, कोशिका की प्लाज्मा झिल्ली पर या यहां तक कि बाह्य अंतरिक्ष में भी। झिल्ली प्रोटीन की इस विशाल श्रृंखला के लिए, क्रायोएपेक्स विधि अपने उपकोशिकीय संदर्भ के भीतर सटीकता के साथ प्रोटीन के स्थानीयकरण और वितरण को देखने की क्षमता प्रदान करती है।

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Disclosures

लेखक हितों का कोई टकराव नहीं घोषित करते हैं ।

Acknowledgments

यहां वर्णित प्रोटोकॉल सेनगुप्ता एट अल, जर्नल ऑफ सेल साइंस, 132 (6), jcs222315 (2019)48द्वारा एक प्रकाशन से उपजा है। यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से R01GM10092 (एस एम के लिए) और एआई081077 (आरवीएस) अनुदान द्वारा समर्थित है, सीटीएसआई-106564 (एसएम के लिए) इंडियाना नैदानिक और ट्रांसलेशनल साइंसेज संस्थान से, और PI4D-209263 (एसएम के लिए) सूजन, इम्यूनोलॉजी, और संक्रामक रोग के लिए पर्ड्यू विश्वविद्यालय संस्थान से ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate Sigma-Aldrich D5637-1G
Acetone (Glass Distilled) Electron Microscopy Sciences 10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc Electron Microscopy Sciences 60952
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL VWR 82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin Sigma-Aldrich 44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 Sigma-Aldrich 44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) Sigma-Aldrich 44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D Sigma-Aldrich 44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm Electron Microscopy Sciences 70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm Electron Microscopy Sciences 70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement Corning 355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm Electron Microscopy Sciences 71008
Glass Knifemaker Leica Microsystems EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16120
HEK 293 Cells ATCC CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System Leica Microsystems EM PACT2 Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution Fisher Scientific 50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm Mager Scientific 16707898
Osmium Tetroxide, crystalline Electron Microscopy Sciences 19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade VWR 97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm Mager Scientific 16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film Electron Microscopy Sciences FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) Avantor Macron Fine Chemicals 7708-10
Tannic Acid Electron Microscopy Sciences 21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm VWR 25382-166
Ultra Glass Knife Strips Electron Microscopy Sciences 71012
Ultramicrotome Leica Microsystems EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate Electron Microscopy Sciences 22400

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References

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जीव विज्ञान अंक 156 क्रायोएपेक्स झिल्ली प्रोटीन एपेक्स2 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी क्रायोफोनिक्सेशन उच्च दबाव ठंड फ्रीज प्रतिस्थापन
अल्ट्रास्ट्रक्चरल-संरक्षित कोशिकाओं के भीतर झिल्ली प्रोटीन स्थानीयकरण के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए क्रायोएपेक्स विधि
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Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin, R. V., Mattoo, S. The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells. J. Vis. Exp. (156), e60677, doi:10.3791/60677 (2020).

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