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Biology

Il metodo CryoAPEX per l'analisi della microscopia elettronica della localizzazione delle proteine membrana all'interno delle cellule ultrastrutturalizzate

Published: February 27, 2020 doi: 10.3791/60677
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5,6
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 3Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University, 4Bindley Biosciences Center, Purdue University, 5Purdue Institute of Integrative Neuroscience, Purdue University, 6Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

Summary

Questo protocollo descrive il metodo cryoAPEX, in cui una proteina della membrana marcata APEX2 può essere localizzata mediante microscopia elettronica di trasmissione all'interno di ultrastruttura cellulare conservata in modo ottimale.

Abstract

Gli eventi cellulari chiave come la trasduzione del segnale e il traffico di membrana si basano sulla corretta posizione delle proteine all'interno dei compartimenti cellulari. Comprendere con precisione la localizzazione subcellulare delle proteine è quindi importante per rispondere a molte domande biologiche. La ricerca di un'etichetta robusta per identificare la localizzazione delle proteine combinata con un'adeguata conservazione cellulare e colorazione è stata storicamente impegnativa. I recenti progressi nell'imaging della microscopia elettronica (EM) hanno portato allo sviluppo di molti metodi e strategie per aumentare la conservazione cellulare ed etichettare le proteine bersaglio. Un tag genetico relativamente nuovo basato sulla perossidasi, APEX2, è un leader promettente nei tag eM-active clonabili. La preparazione del campione per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è avanzata anche negli ultimi anni con l'avvento della criofissia mediante congelamento ad alta pressione (HPF) e disidratazione e colorazione a bassa temperatura tramite sostituzione del congelamento (FS). HPF e FS forniscono un'eccellente conservazione dell'ultrastruttura cellulare per l'imaging TEM, secondo solo per la crio-imaging diretto di campioni vitrei. Qui presentiamo un protocollo per il metodo cryoAPEX, che combina l'uso del tag APEX2 con HPF e FS. In questo protocollo, una proteina di interesse è contrassegnata con APEX2, seguita da fissazione chimica e reazione alla perossida. Al posto della colorazione tradizionale e della disidratazione dell'alcool a temperatura ambiente, il campione viene criofatto e subisce disidratazione e colorazione a bassa temperatura tramite FS. Utilizzando cryoAPEX, non solo è possibile identificare una proteina di interesse all'interno dei compartimenti subcellulari, ma anche informazioni aggiuntive possono essere risolte rispetto alla sua topologia all'interno di una membrana strutturalmente conservata. Dimostriamo che questo metodo può fornire una risoluzione sufficientemente elevata da decifrare i modelli di distribuzione delle proteine all'interno di un lume di organello e distinguere la compartimentazione di una proteina all'interno di un organello in prossimità di altri organelli non etichettati. Inoltre, crioAPEX è proceduralmente semplice e suscettibile alle cellule coltivate nella coltura tissutale. Non è più impegnativo dal punto di vista tecnico rispetto ai tipici metodi di criofissazione e sostituzione del congelamento. CryoAPEX è ampiamente applicabile per l'analisi TEM di qualsiasi proteina di membrana che può essere etichettata geneticamente.

Introduction

Gli studi biologici spesso includono questioni di risoluzione della localizzazione delle proteine subcellulari all'interno di cellule e organelli. La microscopia a immunofluorescenza fornisce un'utile visione a bassa risoluzione della localizzazione delle proteine, e recenti progressi nell'imaging a super-risoluzione stanno spingendo i limiti di risoluzione per le proteine fluorescentimarcate 1,2,3. Tuttavia, la microscopia elettronica (EM) rimane lo standard d'oro per l'imaging dell'ultrastruttura cellulare ad alta risoluzione, anche se l'etichettatura delle proteine è una sfida.

Storicamente, diversi metodi EM sono stati utilizzati per affrontare questioni di localizzazione delle proteine ultrastrutturali. Uno dei metodi più comunemente utilizzati è la microscopia immunoelettronica (IEM), in cui gli anticorpi primari specifici dell'antigene vengono utilizzati per rilevare la proteina di interesse. Il segnale EM è generato dall'applicazione di anticorpi secondari coniugati con particelle ad alta densità di elettroni, più comunemente oro colloidale4,5. In alternativa, gli anticorpi coniugati con enzimi come la perossidasi di ravanello (HRP) possono essere utilizzati per produrre un precipitato ad alta densità di elettroni6,7,8. Esistono due approcci principali per IEM, denominati pre-incorporamento e post-incorporazione. Nel pre-incorporamento IEM, gli anticorpi vengono introdotti direttamente nelle cellule, il che richiede la fissazione della luce e la permeabilizzazione delle cellule9,10,11. Entrambi i passaggi possono danneggiarel'ultrastruttura 12,13. Lo sviluppo di anticorpi significativamente più piccoli costituiti da un frammento di Fab di corpo coniugato con 1,4 nm nanogold consente di utilizzare condizioni di permeabilizzazione molto delicate; tuttavia, il nanooro è troppo piccolo per la visualizzazione diretta in TEM e richiede ulteriori passaggi di miglioramento per diventare visibile14,15,16. Nell'IEM post-incorporamento, gli anticorpi vengono applicati su sottili sezioni di cellule che sono state completamente elaborate per fissazione, disidratazione e incorporamento in resina17. Mentre questo approccio evita la fase di permeabilizzazione, preservare l'epitopo di interesse durante la preparazione del campione è impegnativo18,19,20. Il metodo Tokuyasu di fissazione della luce seguito da congelamento, crio-sezione, e il rilevamento degli anticorpi fornisce una migliore conservazione dell'epitopo21,22. Tuttavia, i requisiti tecnici della crio-ultramicrotomia, così come il contrasto non ottimale ottenuto nella cellula, sono svantaggi23.

L'uso di tag geneticamente codificati elimina molte delle difficoltà dell'IEM legate alla rilevazione della proteina di interesse. Sono disponibili diversi tag, tra cui HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG e metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Ognuno di questi ha vantaggi rispetto ai metodi precedenti, ma ognuno ha anche svantaggi che impediscono l'uso diffuso. Questi inconvenienti vanno dall'inattività di HRP nel citosol alle grandi dimensioni del tag di ferritina, sensibilità alla luce di ReAsH, e piccole dimensioni e mancanza di compatibilità con la colorazione cellulare di metallothionein. Recentemente, una proteina derivata da ascorbate peroxidase è stata progettata come tag EM, chiamato APEX233,34. Come perossidasi, APEX2 può catalizzare l'ossidazione di 3,3' didiaminobenzidina (DAB), producendo un precipitato che reagisce con teossido di osmio per fornire contrasto EM locale con una diffusione minima dalla proteina di interesse (meno di 25 nm)33,35. A differenza dei metodi tradizionali basati su HRP, APEX2 è estremamente stabile e rimane attivo in tutti i compartimenti cellulari33. I campioni possono essere elaborati per TEM utilizzando la colorazione tradizionale dei campioni EM e metodi che consentono una buona visualizzazione delle strutture circostanti33,34,36. Grazie alle sue piccole dimensioni, stabilità e versatilità, APEX2 è emerso come un tag EM con un grande potenziale.

Molti degli approcci discussi in precedenza non possono essere o non sono ancora stati combinati con lo stato attuale dell'arte nella conservazione ultrastrutturale, nella criofissia e nella sostituzione del congelamento a bassa temperatura. Così, soffrono di una mancanza di conservazione della membrana e/o colorazione cellulare per determinare la localizzazione accurata delle proteine. Ciò limita necessariamente la risoluzione e l'interpretazione dei dati che possono essere ottenuti. La criofixazione mediante il congelamento ad alta pressione (HPF) comporta il congelamento rapido di campioni in azoto liquido ad alta pressione (2.100 bar), che causa la vetrificazione piuttosto che la cristallizzazione dei campioni acquosi, preservando così le cellule in uno stato quasi nativo37,38,39. L'HPF è seguita da una sostituzione di congelamento (FS), una disidratazione a bassa temperatura (-90 gradi centigradi) in acetone combinata con incubazione con le tipiche macchie EM come il tetrossido di osmio e l'acetato uranico. HPF e FS insieme offrono un netto vantaggio rispetto alla fissazione chimica tradizionale (un processo più lungo che può portare a manufatti) e alla disidratazione dell'alcol a temperatura ambiente o sul ghiaccio (che può portare all'estrazione di lipidi e zuccheri), e quindi possono combinarsi con i migliori tag EM per il rilevamento delle proteine.

Uno dei motivi per cui HPF/FS non è stato combinato con l'etichettatura APEX2 è che la fissazione chimica della luce è un prerequisito per la reazione alla perossia, limitando la diffusione del prodotto di reazione DAB. Negli studi APEX2 finora, fissazione e reazione alla perossida sono seguiti dai metodi Tradizionali EM per la colorazione e la disidratazione dell'alcol33,36. Tuttavia, è stato dimostrato che dopo la fissazione chimica con HPF/FS fornisce un netto vantaggio nella conservazione rispetto alla fissazione chimica tradizionale e alla disidratazione dell'alcool da solo40. La perdita di integrità ultrastrutturale osservata nei campioni TEM tradizionali appare meno connessa alla fissazione che alla disidratazione, che in genere avviene usando alcol a temperatura ambiente o sul ghiaccio, e può portare all'estrazione di lipidi e zuccheri40,41. Per sviluppare il metodo cryoAPEX, abbiamo ipotizzato che la fissazione chimica e la reazione perossidasi, seguite da HPF e FS, produrrebbero un risultato ottimale in termini di conservazione ultrastrutturale.

Qui presentiamo il protocollo cryoAPEX, che combina l'etichettatura APEX2 con i metodi di criofixation e di sostituzione del congelamento (Figura 1). Questo protocollo semplice consiste nella trasfezione di una proteina marcata APEX2 di interesse, fissazione chimica delle cellule e reazione alla perossida. HPF e FS vengono quindi eseguite seguite dall'incorporamento tipico della resina e dal sezionamento sottile. L'imaging TEM rivela un'eccellente conservazione dell'ultrastruttura utilizzando questo metodo. Inoltre, sono state osservate la localizzazione subcellulare ad alta risoluzione e la distribuzione spaziale di una proteina lumena endolasmica (ER). Questo metodo è ampiamente utile per rilevare la localizzazione della proteina membrana all'interno delle cellule per l'analisi della microscopia elettronica. Nelle nostre mani, il metodo ha funzionato con successo per una varietà di linee cellulari coltivate nella coltura dei tessuti, tra cui HEK-293T (rene embrionale umano), HeLa (cancro cervicale umano), Cos7 (fibroblasto renale della scimmia verde africana) e BHK (rene di criceto del bambino). Le istruzioni dettagliate sono descritte di seguito utilizzando le cellule HEK-293T.

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Protocol

1. Cultura cellulare e trasfezione

  1. Seme HEK-293T cellule su un 60 mm di diametro o più grande piatto di coltura tissutale e crescere al 60%-90% di confluenza in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi centigradi e 5% CO2.
  2. Cellule transfettrali con plasmidi di espressione dei mammiferi marcati APEX2 che utilizzano il reagente di trasfezione (vedi Tabella dei materiali)secondo le indicazioni del produttore.
  3. A 12-15 h dopo la trasfezione, lavare le cellule una volta con salina tamponata da fosfato (PBS). Rimuovere le cellule dal piatto lavando delicatamente con PBS. Un reagente di dissociazione come la trypsin può essere utilizzato se necessario per un determinato tipo di cella. Centrifuga a 500 x g per 5 min per formare un pellet.

2. Fissazione chimica e reazione perossidasi

  1. Rimuovere con attenzione il supernatante e risospendere il pellet in 2 mL del 2% di glutaraldeide (v/v) nel buffer di cacodylate di sodio da 0,1 M, pH 7.4, a temperatura ambiente. Mettere il campione sul ghiaccio e incubare per 30 min. Pellet il campione a 500 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Da questo punto fino al passaggio 2.3.3, conservare il campione e le soluzioni sul ghiaccio ed eseguire la centrifuga a 4 gradi centigradi.
    AVVISO: Sia la glutaraldeide che il tampone di cacodylato di sodio (contenente arsenico) sono tossici. Durante la movimentazione devono essere utilizzate procedure di sicurezza adeguate e attrezzature di protezione personale. Le soluzioni contenenti glutaraldeide e/o tampone di cacodylato di sodio devono essere smaltite come rifiuti chimici pericolosi.
  2. Lavare il pellet 3x per 5 min con 2 mL di tamponi di sodio da 0,1 M. Per questi e successivi fusi, risospendere delicatamente il pellet cellulare nella soluzione richiesta, quindi centrifugare per 5 min a 500 x g e rimuovere e scartare con attenzione il supernatante. Prestare attenzione con le ripetute fasi di pelletazione e sospensione, al fine di ridurre al minimo la perdita del campione.
  3. Eseguire la reazione perossidasi
    1. Preparare una soluzione fresca contenente 1 mg/mL di 3,3'-diaminobenzidine tetraidrocchioro (DAB) in buffer cacodilate di sodio da 0,1 M. Sciogliere il DAB vortice vigoroso per 5-10 min.
      LEGGIA': IL DAB è tossico e potenziale cancerogeno e deve essere maneggiato con procedure di sicurezza adeguate e dispositivi di protezione personale. Le soluzioni contenenti DAB devono essere trattate come rifiuti chimici pericolosi.
    2. Lavare il pellet risuspendendo in 3 mL di soluzione DAB seguito da pelletta a 500 x g per 5 min.
    3. Risospendere il pellet in una soluzione DAB da 3 mL a cui è stato aggiunto perossido di idrogeno per raggiungere una concentrazione finale di 5,88 mM. Incubare per 30 min a temperatura ambiente. Il pellet diventa visibilmente marrone-colorato indicando la presenza del prodotto di reazione DAB insolubile.
      NOTA: potrebbe essere necessario ottimizzare il tempo di incubazione DAB per ogni campione. Il cambio di colore può essere monitorato al microscopio luminoso. Nella nostra esperienza, un'incubazione di 15-45 min è adeguata per la maggior parte delle proteine. Il perossido di idrogeno deve essere ottenuto da una bottiglia appena aperta o da una bottiglia che è stata tenuta ben sigillata dopo l'apertura.
    4. Pellet le cellule, quindi lavare 2x per 5 min con 0,1 M tamponi cacodialato, seguito da un lavaggio nel mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) o sui supporti cellulari di scelta.
  4. Risospendere il pellet cellulare a 500 anni di una soluzione crio-protettrice di DMEM (o altri supporti cellulari di scelta) contenente il 10% di siero bovino fetale e il 15% di albumina del siero bovino bovino. Pellet, aumentando leggermente la velocità di centrifuga da 500 x g se necessario per ottenere un pellet nella soluzione crio-protettrice spessa. Scartare la maggior parte del supernatante, assicurandosi che sia rimasto abbastanza liquido in modo che il pellet non si asciughi. Trasportare il pellet cellulare allo strumento di congelamento ad alta pressione.

3. Congelamento ad alta pressione

  1. Riempire il serbatoio del congelatore ad alta pressione con azoto liquido (LN2) e avviare la pompa per riempire la camera campione con LN2.
    MASSIMA': utilizzare procedure di sicurezza adeguate e dispositivi di protezione personale quando si lavora con azoto liquido.
    NOTA: questi passaggi sono specifici del congelatore ad alta pressione Leica EMPACT2.
  2. Wick via qualsiasi liquido rimanente dal pellet cellulare utilizzando l'angolo di una salvietta di laboratorio o un tovagliolo di carta. Deve rimanere abbastanza liquido che il pellet formi una pasta simile in consistenza al dentifricio. Dovrebbe essere abbastanza sottile da essere aspirato in una punta di pipet da 20 l.
  3. Aspirate 2-3 - L del pellet cellulare e depositarlo su un supporto a membrana. Riempire completamente il pozzo del supporto della membrana, in modo che la tensione superficiale crei una leggera cupola sulla parte superiore, ma il liquido non fuoriesce dal pozzo. Non devono essere presenti bolle d'aria.
  4. Far scorrere il supporto della membrana nella cartuccia e fissarlo. Posizionare la cartuccia nella macchina HPF che è stata preparata e innescata e premere Start per bloccare.
  5. Esaminare i grafici di temperatura e pressione rispetto al tempo per verificare che la pressione sia stata raggiunta di 2100 bar e che la temperatura sia stata raggiunta a -196 gradi centigradi entro 200 ms, ed entrambi i parametri siano rimasti stabili per i 600 ms di misurazione.
  6. Ripetere i passaggi da 3,3 a 3,5 fino a quando non è stato utilizzato il pellet della cella o il numero desiderato di campioni è stato bloccato.
  7. Mantenendo le cartucce immerse in LN2, rimuovere ogni supporto di membrana dalla sua cartuccia, mettere in una capsula di plastica, e posizionare la capsula di plastica in una crio-facciata piena di LN2.
    NOTA: il protocollo potrebbe essere sospeso qui. Le crio-fiale con campioni possono essere conservate in una dewar LN2 in crio-canne o crio-box.

4. Bloccare la sostituzione

MASSIMA': utilizzare procedure di sicurezza adeguate e dispositivi di protezione personale quando si lavora con azoto liquido. Inoltre, molte delle sostanze chimiche utilizzate nel passaggio 4 sono tossiche, tra cui acido tannico, tetrossido di osmio, e acetato di uranilo. Queste sostanze chimiche devono essere trattate secondo adeguate procedure di sicurezza e smaltite come rifiuti chimici pericolosi.

  1. Riempire l'unità di sostituzione automatica di congelamento con LN2. Portare la temperatura a -90 gradi centigradi.
  2. Preparare FS Mix 1 e iniziare FS.
    1. In un cofano chimico, preparare una soluzione di 0,2% acido tannico (w/v) e 5% DI acqua in acetone e 1 mL per campione in crio-viali. Mettere in LN2 per congelare.
    2. Collocare le fiale FS Mix 1 e le crio-fiale contenenti i pellet cellulari congelati nella camera campione dell'unità FS. Trasferire la capsula interna contenente il supporto della membrana dalla fiala LN2 nella corrispondente fiala contenente FS Mix 1.
    3. Avviare un protocollo FS con il suo primo passo di 24 h a -90 . Dopo le 24 h, mettere in pausa l'FS e lavare i campioni 3x per 5 min con acetone che è stato raffreddato a -90 gradi centigradi.
  3. Preparare FS Mix 2 e completare FS
    DESTRA: il tetrossido di Osmio è una sostanza chimica altamente tossica e ossidante che deve essere maneggiata solo da individui addestrati secondo protocolli di sicurezza stabiliti. Devono essere seguiti i protocolli per lo stoccaggio e lo smaltimento di soluzioni contenenti osmio, nonché l'etichettatura delle aree di laboratorio in cui è in uso il tetrossido di osmio. Il tetrossido di Osmio deve essere maneggiato in una cappa chimica con dispositivi di protezione personale, tra cui protezione degli occhi, un camice da laboratorio che fornisce protezione completa del braccio, guanti a doppio Nitrile e un respiratore opzionale.
    1. In un cofano chimico, preparare una soluzione di 1% tetrossido di osmio, 0,2% di acetato uranino, e 5% di acqua in acetone. Aliquota 1 mL per campione in crio-fiale e posto in LN2 per congelare.
      NOTA: le soluzioni stock di acido tannico (10% w/v in acetone), il tetrossido di osmio (10% w/v in acetone) e l'acetato di uranilo (8% w/v in metanolo) possono essere preparate e conservate in crio-fiale in unln2 dewar per facilitare la preparazione delle mix FS.
    2. Mettere le crio-fiale con FS Mix 2 nell'unità FS e trasferire le capsule dal terzo lavaggio dell'acetone nelle fiale FS Mix 2. Incubare in FS Mix 2 per 72 h a -90 gradi centigradi, seguito da un graduale riscaldamento a 0 gradi centigradi su 12-18 h.
  4. Mantenere la temperatura a 0 gradi centigradi e lavare 3x per 30 min con acetone pre-raffreddato da una bottiglia appena aperta.

5. Infiltrazione e incorporamento della resina

AVVISO: La resina qui utilizzata (vedi Tabella dei materiali)è tossica prima della polimerizzazione e deve essere maneggiata con procedure di sicurezza adeguate e dispositivi di protezione personali. Qualsiasi resina non polimerizzata deve essere smaltita come rifiuti chimici pericolosi.

  1. Infiltrare i campioni con crescenti concentrazioni di resina disciolta in acetone da una bottiglia appena aperta. Preparare una miscela di componenti di resina A, B e D in un becher di plastica secondo le indicazioni del produttore e incubare i campioni nelle seguenti concentrazioni di resina: 2%, 4% e 8% per 2 h ciascuno a 0 gradi centigradi. Incubare nel 15%, 30%, 60%, 90% e 100% resina per 4 h ciascuno a temperatura ambiente. Incubare per 4 h in una miscela di componenti A, B, C e D.
  2. Posizionare i supporti a membrana con il lato del pellet cellulare in stampi piatti di incorporamento e riempire con resina (A, B, C e D). Le etichette di carta per i campioni possono essere aggiunte ai pozze in questo momento.
  3. Polimerizzare in forno a 60 gradi centigradi per 24-36 h.
    NOTA: il protocollo può essere sospeso dopo la polimerizzazione.
  4. Rimuovere i blocchi dallo stampo e lasciare raffreddare. Per rimuovere il supporto della membrana, posizionare prima il campione nel mandrino verticale dell'ultramicrotoma dove può essere visualizzato con ingrandimento. Separare il supporto della membrana dal blocco da una combinazione di azoto liquido dabbing sul supporto della membrana per separare il metallo dalla plastica, e utilizzando una lama di rasoio per scheggiare la resina intorno al supporto della membrana. Una volta separato, sollevare delicatamente il supporto della membrana lasciando la cupola di pellet cellulare sulla faccia del blocco.
  5. Posizionare il blocco con il pellet della cella esposta rivolto verso l'alto in uno stampo di incorporamento piatto leggermente più profondo del primo stampo e riempire con resina. Polimerizzare a 60 gradi centigradi per 24-36 h.
    NOTA: il protocollo può essere sospeso dopo la polimerizzazione.

6. Sezionamento

  1. Tagliare il blocco intorno al pellet della cella utilizzando una lama di rasoio. Quindi posizionare il blocco nel mandrino campione sul braccio di sezionamento di un ultramicrotoma. Utilizzando un coltello di vetro o diamante, tagliare il blocco in una forma trapezoidale che circonda da vicino il pellet cellulare.
  2. Ottenere 90 nm sezioni ultrasottili del pellet cellulare utilizzando un coltello di vetro o diamante.
  3. Raccogliere una barra multifunzione di sezioni in una griglia TEM. Le griglie in rame rivestite in forma di formvar (1 x 2 mm2 slot) sono utili per l'imaging di sezioni seriali. Asciugare la griglia scando il bordo su un pezzo di carta da filtro e conservarla in una scatola di memorizzazione della griglia TEM.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa dopo la sezionamento.

7. Immagini TEM

  1. Montare la griglia sul supporto TEM e posizionarla al microscopio. Usiamo abitualmente un Tecnai T12 a 80 kV per lo screening di campioni crioAPEX. Acquisire immagini di cellule e strutture subcellulari di interesse con l'etichettatura APEX2.
  2. Se lo si desidera, ottenere un contrasto di membrana supplementare mediante l'uso di piombo post-colorazione. Vedere la figura 2 per il confronto degli esempi non post-colorato(Figura 2I–K) e dei campioni post-colorato(Figura 2A–H).
    1. Far galleggiare le griglie asciutte sezionate su una goccia di soluzione di cloruro disuso (1,5 mM), 2 volte per 1 min ciascuna, quindi 1x per 10 min.
    2. Galleggiare le griglie su una goccia della soluzione di piombo di Sato per 1 min. Lavare galleggiando sulla soluzione di cloruro di sodio 3x per 1 min, quindi su acqua DI 3x per 1 min. Blot liquido in eccesso dalle griglie e conservare in una scatola griglia.
      AVVISO: Il piombo è una sostanza chimica tossica e deve essere maneggiato con procedure di sicurezza adeguate e dispositivi di protezione personale. Le soluzioni contenenti piombo devono essere smaltite come rifiuti chimici pericolosi.
  3. Immagine di campioni post-macchiati sul TEM.
    NOTA: nella preparazione tradizionale dei campioni per TEM, il passo di contrasto principale viene eseguito prima dell'imaging TEM. Tuttavia, si raccomanda che per i campioni crioAPEX, l'imaging viene eseguito per primo su campioni non con trapelato. Questo assicura che il segnale dal tag possa essere facilmente posizionato dal suo forte contrasto con le strutture cellulari più leggermente macchiate. Per molti campioni, non sarà necessaria alcuna ulteriore colorazione; tuttavia, se si desidera un ulteriore contrasto della membrana, è possibile eseguire il post-colorazione del piombo (passaggio 7.2) e il campione ri-immagine.

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Representative Results

Al fine di confrontare la conservazione ultrastrutturale utilizzando il metodo crioAPEX con la fissazione tradizionale e la disidratazione, abbiamo preparato campioni in cui una membrana del reticolo endolasmico (ERM; il peptide ER membrana) è stato etichettato con APEX2 e trasvenuto nelle cellule HEK-293T. ERM-APEX2 localizza la faccia citoplasmica del ER e rimodella la struttura ER in strutture morfologicamente distinte conosciute come organizzato liscio ER (OSER)34,42,43. La morfologia OSER comprende regioni di membrane lisce, parallele e densamente impilate che fungono da regione ottimale per confrontare la conservazione ultrastrutturale. La preparazione del campione mediante metodi APEX tradizionali ha portato a una chiara etichettatura delle strutture OSER (Figura 2A–D). Al momento dell'ispezione ad alto ingrandimento, le membrane impilate apparivano arruffate e erano presenti lacune non uniformi tra densità di membrana concentriche, indicando una scarsa conservazione della membrana e l'estrazione dei lipidi (Figura 2D). Il campione preparato da cryoAPEX aveva anche un'etichettatura chiaramente definita delle strutture OSER; tuttavia, le membrane erano lisce e parallele, e poca o nessuna estrazione lipidica è stata vista(Figura 2E–H). I risultati di cryoAPEX sono stati di conservazione di alta qualità simile a quelli ottenuti da un campione che ha subito HPF/FS senza la fissazione chimica aggiuntiva e le fasi di reazione APEX2/DAB (Figura 2I-K).

Oltre alla conservazione della membrana visivamente apprezzabile, il metodo cryoAPEX conserva la proteina di interesse in modo che gli aspetti dei modelli di distribuzione delle proteine possano essere osservati in alcuni casi. Per illustrare questo punto, abbiamo usato un'altra proteina ER-localizzata, il lievito di huntingtina che interagisce con la Proteina E (HYPE). HYPE è una proteina di membrana situata sulla faccia luminale della membrana ER 44,45,46,47. I costrutti HYPE-APEX2 sono stati sovraespressi nelle cellule HEK-293T. L'analisi TEM di sezioni sottili da 90 nm ha rivelato che HYPE era presente in tutto il ER periferico e l'involucro nucleare (Figura 3A,B). Inoltre, la densità HYPE è stato in grado di essere risolto in foci regolarmente distanziati lungo la membrana lumena ER (Figura 3C, frecce). La distribuzione e i foci di HYPE erano visibili anche in un campione preparato con fissazione e disidratazione tradizionali; tuttavia, erano presenti ampie interruzioni ed estraidellatorie della membrana, rendendo il campione non ottimale (Figura 3D,E).

Per dimostrare la robusta specificità e applicabilità dell'organinella per una gamma di proteine etichettate, abbiamo eseguito l'etichettatura APEX2 utilizzando tre marcatori cellulari. I mitocondri sono stati etichettati utilizzando mito-V5-APEX234. Questo marcatore della matrice mitocondriale ha fornito una colorazione specifica dei mitocondri (Figura4A). Allo stesso modo, abbiamo valutato l'etichettatura della membrana al plasma utilizzando CAAX-APEX234, che produceva una colorazione distinta solo dellamembranaplasmatica ( Figura 4C). Non è stata osservata alcuna etichettatura negli organelli intracellulari (Figura 4C). Inoltre, abbiamo creato un nuovo costrutto come marcatore per il lume di Golgi fondendo i primi 118 aminoacidi dell'isoforme del topo di z-mannosidase con il gene APEX248. Il MannII-APEX2 risultante è stato trasvenuto transitoriamente in cellule che sono state successivamente preparate con il metodo cryoAPEX. le pile di Golgi macchiate erano chiaramente distinguibili dagli organelli circostanti (Figura 4B). Sono state etichettate singole pile, cisterne e alcune vesciche, tipiche della colorazione Golgi (Figura 4B). Complessivamente, questi marcatori dimostrano che il metodo crioAPEX fornisce un'etichettatura specifica delle proteine della membrana all'interno di vari organelli ad alta risoluzione sufficientemente alta da distinguerle dalle strutture subcellulari circostanti.

Figure 1
Figura 1: Schematico dei passaggi essenziali del protocollo CryoAPEX. (A) Le cellule vengono coltivate e trasinate con un plasmide APEX2. (B) Le cellule sono pellettate e fissate con glutaraldeide, seguite da incubazione (C) con DAB e perossido di idrogeno per produrre il prodotto di reazione perossida. (D) Il pellet è criofatto da HPF, (E) congelato sostituito con metalli pesanti e acetone, e (F) incorporato nella resina. Le sezioni sottili vengono raccolte sul microtoma. (G) L'imaging TEM viene eseguito e può essere aggiunto un ulteriore contrasto dopo la colorazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Confronto della conservazione della membrana OSER con fissazione chimica tradizionale, cryoAPEX e HPF/FS. La morfologia ER riorganizzata in chimicamente fissa, DAB ha reagito alle cellule che esprimono ERM-APEX2 che sono state elaborate tramite fissazione chimica tradizionale e disidratazione alcolica (A-D) o da crioAPEX (E-H) è stata confrontata con le cellule che esprimono ERM-APEX2 che erano criofixedlive e senza la reazione DAB (I-K). Le cellule criofisse vive rappresentano la migliore conservazione ultrastrutturale raggiungibile e fungono da metrica per valutare la conservazione della membrana ottenuta tramite i due protocolli di rilevamento basati su APEX (A–H). L'impilamento lamelllare parallelo a spaziatura uniforme delle membrane derivate da ER ottenute da cryoAPEX (esemplificate nei pannelli G e H),al contrario delle membrane arruffate ottenute con i metodi tradizionali (pannelli C e D),evidenzia la conservazione della membrana superiore ottenuta da cryoAPEX. Questa cifra è stata modificata da Sengupta et al. 201948. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: La localizzazione proteica di una proteina della membrana ER marcata APEX2 può essere risolta in foci periodici. (A) Un'immagine di una sezione sottile di una cellula HEK-293T che esprime HYPE-APEX2 ed elaborata da cryoAPEX rivela la colorazione del ER in uno sfondo citoplasmaso ben conservato (denso) (B,C). Immagini di ingrandimento più elevato di una piccola sezione del ER periferico (delimitato dalla scatola gialla in A e mostrato in B, con ulteriore ingrandimento della scatola rossa in B mostrato in C) esibisce focola periodiche di densità generata da APEX2 (B, scatola rossa e C, punte di freccia bianche che mostrano la periodicità tra i foci HYPE). (D) L'immagine di una sezione sottile di una cellula che esprime HYPE-APEX2 e preparata con la fissazione e la disidratazione chimica tradizionale mostra una colorazione specifica del ER corticale e dell'involucro nucleare (frecce rosse). (E) Ad un ingrandimento più elevato, i foci periodici specifici dell'HYPE erano evidenti all'interno di tratti del ER (scatola gialla e punte a freccia bianca nell'insetto), nonostante le ampie interruzioni della membrana, indicate da frecce rosse. NE - busta nucleare. Questa cifra è stata modificata da Sengupta et al. 201948. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: I marcatori Di Organelle mostrano la specificità del segnale ottenuto dalle proteine con etichetta APEX2. I costrutti proteici con etichetta APEX2 progettati per localizzarsi alla matrice mitocondriale (mito-V5-APEX2; mostrato in A),o il lumare Golgi (z-mannII-APEX2; mostrato in B),o la membrana plasmatica (CAAX-APEX2; mostrata in C) sono stati espressi transitoriamente nelle cellule HEK293 e i campioni elaborati da cryAPEX. Ogni costrutto produceva densità specifiche di organello. Vengono visualizzate ingrandite le viste di due sezioni (scatole gialle o rosse) delle celle che esprimono la coppia z-mannIIAPEX2 (pannello B)o CAAX-APEX2 (pannello C). Questa cifra è stata modificata da Sengupta et al. 201948. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il protocollo cryoAPEX qui presentato fornisce un metodo robusto per caratterizzare la localizzazione delle proteine della membrana all'interno dell'ambiente cellulare. Non solo l'uso di un tag APEX2 geneticamente codificato fornisce una localizzazione precisa di una proteina di interesse, ma l'uso della criofissia e della disidratazione a bassa temperatura fornisce un'eccellente conservazione e colorazione dell'ultrastruttura cellulare circostante. Combinati, questi approcci sono un potente strumento per localizzare una proteina con alta precisione all'interno del suo contesto subcellulare.

Il nocciolo dell'avanzamento di questo metodo è il fatto che la perdita di ultrastruttura sperimentata dopo la preparazione con i metodi TEM tradizionali deriva principalmente dal passaggio di disidratazione piuttosto che dal passaggio di fissaggio40. In precedenza si credeva che i metodi basati sulla perossia erano incompatibili con l'HPF/FS perché richiedevano fissazione chimica prima della reazione alla perossidasi. Per risolvere questo problema, è stato recentemente sviluppato un protocollo chiamato CryoCHEM in cui i campioni sono inizialmente criofissati, seguiti dalla reidratazione e dalla reazione alla perossida4 . Questo approccio fornisce un'eccellente localizzazione degli obiettivi con miglioramenti significativi nella colorazione e conservazione dei campioni. È stato dimostrato di essere utile per i campioni di tessuto e nei casi in cui si desidera la fluorescenza correlata e la microscopia elettronica. Parallelamente a cryoCHEM, il nostro metodo combina la fissazione della glutaraldeide con HPF e FS. CryoAPEX offre un protocollo semplificato che funziona efficacemente anche per piccoli campioni cellulari.

L'accesso agli strumenti di sostituzione di congelamento e congelamento ad alta pressione è fondamentale per il metodo cryoAPEX. Questi strumenti e competenze sono sempre più comuni nelle strutture dei servizi di valutazione. Anche se le apparecchiature HPF e FS non sono prontamente disponibili, il campione fissato chimicamente è abbastanza stabile per un breve lasso di tempo da trasportare modeste distanze40. Abbiamo scoperto che i campioni possono essere conservati dopo la reazione DEL DAB a 4 gradi centigradi per almeno 48 ore prima di HPF senza perdite significative di qualità. Un altro aspetto critico del protocollo cryoAPEX è l'inclusione di controlli, che sono essenziali per un esperimento robusto e risultati convincenti. I campioni preparati dalla trasfezione transitoria con efficienza inferiore al 100% conterranno cellule di controllo negative e celle etichettate all'interno dello stesso campione. Se si utilizzano linee cellulari con espressione stabile di APEX2, un controllo negativo separato deve essere preparato mediante trasfezione di cellule con la proteina di interesse non etichettata a APEX2. Diversi costrutti che possono fungere da controlli dell'organella sono disponibili tramite Addgene, e le immagini pubblicate sono disponibili in questa e in altre pubblicazioni che possono essere utilizzate per la verifica33,34,36,48. Martell et al.36 ha fornito una discussione approfondita sulla progettazione sperimentale e la verifica dei nuovi costrutti di fusione APEX2

Mentre cryoAPEX è ampiamente utile per il rilevamento delle proteine della membrana, esistono alcune limitazioni. Anche se APEX2 è una piccola proteina da 28 kDa, alcune proteine potrebbero non essere in grado di incorporare il tag33,34. APEX2 non è considerato utile per etichettare le proteine solubili nel citosol, a causa del prodotto di reazione diffusa33,36. Inoltre, la rilevazione di piccole quantità di proteine rappresenta una sfida a causa della presenza di colorazione nella cellula circostante. La preparazione da parte di HPF e FS conserva i componenti cellulari che vengono estratti dalla fissazione tradizionale e dalla disidratazione. Questo porta alla colorazione generale più scura nella cellula, potenzialmente in competizione con bassi livelli di etichettatura APEX2.

La tecnica cryoAPEX è ampiamente applicabile a molte proteine, con un numero limitato di passaggi che possono richiedere l'ottimizzazione. In primo luogo, a causa della variabilità individuale tra le proteine, potrebbe essere necessario regolare il livello di espressione delle proteine e/o il tempo di reazione DAB affinché il segnale venga visualizzato sopra la colorazione di base della cellula. Informazioni e protocolli utili per la convalida dei nuovi costrutti di fusione APEX2 e l'ottimizzazione dell'espressione e la colorazione DAB sono forniti da Martell et al.36 Dal punto di vista della colorazione cellulare, il protocollo FS e/o le sostanze chimiche potrebbero dover essere regolati per una visualizzazione ottimale di diverse membrane di orgamici, all'interno di diversi tipi di cellule, tessuti o organismi50,51,52,53,54. Nella nostra esperienza, le condizioni FS qui presentate hanno funzionato bene per una varietà di linee cellulari di mammiferi.

L'approccio ibrido di cryoAPEX ha il potenziale per essere applicato a molte altre tecniche di etichettatura genetica. La sostituzione della disidratazione tradizionale dell'alcool con HPF/FS dovrebbe migliorare notevolmente la conservazione ultrastrutturale e le informazioni sulla localizzazione delle proteine. L'utilizzo di dischi di zaffiro come substrato cellulare per fissare le cellule come monostrato migliora la conservazione della periferia cellulare, compresi i contatti del citoscheletro e delle cellule cellulari. Sarebbero necessarie piccole modifiche al protocollo per utilizzare i dischi di zaffiro. La tecnologia APEX può essere utilizzata per rilevare proteine verdi fluorescenti (GFP) con un peptide35legante GFP. Questo metodo indiretto di rilevamento apre la possibilità di utilizzare la tecnologia APEX per la miriade di proteine già etichettate con GFP. La divisione APEX2 recentemente introdotta sarà vantaggiosa per gli studi di prossimità e interazione55. Inoltre, i metodi esistenti basati su HRP possono essere combinati con HPF/FS per migliorare la conservazione cellulare. Un esempio è fluorescente indicator e peroxidase per precipitation con EM resolution (FLIPPER), in cui i singoli marcatori di cella sono stati fusi sia con un tag fluorescente che con HRP, fornendo marcatori lumenici per Golgi o ER56. Con questo metodo è possibile anche l'uso di substrati perossidici migliorati al posto di DAB, compresi i substrati ottimizzati per l'etichettatura dell'RNA 57. CryoAPEX fornisce anche l'etichettatura cellulare e la conservazione ultrastrutturale necessaria per l'analisi tridimensionale della distribuzione delle proteine attraverso la tomografia elettronica, e potenzialmente a volumi elevati attraverso SBF-SEM o FIB-SEM48,58.

Nel complesso, CryoAPEX è un metodo robusto con ampia applicabilità. In linea di principio, può essere applicato a qualsiasi proteina della membrana, sia all'interno dello spazio lumemale di un organello, sul viso citoplasmico, all'interno delle vesciche, sulla membrana plasmatica della cellula o anche nello spazio extracellulare. Per questa vasta gamma di proteine della membrana, il metodo cryoAPEX offre il potenziale per vedere la localizzazione e la distribuzione di una proteina con precisione all'interno del suo contesto subcellulare.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Il protocollo qui descritto deriva da una pubblicazione di Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Questo lavoro è supportato dalle sovvenzioni R01GM10092 (a S.M.) e AI081077 (R.V.S.) dei National Institutes of Health, CTSI-106564 (a S.M.) dell'Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, e PI4D-209263 (a S.M.) dall'Istituto Universitario Purprovvisorio per l'Infiammazione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate Sigma-Aldrich D5637-1G
Acetone (Glass Distilled) Electron Microscopy Sciences 10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc Electron Microscopy Sciences 60952
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL VWR 82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin Sigma-Aldrich 44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 Sigma-Aldrich 44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) Sigma-Aldrich 44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D Sigma-Aldrich 44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm Electron Microscopy Sciences 70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm Electron Microscopy Sciences 70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement Corning 355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm Electron Microscopy Sciences 71008
Glass Knifemaker Leica Microsystems EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16120
HEK 293 Cells ATCC CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System Leica Microsystems EM PACT2 Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution Fisher Scientific 50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm Mager Scientific 16707898
Osmium Tetroxide, crystalline Electron Microscopy Sciences 19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade VWR 97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm Mager Scientific 16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film Electron Microscopy Sciences FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) Avantor Macron Fine Chemicals 7708-10
Tannic Acid Electron Microscopy Sciences 21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm VWR 25382-166
Ultra Glass Knife Strips Electron Microscopy Sciences 71012
Ultramicrotome Leica Microsystems EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate Electron Microscopy Sciences 22400

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Biologia Numero 156 CryoAPEX Proteina membrana APEX2 microscopia elettronica a trasmissione criofissia congelamento ad alta pressione sostituzione del congelamento
Il metodo CryoAPEX per l'analisi della microscopia elettronica della localizzazione delle proteine membrana all'interno delle cellule ultrastrutturalizzate
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Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin, R. V., Mattoo, S. The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells. J. Vis. Exp. (156), e60677, doi:10.3791/60677 (2020).

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