Summary
このプロトコルは、APEX2タグ付けされた膜タンパク質を、最適に保存された細胞超構造内の透過電子顕微鏡法によって局在させることができるクライオAPEX法を記述する。
Abstract
シグナル伝達や膜の密転のような主要な細胞イベントは、細胞コンパートメント内の適切なタンパク質位置に依存します。タンパク質の正確な細胞内局在化を理解することは、多くの生物学的な質問に答えるために重要です。タンパク質の局在化と適切な細胞保存と染色を組み合わせた堅牢なラベルの探求は、歴史的に困難でした。電子顕微鏡(EM)イメージングの最近の進歩は、細胞の保存と標識標的タンパク質を増加させる多くの方法と戦略の開発につながっています。比較的新しいペルオキシダーゼベースの遺伝的タグであるAPEX2は、クローン可能なEM活性タグの有望なリーダーです。透過型電子顕微鏡(TEM)の試料調製も近年、高圧凍結(HPF)によるクライオフィク沈作の出現と、凍結置換(FS)による低温脱水および染色の出現とともに進んでいる。HPFおよびFSは、TEMイメージングのための細胞超構造の優れた保存を提供し、第2は、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的な光子試料のイメージングを行う。ここでは、Apex2 タグを HPF と FS と組み合わせた cryoAPEX メソッドのプロトコルを紹介します。このプロトコルでは、目的のタンパク質にAPEX2がタグ付けされ、続いて化学固定とペルオキシダーゼ反応が行われます。従来の染色や室温でのアルコール脱水の代わりに、試料を凍結固定し、FS経由で低温で脱水と染色を行います。CryoAPEXを使用すると、目的のタンパク質を細胞内のコンパートメント内で識別できるだけでなく、構造的に保存された膜内のそのトポロジーに関して追加情報を解決することができます。この方法は、オルガネラ内のタンパク質分布パターンを解読し、1つのオルガネラ内のタンパク質の区画化を他の未標識オルガネラに近接して区別するのに十分な高い解像度を提供できることを示す。また、CryoAPEXは、組織培養で増殖した細胞に対して手続き的に簡単かつ受け入れやすい。これは、典型的なクライオフィクセションと凍結置換方法と同じ技術的に困難ではありません。CryoAPEXは、遺伝的にタグ付けできる膜タンパク質のTEM分析に広く適用可能です。
Introduction
生物学的研究には、細胞内およびオルガネラ内の細胞内タンパク質局在化を解決する問題が含まれることがよくあります。免疫蛍光顕微鏡はタンパク質局在化の有用な低分解能のビューを提供し、超解像イメージングにおける最近の進歩は、蛍光タグ付きタンパク質1、2、3の解像度の限界を押し上げている。しかし、電子顕微鏡(EM)は、タンパク質の標識は課題であるが、高解像度の細胞超構造をイメージングするためのゴールドスタンダードのままです。
歴史的に、超構造タンパク質局在化の問題にアプローチするためにいくつかのEM法が使用されてきた。最も一般的に利用されている方法の1つは、抗原特異的一次抗体を使用して目的のタンパク質を検出する免疫電子顕微鏡(IEM)です。EMシグナルは、電子密度の高い粒子と共役する二次抗体の適用により生成され、最も一般的には金金4、5がコロイド状である。あるいは、大根ペルオキシダーゼ(HRP)などの酵素と結合した抗体は、6,7,8の電子密度の高い沈殿物を製造するために使用することができる。IEM には、事前埋め込みと埋め込み後のラベリングという 2 つの主要なアプローチがあります。事前埋め込みIEMにおいて、抗体は細胞に直接導入され、細胞9、10、11の光固定および透過性化が必要となる。両方のステップは、超構造12、13を損傷する可能性があります。1.4 nmナノゴールドと結合した抗体Fab断片からなるかなり小さい抗体の開発は、非常に穏やかな透過性条件を使用することができます。しかし、ナノゴールドはTEMの下で直接可視化するには小さすぎて、14、15、16を見えるようにするために追加の強化ステップが必要です。埋め込み後IEMでは、固定、脱水、および樹脂17への埋め込みによって完全に処理された細胞の薄い切片に抗体が適用される。このアプローチは浸透化ステップを回避しますが、サンプル調製を通して目的のエピトープを維持することは困難である18,19,20.光固定法に続いて凍結、凍結分断、抗体検出により、エピトープ保存21,22が改善されました。しかしながら、クライオ超ミクロトミーの技術的要件は、細胞内で達成される最適でないコントラストと同様に、23の欠点である。
遺伝的にコードされたタグを使用すると、目的のタンパク質の検出に関連するIEMの多くの困難が排除されます。HRP、フェリチン、リース、ミニソグ、メタロチオーネイン24、25、26、27、28、29、30、31、32を含む様々なタグが利用可能です。これらの各方法には、以前の方法よりも利点がありますが、それぞれが広く使用されるのを妨げる欠点もあります。これらの欠点は、サイトゾル中のHRPの不活性からフェリチンタグの大きなサイズ、ReAsHの光感受性、およびメタロチオネインの細胞染色との相溶性の小さいサイズおよび適合性の欠如まで及ぶ。近年、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ由来のタンパク質が、APEX233,34というEMタグとして設計されている。ペルオキシダーゼとして、APEX2は3,3'ジアミノベンジジン(DAB)の酸化を触媒し、目的タンパク質(25nm未満)33、35から最小の拡散で局所EMコントラストを提供するために四酸化オスミウムと反応する沈殿物を生成することができる。従来のHRPベースの方法とは異なり、APEX2は非常に安定しており、すべてのセルラーコンパートメント33でアクティブなままです。サンプルは、従来のEMサンプル染色法と、周囲の構造33、34、36の良好な可視化を可能にする方法を使用してTEM用に処理することができる。サイズが小さく、安定性と汎用性が高いため、APEX2は大きな可能性を秘めたEMタグとして登場しました。
上で論議したアプローチの多くは、超構造保存、クライオフィクセションおよび低温凍結置換における現在の最新技術と組み合わせることができないか、まだ組み合わせられていない。したがって、正確なタンパク質局在性を決定するために、膜保存や細胞染色の欠如に苦しんでいます。これは、取得できるデータの解決と解釈を必ずしも制限します。高圧凍結(HPF)によるクライオフィケーションは、液体窒素中の試料を高圧(約2,100bar)で急速に凍結し、水性試料の結晶化ではなくガラス化を引き起こし、したがってほぼ天然状態の細胞を37、38、39に保存する。HPFは、凍結置換(FS)、低温(-90°C)のアセトンでの脱水を、四酸化オスミウムや酢酸ウラニルなどの典型的なEM染色剤とインキュベーションと組み合わせた。HPFとFSは、従来の化学固定(アーティファクトにつながる可能性のあるより長いプロセス)や室温または氷上でのアルコール脱水(脂質および糖の抽出につながる可能性がある)に対して明確な利点を提供し、したがって、タンパク質検出のための最良のEMタグと組み合わせることが望ましい。
HPF/FSがAPEX2標識と組み合わされていない理由の1つは、光化学固定がペルオキシダーゼ反応の前提条件であり、DAB反応生成物の拡散を制限していることである。これまでのAPEX2研究では、固定およびペルオキシダーゼ反応は、染色およびアルコール脱水33、36のための伝統的なEM法が続いている。しかし、HPF/FSによる化学的固定に続いて、従来の化学固定とアルコール脱水単独で40を保存する上で明確な利点を提供することが示されている。従来のTEMサンプルに見られる超構造的完全性の喪失は、脱水よりも固定に関連していないように見え、これは通常、室温または氷上でアルコールを使用して行われ、脂質および糖40、41の抽出につながる可能性がある。クライオAPEX法を開発するために、化学固定とペルオキシダーゼ反応、続いてHPFおよびFSが超構造保存の面で最適な結果を生み出すと仮定した。
ここでは、APEX2 タグと cryofixation とフリーズ置換メソッドを組み合わせた cryoAPEX プロトコルを紹介します (図 1)。この簡単なプロトコルは、対象となる APEX2 タグ付けされたタンパク質のトランスフェクション、細胞の化学固定、およびペルオキシダーゼ反応から成ります。HPFとFSは、次いで典型的な樹脂埋め込みと薄い断面化を行います。TEMイメージングは、この方法を用いた超構造の優れた保存を明らかにする。さらに、高分解能細胞内局在化および小胞体(ER)内腔タンパク質の空間分布が観察された。この方法は、電子顕微鏡分析のために細胞内の膜タンパク質局在化の検出に広く有用である。私たちの手では、この方法は、HEK-293T(ヒト胚性腎臓)、HeLa(ヒト子宮頸癌)、Cos7(アフリカの緑のサル腎臓線維芽細胞)、BHK(ベビーハムスター腎臓)など、組織培養で成長した様々な細胞株に成功しています。詳細な指示は、HEK-293T細胞を使用して以下に説明します。
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Protocol
1. 細胞培養とトランスフェクション
- 播種HEK-293T細胞は直径60mm以上の組織培養皿に、37°Cおよび5%CO2で細胞培養インキュベーターで60%~90%の合流点に成長する。
- トランスフェクション試薬を用いたAPEX2タグ付き哺乳動物発現プラスミドを有するトランスフェクション細胞(材料表を参照)。
- トランスフェクション後 12~15時間で、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を1回洗浄します。PBSでやさしく洗って皿から細胞を取り出します。特定の細胞型に対して必要な場合は、トリプシンなどの解離試薬を使用してもよい。5分間500xgで遠心分離し、ペレットを形成する。
2. 化学固定とペルオキシダーゼ反応
- 慎重に上清を除去し、2%グルタルアルデヒド(v/v)の2 mLで0.1 Mナトリウムカコジレートバッファー、pH 7.4、室温でペレットを再懸濁します。氷の上にサンプルを置き、30分間インキュベートします。 この時点からステップ2.3.3まで、サンプルと溶液を氷上に保管し、4°Cで遠心分離を行います。
注意:グルタルアルデヒドとナトリウムカコジレートバッファー(ヒ素を含む)の両方が有毒です。取扱いの際には、適切な安全手順と個人用保護具を使用する必要があります。グルタルアルデヒドおよび/またはカコジレートナトリウムバッファーを含む溶液は、有害な化学廃棄物として処分する必要があります。 - ペレットを3倍に5分間洗浄し、2 mLの0.1 Mカコジレートナトリウムバッファーを使用します。これらの後のスミッシュと同様に、必要な溶液中の細胞ペレットを静かに再懸濁し、500 x gで5分間遠心分離し、上清を慎重に除去して廃棄する。サンプルの損失を最小限に抑えるために、繰り返しペレット化および再懸濁ステップを使用して注意する必要があります。
- ペルオキシダーゼ反応を行う
- 0.1 Mカコジレート酸ナトリウム緩衝液中に3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド(DAB)の1mg/mLを含む新鮮な溶液を調製する。5~10分の激しい渦によってDABを溶解します。
注意:DABは有毒であり、潜在的な発がん性物質であり、適切な安全手順と個人用保護具で処理する必要があります。DABを含むソリューションは、有害な化学物質廃棄物として処理する必要があります。 - 3 mLのDAB溶液で再懸濁し、続いて500 x gで5分間ペレットを洗浄します。
- ペレットを過酸化水素を添加した3mL DAB溶液に再懸濁し、最終濃度5.88mMを達成した。客室内で30分間インキュベートします。ペレットは、不溶性DAB反応生成物の存在を示す目に見えて茶色になります。
注: DAB インキュベーション時間は、サンプルごとに最適化する必要があります。色の変化は軽い顕微鏡で監視することができる。私たちの経験では、ほとんどのタンパク質に対して15〜45分のインキュベーションが適切です。過酸化水素は、開いたてのボトルまたは開封後に十分に密閉されたボトルから得る必要があります。 - 細胞をペレットし、0.1 Mカコジレート緩衝液で5分間2x洗浄し、続いてダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)または選択した細胞培地で1回洗浄する。
- 0.1 Mカコジレート酸ナトリウム緩衝液中に3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド(DAB)の1mg/mLを含む新鮮な溶液を調製する。5~10分の激しい渦によってDABを溶解します。
- 10%のウシ胎児血清と15%ウシ血清アルブミンを含むDMEM(または選択した他の細胞培地)のクライオプロテクター溶液の500μLで細胞ペレットを再懸濁する。ペレットは再び、厚い凍結保護溶液中のペレットを達成するために必要な場合は500xgから遠心分離機の速度をわずかに増加させる。上清の大部分を捨て、ペレットが乾燥しないように十分な液体が残っていることを確認します。高圧凍結器に細胞ペレットを輸送します。
3. 高圧凍結
- 高圧冷凍庫の貯蔵庫を液体窒素(LN2)で満たし、ポンプを開始してサンプルチャンバをLN2で満たします。
注意:液体窒素を使用する場合は、適切な安全手順と個人用保護具を使用してください。
注:これらのステップは、Leica EMPACT2高圧冷凍庫に固有のものです。 - 実験室の拭き取りまたはペーパータオルのコーナーを使用して、細胞ペレットから残りの液体を取り除きます。十分な液体は、ペレットが歯磨き粉と同様の一貫性でペーストを形成することを残すべきである。20 μLピペットチップに吸引できるほど薄くする必要があります。
- 細胞ペレットの吸引2~3μLを膜担体に付着させます。膜キャリアの井戸を完全に充填し、表面張力が上にわずかなドームを作り出しますが、液体がウェルからこぼれないようにします。気泡は存在しないはずです。
- 膜キャリアをカートリッジにスライドさせて固定します。準備と準備が済んだ HPF マシンにカートリッジを入れ、スタートボタンを押してフリーズします。
- 温度対時間と圧力対時間グラフを調べて、圧力が2100バールに達し、温度が200 ms以内で-196 °Cに達したことを確認し、測定の600ミリ秒で両方のパラメータが安定したままであることを確認します。
- 細胞ペレットが使用されるか、または必要な数のサンプルが凍結されるまで、手順 3.3 ~ 3.5 を繰り返します。
- カートリッジをLN2に浸したまま、各膜キャリアをカートリッジから取り出し、プラスチックカプセルに入れ、LN2でいっぱいのクライオバイアルにプラスチックカプセルを入れる。
注: ここでプロトコルを一時停止できます。サンプルを含むクライオバイアルは、凍結した箱またはクライオボックスのLN2デュワーに格納することができます。
4. フリーズ置換
注意:液体窒素を使用する場合は、適切な安全手順と個人用保護具を使用してください。さらに、ステップ4で利用される化学物質の多くは、タンニン酸、四酸化オスミウム、酢酸ウラニルを含む有毒である。これらの化学物質は、適切な安全手順に従って取り扱い、有害な化学物質廃棄物として処分されなければなりません。
- 自動凍結置換ユニットに LN2を入力します。温度を-90°Cにします。
- FS ミックス 1 を準備し、FS を開始します。
- 化学フードに、0.2%のタンニン酸(w/v)と5%のDI水をアセトンに、アリコート1サンプル当たり1mLの溶液をクライオバイアルに調製します。凍結するLN2に入れる。
- FSミックス1バイアルと冷凍細胞ペレットを含むクライオバイアルをFSユニットのサンプルチャンバーに入れます。膜キャリアを含む内部カプセルをLN2バイアルからFS Mix1を含む対応するバイアルに移す。
- FS プロトコルを開始し、最初のステップは-90°Cで24時間です。24時間後、FSを一時停止し、サンプルを-90°Cに冷却したアセトンで5分間3x洗浄した。
- FSミックス2を準備し、FSを完了
注意:四酸化オスミウムは、確立された安全プロトコルに従って訓練を受けた個人によってのみ処理されるべき非常に有毒で酸化性の化学物質です。オスミウム含有溶液の貯蔵と廃棄のためのプロトコルに従うだけでなく、四酸化オスミウムが使用されているラボ領域の標識が必要です。四酸化オスミウムは、目の保護、完全な腕の保護を提供するラボコート、二重ニトリル手袋、および任意の呼吸器を含む個人的な保護具を備えた化学フードで扱われるべきです。- 化学フードに、1%の四酸化オスミウム、0.2%酢酸ウラニル、および5%のDI水の溶液をアセトンで調製する。アリコート1サンプルあたり1 mLをクライオバイアルに入れ、LN2に入れ、凍結する。
注:タンニン酸(アセトンでは10%/v)、四酸化オスミウム(アセトンでは10%w/v)、酢酸ウラニル(メタノールで8%w/v)のストック溶液を準備し、FSミックスの調製を容易にするためにLN2デワーの凍結バイアルに貯蔵することができます。 - FSミックス2を使用したクライオバイアルをFSユニットに入れ、カプセルを第3のアセトン洗浄からFSミックス2バイアルに移します。FSミックス2で-90°Cで72時間インキュベートし、続いて12〜18時間にわたって0°Cまで緩やかに加温した。
- 化学フードに、1%の四酸化オスミウム、0.2%酢酸ウラニル、および5%のDI水の溶液をアセトンで調製する。アリコート1サンプルあたり1 mLをクライオバイアルに入れ、LN2に入れ、凍結する。
- 温度を0°Cに保ち、開いたてのボトルからあらかじめ冷却したアセトンで30分間3倍洗います。
5. 樹脂の浸潤と埋め込み
注意:ここで使用される樹脂(材料表参照)は、重合前に有毒であり、適切な安全手順と個人用保護具で取り扱う必要があります。非重合樹脂は有害な化学廃棄物として処分する必要があります。
- 新たに開いたボトルからアセトンに溶解した樹脂濃度の増加に伴いサンプルに浸透します。メーカーの指示に従って樹脂成分A、B、Dをプラスチックビーカーに調製し、0°Cでそれぞれ2%、4%、8%の2hの樹脂濃度でサンプルをインキュベートします。インキュベートは、15%、30%、60%、90%、および100%樹脂で、各温度で4時間ずつ行う。成分A、B、C、およびDの混合物で4時間インキュベートする。
- 細胞ペレットを持つ膜キャリアを平らな埋め込み型に上げ、樹脂(A、B、C、D)で充填します。サンプルの紙ラベルは、この時点で井戸に追加することができます。
- 24-36時間の60°Cのオーブンで重合する。
注: プロトコルは重合後に一時停止できます。 - モールドからブロックを取り出し、冷まします。膜キャリアを除去するために、まず、サンプルを超微小体の垂直チャック内に配置し、拡大して可視化することができる。膜キャリアから膜キャリアを分離し、膜キャリア上の液体窒素を組み合わせて金属をプラスチックから分離し、カミソリブレードを使用して膜キャリアの周りの樹脂を切り離す。分離したら、ブロックの表面に細胞ペレットドームを残して膜キャリアを静かに持ち上げます。
- 最初の金型よりもわずかに深い平らな埋め込み金型に、露出したセルペレットを上向きにしてブロックを配置し、樹脂で満たします。60 °Cで 24~36時間重合します。
注: プロトコルは重合後に一時停止できます。
6. セクション
- カミソリの刃を使用して、セルペレットの周りのブロックをトリミングします。次に、ブロックをサンプルチャックのウルトラミクロトームの断面アームに配置します。ガラスまたはダイヤモンドナイフを使用して、ブロックを細胞ペレットを囲む台形にトリミングします。
- ガラスまたはダイヤモンドナイフを使用して、細胞ペレットの90 nmの超薄型セクションを取得します。
- TEM グリッド上のセクションのリボンをピックアップします。Formvarでコーティングされた銅製のスロットグリッド(1 x 2mm2スロット)は、シリアルセクションのイメージングに便利です。ろ紙の端を吸い取ってグリッドを乾燥させ、TEMグリッド収納ボックスに保管します。
注: プロトコルは、セクション化後に一時停止できます。
7. TEM イメージング
- TEMホルダーにグリッドを取り付け、顕微鏡に入れます。CryoAPEXサンプルのスクリーニングには、80kVのTecnai T12を日常的に使用しています。APEX2標識で、対象細胞や細胞内構造の画像を取得します。
- 必要に応じて、鉛ポスト染色を用いて追加の膜コントラストを得る。非ポスト染色サンプル(図2I-K)とリードポスト染色サンプル(図2A-H)の比較については、図2を参照してください。
- 乾燥グリッドを薄めた塩化ナトリウム溶液(約1.5mM)の滴で下にフロートし、それぞれ1分間2倍、10分間1x。
- 1分間のサトの鉛溶液の滴にグリッドを浮かべ、1分間塩化ナトリウム溶液3xに浮かべて洗浄し、DI水3xで1分間、グリッドから余分な液体をブロットし、グリッドボックスに保管します。
注意:鉛は有毒な化学物質であり、適切な安全手順と個人用保護具で取り扱う必要があります。鉛を含む溶液は有害な化学廃棄物として処分されるべきである。
- TEM上の画像ポスト染色サンプル。
注:TEMの従来のサンプル調製では、TEMイメージングの前に鉛の対照ステップが実行されます。ただし、cryoAPEX サンプルの場合は、コントラストのないサンプルで最初にイメージングを行うことをお勧めします。これにより、タグからの信号は、より軽く染色された細胞構造との強いコントラストによって容易に見つけることができます。多くのサンプルでは、これ以上の染色は必要ありません。ただし、膜のコントラストを追加したい場合は、鉛ポスト染色(ステップ7.2)を実行し、サンプルを再イメージ化することができます。
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Representative Results
従来の固定と脱水を用いたcryoAPEX法を用いた超構造保存を比較するために、小胞体膜(ERM;ER膜)ペプチドをAPEX2でタグ付けし、HEK-293T細胞にトランスフェクトした。ERM-APEX2は、ERの細胞質面に局限し、組織化平滑ER(OSER)34、42、43として知られている形態学的に異なる構造にER構造を改造する。OSERの形態は、超構造保存を比較するのに最適な領域として機能する滑らかで平行な、密積層膜の領域を含む。従来の APEX 法によるサンプルの調製により、OSER 構造の明確なラベル付けが行われた (図 2A–D)。高倍率での検査では、積層膜がフリルで現れ、同心円膜密度の間に不均一なギャップが存在し、膜保存と脂質抽出が不十分であることが示された(図2D)。cryoAPEXによって調製されたサンプルはまた、OSER構造の明確に定義されたラベルを有していた。しかし、膜は滑らかで平行であり、脂質抽出はほとんど見られなかった(図2E-H)。cryoAPEXの結果は、追加の化学固定およびAPEX2/DAB反応ステップを伴わないHPF/FSを受けたサンプルから得られたものと同様の高品質の保存であった(図2I–K)。
cryoAPEX法は、視覚的に認められた膜保存に加えて、タンパク質分布パターンの側面がいくつかのケースで観察されるように目的のタンパク質を保存する。この点を説明するために、別のER局在タンパク質、ハンチン酵母相互作用タンパク質E(HYPE)を使用した。HYPEは、ER膜44、45、46、47のルミナル面上に位置する膜タンパク質である。HYPE-APEX2コンストラクトはHEK-293T細胞で過剰発現した。90 nmの薄いセクションのTEM分析は、HYPEが核エンベロープと同様に周辺ER全体に存在することを明らかにした(図3A、B)。さらに、HYPE密度は、ルーメナルER膜に沿って定期的に配置された病巣に分解することができた(図3C、矢印)。HYPE分布および病巣は、従来の固定および脱水を用いて調製されたサンプルでも見られた。しかし、広範な膜破壊および抽出が存在し、サンプルは最適ではない(図3D,E)。
様々なタグ付きタンパク質に対するcryoAPEX法の強いオルガネラ特異性と適用性を実証するために、3つの細胞マーカーを用いてAPEX2標識を行った。ミトコンドリアは、ミト-V5-APEX234を使用して標識した。このミトコンドリアマトリックスのマーカーは、ミトコンドリアの特異的染色のみを提供した(図4A)。同様に、CAAX-APEX234を用いて細胞膜標識を評価し、これを行った形質膜の染色は、細胞膜のみの染色を行った(図4C)。細胞内小器官では標識は認められなかった(図4C)。さらに、α-マンノシダーゼのマウスアイソフォームの最初の118アミノ酸をAPEX2遺伝子48と融合させることで、ゴルジルーメンのマーカーとしての新しい構築物を作成した。得られたMannII-APEX2は、その後クライオAPEX法によって調製された細胞に一過性にトランスフェクトされた。染色されたゴルジスタックは周囲のオルガネラと明確に区別できた(図4B)。個々のスタック、水槽、およびいくつかの小胞がラベル付けされた、典型的なゴルジ染色(図4B)。全体として、これらのマーカーは、cryoAPEX法が周囲の細胞下構造と区別するのに十分な分解能で様々なオルガネラ内の膜タンパク質の特異的標識を提供することを示す。
図1:CryoAPEXプロトコルの重要なステップの概略図(A) 細胞が増殖し、APEX2プラスミドでトランスフェクトされる。(B) グルタルアルデヒドで細胞をペレット化し固定し、続いて(C)DABと過酸化水素を用いてインキュベーションしてペルオキシダーゼ反応生成物を生成する。(D) ペレットはHPFで凍結固定され、(E)は重金属とアセトンに置換して凍結し、(F)は樹脂に埋め込まれている。薄いセクションはミクロトームで集められる。(G)TEMイメージングが行われ、また、さらなるコントラストは、後染色によって付加されてもよい。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:従来の化学固定、クライオアペックス、HPF/FSを用いたOSER膜保存の比較化学的に固定されたER形態で、DABは、従来の化学固定およびアルコール脱水(A-D)またはクライオAPEX(E-H)によって処理されたERM-APEX2発現細胞を、生きてDAB反応なしで凍結されたERM-APEX2発現細胞と比較した(I-K)に反応した。生きた凍結細胞は、最も達成可能な超構造保存を表し、2つのAPEXベースの検出プロトコル(A-H)を介して得られた膜保存を評価するためのメトリックとしてここで役立ちます。従来の方法(パネルCおよびD)によって得られたフリル膜とは対照的に、cryoAPEX(パネルGおよびHで例示される)によって得られるER由来の膜の等間隔平行ラメラ積層は、cryoAPEXによって得られる優れた膜保存を強調する。この数字はSenguptaら201948から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:APEX2タグ付きER膜タンパク質のタンパク質局在化を周期的な病巣に分解することができます。(A) HYPE-APEX2を発現し、cryoAPEXによって処理されたHEK-293T細胞の薄い断面の画像は、よく保存された(緻密な)細胞質背景(B、C)でERの染色を明らかにする。周辺ERの小さな断面の高い倍率画像(Aで黄色の箱で区分され、Bで示されるBで示される)は、APEX2生成密度(B、赤い箱およびC)の周期的な病巣を示し、HYPE病巣の間の周期性を示す白い矢印を示す。(D) 従来の化学固定・脱水により調製した、HYPE-APEX2を発現する細胞の薄い断面の画像は、皮質ERおよび核エンベロープの特異的染色(赤い矢印)を示す。(E) より高い倍率では、周期的なHYPE特異的病巣は、赤い矢印で示される広範な膜破壊にもかかわらず、ER(インセットの黄色い箱および白い矢印の頭部)のストレッチ内で明らかであった。NE = 核エンベロープ。この数字はSenguptaら201948から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:オルガネラマーカーは、APEX2タグ付けされたタンパク質から得られたシグナルの特異性を示す。ミトコンドリア基質(Aに示すmito-V5-APEX2)、またはゴルジルーメン(α-mannII-APEX2;Bに示す)、または細胞膜(CAAX-APEX2;Cに示す)に局地分解するように設計されたAPEX2タグ付きタンパク質構築物をHEK293細胞で一時的に発現し、クリオAPEXによってサンプルを処理した。 各構築物はオルガネラ特有の密度を生み出した。α-mannIIAPEX2(パネルB)またはCAAX-APEX2(パネルC)を発現する細胞から2つのセクション(黄色または赤色のボックス)の拡大ビューが示されている。この数字はSenguptaら201948から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで提示されるcryoAPEXプロトコルは、細胞環境内の膜タンパク質の局在を特徴付ける堅牢な方法を提供します。遺伝的にコードされた APEX2 タグを使用すると、目的のタンパク質の正確な局在化が実現するだけでなく、クライオフィクセションと低温脱水を使用することで、周囲の細胞の超構造の優れた保存と染色が実現します。これらのアプローチを組み合わせることで、細胞内のコンテキスト内で高精度でタンパク質を局地化するための強力なツールです。
この方法の進歩の核心は、従来のTEM法による調製後に経験した超構造の喪失は、固定ステップ40ではなく脱水工程から主に来るという事実である。以前は、ペルオキシダーゼの反応前に化学固定が必要なため、ペルオキシダーゼベースの方法はHPF/FSと互換性がないと考えられていました。これを回避するために、CryoCHEMという名前のプロトコルが最近開発され、サンプルが最初に凍結され、続いて再水和とペルオキシダーゼ反応49が行われた。このアプローチは、サンプル染色および保存において大幅な改善を加え、優れたターゲットローカリゼーションを提供します。組織サンプルや、相関蛍光および電子顕微鏡が望ましい場合に有用であることが示されている。cryoCHEMと並行して、我々の方法はHPFおよびFSとグルタルアルデヒド固定を結合する。CryoAPEXは、小さな細胞サンプルでも効果的に機能する合理化されたプロトコルを提供します。
高圧凍結および凍結置換器へのアクセスは、cryoAPEX法にとって非常に重要です。これらの機器やスキルは、EM施設でますます一般的になってきています。HPFおよびFS機器が容易に入手できない場合でも、化学的に固定されたサンプルは、わずかな距離40を輸送するのに短い時間のために十分に安定している。我々は、サンプルが品質の著しい損失なしにHPFの前に少なくとも48時間の4°CでDAB反応後に保存できることを発見した。cryoAPEXプロトコルのもう一つの重要な側面は、堅牢な実験と説得力のある結果に不可欠なコントロールを含めることです。効率が100%未満の一過性トランスフェクションによって調製されたサンプルは、同じサンプル内の陰性対照細胞および標識細胞を含む。APEX2の安定した発現を有する細胞株を用いる場合、目的の非APEX2標識タンパク質を有する細胞のトランスフェクションによって別の陰性対照を調製すべきである。オルガネラコントロールとして機能するいくつかの構成要素はAddgeneを通じて利用可能であり、公開された画像は、検証33、34、36、48に使用できるこの出版物および他の出版物で利用可能です。実験的な設計と新しいAPEX2融合構造の検証に関する深い議論はMartellら36によって提供されました
CryoAPEXは膜タンパク質の検出に広く有用であるが、いくつかの制限が存在する。APEX2は小さい28kDaタンパク質であるが、一部のタンパク質はタグ33、34を組み込むことができない場合がある。APEX2は、拡散反応生成物33、36による細胞ゾル中の可溶性タンパク質の標識に有用とは考えられない。さらに、少量のタンパク質の検出は、周囲の細胞内に染色の存在のために課題を提起する。HPFおよびFSによる調製は、従来の固定および脱水によって抽出される細胞成分を保存する。これにより、セル内の全体的な暗い染色が行われる可能性があり、低レベルの APEX2 ラベリングと競合する可能性があります。
cryoAPEX技術は、最適化を必要とする工程の限られた数で、多くのタンパク質に広く適用可能です。まず、タンパク質間の個々の変動性のために、タンパク質発現量および/またはDAB反応時間は、細胞のバックグラウンド染色の上でシグナルを可視化するために調整する必要があります。新しいAPEX2融合構造の検証と発現およびDAB染色の最適化のための有用な情報およびプロトコルは、Martellらによって提供される36細胞染色の観点から、FSプロトコルおよび/または化学物質は、異なる細胞タイプ、組織、または生物50、51、52、54の異なる細胞タイプの異なるオルガネラ膜の最適な視覚化のために調整する必要があるかもしれません。私たちの経験では、ここで提示されたFSの条件は、哺乳類の様々な細胞株のためにうまく機能してきました。
cryoAPEXのハイブリッドアプローチは、他の多くの遺伝的標識技術に適用される可能性を秘めています。従来のアルコール脱水をHPF/FSに置き換えることで、超構造保存とタンパク質局在情報が大幅に向上することが期待されます。サファイアディスクを細胞基質として使用して細胞を単層として固定することで、細胞骨格や細胞との接触を含む細胞周辺の保存が向上します。サファイアディスクを使用するには、プロトコルのマイナーな変更が必要です。APEX技術は、GFP結合ペプチド35を介して緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付けされたタンパク質を検出するために使用することができる。この間接的な検出方法は、すでにGFPでタグ付けされた無数のタンパク質に対してAPEX技術を利用する可能性を開きます。最近導入された分割 APEX2 は、近接および相互作用の研究55に有利です。さらに、既存のHRPベースの方法をHPF/FSと組み合わせて、細胞の保存を改善することができます。一例は、EM r溶出によるp再沈解のためのfluorescent indicatorおよびp近似(FLIPPER)であり、個々の細胞マーカーが蛍光タグとHRPの両方と融合され、ゴルジまたはER56のルーメナルマーカーを提供する。DABの代わりに改良されたペルオキシダーゼ基質の使用も、この方法で可能であり、RNA標識57に最適化された基質を含む。CryoAPEXはまた、電子断層撮影を通じてタンパク質分布の3次元分析に必要な細胞内標識および超構造保存を提供し、潜在的にSBF-SEMまたはFIB-SEM48、58を介して大量に。
全体として、CryoAPEXは広い適用性を有する堅牢な方法である。原則として、オルガネラの内腔腔内、細胞質面、小胞内、細胞の形質膜、あるいは細胞外空間において、あらゆる膜タンパク質に適用することができます。この広大な膜タンパク質の場合、cryoAPEX法は、細胞内のコンテキスト内で正確にタンパク質の局在化と分布を見る可能性を提供します。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言していない。
Acknowledgments
ここで説明するプロトコルは、Senguptaら、細胞科学ジャーナル、132(6)、jcs222315(2019)48による出版物に由来する。 この研究は、国立衛生研究所のR01GM10092(S.M.へ)とAI081077(R.V.S.)、インディアナ州臨床翻訳科学研究所のCTSI-106564(S.M.へ)、PI4D-209263(S.M.)による感染症・感染症研究所の助成金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637-1G | |
| Acetone (Glass Distilled) | Electron Microscopy Sciences | 10016 | |
| Beakers; Plastic, Disposable 120 cc | Electron Microscopy Sciences | 60952 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| Cryogenic Storage Vials, 2 mL | VWR | 82050-168 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin | Sigma-Aldrich | 44611-500ML | |
| Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 | Sigma-Aldrich | 44612-500ML | |
| Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) | Sigma-Aldrich | 44613-100ML | |
| Durcupan ACM Fluka,single component D | Sigma-Aldrich | 44614-100ML | |
| Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
| Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm | Electron Microscopy Sciences | 70900 | |
| Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement | Corning | 355104 | |
| Glass Knife Boats, 6.4 mm | Electron Microscopy Sciences | 71008 | |
| Glass Knifemaker | Leica Microsystems | EM KMR3 | |
| Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
| HEK 293 Cells | ATCC | CRL-1573 | |
| High Pressure Freezer with Rapid Transfer System | Leica Microsystems | EM PACT2 | Archived Product Replaced by Leica EM ICE |
| Hydrogen Peroxide 30% Solution | Fisher Scientific | 50-266-27 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000015 | |
| Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm | Mager Scientific | 16707898 | |
| Osmium Tetroxide, crystalline | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade | VWR | 97062-950 | |
| Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm | Mager Scientific | 16702738 | |
| Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film | Electron Microscopy Sciences | FF2010-Cu | |
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 102090-962 | |
| Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) | Avantor Macron Fine Chemicals | 7708-10 | |
| Tannic Acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 | |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm | VWR | 25382-166 | |
| Ultra Glass Knife Strips | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | EM UC7 | |
| Uranyl Acetate Dihydrate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
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