Summary
이 프로토콜은 APEX2 태그가 달린 막 단백질이 최적으로 보존된 세포 초음파 구조 내에서 전송 전자 현미경검사법에 의해 국한될 수 있는 cryoAPEX 방법을 설명합니다.
Abstract
신호 전이 및 막 인신 매매 와 같은 주요 세포 이벤트는 세포 구획 내의 적절한 단백질 위치에 의존합니다. 단백질의 정확한 세포 내 외 현지화를 이해하는 것은 많은 생물학적 질문에 대답하기 위해 이렇게 중요합니다. 적절한 세포 보존 및 염색과 결합된 단백질 국소화를 식별하기 위한 견고한 라벨에 대한 탐구는 역사적으로 어려운 일이었습니다. 전자 현미경 검사법 (EM) 화상 진찰에 있는 최근 어드밴스는 세포 보존을 증가하고 표적 단백질을 표시하기 위하여 많은 방법 그리고 전략의 발달로 이끌어 냈습니다. 비교적 새로운 퍼옥시다아제 기반 유전자 태그인 APEX2는 복제 가능한 EM 활성 태그의 유망한 리더입니다. 투과 전자 현미경 검사법 (TEM)을 위한 견본 준비는 또한 고압 동결 (HPF) 및 저온 탈수 및 동결 치환 (FS)를 통해 염색에 의한 저온화의 출현과 더불어 최근에 진보했습니다. HPF 및 FS는 유리체 샘플의 저온 이미징에 이어 두 번째로 TEM 이미징을 위한 셀룰러 울트라구조의 우수한 보존을 제공합니다. 여기서 우리는 HPF 및 FS와 APEX2 태그의 사용을 결합하는 cryoAPEX 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜에서 관심 있는 단백질은 APEX2로 태그가 지정되고 화학적 고정 및 과산화아제 반응이 뒤따릅니다. 실온에서 전통적인 염색 및 알코올 탈수 대신, 샘플은 저온이며 FS를 통해 저온에서 탈수 및 염색을 겪습니다. cryoAPEX를 사용하면 관심 있는 단백질을 세포외 구획 내에서 식별할 수 있을 뿐만 아니라 구조적으로 보존된 멤브레인 내에서의 토폴로지와 관련하여 추가 정보를 해결할 수 있습니다. 우리는 이 방법이 세포기관 루멘 내의 단백질 분포 패턴을 해독하고, 다른 표지되지 않은 소기관과 가까운 한 소기관 내에서 단백질의 구획화를 구별할 수 있을 만큼 충분히 높은 해상도를 제공할 수 있음을 보여줍니다. 추가, cryoAPEX는 절차적으로 간단 하 고 조직 배양에서 성장 하는 세포에 순종. 일반적인 동결 및 동결 대체 방법보다 기술적으로 더 어렵지 않습니다. CryoAPEX는 유전적으로 태그가 지정될 수 있는 막 단백질의 TEM 분석에 널리 적용됩니다.
Introduction
생물학 연구는 수시로 세포와 세포기관 내의 세포내 단백질 현지화를 해결의 질문을 포함합니다. 면역형광 현미경 검사법은 단백질 국소화의 유용한 저해상도 뷰를 제공하며, 최근 초고해상도 이미징의 발전은 형광태그단백질1,2,3에대한 해상도의 한계를 밀어내고 있다. 그러나, 전자 현미경 검사법 (EM)는 단백질의 표지가 도전이더라도, 고해상도 세포 초음파를 화상 진찰을 위한 금 본위제남아 있습니다.
역사적으로, 몇몇 EM 방법은 초구조 단백질 현지화의 질문에 접근하기 위하여 이용되었습니다. 가장 일반적으로 이용되는 방법 중 하나는 항원 특이적 1 차 항체가 관심있는 단백질을 검출하기 위하여 이용되는 면역전자 현미경 검사법 (IEM)입니다. EM 신호는 전자 조밀 한 입자와 공액 이차 항체의 응용프로그램에 의해 생성되며, 가장 일반적으로 콜로이드 금4,5. 대안적으로, 말무과후옥시다아제(HRP)와 같은 효소와 접합된항체는6, 7,8을전자조밀성 침전물생성에 사용될 수 있다. IEM에는 사전 포함 및 사후 포함 레이블이라고 하는 두 가지 주요 방법이 있습니다. 사전 포함 IEM에서 항체는 세포에 직접 도입되어 세포의 빛 고정 및 투과화가 필요합니다9,10,11. 두 단계 모두초구조12,13을손상시킬 수 있다. 1.4 nm 나노 골드와 공액 된 항체 Fab 단편으로 구성된 상당히 작은 항체의 개발은 매우 부드러운 투과 조건사용 이 가능합니다; 그러나 나노 골드는 TEM에서 직접 시각화하기에는 너무 작으며14,15,16이표시되기 위해 추가 향상 단계가 필요합니다. 임베딩 후 IEM에서 항체는 수지17에고정, 탈수 및 삽입에 의해 완전히 처리 된 세포의 얇은 섹션에 적용됩니다. 이러한 접근법은 투과 단계를 피하지만, 샘플 전처리 전반에 걸쳐 관심의 에피토프를 보존하는 것은18,19,20에도전적이다. 도쿠야스 광 고정 방법 다음에 동결, 저온 절편 및 항체 검출은 향상된 에피토프보존(21,22)을제공한다. 그러나, 극저온 초미세 절제술의 기술적 요구 사항뿐만 아니라 세포에서 달성된 최적대비 이하의 불이익은 23가지단점이다.
유전적으로 인코딩된 태그를 사용하면 관심 있는 단백질의 검출과 관련된 IEM의 많은 어려움을 제거할 수 있습니다. 태그의 다양한 사용할 수 있습니다, HRP를 포함, 페리틴, ReAsH, miniSOG, 및 메탈로티오닌24,25,26,27,28,29,30,31, 32. 이들 각각은 이전 방법에 비해 장점이 있지만, 각각은 또한 광범위한 사용을 방지 단점이 있다. 이러한 단점은 시토솔에서 HRP의 비활성에서 페리틴 태그의 큰 크기, ReAsH의 빛 감도, 작은 크기와 금속 로티오닌의 세포 염색과의 호환성 부족에 이르기까지 다양합니다. 최근에는 아스코르브베이트 과산화아코시다아제로부터 유래된 단백질이 EM 태그로 설계되고 있으며, APEX233,34. 과산화제로서, APEX2는 3,3' 디아미노벤지딘(DAB)의 산화를 촉매할 수 있으며, 관심 있는 단백질(25 nm 미만)으로부터의 최소한의 확산과 국소 EM 대비를 제공하기 위해 오스뮴 테트록사이드와 반응하는 침전물을 생성한다(33,35. 기존의 HRP 기반 방법과 달리 APEX2는 매우 안정적이며 모든 셀룰러 구획33에서활성 상태로 유지됩니다. 샘플은 기존의 EM 샘플 염색 및 주변구조물(33,34,36)의좋은 시각화를 허용하는 방법을 사용하여 TEM용으로 처리될 수 있다. APEX2는 작은 크기, 안정성 및 다기능성으로 인해 잠재력이 큰 EM 태그로 부상했습니다.
위에서 논의된 많은 접근법은 초구조보존, 저온 동결치환착및저온동결치환착에서 현재의 당과 결합될 수 없거나 아직 결합되지 않았다. 따라서, 그들은 정확한 단백질 국소화를 결정 하기 위해 막 보존 및 세포 염색의 부족에서 고통. 이것은 반드시 얻을 수있는 데이터의 해상도와 해석을 제한합니다. 고압 동결 (HPF)에 의한 Cryofixation은 수성 샘플의 결정화보다는 유리화를 일으키는 고압 (~ 2,100 bar)에서 액체 질소에서 샘플을 신속하게 동결시켜37,38,39에가까운 상태로 세포를 보존합니다. HPF는 동결 치환(FS), 저온(-90°C) 탈수액과 인큐베이션, 오스뮴 테트옥사이드 및 우라닐 아세테이트와 같은 전형적인 EM 얼룩을 결합한다. HPF와 FS는 함께 전통적인 화학 적 고정 (유물로 이어질 수있는 더 이상 과정) 및 실온 또는 얼음 (지질과 설탕의 추출로 이어질 수있는) 알코올 탈수에 비해 뚜렷한 이점을 제공하므로 단백질 검출을위한 최고의 EM 태그와 결합하는 것이 바람직합니다.
HPF/FS가 APEX2 라벨링과 결합되지 않은 한 가지 이유는 빛 화학적 고정이 과산화아역 반응의 전제 조건이며 DAB 반응 생성물의 확산을 제한하기 때문입니다. 지금까지 APEX2 연구에서, 고정 및 과산화아제 반응은 염색 및 알코올 탈수에 대한 전통적인 EM 방법에 이어33,36. 그러나, HPF/FS를 이용한 화학적 고정을 따르는 것은 전통적인 화학적 고정 및 알코올 탈수 단독40에비해 보존에 뚜렷한 이점을 제공한다는 것을 보여주었다. 전통적인 TEM 샘플에서 볼 수 있는 초구조적 무결성의 손실은 탈수에 보다 고정에 덜 연결된 것으로 보이며, 이는 전형적으로 실온 또는 얼음에서 알코올을 사용하여 행해지며, 지질 및 당류의 추출로 이어질 수 있다40,41. cryoAPEX 방법을 개발하기 위해, 우리는 화학 적 고정 및 과산화 아제 반응, HPF 및 FS 에 이어, 초구조 보존의 관점에서 최적의 결과를 생성 할 것이라고 가설.
여기서 우리는 APEX2 태그를 동결 및 동결 대체 방법과 결합한 cryoAPEX프로토콜을제시합니다(그림 1). 이 간단한 프로토콜은 관심 있는 APEX2 태그가 달린 단백질의 형질감염, 세포의 화학적 고정 및 과산화아제 반응으로 구성됩니다. HPF 및 FS는 전형적인 수지 임베딩 및 얇은 단면에 의해 수행됩니다. TEM 이미징은 이 방법을 사용하여 초구조체의 우수한 보존을 보여줍니다. 추가적으로, 고분해능 세포성 면역화 및 벤도아성 망막(ER) 루멘성 단백질의 공간 분포가 관찰되었다. 이 방법은 전자 현미경 분석을 위한 세포 내막 단백질 국소화의 검출을 위해 널리 유용합니다. 우리의 손에, 방법은 HEK-293T (인간 배아 신장), HeLa (인간 자궁 경부암), Cos7 (아프리카 녹색 원숭이 신장 섬유아세포), 및 BHK (아기 햄스터 신장)를 포함하여 조직 배양에서 성장한 다양한 세포주를 위해 성공적으로 일했습니다. HEK-293T 세포를 사용하여 상세한 지침이 아래에 설명되어 있습니다.
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Protocol
1. 세포 배양 및 형질감염
- 종자 HEK-293T 세포는 직경 60 mm 또는 더 큰 조직 배양 접시에 37°C 및 5%CO2에서세포 배양 인큐베이터에서 60%-90% 합류로 성장한다.
- 형질감염 시약을 사용하여 APEX2 태그가 달린 포유류 발현 플라스미드를 사용한 트랜스펙트 세포(재료 표참조)는 제조사의 지시에 따른다.
- 12-15 시간 후 형질 감염에서, 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세포를 한 번 씻어. PBS로 부드럽게 세척하여 접시에서 세포를 제거합니다. 트립신과 같은 해리 시약은 주어진 세포 유형에 필요한 경우 사용될 수 있다. 500 x g에서 5 분 동안 원심 분리기를형성합니다.
2. 화학 적 고정 및 과산화아제 반응
- 상류를 조심스럽게 제거하고 실온에서 0.1 M 나트륨 카코디알산트 완충액, pH 7.4에서 2 % 글루타랄데히드 (v / v)의 2 mL에서 펠렛을 다시 일시 중단하십시오. 샘플을 얼음 위에 놓고 30 분 동안 배양합니다. 4 °C에서 5 분 동안 500 x g에서 샘플을 펠렛. 이 시점부터 2.3.3 단계까지, 시료와 용액을 얼음 위에 유지하고, 4°C에서 원심분리를 수행한다.
주의: 글루타랄데히드와 카코디알산 나트륨 완충제(비소 함유)는 모두 독성이 있습니다. 취급 중에는 적절한 안전 절차와 개인 보호 장비를 사용해야 합니다. 글루타랄데히드 및/또는 카코디알산나트륨 완충액을 함유한 솔루션은 유해 화학 폐기물로 폐기해야 합니다. - 0.1 M 나트륨 카코디산염 완충액의 2 mL로 펠릿 3x를 5 분 동안 씻습니다. 이러한 뿐만 아니라 후속 세안의 경우, 필요한 용액에 세포 펠릿을 부드럽게 다시 일시 중단 한 다음 500 x g에서 5 분 동안 원심 분리를 조심스럽게 제거하고 상한자를 제거하십시오. 시료 손실을 최소화하기 위해 반복펠릿 및 재서스펜션 단계로 주의를 기울여야 합니다.
- 과산화아제 반응 수행
- 0.1 M 나트륨 카코디알산염 완충액에 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로염화물(DAB)의 1 mg/mL을 함유한 신선한 용액을 준비합니다. 5-10 분 동안 격렬한 소용돌이로 DAB를 녹입니다.
주의: DAB는 독성이 있으며 발암 가능성이 있는 물질이며 적절한 안전 절차와 개인 보호 장비로 처리해야 합니다. DAB를 함유한 솔루션은 유해 화학 폐기물로 취급되어야 합니다. - 3 mL의 DAB 용액으로 다시 일시 중단한 다음 500 x g에서 5분 동안 펠릿을 세척합니다.
- 과산화수소가 5.88 mM의 최종 농도를 달성하기 위해 첨가 된 3 mL DAB 용액에서 펠렛을 다시 일시 중단하십시오. 방 온도에서 30 분 동안 배양하십시오. 펠릿은 불용성 DAB 반응 생성물의 존재를 나타내는 눈에 띄게 갈색이 된다.
참고: DAB 인큐베이션 시간은 각 샘플에 대해 최적화되어야 할 수 있습니다. 색상 변화는 광 현미경에서 모니터링 할 수 있습니다. 우리의 경험에서, 15-45 분 배양은 대부분의 단백질에 적합. 과산화수소는 갓 개봉 한 병 또는 개봉 후 잘 밀봉 된 병에서 얻어야합니다. - 펠렛 세포를, 0.1 M 나트륨 카코디산완충액으로 5분 동안 2x 세척한 다음, 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM) 또는 셀 배지에서 한 번 세척합니다.
- 0.1 M 나트륨 카코디알산염 완충액에 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로염화물(DAB)의 1 mg/mL을 함유한 신선한 용액을 준비합니다. 5-10 분 동안 격렬한 소용돌이로 DAB를 녹입니다.
- 10% 태아 소 혈청 및 15% 소 혈청 알부민을 함유하는 DMEM(또는 다른 세포 매체)의 저온 보호용액의 500 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단시켰다. 다시 펠릿, 두꺼운 저온 보호 용액에서 펠릿을 달성하기 위해 필요한 경우 500 x g에서 원심 분리 속도를 약간 증가시켰다. 상급의 대부분을 폐기, 펠릿이 건조되지 않도록 충분한 액체가 남아 있는지 확인. 셀 펠릿을 고압 동결 기기로 운반합니다.
3. 고압 동결
- 고압 냉동고 저장소에 액체 질소(LN2)를채우고 펌프를 시작하여 샘플 챔버를 LN2로채웁니다.
주의: 액체 질소로 작업할 때적절한 안전 절차와 개인 보호 장비를 사용하십시오.
참고: 이러한 단계는 라이카 EMPACT2 고압 냉동고에만 해당됩니다. - 실험실 닦아 또는 종이 타월의 모서리를 사용하여 세포 펠릿에서 남아있는 액체를 멀리 심지. 충분한 액체는 펠릿이 치약과 일관성이 비슷한 페이스트를 형성한다는 것을 유지해야합니다. 20 μL 파이펫 팁으로 흡입될 수 있을 만큼 얇아야 합니다.
- 세포 펠릿의 2-3 μL을 흡인하고 멤브레인 담체에 증착합니다. 표면 장력이 상단에 약간의 돔을 생성하지만, 액체가 우물에서 유출되지 않도록, 멤브레인 캐리어의 우물을 완전히 채웁니다. 기포가 없어야 합니다.
- 멤브레인 캐리어를 카트리지에 밀어 넣고 고정합니다. 카트리지를 준비되고 프라이밍된 HPF 기계에 넣고 시작을 눌러 동결합니다.
- 온도 대 시간 및 압력 대 시간 그래프를 검사하여 압력이 2100 bar에 도달하고 온도가 200 ms 내에서 -196 °C에 도달했는지 확인하고 두 매개 변수모두 600 ms 측정에 대해 안정적으로 유지되었는지 확인합니다.
- 3.3 에서 3.5 단계는 세포 펠릿이 사용되거나 원하는 샘플 수가 동결 될 때까지 반복합니다.
- LN2에담근 카트리지를 보관하고 카트리지에서 각 멤브레인 캐리어를 제거하고 플라스틱 캡슐에 넣고 플라스틱 캡슐을 LN2로가득 찬 저온 바이알에 넣습니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지될 수 있습니다. 샘플이 있는 저온 바이알은 저온 지팡이 또는 저온 상자에 LN2 dewar에 보관할 수 있습니다.
4. 동결 대체
주의: 액체 질소로 작업할 때적절한 안전 절차와 개인 보호 장비를 사용하십시오. 또한 4단계에서 사용되는 많은 화학 물질은 탄닌산, 테트옥사이드 오스뮴 및 우라닐 아세테이트를 포함한 독성이 있습니다. 이러한 화학물질은 적절한 안전 절차에 따라 취급되어야 하며 유해 화학 폐기물로 폐기되어야 합니다.
- LN2로자동 동결 대체 장치를 채웁니다. 온도를 -90 °C로 가져옵니다.
- FS 믹스 1을 준비하고 FS를 시작합니다.
- 화학 적 후드에서, 0.2 % 탄닌산 (w / v) 및 5 % DI 물 아세톤및 시료 당 1 mL의 용액을 저온 바이알로 준비하십시오. LN2에 넣고 얼리시면 됩니다.
- FS 믹스 1 바이알과 냉동 셀 펠릿을 포함하는 저온 바이알을 FS 장치의 샘플 챔버에 놓습니다. LN2 바이알로부터 멤브레인 담체를 함유하는 내부 캡슐을 FS Mix 1을 함유하는 상응하는 바이알내로 이송한다.
- 첫 번째 단계는 -90°C에서 24시간인 FS 프로토콜을 시작합니다. 24시간 후, FS를 일시 중지하고, -90°C로 냉각된 아세톤으로 샘플을 3x 5분 동안 세척한다.
- FS 믹스 2 를 준비하고 FS를 완료
주의: 오스뮴 테트옥사이드는 확립된 안전 프로토콜에 따라 훈련받은 사람만 처리해야 하는 매우 독성이 높고 산화되는 화학물질입니다. 오스뮴 함유 용액의 저장 및 폐기를 위한 프로토콜을 따라야 하며, 오스뮴 테트옥사이드가 사용 중인 실험실 영역의 라벨링을 따라야 합니다. 오스뮴 테트옥사이드는 눈 보호, 완전한 팔 보호 기능을 제공하는 실험실 코트, 이중 니트릴 장갑 및 선택적 호흡보호구를 포함한 개인 보호 장비가 있는 화학 후드에서 취급해야 합니다.- 화학 적 후드에서 1 % 오스뮴 테트 옥사이드, 0.2 % 우라일 아세테이트 및 5 % DI 물용액을 아세톤에 준비하십시오. 시료당 1 mL을 저온 바이알에 넣고 LN2에 넣어 동결시.
참고 : 탄닌산 (아세톤에 10 % w / v), 오스뮴 테트 옥사이드 (아세톤에서 10 % w / v) 및 우라닐 아세테이트 (메탄올8 % w / v)의 재고 용액은 FS Mixes의 준비를 용이하게하기 위해 LN2 dewar에서 저온 바이알에 준비및 보관 할 수 있습니다. - FS Mix 2가 있는 저온 바이알을 FS 장치에 넣고 세 번째 아세톤 세척에서 캡슐을 FS Mix 2 바이알로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 넣습니다. FS 믹스 2에서 -90°C에서 72시간 동안 인큐베이션한 다음 12-18시간 동안 0°C로 점진적으로 온난화합니다.
- 화학 적 후드에서 1 % 오스뮴 테트 옥사이드, 0.2 % 우라일 아세테이트 및 5 % DI 물용액을 아세톤에 준비하십시오. 시료당 1 mL을 저온 바이알에 넣고 LN2에 넣어 동결시.
- 온도를 0°C로 유지하고 갓 개봉한 병에서 미리 냉각된 아세톤으로 30분간 30분간 세척합니다.
5. 수지 침투 및 포함
주의: 여기에서 사용되는 수지는 중합 전에 독성이 있으며 적절한 안전 절차 및 개인 보호 장비로 취급해야 합니다. 중합되지 않은 수지는 유해 화학 폐기물로 폐기되어야 합니다.
- 새로 개봉한 병에서 아세톤에 용해된 수지의 농도가 증가하여 시료에 침투합니다. 제조사의 지시에 따라 플라스틱 비커에 수지 성분 A, B 및 D를 혼합하여 제조하고, 0°C에서 각각 2시간 동안 2%, 4%, 8%의 수지 농도로 샘플을 배양한다. 실온에서 각각 4 시간 동안 15%, 30%, 60%, 90%, 100% 수지로 배양합니다. 성분 A, B, C 및 D의 혼합물에서 4 시간 동안 배양합니다.
- 셀 펠릿 측면이 있는 멤브레인 캐리어를 평평한 임베딩 금형에 넣고 수지(A, B, C 및 D)로 채웁니다. 시료에 대한 종이 라벨은 현재 웰에 추가할 수 있습니다.
- 24-36 시간 동안 60 °C에서 오븐에서 중합.
참고: 프로토콜은 중합 후 일시 중지될 수 있습니다. - 금형에서 블록을 제거하고 식힙니다. 멤브레인 담체를 제거하려면 먼저 샘플을 배율로 시각화 할 수있는 초미세 화의 수직 척에 넣습니다. 멤브레인 캐리어에 액체 질소를 두드리는 조합으로 멤브레인 담체로부터 멤브레인 담체를 분리하여 금속을 플라스틱으로부터 분리하고, 면도날을 사용하여 멤브레인 담체 주변의 수지들을 칩아웃한다. 분리될 때, 막 담체를 부드럽게 들어 올려 블록의 얼굴에 세포 펠릿 돔을 남깁니다.
- 노출된 셀 펠릿이 첫 번째 금형보다 약간 깊은 평평한 임베딩 몰드에서 위쪽을 향하도록 블록을 놓고 수지로 채웁니다. 24-36 시간 동안 60 °C에서 중합.
참고: 프로토콜은 중합 후 일시 중지될 수 있습니다.
6. 절편
- 면도날을 사용하여 셀 펠릿 주위의 블록을 다듬습니다. 그런 다음 블록을 샘플 척에 울트라 마이크로톤의 절편 암에 놓습니다. 유리 또는 다이아몬드 나이프를 사용하여 블록을 세포 펠릿을 둘러싸고 있는 사다리꼴 모양으로 다듬습니다.
- 유리 또는 다이아몬드 나이프를 사용하여 셀 펠릿의 90 nm 초박형 섹션을 가져옵니다.
- TEM 그리드에서 섹션 리본을 선택합니다. Formvar 코팅 구리 슬롯 그리드(1 x 2mm2 슬롯)는 직렬 섹션을 이미징하는 데 유용합니다. 필터 용지에 가장자리를 블로팅하여 그리드를 건조하고 TEM 그리드 저장 상자에 보관하십시오.
참고: 절편 후 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
7. TEM 이미징
- TEM 홀더에 그리드를 장착하고 현미경으로 놓습니다. 우리는 정기적으로 냉동 APEX 샘플을 스크리닝80 kV에서 Tecnai T12를 사용합니다. APEX2 라벨링으로 관심 있는 세포 및 세포 외 구조의 이미지를 획득합니다.
- 원하는 경우, 리드 포스트 염색을 사용하여 추가적인 멤브레인 대비를 얻습니다. 얼룩이 없는 시료(그림2I-K)와 염색 후 염색 후 샘플을 비교하는 것은 그림 2를 참조하십시오(그림2A-H).
- 희석염화나트륨 용액(~1.5mM)을 한 방울 떨어뜨리고, 각각 1분동안 2x, 10분 동안 1x를 플로트합니다.
- 사토의 리드 용액 한 방울에 1 분 동안 그리드를 띄우고 염화 나트륨 용액에 3 x 를 1 분 동안 떠서 씻은 다음 DI 물 3 x에 1 분 동안 그리드에서 과도한 액체를 블롯하고 그리드 상자에 보관하십시오.
주의: 납은 독성 화학 물질이며 적절한 안전 절차 및 개인 보호 장비로 처리해야합니다. 납을 함유한 솔루션은 유해 화학 폐기물로 폐기해야 합니다.
- TEM에 이미지 염색 후 샘플.
참고: TEM을 위한 전통적인 견본 준비에서는, 지도 대조 단계는 TEM 화상 진찰의 앞에 수행됩니다. 그러나 cryoAPEX 샘플의 경우 대비가 아닌 샘플에서 먼저 이미징을 수행하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 태그의 신호가 더 가볍게 염색된 세포 구조와 강한 대조를 이루면 쉽게 배치될 수 있습니다. 많은 샘플의 경우 더 이상 염색이 필요하지 않습니다. 그러나, 추가적인 멤브레인 대비가 필요한 경우, 리드 포스트 염색을 수행할 수 있다(Step 7.2) 및 샘플을 다시 이미지화한다.
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Representative Results
저온아펙스 방법을 이용한 초구조보존을 기존의 고정 및 탈수와 비교하기 위해, 우리는 안구 망막(ERM)이 있는 샘플을 제조하였다. ER 멤브레인) 펩티드를 APEX2로 태그하고 HEK-293T 세포로 형질전환하였다. ERM-APEX2는 ER의 세포질 면을 현지화하고 ER 구조를 조직된 부드러운 ER(OSER)34,42,43으로알려진 형태학적으로 구별되는 구조로 리모델링한다. OSER 형태는 초구조 보존을 비교하는 최적의 영역역할을 하는 매끄럽고 평행하며 조밀하게 쌓인 멤브레인 영역을 포함합니다. 기존의 APEX 방법에 의한 샘플의 제조는 OSER 구조의 명확한 라벨링(그림2A-D)을초래하였다. 고배율에서 검사시, 적층된 멤브레인은 주름이 있고 불균일한 틈새가 동심막 밀도 사이에 존재하였고, 이는 막 보존과 지질 추출이 불량했음을나타낸다(도 2D). cryoAPEX에 의해 제조 된 샘플은 또한 명확하게 OSER 구조의 라벨을 정의했다; 그러나, 막은 매끄럽고 평행하였고, 지질 추출이 거의 또는 전혀 보이지않았다(도 2E-H). cryoAPEX의 결과는 추가적인 화학적 고정 및 APEX2/DAB 반응단계(그림 2I-K)없이HPF/FS를 받은 샘플로부터 얻은 것과 유사한 고품질 보존의 결과였다.
시각적으로 현저한 막 보존 이외에, cryoAPEX 방법은 단백질 분포 패턴의 양상이 경우에 따라 관찰될 수 있도록 관심 있는 단백질을 보존한다. 이 점을 설명하기 위해, 우리는 또 다른 ER 국소 단백질, 헌팅틴 효모 상호 작용 단백질 E (HYPE)를 사용했습니다. HYPE는 ER 멤브레인 44, 45,46,47의발광면에 위치한 막 단백질입니다. 과대 광고-APEX2 컨스트럭트는 HEK-293T 세포에서 과발현되었다. 90 nm 얇은 단면의 TEM 분석은 과대 광고가 핵 봉투뿐만 아니라 주변 ER 전체에 걸쳐 존재했다는 것을 밝혔다(그림 3A, B). 부가적으로, 과대 광고 밀도는 내문 ER 멤브레인을 따라 정기적으로 이격된 초점으로 해결될 수있었다(도 3C,화살표). 과대 광고 분포 및 초점또한 전통적인 고정 및 탈수로 제조 된 샘플에서 볼 수 있었다; 그러나 광범위한 멤브레인 붕괴 및 추출이 존재하여 시료가 최적이 되지않았습니다(그림 3D,E).
다양한 태그가 부착된 단백질에 대한 cryoAPEX 방법의 강력한 조직특이성 및 적용가능성을 입증하기 위해 세 가지 세포 마커를 사용하여 APEX2 라벨링을 수행했습니다. 미토콘드리아는 미토-V5-APEX234를사용하여 표지되었다. 미토콘드리아 매트릭스의 이러한 마커는 미토콘드리아만의 특이적 염색을제공했다(도 4A). 마찬가지로, 우리는 CAAX-APEX234를사용하여 플라즈마 멤브레인 라벨링을 평가했는데, 이는 플라즈마 멤브레인만의 뚜렷한 염색을 생성했습니다(그림4C). 세포내 세포기관에서 라벨링이 관찰되지않았다(도 4C). 또한, α-mannosidase의 마우스 이소폼의 첫 번째 118아미노산을 APEX2 유전자48과융합하여 골지 루멘의 마커로서 새로운 구성을 만들었습니다. 생성된 MannII-APEX2는 이후에 저온 APEX 방법에 의해 제조된 세포로 과도하게 형질감염되었다. 스테인드 골지 스택은 주변 세포기관과 명확하게 구별되었다(도4B). 개별 스택, 시스터나 및 일부 소포는 골지 염색의 전형적인 표지되었다(그림 4B). 전부, 이 마커는 cryoAPEX 방법이 주변 하위 세포 구조에서 그(것)들을 구별하기 위하여 충분히 높은 해결책에 있는 각종 세포기관 내의 막 단백질의 특정 표지를 제공한다는 것을 보여줍니다.
그림 1: CryoAPEX 프로토콜의 필수 단계의 회로도. (A)세포가 성장하여 APEX2 플라스미드로 형질전환된다. (B)세포는 글루타랄데히드로 펠릿되고 고정되고, 그 다음에(C)DAB 및 과산화수소를 배양하여 과산화효소 반응 생성물을 생성한다. (D)펠릿은 HPF에 의해 냉동,(E)중금속과 아세톤으로 대체 된 동결, 그리고(F)수지에 내장되어 있습니다. 얇은 섹션은 마이크로 토메에 수집됩니다. (G)TEM 이미징이 수행되고 스테인드 후 추가 대비가 추가될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 기존의 화학 적 고정, 저온 APEX 및 HPF / FS를 사용하여 OSER 멤브레인 보존비교. 화학적으로 고정된 재조직된 ER 형태는, DAB는 전통적인 화학적 고정 및 알코올 탈수를 통해 처리된 ERM-APEX2 발현 세포를반응(A-D)또는 저온APEX(E-H)에 의해 서채고된 ERM-APEX2 발현 세포와 비교하여 DAB 반응(I-K)을 극저온으로 처리하였다. 살아있는 저온 고정 세포는 최고의 달성 가능한 초구조 보존을 나타내며 두 개의 APEX 기반 검출프로토콜(A-H)을통해 얻어진 멤브레인 보존을 평가하기 위한 지표로서 여기에서 작용한다. 전통적인 방법 (패널 C 및 D)에의해 얻어진 주름 멤브레인과는 달리, 저온 APEX (패널 G 및 H에서예시)에 의해 얻어진 ER 유래 멤브레인의 균등한 간격 병렬 라멜라 스태킹은 cryoAPEX에 의해 얻어진 우수한 멤브레인 보존을 강조합니다. 이 수치는 2019 년48에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: APEX2 태그가 달린 ER 막 단백질의 단백질 국소화는 주기적인 초점으로 해결될 수 있다. (A)HEK-293T 세포의 얇은 부분의 이미지는 HYPE-APEX2를 발현하고 저온 APEX에 의해 처리되어 잘 보존된(조밀한) 세포질배경(B,C)에서ER의 염색을 드러낸다. 주변 ER의 작은 부분의 높은 배율 이미지 (A에서 노란색 상자에 의해 구분되고 B에도시된 B로 표시됨) APEX2 생성 밀도의 주기적 초점(B,빨간색 상자 및 C,HYPE 초점 사이의 주기적을 나타내는 흰색 화살표 헤드)를 나타낸다. (D)과대 광고-APEX2를 발현하고 전통적인 화학적 고정 및 탈수에 의해 제조된 세포의 얇은 부분의 이미지는 피질 ER 및 핵 봉투(빨간 화살표)의 특정 염색을 나타낸다. (E)더 높은 배율에서, 주기적인 HYPE 특이적 초점은 적색 화살표로 표시된 광범위한 막 파괴에도 불구하고 ER (인세트의 노란색 상자 및 흰색 화살표 헤드)의 스트레칭 내에서 명백하였다. NE = 핵 봉투. 이 수치는 2019 년48에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 세포자 마커는 APEX2 태그가 달린 단백질로부터 수득된 신호의 특이성을 보여준다. 미토콘드리아 매트릭스(mito-V5-APEX2; A에도시된)로 국소화하도록 설계된 APEX2 태그단백질 컨스트럭트는 또는 골지 루멘(α-mannII-APEX2; B에도시된), 또는 혈장 막(CAAX-APEX2; C에나타낸)을 HEK293 세포및 시료에 의해 일시적으로 발현하였다. 각 구조는 세포기관 특정 밀도를 산출했다. α-mannIIAPEX2(패널 B)또는 CAAX-APEX2(패널 C)를발현하는 세포로부터의 두 섹션(노란색 또는 빨간색 상자)의 확대된 뷰가 도시된다. 이 수치는 2019 년48에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 cryoAPEX 프로토콜은 세포 환경 내에서 막 단백질의 국소화를 특성화하는 강력한 방법을 제공한다. 유전적으로 인코딩된 APEX2 태그를 사용하면 관심 있는 단백질의 정확한 국소화를 제공할 뿐만 아니라, 저온 탈수및 저온 탈수의 사용은 주변 세포 초구조체의 우수한 보존 및 염색을 제공합니다. 결합된, 이 접근은 그것의 세포내 문맥 내의 높은 정밀도로 단백질을 현지화하기 위한 강력한 공구입니다.
이 방법의 발전의 핵심은 전통적인 TEM 방법에 의한 제조 후 경험된 초구조체의 손실이 주로 고정단계(40)가아닌 탈수 단계로부터 온다는 사실이다. 그것은 이전에 과산화 아 제 기반 방법은 과산화 아 제 반응 전에 화학 적 고정을 필요로 하기 때문에 HPF/FS와 호환 되지 않은 것으로 생각 되었다. 이 것을 해결하기 위하여는, CryoCHEM에게 명명된 프로토콜은 견본이 처음에 동결되는, 재수화 및 과산화증 반응49에선행되는 개발되었습니다. 이 접근 방식은 샘플 염색 및 보존에 상당한 개선을 통해 우수한 대상 지역화를 제공합니다. 그것은 조직 견본및 상관적인 형광 및 전자 현미경 검사가 요구되는 경우에 유용하기 위하여 보였습니다. cryoCHEM과 병행하여, 우리의 방법은 글루타랄데히드 고정과 HPF 및 FS를 결합합니다. CryoAPEX는 작은 세포 샘플에서도 효과적으로 작동하는 간소화된 프로토콜을 제공합니다.
고압 동결 및 동결 대체 기기에 대한 접근은 cryoAPEX 방법에 매우 중요합니다. 이러한 장비와 기술은 EM 시설에서 점점 더 흔해지고 있습니다. HPF 및 FS 장비가 용이하게 구할 수 없더라도, 화학적으로 고정된 시료는적당한 거리(40)로수송될 수 있는 짧은 시간 동안 충분히 안정적이다. 우리는 견본이 질의 중요한 손실 없이 HPF의 앞에 적어도 48 시간 동안 4°C에서 DAB 반응 후에 저장될 수 있다는 것을 것을을 발견했습니다. cryoAPEX 프로토콜의 또 다른 중요한 측면은 강력한 실험과 설득력있는 결과에 필수적인 컨트롤을 포함시키는 것입니다. 효율이 100% 미만인 과도 형질 전환으로 제조된 샘플은 동일한 샘플 내에서 음의 대조군 세포뿐만 아니라 표지된 세포를 포함합니다. APEX2의 안정한 발현을 가진 세포주를 사용하는 경우, 관심 있는 비APEX2 표지 단백질을 가진 세포의 형질전환에 의해 별도의 음성 대조군을 제조해야 한다. Addgene을 통해 오르간 연주자 제어역할을 할 수 있는 여러 구문들이 제공되며, 게시된 이미지는검증33,34,36,48에사용될 수 있는 다른 간행물들에서 사용할 수 있다. Martell et al.36에 의해 새로운 APEX2 융합 구도의 실험 설계 및 검증에 대한 심층적인 논의가 제공되었습니다.
cryoAPEX는 막 단백질의 검출을 위해 광범위하게 유용하지만, 몇 가지 제한사항이 존재합니다. APEX2는 작은 28 kDa 단백질이지만, 일부 단백질은 태그33,34를통합하지 못할 수 있습니다. APEX2는 확산 반응 생성물33,36으로인해 시토솔에 수용성 단백질을 라벨링하는 데 유용하지 않은 것으로 간주된다. 추가적으로, 단백질의 소량의 검출은 주변 세포에 있는 얼룩의 존재 때문에 도전을 제기합니다. HPF와 FS에 의한 준비는 전통적인 고정 및 탈수에 의해 추출되는 세포 성분을 보존합니다. 이것은 세포에 있는 전반적인 어두운 얼룩으로 이끌어 냅니다, 잠재적으로 APEX2 라벨의 낮은 수준과 경쟁하.
cryoAPEX 기술은 최적화가 필요할 수 있는 제한된 수의 단계로 많은 단백질에 널리 적용됩니다. 첫째, 단백질 간의 개별적인 가변성으로 인해, 단백질 발현 수준 및/또는 DAB 반응 시간은 신호가 세포의 배경 염색 위에 시각화되기 위해 조정될 필요가 있다. 새로운 APEX2 융합 구단의 유효성 을 검증하고 발현 및 DAB 염색의 최적화를 위한 유용한 정보 및 프로토콜은 Martell et al.36 세포 염색 관점에서, FS 프로토콜 및/또는 화학 물질은 상이한 세포 유형, 조직 또는 유기체50,51,52,53 , 53,50, 50, 50,50, 50, 53,54. 우리의 경험에서, 여기에 제시된 FS 조건은 포유류 세포주의 다양한 잘 일했습니다.
cryoAPEX의 하이브리드 접근법은 다른 많은 유전자 표지 기술에 적용될 가능성이 있습니다. 전통적인 알코올 탈수함을 HPF/FS로 대체하면 초구조 보존 및 단백질 국소화 정보가 크게 개선될 것으로 기대됩니다. 사파이어 디스크를 세포 기판으로 활용하여 세포체를 고정하여 세포내골격 및 세포-세포 접촉을 포함하는 세포 주변의 보존을 향상시킨다. 사파이어 디스크를 사용하려면 프로토콜을 약간 수정해야 합니다. APEX 기술은 GFP 결합 펩타이드35를통해 녹색 형광 단백질(GFP) 태그가 지정된 단백질을 검출하는 데 사용될 수 있다. 이 간접적인 검출 방법은 이미 GFP로 태그된 무수한 단백질에 APEX 기술을 활용할 수 있는 가능성을 열어줍니다. 최근에 도입된 분할 APEX2는 근접 및 상호 작용 연구55에유리할 것이다. 또한 기존의 HRP 기반 방법을 HPF/FS와 결합하여 세포 보존을 개선할 수 있습니다. 한 가지 예는 개별 세포 마커가 형광 태그 및 HRP 둘 다와 융합된 EM resolution (FLIPPER)을 이용한 p침전을 위한 fluorescent indicator 및 peroxidase이며, 골기 또는 ER56에대한 내문 마커를 제공한다. DAB 대신개선된 과산화아제 기판을 사용하는 것도 RNA 라벨링 57에최적화된 기판을 포함하는 이 방법을 사용하여 가능하다. CryoAPEX는 또한 전자 단층 촬영을 통해 단백질 분포의 3 차원 분석에 필요한 세포 내 라벨링 및 초구조 보존을 제공하며, 잠재적으로 SBF-SEM 또는 FIB-SEM48,58을통해 대량으로 제공합니다.
전반적으로 CryoAPEX는 광범위한 적용성을 갖춘 견고한 방법입니다. 원칙적으로, 그것은 어떤 막 단백질에 적용 될 수 있습니다., 세포 기관의 내 문 공간 내에서 여부, 세포질 얼굴에, 소포 내에서, 세포의 혈장 막 또는 세포 외 공간에서. 이 방대한 범위의 막 단백질에 대해, cryoAPEX 방법은 세포내 문맥 내에서 정확도로 단백질의 국소화 및 분포를 볼 수 있는 잠재력을 제공한다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
여기서 설명된 프로토콜은 세포 과학 저널, 132 (6), jcs222315 (2019)48에의한 간행물에서 유래한다. 이 작품은 인디애나 임상 및 번역 과학 연구소에서 건강의 국립 연구소에서 R01GM10092 (S.M.에) 및 AI081077 (R.V.S.) 보조금에 의해 지원됩니다, CTSI-106564 (S.M.에), 그리고 PI4D-209263 (S.M.에) 감염성 질환 연구소에서 감염성 연구소, 감염성 연구소.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637-1G | |
| Acetone (Glass Distilled) | Electron Microscopy Sciences | 10016 | |
| Beakers; Plastic, Disposable 120 cc | Electron Microscopy Sciences | 60952 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| Cryogenic Storage Vials, 2 mL | VWR | 82050-168 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin | Sigma-Aldrich | 44611-500ML | |
| Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 | Sigma-Aldrich | 44612-500ML | |
| Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) | Sigma-Aldrich | 44613-100ML | |
| Durcupan ACM Fluka,single component D | Sigma-Aldrich | 44614-100ML | |
| Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
| Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm | Electron Microscopy Sciences | 70900 | |
| Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement | Corning | 355104 | |
| Glass Knife Boats, 6.4 mm | Electron Microscopy Sciences | 71008 | |
| Glass Knifemaker | Leica Microsystems | EM KMR3 | |
| Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
| HEK 293 Cells | ATCC | CRL-1573 | |
| High Pressure Freezer with Rapid Transfer System | Leica Microsystems | EM PACT2 | Archived Product Replaced by Leica EM ICE |
| Hydrogen Peroxide 30% Solution | Fisher Scientific | 50-266-27 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000015 | |
| Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm | Mager Scientific | 16707898 | |
| Osmium Tetroxide, crystalline | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade | VWR | 97062-950 | |
| Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm | Mager Scientific | 16702738 | |
| Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film | Electron Microscopy Sciences | FF2010-Cu | |
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 102090-962 | |
| Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) | Avantor Macron Fine Chemicals | 7708-10 | |
| Tannic Acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 | |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm | VWR | 25382-166 | |
| Ultra Glass Knife Strips | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | EM UC7 | |
| Uranyl Acetate Dihydrate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
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