Summary
בפרוטוקול זה, שיטה של מורטין איון בידוד והשתלת לתוך רקמת השומן הלבן התת עורית מתוארת. האיים המבודדים של מורנה ממורג מושתלים לתוך המטופל מורין באמצעות קרום מרתף הידרוג'ל. רמת הגלוקוז בדם של המטופלים מנוטרים, ו ניתוח היסטולוגיה של שתלי איון מבוצע.
Abstract
השתלת איון הלבלב הוא טיפול רפואי מבוסס היטב עבור סוכרת סוג 1. קפסולת הכליה הוא האתר הנפוץ ביותר עבור השתלת איון במודלים מכרסמים. עם זאת, קפסולת הכליה הדוקה מגבילה את ההשתלה של איונים מספיקים בבעלי חיים גדולים ובני אדם. רקמת השומן הלבנה לבנה תת עורית (ISWAT), חלל תת עורי חדש, נמצא להיות אתר בעל ערך פוטנציאלי עבור השתלת איון. באתר זה יש אספקת דם טובה יותר מאשר חללים תת עורית אחרים. יתר על כן, ISWAT להכיל מסה איון גדול יותר מאשר קפסולת הכליה, והשתלת לתוך זה הוא פשוט. כתב יד זה מתאר את ההליך של בידוד איון העכבר והשתלת באתר ISWAT של העכבר סוכרתית התחביריים. באמצעות פרוטוקול זה, מורטין איונים הלבלב היו מבודדים על ידי העיכול הסטנדרטי קולגן ומטריצות קרום המרתף הידרוג'ל שימש לתיקון איונים מטוהרים באתר ISWAT. רמות הגלוקוז בדם של עכברי המטופל היו מנוטרים במשך יותר מ 100 ימים. שתלי איון אוחזרו ביום 100 לאחר ההשתלה ניתוח היסטולוגית. הפרוטוקול להשתלה איון באתר ISWAT המתואר בכתב יד זה הוא פשוט ואפקטיבי.
Introduction
השכיחות העולמית והשכיחות של סוכרת מסוג 1 (T1DM) עולים במהירות, על פי הנתונים הסטטיסטיים של הפדרציה הבינלאומית לסוכרת (צה"ל)1. השתלת איון היא אחת הגישות המבטיחים ביותר לטיפול T1DM4. מאז פריצת הדרך הגדולה שנעשתה השתלת איון קליני באמצעות פרוטוקול אדמונטון2 דווח, תפקוד הישרדות השתל איון ב T1DM הנמענים לאחר 5 שנים מגיע כעת על 50%3.
בעבר, מספר אתרי השתלת, כגון הכבד, כמוסת כליות, טחול, אזור תוך שרירי, מרחב תת עורי, מח עצם, ואת הכיס אונטל נחקרו עבור השתלת איון ניסיוני5,6,7. חלק מהאתרים הנ ל נבדקו בהגדרות הקליניות8. למרות השתלת איון לתוך הכבד נשאר השיטה הנפוצה ביותר בשימוש ביישום קליני בהווה9, יש כמה בעיות חשובות לכתובת בעת שימוש באתר זה. למשל, כיצד להפחית את אובדן מוקדם של האיים המושתלים שנגרמו על ידי התגובה הדלקתית מיידית של דם בתיווך (IBMIR) ואספקת חמצון העניים10,11 וכיצד לאחזר את שתלי איון במידת הצורך, כי הם מפזרים לוקליזציה בכבד. קפסולת הכליות עשויה להיות אתר אידיאלי עבור נמעני מכרסמים. עם זאת, הקפסולה כליה הדוקה מגביל את ההשתלה של איונים allogeneic מספקת בבני אדם, למרות שזה יכול להיות מתאים יותר עבור השתלת איון xenotransplantation בשל ההכנות מטוהרים מאוד חזירי איון בשימוש קליני5,12. לכן, החיפוש אחר אתר מתאים יותר עבור השתלת איון הוא בעיצומו.
החלל התת עורי עשוי לשמש כאתר הישימה קלינית עבור השתלת איון בשל הנגישות שלה. עם זאת, את היעילות של השתלת איון לחלל תת עורית הוא נמוך מאוד, ובכך דורשים מספר גדול יחסית של איוקמיה הפוכה13. לאחרונה, צוות מחקר יפני מצא את ISWAT, אתר תת עורית הספר מעולה להשתלה איון במודל murine בהשוואה לכבד14. ISWAT מכיל את העורק האפיקיבה ואת הווריד, כך אספקת הדם העשיר עשוי להבטיח השתלת איון revascularization. בכתב יד זה, אנו מציעים שיטת השרשה קלה באמצעות מטריקס מטריצות קרום הידרוג'ל כדי לתקן איונים murine מורנה ב ISWAT. פרוטוקול זה מוכיח יעיל עבור השתלת איון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בפרוטוקול זה עקבו אחר עקרונות הרווחה של בעלי החיים של הוועדה לסקירת האתיקה של בית החולים השני של שנזן. מקבלי השתל איון ותורמים היו 8-עד 10-שבוע בן C57BL/6 עכברים זכרים שנרכשו מהמרכז הרפואי בעלי חיים בפרובינצית גואנג-דונג. ההליך של קצירת, בידוד, תרבות, או מינהל של תאים שנקטפו בוצעו בתנאים אספטי.
1. הכנה איון
- הכנת הקולגן הסוג V פתרון עבודה. שוקלים את הסוג V ולפזר עם D-האנק של מאגר לריכוז הסופי של 1 מ"ג/mL, מסנן באמצעות 0.22 יקרומטר מזרק מונחה יחידת מסנן ומזרק 60 mL ו-precool קרח. יש צורך בנפח של 5 מ"ל עבור כל נמען תורם.
- המתת חסד של 10 שבועות בן C57BL/6 עכבר זכר (23 ± 2 g) על ידי פריקה צוואר הרחם לרסס את החלק החיצוני של העכבר עם 75% אתנול במשך כמה שניות. בינתיים, למלא מזרק 5 מ ל עם הפתרון הקולגן ולשנות את המחט מזרק עם המחט קהה בוטה המחודד (32 G).
- לשים את העכבר התורם בתנוחה פרקדן על שקית קרח תחת היקף החתך, לחתוך פתח רוחבי באמצעות ישר הצביע מספריים אופטלמולוגי בעור של אזור הערווה, ולחלוטין לממש את העור לעבר הראש. ואז לפתוח לחלוטין את הבטן דרך חתך V מאזור הערווה לתהליך xiphoid.
- לחשוף את כיס המרה ואת כל אורכו של צינור המרה המשותף על ידי מיקום מחדש של הכבד. ואז להדק את פתיחת התריסריון של צינור המרה המשותף עם מהדק כלי הדם ולחתוך פתח קטן בכיס המרה.
הערה: מיקום מחטים אופטימלי חשוב למנוע תזים לתוך הכבד והמרה. - צינורית צינור המרה המשותף מפתח כיס המרה באמצעות מחט זלוף בשלב 1.2, ואז להזריק ~ 2 mL של הפתרון הקולגן לתוך הלבלב. לאחר מכן, הפרידו את הלבלב המצעם מהמעיים, הקיבה והטחול באמצעות שני זוגות של מיקרופינצטה לא פולשנית, והכניסו אותו לשפופרת של 50 מ ל בקרח.
הערה: חזור על התהליך עבור כל עכברי התורמים. שלושה משחטות ברציפות (לא יותר מ 40 דקות מלבד) ניתן לשלב לתוך צינור שפופרת של 50 mL מראש עם 3 מ ל של הפתרון הקולגן עבור כל לבלב. - הוסף 100 μL DNase I (10 מ"ג/mL) לכל הלבלב לתוך הצינורות החרויים 50 mL, ולעכל את המשחטות באמבט מים ב 37 ° צ' על ידי לטלטל את צינורות החרוט עבור 3 – 5 דקות.
הערה: לנער את הצינורות במרץ 40 x במרווחי זמן של 10 כדי לנתק את הרקמה לפני העיכול באמבט מים, ולאחר מכן לטלטל את הצינורות בזמן העיכול. - הוסף פתרון עצירה (2.5 mg/mL BSA-HBSS פתרון) עד לנפח הסופי של 50 mL כדי לחסום את העיכול, ואת הדופק צנטריפוגה את הצינורות למהירות של 750 x g ב 4 ° c ולהפסיק במהירות.
- יוצקים את supernatant ולשטוף את כדורי 2x על ידי השעיית מחדש בעדינות ב 15-25 מ ל של BSA-HBSS. הדופק צנטריפוגה את הצינור עם אותם תנאים מהירות כפי שמתואר בשלב 1.7 עבור 1 דקות.
- יוצקים את הסופרנטאנט ואת הבריכה את כדורי שלושת הצינורות החרוטים לתוך צינורית חרוט 50 mL. השהה מחדש את כדורי בנפח כולל של 10 מ"ל של histopaque-1119. מערבבים הומוגנבאופן רציף, ברציפות להוסיף 5 מ ל של histopaque-1077 ו-5 מ ל של HBSS על ידי ליטוף לאט לאורך הצד של הצינור.
- לסובב את הדגימות בצנטריפוגה ב 750 x g ב 4 ° צ' עבור 10 דקות ללא בלמים.
- מביס את איונים מן HBSS/histopaque-1077 ממשק לתוך צינורית חרוט 50 mL באמצעות חד פעמי 5 מ ל הצינור פסטר, להוסיף BSA-HBSS לנפח הסופי של 50 mL, והדופק צנטריפוגה ב 750 x g ב 4 ° c.
- שופכים את הסופרנטאנט ושוטפים את איואיי באמצעות 30 מ ל של BSA-HBSS. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 750 x g ב 4 ° c.
- השעיה מחדש של איונים באמצעות 30 מ ל של תרבות בינונית (10% FBS-1% P/S-CMRL-1066) לצינור ולשפוך ב 10 ס מ קוטר התרבות הדוקה האור. תחת stereomicroscope, באמצעות 200 μL ג'ל טעינת pipet טיפים, לאסוף את איונים מן הפתרון מבוסס על המבנה שלהם (כלומר, מבחינה מעשית, לבן). לשים לתוך צלחת תרבות תא מטופל עם 10 מ ל של מדיום התרבות.
הערה: איסוף הידיים השני יכול להתבצע אם הטוהר של איונים מטוהרים הראשון אינו אופטימלי לאחר הקטיף הראשון. - בדוק את הטוהר של האיים שנבחרו על ידי dithizone מכתים תחת מיקרוסקופ אור לזהות את הכדאיות של איונים על ידי fluorescein diאצטט (FDA)-propidium יודיד (PI) מכתים תחת מיקרוסקופ פלורסנט.
- תרבות האיים המבודדים בתווך תרבותי (כמו בשלב 1.13) בחממה ב 37 ° c, 95% air-5% CO2 לפני ההשתלה.
2. ISWAT השתלת איון
- לגרום לסוכרת בגבר בן 8 שבועות C57BL/6 עכברים (22 ± 2 גרם) על ידי הזרקה אחת של streptozotocin (STZ). ביום-4, מהר את העכברים ~ 4-6 h, לאחר מכן להכין 2% STZ פתרון באמצעות 0.1 M ציטראט מאגר (pH 4.4). שוקלים, להשעות מחדש במאגר, ולהזריק את העכברים intraperitoneally במינון של 180 מ"ג/ק"ג.
הערה: הפתרון STZ צריך להיות טרי מוכן לפני השימוש מכוסה ברדיד אלומיניום עקב רגישות האור שלה. יש להשתמש בו מיד, כי היא תאבד פעילות בתוך 15 – 20 דקות. - ניקוב ורידים caudal של העכברים STZ-מוזרק לאסוף קצת דם בסביבות 10 בבוקר של יום -1 ויום 0 ולמדוד את רמת הגלוקוז בדם שאינם בצום באמצעות רצועת הבדיקה ומכשיר בסיסי לניטור הגלוקוז בדם. העכברים ישמשו כנמעני השתלת איון אם רמות הגלוקוז בדם של 2 ימי המבחן הרצופות הן לפחות 20 מ מול/L.
- ביום 0, שקול וסמן את כל עכברי הנמען. הפנטוברביטל כל נמען באמצעות הזרקת 60 מ"ג/ק"ג לintraperitoneally נתרן.
הערה: לנהל את הבוהן כדי לבדוק את עומק ההרדמה. אם לעכבר הנמען אין רפלקס גמילה, רמת ההרדמה מספיקה לניתוח. אם לא, ניהול נוסף 10 מ"ג/ק"ג פנטוברביטל נתרן. פנטוברביטל נתרן בשימוש היה מדולל תמיסת מלח פיזיולוגי סטרילי בריכוז של 2% (m/v). - קח את ההידרוג'ל ממקפיא של 20 ° c ושמור אותו על הקרח כדי לאפשר את הפשרה. ההידרוג'ל הינו נוזלי בגובה של 4 עד 10 ° c והוא יחזק בטמפרטורה גבוהה יותר.
- לאסוף ~ 450 – 500 המקבילה איון (IEQ) עבור כל נמען לתוך שפופרת 1.5 mL סטרילי מתחת לstereomicroscope (כמו בשלב 1.13) עם 200 μL של התרבות בינונית ולשמור על הקרח עד מוכן השתלת.
- לנגב את האזור השמאלי הלבין של המטופל באמצעות 75% אתנול. מניחים אותו במצב פרקדן ולתקן את ארבעת הגפיים באמצעות קלטת כירורגית. לגלח את השיער סביב האתר כירורגי עם קוצץ חשמלי ולנקות את האזור עם שפתי-האור.
- הפוך את חתך העור האנכי באזור זה באמצעות מספריים אופטלמולוגית ומיקרופינצטה לא פולשנית, לזהות את עורק הקיבה והווריד הנחותים באיזווואט, וליצור כיס קטן מעל כלי הדם.
- ספין הצינור איים עבור 30 s ב 200 x g ולהסיר את supernatant ככל האפשר. מנושף 20 μL של הידרוג'ל מופל לחלוטין ולטעון אותו לתוך הצינור עם איונים. , להשהות את האיים בעדינות. להימנע מבועות
- העבר את התערובת של איון-הידרוג'ל כולו בצינור לכיס (שלב 2.7) של המטופל עם טיפ 200 μL.
הערה: תהליך זה דורש שני טכנאים, אחד להרים את הקצוות של הכיס באמצעות מיקרופינצטה לא פולשנית, והשני לאספקת תערובת איון לתוך הכיס. - הוסף 20 μL של צפלוספורין (~ 5 – 10 מ"ג) לתוך האתר השתלת לאחר התערובת איונים-הידרוג'ל הוא מתחזק לחלוטין, ולאחר מכן להשתמש בתפר כירורגי 5-0 לסגור את השריר והעור עם שיטת תפר רציפה.
הערה: ההידרוג'ל צריך בערך 3 דקות כדי לגבש עקב טמפרטורת הגוף. - הציבו את המטופל בכלוב נקי והמשיכו להתחמם באמצעות משטח תרמי. המשך לעקוב עד שהנמען מתאושש במלואו ומתחיל לנוע באופן עצמאי. לאחר מכן לנהל 0.03 mg/ml Buprenorphine עם intraperitoneally מלוחים פיסיולוגיים, על פי 0.1 mg/ק"ג מינון.
- חזור על שלבים 2.3 – 2.11 עבור כל עכבר נמען.
- למדוד את רמות הגלוקוז בדם שאינם צום של עכברי הנמען (כמו בשלב 2.2) 3 – 4x בשבוע עבור החודש הראשון, ו-1x בשבוע לאחר מכן.
- בסוף המעקב (100 ימים לאחר ההשתלה), תחת הרדמה (בוצע כמו בשלב 2.3) הבלו ISWAT הנושאת את השתל מהנמענים בעקבות הצעדים סטרילי המתואר בשלב 2.6. תקן את הרקמה בפורמאלין ופאראפורמלדהיד בהתאם לפרוטוקולים היסטלוגיים עבור המטאוקסילין והאאוזין (H & E) כתמים ואימונולואואורולוגיים של אינסולין וגלוגון.
- להוסיף צפלוספורין ולסגור את החתך של הנמענים כמו בשלב 2.10, לאחר מכן להתכונן להחלמה כמו בשלב 2.11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שני הליכים מוצגים בפרוטוקול זה: הכנה מורנה איון השתלת איון לאתר ISWAT. , בהליך הראשון לאחר השימוש והעיכול עם מסוג V קולגן הפתרון, טיהור עם Histopaque-1119 ו Histopaque-1077 וצעד נוסף לקטוף יד, איונים murine מבודדים יהיה טהור מספיק עבור השתלת (כפי שמוצג באיור 1) ואת איונים מבודדים כי יש כדאיות גבוהה ישמש השתלת (כפי שמוצג באיור 2). בהליך השני, האינדוקציה סוכרת עם כימיה STZ הוא קריטי. המינון האופטימלי של STZ תלוי במתח העכבר גיל, ואינדוקציה מוצלחת של סוכרת מוגדר על ידי רמות הגלוקוז בדם שאינם מהירים של יותר מ 16.7 mmol/L באותו זמן בשני ימים רצופים. עכברים סוכרתית יכולים לשרוד ללא השתלת איון במשך כמה שבועות. שתלי איון צריך להיות מעורב במלואו עם הידרוג'ל לפני המושתלים לתוך האתר ISWAT, וכמה דקות צריך לעבור את השתלים להיות קבוע ל-איסאט (איור 3). כאשר המושתלים לתוך ISWAT, שתלי איון הפוך היפררגליקמיה במשך כחודש אחד, ואת משקל הגוף של עכברים הנמען גדל בהדרגה (איור 4). ב 100 ימים לאחר ההשתלה, שתלי איון אוחזרו עבור ניתוח היסטולוגית (איור 5). כפי שמוצג באיור 4, הדם הלא בצום בשעה ~ 10 בבוקר בימי המבחן עלה במהירות לאחר הסרת השתלים. הצביעת H & E הוכיחה ששתלים איון נשארו ללא פגע. אינסולין ו גלוקגון אימונוofor, כתמים הראו את המושתלים פעלו היטב (איור 5).
איור 1: הלבלב זלוף והעיכול וטיהור איון. (א) תהליך של פרזיה לבלב (A1–A6). (ב) נקודת הקצה של העיכול הלבלב, עם חלקיקים מושעה. (ג) איים מטוהרים שנצפו תחת המיקרוסקופ האור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: טוהר והכדאיות של איונים מטוהרים. (א) טוהר איון נקבע על ידיכתמיםdithizone. הכדאיות של איון המוערך על ידי ה-FDA-PI כתמים כפולים. (ב) דימוי מיקרוסקופ קל של איונים. (ג) FDA הצביעת מראה תאים קיימא בירוק. (ד) פאי-פלואורסצנטית אדום מעיד על תאים מתים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השתלת איון. (א) לאחר הרדמה, לגלח את השיער באתר השתלת עם להב מכונת גילוח ולתקן את הגפיים המטופל בתנוחת הבטן כלפי מעלה עם קלטת כירורגית. (ב) לאחר כריתת האונה, נחשף אתר ההשתלה של iswat. (ג) איונים מעורבים בהידרוג'ל מושתלים באיטיות לאתר iswat. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: רמות הגלוקוז בדם והשתלת משקל גוף. שאינם צום רמות הגלוקוז בדם (הקו האדום) ואת משקולות הגוף (קו כחול) של עכברי הנמען המושתלים עם איונים syngeneic (n = 7). החץ השחור מציין כי השתלים הוסרו 100 ימים לאחר ההשתלה. כמה וריאציות ברמות הגלוקוז בדם השוואת הנמענים השונים נצפתה, המשקף הבדלים באיכות ותפקוד של איון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: היסטולוגיה והאימונולובורנציה. סעיפים השתל היו מוכתם עם H & E, dapi (גרעיני), אנטי-עכבר נוגדן לאינסולין, ונגד העכבר גלוקגון נוגדן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השתלת איון הלבלב הוא טיפול מבטיח לטיפול T1DM. ההשפעה של טיפול זה מושפע גורמים רבים ובחירת אתר אופטימלי עבור השרשה איון חשוב מאוד. האתר האנטומי האידיאלי עבור השתלת איון צריך את המאפיינים הבאים: נגישות להשתלה פשוטה, ביופסיה, והליכי אחזור השתל; סיבוכים מופחתים; שיעור הצלחה גבוהה של בקרת גלוקוז בדם; ולטווח ארוך הישרדות של שתלי איון6,16.
הצוות שלנו תיאר בעבר פרוטוקול עבור השתלת איון ב המנטום במודל murine17. במהלך המנטום, הגלוקוז בדם נורמלי הושג במועד מאוחר יותר לעומת השתלת איון תחת קפסולת הכליה. כתוצאה מכך, האתרים האחרים לנטיעת איים נחקרו.
ISWAT דווחה כאתר חלופי לכבד, כפי שהוא צריך פחות איים להפוך היפררגליקמיה של הנמענים לעומת השתלת בכבד14. יתר על כן, השתלות האיים קל, כמו מדמיין ומאחזר את השתלים14. במחקר שלנו, עכברים הנמען הפחיתו היפרגליקמיה בתוך חודש אחד לאחר השתלת איון, הרומז כי ISWAT דורש יותר מאשר קפסולת הכליה לייצר אינסולין מספיק. לפיכך, תוצאות אלו מעידות על כך שהאתר לא מציע תנאים טובים יותר לדיפוזיה של חמצן, חומרים מזינים ולחידוש השתל.
טוהר גבוהה ופעילות של איונים מבודדים הם בעלי חשיבות חיונית להפוך היפרגליקמיה של נמעני סוכרתית בהגדרת השתלת allo-איון, ופרוטוקולי בידוד איון אינם זהים בין חוקרים שונים18,19,20. זמן העיכול הוא קריטי מאוד לקבלת איונים באיכות גבוהה. בניסיון שלנו, זה לא יעלה על 5 דקות. איונים מבודדים יכולים להיות מתורבתים בחממה 37 ° c במשך הלילה כדי לאפשר שחזור מהלחץ המכני של הליך העיכול21.
ההידרוג'ל המשמש כאן הוא מטריצת קרום מרתף המכילה למינציה, קולגן IV, וגורמי גדילה17. הוא מתגבש כאשר הוא מגיע לטמפרטורת הגוף ומסייע לשמור על שתלי איון באתר ISWAT. למרות שהוא אינו רעיל לאיונים, האם נוכחות ההידרוג'ל משפיעה על הסדר היום והתפקוד נותר להיקבע.
נלקח באופן קולקטיבי, ISWAT הוא מרחב תת עורית הרומן השתלת איון במודלים מכרסמים ופוטנציאלי לשימוש קליני. להערכה מלאה, נדרשים מחקרים נוספים באמצעות מודלים גדולים יותר של יונקים פרה-קליניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מדווחים על ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים לאומי מפתח R & D תוכנית של סין (2017YFC1103704) קרנות מיוחדות לבניית בתי חולים ברמה גבוהה בפרובינצית גואנג-דונג (2019), פרויקט Sanming של הרפואה שנזן (SZSM201412020), קרן לרמה גבוהה משמעת רפואית בנייה של שנג (2016031638), קרן שנזן של המדע והטכנולוגיה (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), קרן שנזן לבריאות ותכנון משפחה הנציבות (SZXJ2017021SZXJ2018059), רפואי הקרן למחקר מדעי של פרובינציית גואנג-דונג של סין (A2019218), הקרן פוסט-דוקטורט בסין (2018M633218).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Syringe-driven Filter Unit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL Pasteur pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
| 5 mL syringe | Szboon, China | 20170829 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 5-0 surgical suture | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| 60 mL syringe | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
| anti-mouse Glucagon antibody | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
| anti-mouse insulin antibody | Cell Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
| blunt-pointed perfusion needle | Oloey, China | 005 | 32G, yellow |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | 8~10 weeks | |
| cell culture dish | BIOFIL, China | TCD000100 | General,Non-treated,87.8 mm diameter |
| centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
| cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| collagenase Type V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-hank's buffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| fluorescent microscope | Leica | DMIL | |
| gel-loading pipet tips | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| light-tight culture dish | DVS, China | AN-5058548 | self-made, glass dish sprayed with black paint |
| Medical Adhesive Tape | Cofoe, China | K12001 | |
| non-invasive microtweezers | RWD Life Science | F11033-11 and F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| ophthalmic scissors | RWD Life Science | S12012-12 and S11001-08 | |
| P/S (penicillin / streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Test Strip | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
| vascular clamp | RWD Life Science | R31006-04 |
References
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), 007823 (2012).
- Pathak, V., Pathak, N. M., O'Neill, C. L., Guduric-Fuchs, J., Medina, R. J. Therapies for Type 1 Diabetes: Current Scenario and Future Perspectives. Clinical Medicine Insights: Endocrinology and Diabetes. 12, 1179551419844521 (2019).
- Bottino, R., Knoll, M. F., Knoll, C. A., Bertera, S., Trucco, M. M. The Future of Islet Transplantation Is Now. Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202 (2018).
- Stokes, R. A., et al. Transplantation sites for human and murine islets. Diabetologia. 60 (10), 1961-1971 (2017).
- van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. The choice of anatomical site for islet transplantation. Cell Transplantation. 17 (9), 1005-1014 (2008).
- Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation. Journal of Diabetes Science and Technology. , (2019).
- Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. Clinical islet transplantation: is the future finally now. Current Opinion in Organ Transplantation. 23 (4), 428-439 (2018).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).
- Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article. International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).
- Luan, N. M., Iwata, H. Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment. American Journal of Transplantation. 14 (7), 1533-1542 (2014).
- Yasunami, Y., et al. A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver. Transplantation. 102 (6), 945-952 (2018).
- Rajab, A. Islet transplantation: alternative sites. Current Diabetes Reports. 10 (5), 332-337 (2010).
- Ekser, B., Vagefi, P. A. Search for the best site in islet xenotransplantation. International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).
- Lu, Y., et al. A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse. Journal of Visualized Experiments. (143), e57160 (2019).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), e2096 (2011).
- Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
