Summary
Bu protokolde inguinal subkutan beyaz yağ dokusuna murine adacık izolasyonu ve transplantasyon yöntemi tanımlanmıştır. İzole syngeneic murine adacıkları bir murine alıcı içine bir bodrum membran hidrojel kullanılarak nakledilir. Alıcıların kan şekeri düzeyi izlenir ve adacık greftlerinin histoloji analizi yapılır.
Abstract
Pankreas adacık nakli tip 1 diyabet için köklü bir tedavi yöntemidir. Böbrek kapsülü kemirgen modellerinde adacık nakli için en sık kullanılan yerdir. Ancak, sıkı böbrek kapsülü büyük hayvanlarda ve insanlarda yeterli adacıkların naklini sınırlar. Yeni bir deri altı alan olan inguinal subkutan beyaz yağ dokusunun (ISWAT) adacık nakli için potansiyel olarak değerli bir yer olduğu bulunmuştur. Bu site diğer deri altı alanlarda daha iyi kan akımı vardır. Ayrıca, ISWAT böbrek kapsülü daha büyük bir adacık kütlesi barındırır, ve içine nakli basittir. Bu makale, sinjenik diyabetik fare alıcılarının ISWAT bölgesinde fare adacık izolasyonu ve transplantasyon prosedürünü açıklamaktadır. Bu protokol kullanılarak, murine pankreas adacıkları standart kollajenaz sindirim tarafından izole edildi ve bir bazal membran matris hidrojel ISWAT sitesinde safamına adacıklar sabitleme için kullanılmıştır. Alıcı farelerin kan şekeri düzeyleri 100 günden fazla izlendi. Adacık greftleri histolojik analiz için transplantasyon dan sonra 100. Bu el yazmasında açıklanan ISWAT sitesinde adacık nakli protokolü basit ve etkilidir.
Introduction
Uluslararası Diyabet Federasyonu (IDF)1istatistiksel verilerine göre, tip 1 diabetes mellitus (T1DM) dünya çapında insidansı ve yaygınlığı hızla artmaktadır. Adacık transplantasyonu T1DM4tedavisinde en umut verici yaklaşımlardan biridir. Edmonton protokolü2 kullanılarak klinik adacık transplantasyonunda yapılan büyük atılım rapor edildiğinden, 5 yıl sonra T1DM alıcılarında adacık grefti sağkalım günümüzde yaklaşık %50'ye 3'e ulaşmaktadır.
Geçmişte deneysel adacık nakli için karaciğer, böbrek kapsülü, dalak, kas içi bölge, deri altı alan, kemik iliği ve omental kese gibi çeşitli transplantasyon bölgeleri incelenmiştir5,6,7. Yukarıdaki sitelerin bazıları klinik ortamlarda test edilmiştir8. Karaciğeriçine adacık nakli şu anda klinik uygulamada en yaygın kullanılan yöntem olmaya devam etmesine rağmen9, Bu siteyi kullanırken ele alınması gereken birkaç önemli sorunlar vardır. Örneğin, anlık kan aracılı inflamatuar reaksiyon (IBMIR) ve kötü oksijenasyon kaynağı10,11 ve nasıl gerekirse adacık greftleri almak için neden nakledilen adacıkların erken kaybını azaltmak için nasıl, onlar yaygın karaciğerde lokalize çünkü. Böbrek kapsülü kemirgen alıcıları için ideal bir yer olabilir. Ancak, sıkı böbrek kapsülü insanlarda yeterli allojenik adacıkların nakli sınırlar, klinik olarak kullanılan yüksek saflaştırılmış domuz adacık preparatları nedeniyle adacık ksenotransplantasyon için daha iyi bir uyum olabilir rağmen5,12. Bu nedenle adacık nakli için daha uygun bir alan arayışı devam etmektedir.
Deri altı alan erişilebilirliği nedeniyle adacık nakli için klinik olarak uygulanabilir bir alan olarak kullanılabilir. Ancak, subkutan alana adacık nakli verimliliği son derece düşüktür, böylece hiperglisemi ters adacıkların nispeten çok sayıda gerektiren13. Son zamanlarda, bir Japon araştırma ekibi ISWAT bulundu, karaciğer ile karşılaştırıldığında bir murine modelinde adacık nakli için üstün yeni bir deri altı site14. ISWAT epigastrik arter ve ven içerir, bu nedenle zengin kan akımı adacık greft revaskülarizasyon sağlayabilir. Bu yazıda, ISWAT'taki singenik murine adacıklarını onarmak için bir bodrum membran matris hidrojeli kullanılarak kolay bir implantasyon yöntemi öneriyoruz. Bu protokol adacık nakli için etkili olduğunu kanıtlıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokoldeki tüm prosedürler Shenzhen İkinci Halk Hastanesi Etik İnceleme Komitesi hayvan refahı ilkelerini izledi. Adacık grefti alıcıları ve bağışçıları Guangdong Eyaleti Tıbbi Hayvan Merkezi'nden satın alınan 8 ila 10 haftalık C57BL/6 erkek farelerdi. Hasat edilen hücrelerin hasat, izolasyon, kültür veya idaresi işlemleri aseptik koşullarda gerçekleştirilmiştir.
1. Adacık hazırlama
- Kollajenaz Tip V çalışma çözeltisi hazırlayın. Kollajenaz Tip V'yi tartın ve D-Hank'in tamponuyla 1 mg/mL'lik son konsantrasyona, 0,22 m şırınga tahrikli filtre ünitesi ve 60 mL şırınga ve buzda precool kullanarak filtre uygulayın. Her donör alıcı için 5 mL hacim gereklidir.
- Servikal çıkış la 10 haftalık C57BL/6 erkek fare (23 ± 2 g) ötenazi yapın ve farenin dış kısmını birkaç saniye liğine %75 etanol püskürtün. Bu arada, kollajenaz çözeltisi ile 5 mL şırınga doldurun ve bükme künt sivri perfüzyon iğnesi (32 G) ile şırınga iğnesini değiştirin.
- Donör fareyi, diseksiyon kapsamı nın altındaki bir buz torbasının üzerine supine pozisyonunda koyun, kasık bölgesinin derisinde düz sivri oftalmik makas kullanarak enine bir açıklık kesin ve cildi tamamen kafaya doğru eğdirin. Daha sonra kasık bölgesinden ksifoid sürecine V-kesi ile karın tamamen açın.
- Karaciğer ilerleyerek safra kesesi ve ortak safra kanalının tüm uzunluğu açığa. Sonra bir vasküler kelepçe ile ortak safra kanalının duodenal açılış kelepçe ve safra kesesi küçük bir açıklık kesti.
NOT: Optimal iğne yerleştirilmesi karaciğer ve safra kesesi içine geri akışını önlemek için önemlidir. - Adım 1.2 perfüzyon iğnesi kullanarak safra kesesi açılması ortak safra kanalı kanüle, sonra pankreas içine kollajenaz çözeltisi ~ 2 mL enjekte. Bundan sonra, bağırsak, mide ve dalak noninvaziv mikrotweezers iki çift kullanarak perfüzyon pankreas ayırmak ve buz üzerinde 50 mL konik tüp içine koyun.
NOT: Tüm donör fareler için işlemi tekrarlayın. Üç ardışık perfüzyon pankreas (en fazla 40 dk dışında) her pankreas için kollajenaz çözeltisi 3 mL ile önceden doldurulmuş 50 mL konik tüp içine kombine edilebilir. - 50 mL konik tüpleriçine pankreas başına 100 μL DNase I (10 mg/mL) ekleyin ve 37 °C'de bir su banyosundaki pankreası 3-5 dk konik tüpleri sallayarak sindirin.
NOT: Su banyosunda sindirim den önce doku ayırmak için 10 s aralıklarla güçlü 40x tüpleri çalkalayın ve sonra orta derecede sindirim sırasında tüpleri sallamak. - Sindirimi engellemek için son 50 mL'lik bir stop çözeltisi (2,5 mg/mL BSA-HBSS çözeltisi) ekleyin ve tüpleri 4 °C'de 750 x g hıza santrifüj edin ve hızla durdurun.
- Supernatant dökün ve bsa-HBSS 15-25 mL yavaşça resuspend tarafından pelet 2x yıkayın. Nabız 1 dakika için adım 1.7 özetlenen aynı hız koşulları ile tüp santrifüj.
- Supernatant dökün ve 50 mL konik tüp içine üç konik tüplerin pelet havuz. Hetopaque-1119 toplam hacmi 10 mL pelet resuspend. Homojen bir şekilde karıştırın ve tüpün yan tarafına yavaşça boru tutarak 5 mL histopaque-1077 ve 5 mL HBSS ekleyin.
- 4 °C'de 750 x g'de, 10 dk frensiz olarak numuneleri santrifüjde döndürün.
- Tek kullanımlık 5 mL Pasteur pipet kullanarak HBSS/histopaque-1077 arabirimindeki adacıkları 50 mL konik bir tüpe aspire edin, BSA-HBSS'yi 50 mL'lik son hacmine ekleyin ve 4 °C'de 750 x g'da darbe santrifüjünü ekleyin.
- Supernatant dökün ve BSA-HBSS 30 mL kullanarak adacıkları yıkayın. 4 °C'de 750 x g'de 1 dk santrifüj.
- Adacıkları tüp başına 30 mL kültür ortamı (%10 FBS-1%P/S-CMRL-1066) kullanarak yeniden askıya alın ve 10 cm çapında ışık geçirmez bir kültür kabına dökün. Stereomikroskop altında, 200 μL jel yükleme pipet uçları kullanarak, adacıkları morfolojilerine (yani küresel, beyaz) göre çözeltiden seçin. 10 mL kültür ortamı ile işlenmemiş bir hücre kültürü yemeğine koyun.
NOT: İlk saflaştırılmış adacıkların saflığı ilk toplamadan sonra uygun değilse ikinci bir toplama yapılabilir. - Hafif bir mikroskop altında dithizone boyama tarafından özenle seçilmiş adacıkların saflığını kontrol edin ve floresan mikroskop altında floresan disetat (FDA)-propidium iyodür (PI) boyama ile adacıkların canlılığını tespit edin.
- Kültür kültür ortamda izole adacıklar (adım 1.13 gibi) bir kuvöz de 37 °C, 95% hava-5% CO2 transplantasyon önce.
2. ISWAT adacık nakli
- 8 haftalık erkek C57BL/6 farelerinde (22 ± 2 g) tek bir streptozotosin (STZ) enjeksiyonu ile diyabetinin indüklemesi. Gün -4, ~ 4-6 h için fareler hızlı, sonra 0.1 M sitrat tampon (pH 4.4) kullanarak% 2 STZ çözeltisi hazırlamak. Tartın, tampon da yeniden askıya alın ve farelere intraperitoneal olarak 180 mg/kg dozda enjekte edin.
NOT: STZ çözeltisi kullanılmadan önce taze olarak hazırlanmalı ve ışık hassasiyeti nedeniyle alüminyum folyo ile kaplanmalıdır. 15-20 dakika içinde aktivite kaybedersiniz, çünkü hemen kullanılmalıdır. - STZ enjekte edilen farelerin kaudal damarlarını delerek yaklaşık 10 günü -1 ve gün 0'da biraz kan toplayın ve bir test şeridi ve temel kan şekeri izleme cihazı kullanarak açlık dışı kan şekeri seviyesini ölçün. Ardışık 2 test gününün kan şekeri düzeyleri en az 20 mmol/L ise fareler adacık nakli alıcısı olarak kullanılacaktır.
- 0. günde, tüm alıcı fareleri tartın ve işaretleyin. Her alıcıya 60 mg/kg pentobarbital sodyum intraperitoneal enjekte ederek anestezi.
NOT: Anestezinin derinliğini kontrol etmek için bir parmak ucutu uygulayın. Alıcı farenin çekilme refleksi yoksa, anestezi seviyesi ameliyat için yeterlidir. Değilse, ek bir 10 mg / kg pentobarbital sodyum uygulayın. Kullanılan pentobarbital sodyum steril fizyolojik serum fizyolojik olarak %2 (m/v) konsantrasyonu ile seyreltildi. - Hidrojeli -20 °C'lik bir dondurucudan çıkarın ve çözülmesini sağlamak için buzüzerinde tutun. Hidrojel 4-10 °C'de sıvıdır ve daha yüksek bir sıcaklıkta katılayacaktır.
- Her alıcı için steromikroskop altında steril 1,5 mL santrifüj tüp (adım 1.13 gibi) 200 μL kültür ortamına sahip ~450-500 adacık eşdeğerleri (IEQ) seçin ve transplantasyona hazır olana kadar buzda tutun.
- % 75 etanol kullanarak alıcının sol inguinal alan swab. Supine pozisyonda yerleştirin ve cerrahi bant kullanarak dört ekstremite düzeltmek. Elektrikli makaslarla cerrahi alanın etrafındaki tüyleri tıraş edin ve bölgeyi Iodophor ile temizler.
- Oftalmik makas ve noninvaziv mikrotweezers kullanarak bu alanda dikey bir deri kesi yapmak, ISWAT inferior epigastrik arter ve ven tanımlamak, ve damarların üzerinde küçük bir cep oluşturmak.
- Adacık tüpünü 200 x g'de 30 s'ye döndürün ve supernatant'ı mümkün olduğunca çıkarın. Tamamen çözülmüş hidrojel 20 μL aspire ve adacıklar ile tüp içine yükleyin. Adacıkları yavaşça askıya alın, kabarcıklardan kaçının.
- Tüpteki tüm adacık-hidrojel karışımını 200 μL pipet ucu yla alıcının cebine (adım 2.7) teslim edin.
NOT: Bu işlem, biri invaziv olmayan mikrotweezerler kullanarak cebin kenarlarını almak için iki teknisyen, diğeri de adacık karışımını cebe teslim etmek için gereklidir. - Adacıklar-hidrojel karışımı tamamen katılaşmış sonra transplantasyon sitesine 20 μL sefalosporin (~5-10 mg) ekleyin, sonra sürekli dikiş yöntemi ile kas ve cilt kapatmak için 5-0 cerrahi dikiş kullanın.
NOT: Hidrojel vücut ısısı nedeniyle katılaşmak için yaklaşık 3 dakika gerekir. - Alıcıyı temiz bir kafese yerleştirin ve termal ped kullanarak sıcak tutun. Alıcı tamamen iyileşip özerk olarak hareket etmeye başlayana kadar izlemeye devam edin. Daha sonra 0.1 mg/Kg dozuna göre steril fizyolojik salin intraperitoneally 0.03 mg/ml Buprenorfin uygulayın.
- Her alıcı fare için 2.3-2.11 adımlarını yineleyin.
- Alıcı farelerin açlık dışı kan şekeri düzeylerini (adım 2.2'deki gibi) ilk ay için haftada 3-4x, ondan sonra da haftada 1x ölçün.
- Takip sonunda (transplantasyondan 100 gün sonra), anestezi altında (adım 2.3'te olduğu gibi yapılır) 2.6.adımda açıklanan steril adımları takiben alıcılardan greft taşıyan ISWAT'ı dışarı çıkarır. İnsülin ve glukon ile hematoksilin ve eozin (H&E) boyama ve immünoffloresan için histolojik protokollere göre formalin ve paraformaldehit doku düzeltin.
- Sefalosporin ekleyin ve adım 2.10 gibi alıcıların kesi kapatın, sonra adım 2.11 gibi kurtarma için hazırlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde iki işlem uygulanmaktadır: iswat bölgesine mürin adacık hazırlama ve adacık nakli. İlk işlemde, Tip V kollajenaz çözeltisi ile perfüzyon ve sindirilme, Histopaque-1119 ve Histopaque-1077 ile arındırılması ve ek bir el toplama adımı ndan sonra, izole edilmiş rüri adacıkları transplantasyon için yeterince saf olacaktır (Şekil 1'degösterildiği gibi) ve yüksek canlılığa sahip izole adacıklar transplantasyon için kullanılacaktır (Şekil 2'degösterildiği gibi). İkinci işlemde, STZ kimyasal ile diyabet indüksiyonu önemlidir. STZ optimal doz fare zorlanma ve yaşbağlıdır, ve diyabet başarılı indüksiyon fazla hızlı olmayan kan şekeri düzeyleri ile tanımlanır 16.7 mmol / L iki ardışık gün aynı anda. Diyabetik fareler adacık nakli olmadan birkaç hafta hayatta kalabilirler. IsWAT bölgesine nakledilmeden önce adacık greftleri tamamen hidrojel ile karıştırılmalı ve greftlerin IWSAT'a sabitlenebilmeleri için birkaç dakika geçmesi gerekmektedir(Şekil 3). ISWAT'a nakledildiğinde, adacık greftleri hiperglisemiyi yaklaşık bir ay lığına tersine çevirdi ve alıcı farelerin vücut ağırlığı giderek arttı(Şekil 4). Transplantasyondan 100 gün sonra histolojik analiz için adacık greftleri alındı(Şekil 5). Şekil 4'tegösterildiği gibi, test günlerinde ~10 AM'de açlık sızkan kan greftler çıkarıldıktan sonra hızla yükselmiştir. H&E boyama, adacık greftlerinin bozulmadığını gösterdi. İnsülin ve glukagon immünoresans boyama, nakledilen adacıkların iyi işlediğini göstermiştir(Şekil 5).
Şekil 1: Pankreas perfüzyonu ve sindirim ve adacık arınma. (A) Pankreas perfüzyon süreci (A1–A6). (B) Pankreas sindirim bitiş noktası, parçacıklar askıya ile. (C) Işık mikroskobu altında gözlenen saflaştırılmış adacıklar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Saflık ve saflaştırılmış adacıkların canlılığı. (A) Dithizone boyama ile belirlenen adacık saflığı. Fda-PI çift boyama ile değerlendirilen adacık canlılığı. (B) Adacıkların ışık mikroskobu görüntüsü. (C) FDA boyama yeşil canlı hücreleri gösterir. (D) PI floresan kırmızı ölü hücreleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Adacık nakli. (A)Anesteziden sonra, transplantasyon yerindeki saçı tıraş bıçağıyla tıraş edin ve cerrahi bantla karın yukarı doğru pozisyonda alıcı uzuvları düzeltin. (B) Laparotomi sonrası ISWAT transplantasyon bölgesi açığa çıktı. (C) Hidrojel içinde karıştırılan adacıklar yavaş yavaş ISWAT bölgesine nakledilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kan şekeri düzeyleri ve vücut ağırlığı posttransplantasyonu. Singenik adacıklarla nakledilen alıcı farelerin açlık dışı kan şekeri düzeyleri (kırmızı çizgi) ve vücut ağırlıkları (mavi çizgi). Siyah ok greftlerin nakilden 100 gün sonra çıkarıldığını gösteriyor. Kan şekeri düzeylerinde çeşitli alıcıları karşılaştıran bazı değişimler gözlendi, adacık kalitesi ve fonksiyonu farklılıkları nı yansıtan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Histoloji ve immünofloresans. Greft kesitleri H&E, DAPI (çekirdek), anti-fare insülin antikor ve anti-fare glukagon antikor ile boyandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pankreas adacık nakli T1DM tedavisi için umut verici bir tedavi yöntemidir. Bu tedavinin etkisi birçok faktörden etkilenir ve adacık implantasyonu için en uygun yeri seçmek son derece önemlidir. Adacık transplantasyonu için ideal anatomik alan aşağıdaki özelliklere sahip olmalıdır: basit transplantasyon, biyopsi ve greft alma işlemleri için erişilebilirlik; azaltılmış komplikasyonlar; kan şekeri kontrolünün yüksek başarı oranı; ve adacık greftlerinin uzun süreli hayatta kalma15,16.
Ekibimiz daha önce omentumda adacık nakli için bir protokol tanımlanmışbir murine modeli17. Omentumda böbrek kapsülü altındaki adacık nakline göre daha sonra normal kan şekeri elde edildi. Sonuç olarak, adacık implante için diğer siteler araştırıldı.
ISWAT karaciğer için alternatif bir site olarak bildirilmiştir, bu karaciğer de transplantasyon ile karşılaştırıldığında alıcıların hiperglisemi tersine çevirmek için daha az adacıkihtiyacı olarak14. Ayrıca, adacıkların nakli kolaydır, çünkü greftleri görselleştirmek ve almak14. Çalışmamızda, alıcı fareler adacık naklinden sonra bir ay içinde hiperglisemiyi azaltarak, ISWAT'ın yeterli insülin üretmek için böbrek kapsülünden daha uzun süreye ihtiyaç duyduğunu düşündürmektedir. Bu nedenle bu sonuçlar, ISWAT bölgesinin oksijen difüzyonu, besin maddeleri ve greftin revaskülarizasyonu için daha iyi koşullar sunamayabileceğini göstermektedir.
Yüksek saflık ve izole adacıkların aktivitesi allo-adacık transplantasyon ayarında diyabetik alıcıların hiperglisemi ters hayati önem taşımaktadır, ve adacık izolasyon protokolleri farklı araştırmacılar arasında aynı değildir18,19,20. Sindirim süresi çok yüksek kaliteli adacıklar elde etmek için çok önemlidir. Deneyimlerimize göre, 5 dakikayı geçmemelidir. İzole adacıklar, sindirim prosedürünün mekanik stresinden kurtulmayı sağlamak için bir gecede 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde kültürlenebilir21.
Burada kullanılan hidrojel laminin içeren bir bazal membran matris, kollajen IV, ve büyüme faktörleri17. Vücut ısısına ulaştığında katılaştırır ve iswat bölgesinde adacık greftlerinin korunmasına yardımcı olur. Adacıklar için toksik olmamakla birlikte, hidrojelin varlığının adacık engraftment ve fonksiyon unu etkileyip etkilemediği belirlenecektir.
Toplu olarak ele alındığında, ISWAT kemirgen modellerinde adacık nakli için yeni bir deri altı alan ve potansiyel klinik kullanım için. Tam değerlendirme için, daha büyük memeli preklinik modelleri kullanarak ek çalışmalar gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması bildirmez.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Temel Ar-Ge Programı (2017YFC1103704)Guangdong Eyaleti Yüksek Düzeyli Hastanelerin İnşaatı Için Özel Fonlar (2019), Shenzhen'deki Sanming Tıp Projesi (SZSM201412020), Yüksek Seviye Fonu'ndan gelen hibelerle desteklenmiştir. Shenzhen Tıbbi Disiplin İnşaatı (2016031638), Shenzhen Bilim ve Teknoloji Vakfı (JCJY20160229204849975, GJHZ201703141713575556), Shenzhen Sağlık ve Aile Planlama Komisyonu Vakfı (SZXJ2017021SZXJ2018059), Tıbbi Tıp Çin Guangdong Eyaleti Bilimsel Araştırma Vakfı (A2019218), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2018M633218).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Syringe-driven Filter Unit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL Pasteur pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
| 5 mL syringe | Szboon, China | 20170829 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 5-0 surgical suture | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| 60 mL syringe | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
| anti-mouse Glucagon antibody | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
| anti-mouse insulin antibody | Cell Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
| blunt-pointed perfusion needle | Oloey, China | 005 | 32G, yellow |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | 8~10 weeks | |
| cell culture dish | BIOFIL, China | TCD000100 | General,Non-treated,87.8 mm diameter |
| centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
| cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| collagenase Type V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-hank's buffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| fluorescent microscope | Leica | DMIL | |
| gel-loading pipet tips | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| light-tight culture dish | DVS, China | AN-5058548 | self-made, glass dish sprayed with black paint |
| Medical Adhesive Tape | Cofoe, China | K12001 | |
| non-invasive microtweezers | RWD Life Science | F11033-11 and F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| ophthalmic scissors | RWD Life Science | S12012-12 and S11001-08 | |
| P/S (penicillin / streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Test Strip | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
| vascular clamp | RWD Life Science | R31006-04 |
References
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), 007823 (2012).
- Pathak, V., Pathak, N. M., O'Neill, C. L., Guduric-Fuchs, J., Medina, R. J. Therapies for Type 1 Diabetes: Current Scenario and Future Perspectives. Clinical Medicine Insights: Endocrinology and Diabetes. 12, 1179551419844521 (2019).
- Bottino, R., Knoll, M. F., Knoll, C. A., Bertera, S., Trucco, M. M. The Future of Islet Transplantation Is Now. Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202 (2018).
- Stokes, R. A., et al. Transplantation sites for human and murine islets. Diabetologia. 60 (10), 1961-1971 (2017).
- van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. The choice of anatomical site for islet transplantation. Cell Transplantation. 17 (9), 1005-1014 (2008).
- Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation. Journal of Diabetes Science and Technology. , (2019).
- Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. Clinical islet transplantation: is the future finally now. Current Opinion in Organ Transplantation. 23 (4), 428-439 (2018).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).
- Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article. International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).
- Luan, N. M., Iwata, H. Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment. American Journal of Transplantation. 14 (7), 1533-1542 (2014).
- Yasunami, Y., et al. A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver. Transplantation. 102 (6), 945-952 (2018).
- Rajab, A. Islet transplantation: alternative sites. Current Diabetes Reports. 10 (5), 332-337 (2010).
- Ekser, B., Vagefi, P. A. Search for the best site in islet xenotransplantation. International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).
- Lu, Y., et al. A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse. Journal of Visualized Experiments. (143), e57160 (2019).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), e2096 (2011).
- Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
