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मिमूत्र आइलेट्स के इंगुइनल सबक्यूटिनियस व्हाइट एडीपोज टिश्यू (आईएसवाट) प्रत्यारोपण मॉडल

Published: February 16, 2020 doi: 10.3791/60679
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2, 3, 4, 1, 1, 5, 1, 1
1Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Institute of Translational Medicine, Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Health Science Center, 2Institute for Cellular Therapeutics, Allegheny-Singer Research Institute, 3School of Pharmaceutical Sciences, Wenzhou Medical University, 4Xenotransplantation Program/Department of Surgery, University of Alabama at Birmingham, 5Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, Nanjing Medical University
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल में, मूत्र आइलेट अलगाव और प्रत्यारोपण की एक विधि इंगिनल चमड़े के नीचे वसा ऊतक में वर्णित है। अलग सिंजेनिक मूत्र आइलेट्स एक तहखाने झिल्ली हाइड्रोजेल का उपयोग कर एक मूत्र प्राप्तकर्ता में प्रत्यारोपित कर रहे हैं । प्राप्तकर्ताओं के रक्त ग्लूकोज स्तर की निगरानी की जाती है, और आइलेट ग्राफ्ट का हिस्टोलॉजी विश्लेषण किया जाता है।

Abstract

अग्नाशय आइलेट प्रत्यारोपण प्रकार 1 मधुमेह के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित चिकित्सकीय उपचार है। किडनी कैप्सूल कृंतक मॉडल में आइलेट प्रत्यारोपण के लिए सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली साइट है। हालांकि, तंग गुर्दे कैप्सूल बड़े जानवरों और मनुष्यों में पर्याप्त आइलेट्स के प्रत्यारोपण को सीमित करता है। इंगिनल चमड़े के नीचे वसा ऊतक (ISWAT), एक नया चमड़े के नीचे अंतरिक्ष, आइलेट प्रत्यारोपण के लिए एक संभावित मूल्यवान साइट पाया गया था । इस साइट में अन्य चमड़े के नीचे रिक्त स्थान की तुलना में बेहतर रक्त आपूर्ति है। इसके अलावा, ISWAT गुर्दे कैप्सूल की तुलना में एक बड़ा आइलेट द्रव्यमान को समायोजित करता है, और इसमें प्रत्यारोपण सरल है। यह पांडुलिपि सिंजेनिक मधुमेह माउस प्राप्तकर्ताओं के ISवाट साइट में माउस आइलेट अलगाव और प्रत्यारोपण की प्रक्रिया का वर्णन करती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, murine अग्नाशय आइलेट्स मानक कोलेजेनेज पाचन द्वारा अलग थे और इस्वाट साइट में शुद्ध आइलेट्स को ठीक करने के लिए एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स हाइड्रोगेल का उपयोग किया गया था। प्राप्तकर्ता चूहों के रक्त शर्करा के स्तर पर १०० से अधिक दिनों तक नजर रखी गई । आइलेट ग्राफ्ट हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए प्रत्यारोपण के बाद १०० दिन में प्राप्त किए गए थे । इस पांडुलिपि में वर्णित आइवाट साइट में आइलेट प्रत्यारोपण के लिए प्रोटोकॉल सरल और प्रभावी है।

Introduction

इंटरनेशनल डायबिटीज फेडरेशन (आईडीएफ)1के सांख्यिकीय आंकड़ों के अनुसार, दुनिया भर में घटना और प्रकार की व्यापकता 1 मधुमेह मेलिटस (T1DM) जल्दी से बढ़ रहे हैं । आइलेट प्रत्यारोपण T1DM4के इलाज के लिए सबसे आशाजनक दृष्टिकोणों में से एक है । एडमोंटन प्रोटोकॉल2 का उपयोग करनैदानिक आइलेट प्रत्यारोपण में की गई महान सफलता की सूचना दी गई थी, 5 साल बाद T1DM प्राप्तकर्ताओं में कार्य करने वाले आइलेट भ्रष्टाचार अस्तित्व अब लगभग 50%3तक पहुंच गया है।

अतीत में, कई प्रत्यारोपण साइटों, जैसे जिगर, गुर्दे कैप्सूल, तिल्ली, इंट्रामस्कुलर क्षेत्र, चमड़े के नीचे अंतरिक्ष, अस्थि मज्जा, और ओमेंटल थैली प्रायोगिक आइलेट प्रत्यारोपण5,6,7के लिए पता लगाया गया । उपरोक्त साइटों में से कुछ का परीक्षण नैदानिक सेटिंग्स8में किया गया है । हालांकि जिगर में आइलेट प्रत्यारोपणवर्तमान9 में नैदानिक आवेदन में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि बनी हुई है, इस साइट का उपयोग करते समय संबोधित करने के लिए कई महत्वपूर्ण समस्याएं हैं। उदाहरण के लिए, तत्काल रक्त मध्यस्थता भड़काऊ प्रतिक्रिया (IBMIR) और खराब ऑक्सीजनकी आपूर्ति10,11 और यदि आवश्यक हो तो आइलेट ग्राफ्ट को पुनः प्राप्त करने के लिए प्रत्यारोपित आइलेट के शुरुआती नुकसान को कैसे कम किया जाए, क्योंकि वे जिगर में फैलाना। गुर्दे कैप्सूल कृंतक प्राप्तकर्ताओं के लिए एक आदर्श साइट हो सकती है। हालांकि, तंग गुर्दे कैप्सूल मनुष्यों में पर्याप्त एलोजेनिक आइलेट्स के प्रत्यारोपण को सीमित करता है, हालांकि यह चिकित्सकीय रूप सेउपयोगकी जाने वाली अत्यधिक शुद्ध पोर्सिन आइलेट तैयारी के कारण आइलेट ज़ेनोट्रांसप्लांटेशन के लिए बेहतर फिट हो सकताहै। इसलिए, आइलेट प्रत्यारोपण के लिए अधिक उपयुक्त साइट की खोज चल रही है।

चमड़े के नीचे अंतरिक्ष अपनी पहुंच के कारण आइलेट प्रत्यारोपण के लिए एक चिकित्सकीय लागू साइट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, सबसे नीचे अंतरिक्ष में आइलेट प्रत्यारोपण की दक्षता बेहद कम है, इस प्रकार हाइपरग्लाइसेमिया13को रिवर्स करने के लिए अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में आइलेट्स की आवश्यकता होती है। हाल ही में, एक जापानी अनुसंधान टीम ISWAT, एक उपन्यास चमड़े के नीचे एक मूत्र मॉडल में आइलेट प्रत्यारोपण के लिए बेहतर साइट पाया जब जिगर14की तुलना में । आईएसवाट में एपिगास्ट्रिक धमनी और नस शामिल है, इसलिए समृद्ध रक्त आपूर्ति आइलेट भ्रष्टाचार संशोधन सुनिश्चित कर सकती है। इस पांडुलिपि में, हम इस्वाट में सिंजेनिक मैरिन आइलेट्स को ठीक करने के लिए बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स हाइड्रोगेल का उपयोग करके एक आसान प्रत्यारोपण विधि का प्रस्ताव करते हैं। यह प्रोटोकॉल आइलेट प्रत्यारोपण के लिए प्रभावी साबित होता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में सभी प्रक्रियाओं शेर्ज़ेन दूसरे पीपुल्स अस्पताल की नैतिकता समीक्षा समिति के पशु कल्याण के सिद्धांतों का पालन किया । आइलेट भ्रष्टाचार प्राप्तकर्ताओं और दानदाताओं 8-10 सप्ताह पुराने C57BL/6 पुरुष चूहों गुआंगदोंग प्रांत के चिकित्सा पशु केंद्र से खरीदा गया । कटाई, अलगाव, संस्कृति, या काटा कोशिकाओं के प्रशासन की प्रक्रिया असेप्टिक परिस्थितियों में किया गया ।

1. आइलेट तैयारी

  1. कोलेजेनेज टाइप वी वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें। कोलेजेनेज टाइप वी का वजन करें और डी-हैंक के बफर के साथ 1 मिलीग्राम/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए भंग करें, 0.22 माइक्रोन सिरिंज-चालित फ़िल्टर यूनिट और 60 मिलीग्राम सिरिंज और बर्फ में प्रीकूल का उपयोग करके फ़िल्टर करें। प्रत्येक दाता प्राप्तकर्ता के लिए 5 mL की मात्रा की आवश्यकता होती है।
  2. सर्वाइकल अव्यवस्था से 10 सप्ताह पुराने C57BL/6 पुरुष माउस (23 ± 2 ग्राम) को इच्छामृत्यु दें और माउस के बाहरी हिस्से को कुछ सेकंड के लिए 75% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। इस बीच, कोलेजेनेज समाधान के साथ 5 मिलीग्राम सिरिंज भरें और सिरिंज सुई को झुकाने वाली कुंद-नुकीली परफ्यूजन सुई (32 जी) के साथ बदलें।
  3. विच्छेदन गुंजाइश के तहत एक बर्फ की थैली पर सुसाइन की स्थिति में दाता माउस रखो, जघन क्षेत्र की त्वचा में सीधे नुकीले नेत्र कैंची का उपयोग कर एक ट्रांसवर्स खोलने में कटौती, और पूरी तरह से सिर की ओर त्वचा चीरा । फिर पूरी तरह से जघन क्षेत्र से xiphoid प्रक्रिया के लिए एक वी चीरा के माध्यम से पेट खोलें ।
  4. पित्ताशय और जिगर को फिर से स्थापित करके आम पित्त वाहिनी की पूरी लंबाई को बेनकाब करते हैं। फिर एक संवहनी क्लैंप के साथ आम पित्त वाहिनी के डुओडेनल खोलने को क्लैंप करें और पित्ताशय की थैली में एक छोटे से उद्घाटन को काट लें।
    नोट: लिवर और पित्ताशय की थैली में बैकफ्लो को रोकने के लिए इष्टतम सुई प्लेसमेंट महत्वपूर्ण है।
  5. चरण 1.2 में परफ्यूजन सुई का उपयोग करके गॉल ब्लैडर खोलने से आम पित्त वाहिनी को कैनन्यूलेट करें, फिर अग्न्याशय में कोलेजेनेज़ समाधान के ~ 2 मिलील इंजेक्ट करें। उसके बाद, आंतों, पेट और तिल्ली से छिद्रित अग्न्याशय को अलग करें, दो जोड़े नॉनइनवेसिव माइक्रोट्वीज़र्स का उपयोग करके, और इसे बर्फ पर 50 मिलीएल शंकुई ट्यूब में डाल दें।
    नोट: सभी दाता चूहों के लिए प्रक्रिया दोहराएं। लगातार तीन छिद्रित पैनक्रीज (40 से अधिक 0 0 0 0 से अलग नहीं) को प्रत्येक अग्न्याशय के लिए कोलेजेनेज़ समाधान के 3 मिलील से भरे 50 मिलीएल शंकुधारी ट्यूब में जोड़ा जा सकता है।
  6. 50 मिलीग्राम शंकुई ट्यूबों में प्रति अग्न्याशय में 100 माइक्रोन डीनएसे आई (10 मिलीग्राम/mL) जोड़ें, और 3-5 मिन के लिए शंकुट्यूब मिलाकर 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में पैनक्रीज को पचा लें।
    नोट: पानी के स्नान में पाचन से पहले ऊतक को असंबद्ध करने के लिए 10 एस अंतराल में ट्यूबों को तेजी से 40x हिलाएं, और फिर पाचन के दौरान ट्यूबों को मामूली रूप से हिलाएं।
  7. पाचन को अवरुद्ध करने के लिए 50 मिलीग्राम की अंतिम मात्रा तक स्टॉप सॉल्यूशन (2.5 मिलीग्राम/एमएल बीएसए-एचबीएसएस समाधान) जोड़ें, और नाड़ी ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 750 x ग्राम की गति से अपाइन करें और जल्दी बंद हो जाएं।
  8. सुपरनेटेंट को बंद करें और बीएसए-एचबीएसएसएस के 15-25 मीटर में धीरे-धीरे फिर से निलंबित करके छर्रों 2x को धोएं। पल्स 1 मिन के लिए चरण 1.7 में उल्लिखित समान गति की स्थिति के साथ ट्यूब को अपकेंद्रित करें।
  9. सुपरनेटेंट डालो और एक 50 mL शंकु ट्यूब में तीन शंकु ट्यूब के छर्रों पूल। हिस्टॉफ-1119 के कुल 10 मीटर की मात्रा में छर्रों को फिर से निलंबित करें। सजातीय रूप से मिलाएं, और क्रमिक रूप से ट्यूब के किनारे धीरे-धीरे पाइपिंग करके हिस्टॉफ-1077 और एचबीएसएस के 5 मिलील के 5 मिलील जोड़ें।
  10. बिना ब्रेक के 10 मीटर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 750 x ग्राम पर अपकेंद्री में नमूनों को स्पिन करें।
  11. एचबीएसएसएस/हिस्टोपेक-1077 इंटरफेस से आइलेट्स को डिस्पोजेबल 5 एमएल पाश्चर पिपेट का उपयोग करके 50 मिलीग्राम शंकुट्यूब में, बीएसए-एचबीएसको 50 मिलीग्राम की अंतिम मात्रा में जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 750 x ग्राम पर पल्स अपकेंद्री।
  12. सुपरनेट ेंट बंद करें और बीएसए-एचबीएसएसएस के 30 एमसीएल का उपयोग करके आइलेट्स धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 750 x ग्राम पर 1 मिन के लिए सेंट्रलाइज।
  13. संस्कृति माध्यम के 30 मिलीएल (10% FBS-1% पी/एस-CMRL-1066) प्रति ट्यूब का उपयोग कर आइलेट्स को फिर से निलंबित करें और 10 सेमी व्यास प्रकाश-तंग संस्कृति पकवान में डालें। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, 200 माइक्रोन जेल-लोडिंग पाइप्ट युक्तियों का उपयोग करके, उनके आकृति विज्ञान (यानी, स्पेरोइडल, सफेद) के आधार पर समाधान से आइलेट्स को हैंडपिक करें। संस्कृति माध्यम के 10 mL के साथ एक अनुपचारित सेल संस्कृति पकवान में रखो ।
    नोट: एक दूसरी हैंडपिकिंग की जा सकती है यदि पहली पिकिंग के बाद पहले-शुद्ध आइलेट्स की शुद्धता इष्टतम नहीं है।
  14. एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे डाइथिज़ोन धुंधला द्वारा चुने गए आइलेट्स की शुद्धता की जांच करें और फ्लोरोसेइन डायसेटेट (एफडीए) द्वारा आइलेट्स की व्यवहार्यता का पता लगाएं - प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के नीचे धुंधला।
  15. संस्कृति माध्यम में अलग आइलेट्स (चरण 1.13 के रूप में) 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में, 95% हवा- 5% सीओ2 प्रत्यारोपण से पहले।

2. इस्वाट आइलेट प्रत्यारोपण

  1. 8 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL/6 चूहों (22 ± 2 ग्राम) में स्ट्रेप्टोजोटोसिन (STZ) के एक इंजेक्शन से मधुमेह प्रेरित । दिन -4 पर, ~ 4-6 घंटे के लिए चूहों को तेज करें, फिर 0.1 एम साइटरेट बफर (पीएच 4.4) का उपयोग करके 2% STZ समाधान तैयार करें। वजन, बफर में फिर से निलंबित, और चूहों इंट्रापेरिटोनी १८० मिलीग्राम/किलो की खुराक पर इंजेक्ट ।
    नोट: STZ समाधान के लिए हौसले से उपयोग से पहले तैयार है और अपनी प्रकाश संवेदनशीलता के कारण एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर की जरूरत है । इसका उपयोग तुरंत किया जाना चाहिए, क्योंकि यह 15-20 मिनट के भीतर गतिविधि खो देगा।
  2. STZ इंजेक्शन चूहों की कौडल नसों पंचर दिन के लगभग 10 बजे कुछ रक्त इकट्ठा करने के लिए-1 और 0 दिन 0 और एक परीक्षण पट्टी और एक बुनियादी रक्त ग्लूकोज निगरानी उपकरण का उपयोग कर गैर उपवास रक्त ग्लूकोज स्तर को मापने । चूहों आइलेट प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा अगर लगातार 2 परीक्षण दिनों के रक्त शर्करा का स्तर दोनों कम से 20 mmol/L हैं ।
  3. 0 दिन पर, वजन और सभी प्राप्तकर्ता चूहों को चिह्नित करें। 60 मिलीग्राम/किलो पेंटोबार्बिटल सोडियम इंट्रापेरिटोनी इंजेक्शन लगाकर प्रत्येक प्राप्तकर्ता को एनेस्थेटिज़ करें।
    नोट: संज्ञाहरण की गहराई की जांच करने के लिए एक अंगूठी चुटकी प्रशासन। यदि प्राप्तकर्ता माउस में कोई वापसी पलटा नहीं है, तो संज्ञाहरण का स्तर सर्जरी के लिए पर्याप्त है। यदि नहीं, तो अतिरिक्त 10 मिलीग्राम/किलो पेंटोबार्बिटल सोडियम का प्रशासन करें। इस्तेमाल किए जाने वाले पेंटोबार्बिटल सोडियम को 2% (मीटर वी) की एकाग्रता पर बाँझ फिजियोलॉजिक खारा में पतला किया गया था ।
  4. हाइड्रोजेल को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से बाहर निकालें और विगलन की अनुमति देने के लिए इसे बर्फ पर रखें। हाइड्रोजेल 4-10 डिग्री सेल्सियस पर तरल है और उच्च तापमान पर जमना होगा।
  5. प्रत्येक प्राप्तकर्ता के लिए ~ 450-500 आइलेट समकक्ष (आईईक्यू) को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत एक बाँझ 1.5 मिलील सेंट्रलाइज ट्यूब में चुनें (चरण 1.13 में) संस्कृति माध्यम के 200 माइक्रोन के साथ और प्रत्यारोपण के लिए तैयार होने तक बर्फ पर रहें।
  6. 75% इथेनॉल का उपयोग करप्राप्तकर्ता के बाएं इंगनल क्षेत्र को झाड़ू। इसे सुपाणि की स्थिति में रखें और सर्जिकल टेप का उपयोग करके चार अंगों को ठीक करें। बिजली के क़ैंची के साथ शल्य चिकित्सा स्थल के आसपास के बालों को शेव करें और Iodophor के साथ क्षेत्र झाड़ू।
  7. नेत्र कैंची और noninvasive microtweezers का उपयोग कर इस क्षेत्र में एक ऊर्ध्वाधर त्वचा चीरा बनाओ, ISWAT में अवर epigastric धमनी और नस की पहचान, और जहाजों के ऊपर एक छोटी सी जेब बनाते हैं ।
  8. आइलेट्स ट्यूब को 200 x ग्राम पर 30 एस के लिए स्पिन करें और जितना हो सके सुपरनेटेंट को हटा दें। पूरी तरह से गल हाइड्रोजेल के Aspirate 20 μL और यह आइलेट्स के साथ ट्यूब में लोड । बुलबुले से बचते हुए आइलेट्स को धीरे से फिर से निलंबित करें।
  9. 200 माइक्रोन पिपेट टिप के साथ प्राप्तकर्ता की जेब (चरण 2.7) में ट्यूब में पूरे आइलेट-हाइड्रोजेल मिश्रण वितरित करें।
    नोट: इस प्रक्रिया में दो तकनीशियनों की आवश्यकता होती है, एक गैर-वेहम्वेन माइक्रोट्वीज़र्स का उपयोग करके जेब के किनारों को चुनने के लिए, और दूसरा आइलेट मिश्रण को जेब में वितरित करने के लिए।
  10. आइलेट्स-हाइड्रोगेल मिश्रण पूरी तरह से जम जाने के बाद प्रत्यारोपण स्थल में सिफेलोस्पोरिन (~ 5-10 मिलीग्राम) के 20 माइक्रोन जोड़ें, फिर मांसपेशियों और त्वचा को निरंतर सीवन विधि के साथ बंद करने के लिए 5-0 सर्जिकल सीवन का उपयोग करें।
    नोट: हाइड्रोजेल को शरीर के तापमान के कारण जमना करने के लिए लगभग 3 न्यूनतम की आवश्यकता होती है।
  11. प्राप्तकर्ता को एक साफ पिंजरे में रखें और थर्मल पैड का उपयोग करके गर्म रखें। जब तक प्राप्तकर्ता पूरी तरह से ठीक नहीं हो जाता और स्वायत्त रूप से स्थानांतरित होने तक निगरानी रखें। फिर 0.1 मिलीग्राम/किलो ग्राम खुराक के अनुसार बाँझ शारीरिक नमकीन इंट्रापेरिटोनी के साथ 0.03 मिलीग्राम/एमएल बुप्रेनोरफिन का प्रशासन करें।
  12. प्रत्येक प्राप्तकर्ता माउस के लिए चरण 2.3-2.11 दोहराएं।
  13. प्राप्तकर्ता चूहों के गैर-उपवास रक्त शर्करा के स्तर को मापें (चरण 2.2 के रूप में) 3-4x पहले महीने के लिए एक सप्ताह, और उसके बाद एक सप्ताह 1x।
  14. अनुवर्ती (प्रत्यारोपण के बाद १०० दिन) के अंत में, संज्ञाहरण के तहत (कदम २.३ में के रूप में किया) उत्पाद शुल्क ISWAT शेष कदम २.६ में वर्णित कदम के बाद प्राप्तकर्ताओं से भ्रष्टाचार असर । हेमैटोक्सिलिन और इओसिन (एच एंड ई) के लिए हिस्टोलॉजिकल प्रोटोकॉल के अनुसार फॉर्मेलिन और पैराफॉर्मलडिहाइड में ऊतक को ठीक करें और इंसुलिन और ग्लूकागन की प्रतिरक्षण।
  15. सेफेलोस्पोरिन जोड़ें और चरण 2.10 के रूप में प्राप्तकर्ताओं के चीरा बंद करें, फिर चरण 2.11 में वसूली के लिए तैयार करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में दो प्रक्रियाएं शुरू की जाती हैं: इस्वाट साइट में मूत्र आइलेट तैयारी और आइलेट प्रत्यारोपण। पहली प्रक्रिया में, टाइप वी कोलेजेनेज़ समाधान के साथ पर्फ्यूज करने और पचाने के बाद, हिस्टोपाक-1119 और हिस्टोपाक-1077 और एक अतिरिक्त हाथ उठा कदम के साथ शुद्ध, अलग-अलग मूत्र आइलेट्स प्रत्यारोपण के लिए पर्याप्त रूप से शुद्ध होंगे (जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है) और अलग-थलग आइलेट्स जिनमें उच्च व्यवहार्यता है, प्रत्यारोपण के लिए उपयोग किया जाएगा (जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है)। दूसरी प्रक्रिया में, STZ रसायन के साथ मधुमेह प्रेरण महत्वपूर्ण है। STZ की इष्टतम खुराक माउस तनाव और उम्र पर निर्भर करती है, और मधुमेह के सफल प्रेरण को लगातार दो दिनों में एक ही समय में 16.7 mmol/L से अधिक के गैर-तेज रक्त ग्लूकोज स्तर द्वारा परिभाषित किया गया है। मधुमेह चूहों कुछ हफ्तों के लिए आइलेट प्रत्यारोपण के बिना जीवित रह सकते हैं। आइलेट ग्राफ्ट पूरी तरह से इस्वाट साइट में प्रत्यारोपित होने से पहले हाइड्रोगेल के साथ मिलाया जाना चाहिए, और कुछ मिनट के लिए ग्राफ्ट के लिए पारित करने के लिए IWSAT(चित्रा 3)में तय होने की जरूरत है । जब ISWAT में प्रत्यारोपित, आइलेट ग्राफ्ट के बारे में एक महीने के लिए हाइपरग्लाइसेमिया उलट, और प्राप्तकर्ता चूहों के शरीर के वजन धीरे से वृद्धि हुई(चित्रा 4)। प्रत्यारोपण के बाद १०० दिनों में, आइलेट ग्राफ्ट हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण(चित्रा 5)के लिए प्राप्त किए गए थे । जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है, परीक्षण के दिनों में ~ 10 बजे गैर-उपवास रक्त तेजी से ग्राफ्ट हटाने के बाद गुलाब। एच एंड ई धुंधला प्रदर्शन किया है कि आइलेट कलम बरकरार रहे। इंसुलिन और ग्लूकागन इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रत्यारोपित आइलेट्स अच्छी तरह से कार्य(चित्र5)दिखाया ।

Figure 1
चित्र1: अग्न्याशय परफ्यूजन और पाचन और आइलेट शुद्धि। (A)अग्न्याशय परफ्यूजन की प्रक्रिया(A1-A6)। (ख)अग्न्याशय पाचन का अंतिम बिंदु, कणों के साथ निलंबित कर दिया । (ग)हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे देखा शुद्ध आइलेट्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: शुद्ध आइलेट्स की शुद्धता और व्यवहार्यता। (क)आइलेट शुद्धता dithizone धुंधला द्वारा निर्धारित । आइलेट व्यवहार्यता एफडीए-पीआई डबल धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया गया। (ख)आइलेट्स की हल्की माइक्रोस्कोपी छवि। (ग)एफडीए धुंधला हरे रंग में व्यवहार्य कोशिकाओं को दर्शाता है । (D)पीआई फ्लोरेसेंस लाल मृत कोशिकाओं को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: आइलेट प्रत्यारोपण। (ए)संज्ञाहरण के बाद, एक शेवर ब्लेड के साथ प्रत्यारोपण स्थल पर बाल दाढ़ी और शल्य चिकित्सा टेप के साथ पेट की ऊपर की स्थिति में प्राप्तकर्ता अंगों को ठीक । (ख)लैप्रोटॉमी के बाद इसवाट प्रत्यारोपण स्थल का पर्दाफाश हो ता है। (ग)हाइड्रोजेल में मिश्रित आइलेट्स को धीरे-धीरे आईएसवाट साइट में प्रत्यारोपित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: रक्त शर्करा का स्तर और शरीर के वजन के बाद प्रत्यारोपण। सिंजेनिक आइलेट्स (एन = 7) के साथ प्रत्यारोपित प्राप्तकर्ता चूहों के गैर-उपवास रक्त ग्लूकोज स्तर (लाल रेखा) और शरीर के वजन (नीली रेखा) । काला तीर बताता है कि प्रत्यारोपण के 100 दिन बाद ग्राफ्ट हटा दिए गए। विभिन्न प्राप्तकर्ताओं की तुलना में रक्त शर्करा के स्तर में कुछ भिन्नताएं देखी गईं, जो आइलेट गुणवत्ता और कार्य में अंतर को दर्शाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: हिटोलॉजी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस। भ्रष्टाचार वर्गों एच एंड ई, DAPI (नाभिक), विरोधी माउस इंसुलिन एंटीबॉडी, और विरोधी माउस ग्लूकागन एंटीबॉडी के साथ दाग थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

अग्न्याशय आइलेट प्रत्यारोपण T1DM के इलाज के लिए एक आशाजनक चिकित्सा है । इस चिकित्सा का प्रभाव कई कारकों से प्रभावित होता है और आइलेट प्रत्यारोपण के लिए एक इष्टतम साइट चुनना अत्यंत महत्वपूर्ण है। आइलेट प्रत्यारोपण के लिए आदर्श शारीरिक साइट में निम्नलिखित विशेषताएं होनी चाहिए: सरल प्रत्यारोपण, बायोप्सी और भ्रष्टाचार पुनर्प्राप्ति प्रक्रियाओं के लिए पहुंच; कम जटिलताओं; रक्त ग्लूकोज नियंत्रण की उच्च सफलता दर; और आइलेट ग्राफ्ट15,16के दीर्घकालिक अस्तित्व .

हमारी टीम ने पहले एक मूत्र मॉडल17में ओमेंटम में आइलेट प्रत्यारोपण के लिए एक प्रोटोकॉल वर्णित किया । ओमेंटम में किडनी कैप्सूल के नीचे आइलेट प्रत्यारोपण की तुलना में बाद में सामान्य रक्त ग्लूकोज हासिल किया गया। नतीजतन, आइलेट्स प्रत्यारोपित करने के लिए अन्य साइटों का पता लगाया गया।

ISWAT जिगर के लिए एक वैकल्पिक स्थल के रूप में सूचित किया गया था, क्योंकि यह कम islets की जरूरत है जिगर14में प्रत्यारोपण की तुलना में प्राप्तकर्ताओं के हाइपरग्लाइसेमिया रिवर्स । इसके अलावा, आइलेट्स का प्रत्यारोपण आसान है, जैसा कि14कलम की कल्पना और पुनः प्राप्त करना है। हमारे अध्ययन में, प्राप्तकर्ता चूहों आइलेट प्रत्यारोपण के बाद एक महीने के भीतर हाइपरग्लाइसेमिया कम हो गया है, सुझाव है कि ISWAT गुर्दे कैप्सूल से अधिक समय की आवश्यकता के लिए पर्याप्त इंसुलिन का उत्पादन । इसलिए इन परिणामों से संकेत मिलता है कि ISWAT साइट ऑक्सीजन, पोषक तत्वों के प्रसार के लिए और भ्रष्टाचार के पुनर्संहार के लिए बेहतर शर्तों की पेशकश नहीं कर सकते हैं ।

एलो-आइलेट प्रत्यारोपण सेटिंग में मधुमेह प्राप्तकर्ताओं के हाइपरग्लाइसेमिया को रिवर्स करने के लिए उच्च शुद्धता और गतिविधि महत्वपूर्ण महत्व पूर्ण है, और आइलेट आइसोलेशन प्रोटोकॉल विभिन्न शोधकर्ताओं18,19,20के बीच समान नहीं हैं। उच्च गुणवत्ता वाले आइलेट्स प्राप्त करने के लिए पाचन समय बहुत महत्वपूर्ण है। हमारे अनुभव में, यह 5 मिन से अधिक नहीं होना चाहिए। पाचन प्रक्रिया21के यांत्रिक तनाव से वसूली की अनुमति देने के लिए अलग-थलग आइलेट्स को रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत किया जा सकता है।

यहां उपयोग किया जाने वाला हाइड्रोगेल एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स है जिसमें लेमिनिन, कोलेजन चतुर्थ और विकास कारक17होते हैं। यह तब जम जाता है जब यह शरीर के तापमान तक पहुंचता है और आइवाट साइट में आइलेट ग्राफ्ट रखने में मदद करता है। हालांकि यह आइलेट्स के लिए विषाक्त नहीं है, क्या हाइड्रोजेल की उपस्थिति आइलेट एनग्राफमेंट को प्रभावित करती है और कार्य निर्धारित किया जाना बाकी है।

सामूहिक रूप से लिया गया, ISWAT कृंतक मॉडल ों में आइलेट प्रत्यारोपण के लिए और संभावित रूप से नैदानिक उपयोग के लिए एक उपन्यास चमड़े के नीचे की जगह है। पूर्ण मूल्यांकन के लिए, बड़े स्तनपायी प्रीक्लिनिकल मॉडल का उपयोग करके अतिरिक्त अध्ययन की आवश्यकता होती है।

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Disclosures

लेखकहितों के टकराव की रिपोर्ट नहीं करते हैं ।

   

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2017YFC1103704) गुआंगदोंग प्रांत (2019) में उच्च स्तरीय अस्पतालों के निर्माण के लिए विशेष धन, शेनझेन में चिकित्सा की संमिंग परियोजना (SZSM201412020), उच्च स्तर के लिए निधि से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था शेर्ज़ेन का चिकित्सा अनुशासन निर्माण (2016031638), शेनझेन फाउंडेशन ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी (JCJY2016029204849975, GJHZ20170314171357556), शेनझेन फाउंडेशन ऑफ हेल्थ एंड फैमिली प्लानिंग कमीशन (एसजेडएक्सजे2017021SZXJ20180955 चीन के गुआंगदोंग प्रांत के वैज्ञानिक अनुसंधान फाउंडेशन (A2019218), चीन पोस्टडॉक्टोरल साइंस फाउंडेशन (2018M633218) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm Syringe-driven Filter Unit Merck Millipore SLHV033RB
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
5 mL Pasteur pipette JingAn Biological, China J00085
5 mL syringe Szboon, China 20170829
50 mL conical tube Corning 430829
5-0 surgical suture sh-Jinhuan, China CR537
60 mL syringe Szboon, China 20170623
75% Ethanol LIRCON, China 9180527
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) Invitrogen A21202 Dilution (1:200)
anti-mouse Glucagon antibody Abcam ab10988 Dilution (1:100)
anti-mouse insulin antibody Cell Signaling Technology 3014s Dilution (1:100)
blunt-pointed perfusion needle Oloey, China 005 32G, yellow
BSA Meilune, China MB4219
C57BL/6 Mice Medical Animal Center of Guangdong Province 8~10 weeks
cell culture dish BIOFIL, China TCD000100 General,Non-treated,87.8 mm diameter
centrifuge Thermo Scientific ST16R
cephalosporin Lukang medical, China 150303
CMRL-1066 Sigma-Aldrich C0422
Codos Pet Clipper Szcodos, China CP-8000
collagenase Type V Sigma C9262
DAPI Thermo Fisher D1306
D-hank's buffer Coolaber, China PM5140-10
dithizone Sigma-Aldrich D5130
Dnase I Sigma-Aldrich D4263
Eosin staining media Beyotime Biotech, China C0109
FBS GE Healthcare Life Sciences SH30084
fluorescein diacetate (FDA) Thermo Fisher F1303
fluorescent microscope Leica DMIL
gel-loading pipet tips Corning CLS4884
HBSS Coolaber, China PM5150-10
hematoxylin staining media Cell Signaling Technology 14166S
HISTOPAQUE-1077 Sigma-Aldrich RNBG0522
HISTOPAQUE-1119 Sigma-Aldrich RNBG0536
Hydrogel BD Biosciences 356234 Basement Membrane Matrix
Iodophor LIRCON, China 5190313
light-tight culture dish DVS, China AN-5058548 self-made, glass dish sprayed with black paint
Medical Adhesive Tape Cofoe, China K12001
non-invasive microtweezers RWD Life Science F11033-11 and F12016-15
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system Johnson & Johnson 33391713
ophthalmic scissors RWD Life Science S12012-12 and S11001-08
P/S (penicillin / streptomycin) Gibco 15140-122
pentobarbital sodium Sigma-Aldrich P-010
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
STZ (streptozotocin) Sigma-Aldrich S0130
Test Strip GenUltimate 100-50
TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) proteintech SA00007-2 Dilution (1:200)
vascular clamp RWD Life Science R31006-04

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References

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Peng, Y., Zou, Z., Chen, J., Zhang, H., Lu, Y., Bittino, R., Fu, H., Cooper, D. K. C., Lin, S., Cao, M., Dai, Y., Cai, Z., Mou, L. Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets. J. Vis. Exp. (156), e60679, doi:10.3791/60679 (2020).

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