Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

العزلة المصاحبة للخلايا الفلكية الأولية وMicroglia لعدوى طفيلي بروتوزوا

Published: March 18, 2020 doi: 10.3791/60680
* These authors contributed equally

Summary

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توجيه كيفية استخراج وصيانة وفصل الخلايا المادرينية وخلايا الميكروجليا من الجهاز العصبي المركزي ، تليها العدوى بالطفيليات الأولية.

Abstract

الخلايا الفلكية وmicroglia هي الخلايا الدبقية الأكثر وفرة. وهي مسؤولة عن الدعم الفسيولوجي وصيانة التوازن في الجهاز العصبي المركزي (CNS). وتبرر الأدلة المتزايدة على مشاركتها في مكافحة الأمراض المعدية الاهتمام الناشئ بتحسين منهجيات عزل الخلايا الفلكية الأولية والميكروغليا من أجل تقييم استجاباتها للإصابات التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي. بالنظر إلى تأثير تريبانوصوما كروزي (T. cruzi) وToxoplasma gondii (T. gondii)العدوى في الجهاز العصبي المركزي ، نقدم هنا طريقة لاستخراج وصيانة وانفصام وإصابة الخلايا الفلكية المادرين وخلايا microglia مع الطفيليات البروتوزوا. يتم الاحتفاظ بالخلايا المستخرجة من القشريات حديثي الولادة في المختبر لمدة 14 يومًا مع استبدال الوسائط التفاضلية الدورية. يتم الحصول على الخلايا الفلكية وmicroglia من نفس بروتوكول الاستخراج عن طريق التفكك الميكانيكي. بعد الفينومينب عن طريق قياس خلايا التدفق ، تصاب الخلايا بطفيليات بروتوزوا. يتم تحديد معدل العدوى عن طريق المجهر الفلوري في نقاط زمنية مختلفة ، مما يتيح تقييم القدرة التفاضلية للخلايا الدبقية على السيطرة على غزو البروتوزوان والنسخ المتماثل. تمثل هذه التقنيات طرقًا بسيطة ورخيصة وفعالة لدراسة استجابات الخلايا الفلكية والميكروجليا للعدوى ، مما يفتح المجال لمزيد من تحليل المناعة العصبية.

Introduction

ويتكون الجهاز العصبي المركزي أساسا من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية1,2,3. Microglia والخلايا الفلكية هي خلايا جليا الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي. Microglia، الضامة المقيم، هو المناعة والخلية غليا البلعوم في CNS,في حين أن الخلايا الفلكية هي المسؤولة عن الحفاظ على التوازن وممارسة وظائف داعمة5.

على الرغم من الخلايا الدبقية التي تعرف تقليديا لتكون مسؤولة عن دعم وحماية الخلايا العصبية6,7, وقد وصفت الوظائف الناشئة من هذه الخلايا في الأدب الأخير, بما في ذلك استجاباتهم للعدوى8,9,,10,11. وبالتالي ، هناك دفع لتطوير أساليب لعزل هذه الخلايا الدبقية لفهم وظائفها بشكل فردي.

هناك بعض النماذج البديلة لدراسة الخلايا الدبقية بدلا من الثقافات الأولية، مثل الأنساب الخلايا الخالدة وفي نماذج الحي. ومع ذلك ، فإن الخلايا الخالدة أكثر عرضة للخضوع للانجراف الوراثي والتغيرات المورفولوجية ، في حين أن الدراسات في الجسم الحي تفرض شروط تلاعب محدودة. على العكس من ذلك، الثقافات الأولية هي سهلة للتعامل معها، أفضل تشبه في خلايا الجسم الحي وتسمح لنا أيضا للسيطرة على العوامل التجريبية12،,13. هنا، ونحن نصف المبادئ التوجيهية حول كيفية استخراج والحفاظ على وفصلها الخلايا الفلكية المورين والخلايا الأولية microglia في نفس البروتوكول. وعلاوة على ذلك، نقدم أيضا أمثلة على كيفية العمل مع عدوى البروتوزوا في هذه الثقافات.

تم استزراع خلايا الجهاز العصبي المركزي المستخرجة من الفئران الوليدية (حتى 3 أيام) لمدة 14 يومًا على الوسائط التفاضلية التي تسمح بالنمو التفضيلي للخلايا الفلكية وخلايا الميكروجليا. وبما أن الميكروجليا ترتاح فوق الخلايا الفلكية المرفقة، فقد انفصلت مجموعات الخلايا ميكانيكيا ً في حاضنة مدارية. بعد ذلك ، جمعنا كل supernatant التي تحتوي على microglia وأضاف التربسين لفصل الخلايا الفلكية. تم تقييم الخلايا الدبقية المعزولة بشكل ظاهري عن طريق قياس خلايا التدفق ومطلية وفقًا للتجربة المطلوبة.

كما قدمنا أمثلة حول كيفية إصابة هذه الميكروجليا المعزولة والخلايا الفلكية بالطفيليات الأولية. T. gondii هو protozoan العصبية للغاية المسؤولة عن toxoplasmosis14, في حين T. كروزالأول هو المسؤول عن مرض شاغاس الذي يمكن أن يؤدي إلى تطوير الاضطرابات العصبية في الجهاز العصبي المركزي15,16. وعلاوة على ذلك, وقد أفيد أيضا أن العدوى مع T. gondii17,18 أو T. cruzi19,20,21 كانت السبب المفترض للوفاة في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة. لذلك ، فإن توضيح الدور المناعي للخلايا الدبقية من الجهاز العصبي المركزي في السيطرة على التهابات البروتوزوا له أهمية كبيرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أجريت جميع الإجراءات التجريبية المتعلقة بالفئران وفقا للقانون الوطني البرازيلي (11.794/2008) ووافقت عليها اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لجامعة ساو باولو الاتحادية.

1. استخراج الخلايا الدبقية والصيانة والتفكك

ملاحظة: يعتمد عدد الفئران المستخدمة لاستخراج الخلايا الدبقية على كمية الخلايا المطلوبة لإجراء التجارب المطلوبة. في هذا البروتوكول، تم الحصول على ما مجموعه 2.7 × 107 الخلايا الفلكية و 4 × 106 ميكروجليا من ستة فئران C57BL/6 حديثي الولادة. تم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل حالة معقمة في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.

  1. اليوم الأول
    1. قم بإعداد محلول الملح المتوازن من هانك النقي (HBSS) وHBSS + 10٪ من مصل الأبقار الجنيني المعطل للحرارة (FBS) (انظر جدول المواد).
    2. إعداد مكملة جلف تعديل جلكو المتوسط (DMEM)/F12 (10٪ FBS + 0.08 mM Penicillin + 0.09 mM Streptomycin + 12.5 mM HEPES + 30 mm الصوديوم بيكربونات، درجة الحموضة 7.2) وتصفيته مع مرشح 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يجب تخزين كافة الوسائط الثقافية عند درجة حرارة 4 درجة مئوية، ولكن من الضروري التسخين المسبق لها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل بدء التجربة.
    3. تعقيم جميع الأدوات الجراحية (مقص، ملعقة وملاقط) في الأوتوكلاف واستخدام الإيثانول 70٪ أثناء العملية.
    4. وضع الأطفال حديثي الولادة (حتى 3 أيام) الفئران في غرفة مختومة تحتوي على القطن غارقة مع إيزوفران لمدة 5 دقيقة للتخدير العميق.
    5. رش الجرو الماوس مع الإيثانول 70٪ وقطع رأس الحيوان مع مقص.
    6. جعل قطع sagittal (الخلفي إلى الأمامي) مع مقص على طول الجمجمة لفتحه وفضح الدماغ. فصل الجمجمة عن الدماغ باستخدام ملاقط. إزالة الدماغ باستخدام ملعقة صغيرة للحفاظ على سلامة الدماغ.
    7. ضع الدماغ في طبق بتري جاف (قطره 6 سم). إزالة لمبة الشم والمخيخ باستخدام ملعقة صغيرة. نقل القشرة إلى طبق آخر بيتري (قطر 6 سم) التي تحتوي على HBSS + 10٪ FBS (2 مل / طبق بيتري).
    8. قطع أنسجة الدماغ إلى قطع صغيرة مع مقص معقم واستخدام p1000 micropipette نقل كل أنسجة الدماغ مع HBSS + 10% FBS إلى أنابيب مخروطية مختلفة 15 مل. تأكد من أن حجم النهائي هو 2 مل / أنبوب. إذا لم يكن كذلك ، كاملة مع HBSS + 10 ٪ FBS.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا. إذا كان الأمر كذلك ، يجب وضع أنابيب مخروطية مع أنسجة CNS على الجليد حتى ساعة واحدة.
    9. غسل أنسجة الدماغ قطع مع 3 مل من HBSS + 10٪ FBS (لكل أنبوب) وبعد التفكيك. إزالة بعناية supernatant. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
      ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى إزالة الحطام واستعادة الأنسجة المستخرجة.
    10. غسل أنسجة الدماغ قطع مع 3 مل من HBSS نقية (لكل أنبوب) وبعد decantation، وإزالة بعناية supernatant. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
      ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى إزالة المصل المتبقي من السهوات السابقة، حيث سيتم trypsinized الخلايا في الخطوة التالية.
    11. إضافة 3 مل من التربسين لكل أنبوب ومكان في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، يهز بلطف أنابيب كل 5 دقيقة. تجنب فقاعات عن طريق عكس أو خلط فجأة الأنابيب.
      ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى هضم الأنسجة التي تم جمعها.
    12. لتعطيل التربسين، اغسل الأنسجة بـ 3 مل لكل أنبوب من HBSS + 10% FBS، وبعد إزالة الأنسجة، قم بإزالة الفوق. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
    13. غسل الأنسجة مع 3 مل لكل أنبوب من HBSS نقية وإزالة بعناية supernatant. كرر هذه الخطوة مرتين.
    14. إضافة 7 مل لكل أنبوب من HBSS نقية وتجانس الأنسجة من خلال ممرات متتالية في الماصة: أولا مع ماصة المصلية 10 مل، تليها 5 مل وأخيرا مع micropipette p1000.
    15. بعد التجانس، أنابيب الطرد المركزي في 450 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    16. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه مع 4 مل من HBSS + 10٪ FBS لكل أنبوب.
    17. نقل الخلايا إلى قارورة T-75 المعالجة مسبقًا للحصول على التصاق مثالي بثقافة الخلية (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: معالجة الأنسجة من كل الحيوان لكل قارورة.
    18. ضع القارورة في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربونلمدة 30 دقيقة للتقيد.
    19. أضف 10 مل من DMEM/F12 المكمللكل قارورة وحضن عند 37 درجة مئوية و5% CO2.
      ملاحظة: وحدة التخزين النهائية هو 14 مل لكل قارورة.
  2. اليوم الثالث
    1. إزالة 7 مل من الثقافة المتوسطة من قارورة T-75 وإضافة 7 مل من DMEM/F12 التكميلية الطازجة.
      ملاحظة: سوف تحتوي القوارير على الكثير من الحطام الخلوي ومظهر غائم.
  3. اليوم الخامس
    1. إزالة جميع المتوسطة من قارورة T-75 وإضافة 14 مل من DMEM/F12 التكميلية الطازجة.
      ملاحظة: يتم استبدال المتوسطة من القوارير لإزالة الحطام والخلايا غير الملتصقة.
    2. بعد كل 48 ساعة، وإزالة 6 مل من supernatant وإضافة 7 مل من جديد تكمل DMEM/F12 المتوسطة حتى اليوم 14 من الثقافة.
  4. اليوم الرابع عشر
    1. بعد إزالة 6 مل من supernatant وإضافة 7 مل من جديد تكملة DMEM/F12 المتوسطة، وإغلاق قوارير T-75 بإحكام.
    2. وضعها في الكلمة شاكر المداري في 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها لفصل ميكانيكيا microglia من الخلايا الفلكية.
  5. اليوم الخامس عشر
    1. تأخذ القوارير من شاكر وغسلها بقوة مع المتوسطة الخاصة بهم من أجل تحسين الخلايا وحصاد أكبر عدد ممكن من microglia. ثم، وجمع supernatant (التي تحتوي على microglia) ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
    2. بعد ذلك، إضافة 4 مل من التربسين في كل قارورة واحتضان لمدة 5 دقيقة في 37 درجة مئوية من أجل فصل الخلايا الفلكية.
    3. إضافة 5 مل لكل قارورة من DMEM/F12 التكميلية لتعطيل التربسين. اغسل القوارير بوسيطها الخاص ونقل محتوياتها إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
    4. الطرد المركزي جميع الأنابيب التي تحتوي على microglia منفصلة والخلايا الفلكية في 450 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    5. تجاهل supernatant. إعادة تعليق بيليه microglia في 1 مل والخلايا الفلكية في 10 مل من DMEM/F12 التكميلية.
    6. انتقل إلى عد الخلايا في غرفة نيوباور أو عداد الخلية التلقائي. لوحة الخلايا مع مكملة DMEM/F12 في الكثافة المطلوبة في لوحة ثقافة الخلية السفلية المسطحة المناسبة (المعالجة المسبقة لمرفق الخلية الأمثل؛ انظر جدول المواد). الخلايا المحتضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة للسماح لهم بإرفاق.
      ملاحظة: حجز 1.5 × 106 من كل مجموعة من خلايا لتأكيد نقاوتها عن طريق قياس الخلايا التدفق.
    7. إجراء تحليل قياس خلايا التدفق للتحقق من نقاء مجموعات الخلايا.
      ملاحظة: نحن نعتبر microglia CD11b+/ CD45+/ GFAP- والخلايا الفلكية CD11b-/ CD45-/GFAP+. ويمكن النظر في iba1 وTMEM119 تلطيخ من أجل توصيف تماما microglia22.
    8. إضافة FMO (فلورسينس ناقص واحد)23 وعينة غير ملطخة لكل مجموعة من الخلايا (الخلايا الفلكية وmicroglia) كضوابط قياس الخلايا التدفق.
    9. لكل مجموعة من الخلايا، حجز 5 × 105 خلايا لكل عينات ملطخة وغير ملطخة. لFMO، حجز اثنين من أنابيب أخرى من microglia تحتوي على 2.5 × 105 خلايا لكل منهما وحجز أيضا أنبوب آخر من 5 × 105 الخلايا الفلكية.
      ملاحظة: بما أن أرقام الميكروجليا يمكن أن تكون عاملاً مقيداً، فمن الممكن استخدام عدد أقل من الخلايا لعناصر التحكم غير الملطخة وFMO.
    10. طرد مركزي جميع الأنابيب الدقيقة في 450 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه مع 500 ميكرولتر / ميكروتيوب من المخزن المؤقت FACS (الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة (PBS) + 0.5٪ ألبوم مصل البقري (BSA) + 2 mM EDTA، درجة الحموضة 7.2).
    11. الطرد المركزي جميع الأنابيب الدقيقة في 450 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه مع 100 ميكرولتر / ميكروtube من مكافحة CD16/CD32 (استنساخ 93) (1:50) المخفف في المخزن المؤقت FACS. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    12. أضف 500 ميكرولتر/ميكروأنبوب من عازل FACS إلى جميع الأنابيب الدقيقة والطرد المركزي عند 450 × غرام عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقيقة. تخلص من الsupernatant. إعادة تعليق الخلايا الفلكية وأنابيب تلطيخ microglia وأيضا أنبوب FMO astrocyte مع 50 ميكرولتر / ميكروأنبوب من علامات السطح مزيج: مكافحة CD45 (PE, استنساخ 30-F11) ومكافحة CD11b (eFluor 450, استنساخ M1/70) (كلاهما المخفف في 1: 100 في المخزن المؤقت FACS).
    13. بالنسبة للخلايا غير الملطخة، قم بإعادة التعليق بنفس حجم المخزن المؤقت FACS. لmicroglia FMO، احتضان كل أنبوب microglia مع مكافحة CD45 أو مكافحة CD11b. احتضان جميع العينات في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام.
    14. إضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لكل ميكروتيو. الطرد المركزي في 450 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه مع 100 ميكرولتر / microtube من تثبيت المخزن المؤقت (انظر جدول المواد)لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    15. أضف 500 ميكرولتر/ميكروتيوب من حاجز التبيرية 1x (انظر جدول المواد)واحتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقيقة في الظلام.
    16. طرد مركزي جميع الأنابيب الدقيقة في 450 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة. إعادة تعليق الخلايا الفلكية وأنابيب تلطيخ microglia وأيضا أنابيب FMO microglia مع 50 ميكرولتر / ميكروأنبوب من الأجسام المضادة داخل الخلايا المضادة لGFAP (APC، استنساخ GA5) في تخفيف 1:100 في 1x العازلة التحمل. بالنسبة للخلايا غير الملطخة وFMO الفلكية، قم بإعادة تعليق الخلايا بنفس حجم المخزن المؤقت FACS. احتضان جميع العينات في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    17. اغسل جميع الأنابيب بإضافة 500 ميكرولتر/ميكروتيوب من حاجز التعامّل 1x. طرد مركزي جميع الأنابيب الدقيقة في 450 × ز، لمدة 5 دقيقة في 4 درجات مئوية. إعادة تعليق كل أنبوب صغير في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. الحصول على 1 × 105 أحداث / عينة على مقياس التدفق الخلوي.
    18. للتحليل، يجب أن تكون الخلايا مسورة أولاً على CD11b x CD45 ثم GFAP الرسم البياني.
      ملاحظة: عناصر التحكم غير الملطخة وFMO مفيدة لتحديد البوابات.

2- العدوى وتقييم معدلات العدوى

  1. عدوى الخلايا الدبقية مع T. جوندي
    1. لوحة 3 × 104 microglia أو الخلايا الفلكية مع مكملة DMEM/F12 في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة في لوحة مسطحة 96-جيدا معالجة (انظر جدول المواد).
    2. تصيب كل مجموعة من خلايا مع التاكيزويت من سلالة T. gondii RH التعبير عن البروتين الفلوري الأصفر (YFP) في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 1:1 (طفيلي: خلية) المخفف في 200 μL/well من RPMI التكميلية (3٪ FBS + 0.16 mM البنسلين + 0.18 mM Streptomycin + 12.5 mM HEPES + 30 mm درجة الحموضة 7.2) (انظر جدول المواد). احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة.
    3. ثم، تجاهل supernatant وإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر / بئر من 1٪ بارافورمالديهايد (PFA) المخفف في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    4. استبدال PFA مع 100 ميكرولتر / بئر من PBS في درجة الحموضة 7.2.
    5. إزالة بعناية نواة الخلايا الفائقة ووصمة عار عن طريق الأنابيب 50 μL/well من DAPI (5 ملغ / مل) المخفف في درجة الحموضة PBS 7.2 (1:1000) لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    6. استبدال محلول تلطيخ DAPI مع 100 ميكرولتر / بئر من PBS (درجة الحموضة 7.2) وتحليلها عن طريق المجهر الفلوري.
  2. عدوى الخلايا الدبقية مع T. cruzi
    1. لوحة 3 × 104 microglia أو الخلايا الفلكية مع مكملة DMEM/F12 في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة في لوحة مسطحة 96-جيدا معالجة (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: لكل نقطة زمنية للعدوى، استخدم لوحة مختلفة.
    2. تصيب الخلايا الدبقية مع التربوماستيغوتات من سلالة T. cruzi Y في وزارة الداخلية من 5:1 (الطفيليات: الخلية) المخففة في 200 ميكرولتر / بئر من RPMI التكميلية واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لغزو الخلية من قبل الطفيلي.
    3. إزالة جميع supernatant وغسل الآبار عن طريق إضافة 200 ميكرولتر / جيدا من RPMI التكميلية لإزالة جميع الطفيليات خارج الخلية. إزالة supernatant وإضافة 200 μL/ well من RPMI التكميلية الطازجة.
      ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى إزالة جميع الطفيليات التي لم تغزو الخلايا الملتصقة.
    4. الخلايا المصابة بكوباني لمدة 2 ساعة و 48 ساعة و 96 ساعة لتقييم تكرار T. cruzi في الخلايا الدبقية11.
    5. بعد كل نقطة زمنية، قم بإزالة الخلايا الفائقة وإصلاح الخلايا بـ 100 ميكرولتر/بئر من الميثانول لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم استبدل الميثانول بـ 100 ميكرولتر/بئر من PBS (درجة الحموضة 7.2).
    6. بعد التثبيت ، قم بإعداد الخلايا للحصول على المنافية على النحو التالي.
      1. لتجنب الفلورالذاتي، علاج الخلايا مع 100 ميكرولتر/ بئر من 50 mM NH4Cl المخفف في برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 8.0) لمدة 15 دقيقة. غسل الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر / بئر من برنامج تلفزيوني وإزالته على الفور (كرر هذه الخطوة 3 مرات).
      2. بعد ذلك ، permeabilize الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر / بئر من 0.5 ٪ تريتون المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة غسل الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر / بئر من برنامج تلفزيوني وإزالته على الفور (كرر هذه الخطوة 3 مرات).
      3. ثم، احتضان ثقافة الخلية مع 100 ميكرولتر / بئر من محلول منع (5٪ الحليب غير الدهون + 2٪ BSA المخفف في برنامج تلفزيوني [درجة الحموضة 7.2]) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر / بئر من برنامج تلفزيوني وإزالته على الفور (كرر هذه الخطوة 3 مرات).
      4. من أجل وصمة عار amastigotes، واحتضان مع 30 μL/well من الأجسام المضادة أحادية النسيلة غير التجارية (mAb) 2C2 المضادة للسبس-4 البروتين (1:200) المخفف في محلول منع لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
      5. غسل الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر / بئر من برنامج تلفزيوني وإزالته على الفور (كرر هذه الخطوة 3 مرات). احتضان لوحة مع 30 ميكرولتر / بئر من الأجسام المضادة للفأرة الثانوية (1:500) المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
        ملاحظة: كان بروتين mAb 2C2 المضاد لـ Ssp-4 غير التجاري هدية لطيفة من البروفيسور الدكتور ريناتو أ. هارونا من قسم علم الأحياء الدقيقة وعلم المناعة والطفيليات في جامعة ساو باولو الاتحادية.
      6. إزالة بعناية نواة supernatant ووصمة عار عن طريق إضافة 50 ميكرولتر / بئر من DAPI (5 ملغ / مل) المخفف في درجة الحموضة PBS 7.2 (1:1000) لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      7. استبدال محلول تلطيخ DAPI مع 100 ميكرولتر / بئر من درجة الحموضة PBS 7.2 وتحليلها عن طريق المجهر الفلوري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

فياليوم الرابع عشر، خضعت ثقافة الخلايا الدبقية(الشكل 1أ)للتفكك الميكانيكي. تم تحليل مجموعات الخلايا المعزولة عن طريق قياس الخلايا المتدفقة وفقًا لعلامات CD11b و CD45 و GFAP. يمكننا أن نلاحظ نقاء 89.5٪ للسكان الخلايا الفلكية و 96.6٪ للسكان microglia(الشكل 1B). بعد العزلة، تم مطلي الخلايا في لوحة مسطحة 96 بئرا وبعد 24 ساعة كانت على استعداد للإصابة من قبل T. كروزي أو T. غوندي وفقا لبروتوكولات العدوى ذات الصلة. هنا قدمنا عدوى دورة زمنية من T. cruzi كمثال على تقييم معدل العدوى في هذه الخلايا الدبقية.

الخلايا الفلكية وmicroglia (3 × 104 خلايا / جيدا) أصيبت مع T. كروزي في وزارة الداخلية = 5:1 (الطفيليات: الخلية) لمدة 2-96 ساعة(الشكل 2). تم تقييم معدل العدوى عن طريق الفلور المناعي عن طريق حساب عدد الخلايا وعدد الطفيليات الملطخة بجهاز تداخل الحمض النووي (DAPI). باختصار، يمكننا أن نلاحظ أن تي كروزي قادر على غزو الميكروجليا والخلايا الفلكية بمعدلات مماثلة. وعلاوة على ذلك، ت. كروزي يكرر في كلا النوعين من الخلايا، والوصول إلى أعلى معدل العدوى في 96 ساعة بعد العدوى (p.i.). ومن المثير للاهتمام، في 96 ساعة p.i. معدل العدوى هو أكثر وضوحا في الخلايا الفلكية مما كانت عليه في microglia، مما يشير إلى أن خلايا microglia قادرة على السيطرة على تكرار الطفيليات أكثر كفاءة من الخلايا الفلكية، كما وصفنا سابقا11.

من المهم ملاحظة أن استخدام الطفيليات المعدلة وراثياً التي تعبر عن مراسلين فلورسنت أو طفيليات موسومة بأجسام مضادة فلورية محددة يمكن أن يحسن المجهر المناعي الفلوري ، لأنها تتميز بشكل أفضل عن نواة الخلية(الشكل 3). وعلاوة على ذلك ، يمكن تحديد معدل عدوى الطفيليات الفلورية من خلال تقنيات أخرى مثل قياس الخلايا التدفق. هنا قدمنا أمثلة من T. gondii RH سلالة تعبر بشكل تأسيسي YFP(الشكل 3A) وت. كروزي Y سلالة ملطخة غير التجارية mAb 2C2 المضادة للبروتين Ssp-4(الشكل 3B).

بالإجمال، يصف هذا البروتوكول كيفية استخراج وصيانة وانفصام وإصابة الخلايا الأولية والبولية المادرين، والتي يمكن أن تكون أداة قوية لدراسة، على سبيل المثال، الاستجابات المناعية للخلايا الدبقية لعدوى البروتوزوا كما تم توضيحها بإيجاز هنا.

Figure 1
الشكل 1: الخلايا الفلكية الأولية وخلايا الميكروجليا. (أ)تم الحصول على صور من الخلايا الدبقية C57BL/6 المورين في اليوم الرابععشر من الثقافة عن طريق المجهر المقلوب (400x). يشير السهم الأحمر إلى طبقة الخلايا الفلكية ويشير السهم الأسود إلى الميكروجليا. (ب)بعد التفكك الميكانيكي، كانت الخلايا الفلكية وmicroglia ملطخة (5 × 105 خلايا) مع الفلورسنت المضادة CD11b، ومكافحة CD45 ومكافحة GFAP وتقييمها من قبل قياس خلايا التدفق (1 × 105 خلايا اقتناء). وتعتبر الخلايا الفلكية كما CD11b-/ CD45- وGFAP+ الخلايا، في حين أن microglia هي CD11b+/ / CD45+ وGFAP- الخلايا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: المسار الزمني للعدوى T. cruzi في الخلايا الدبقية. وقد أصيب الخلايا الفلكية وmicroglia من C57BL/6 الفئران مع T. كروزي Y (وزارة الداخلية = 5:1). بعد 2 ساعة و 48 ساعة و 96 ساعة ، تم إصلاح الغرف مع الميثانول وملطخة بعلامة نواة الخلية DAPI (الأزرق) ومكافحة GFAP (أحمر). تم الحصول على الصور عن طريق المجهر الفلوري المقلوب (400x). تم تقييم عدد الأماستيغوتات داخل الخلايا وتواتر الخلايا المصابة من قبل برنامج المجهر الفلوري (انظر جدول المواد). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الخلايا الفلكية والعدوى الدقيقة مع الطفيليات البروتوزوان الفلورية. (A)3 × 104 الخلايا الفلكية وmicroglia من C57BL/6 الفئران أصيبت (وزارة الداخلية = 1:1) مع T. gondii RH YFP (الأخضر) لمدة 48 ساعة، تم إصلاح الغرف مع 1٪ PFA وملطخة DAPI (الأزرق). (ب)3 × 104 الخلايا الفلكية وmicroglia من C57BL/6 الفئران أصيبت (وزارة الداخلية = 5:1) مع T. كروزي Y لمدة 96 ساعة، والغرف كانت ثابتة مع الميثانول النقي وملطخة DAPI (الأخضر) وmAb 2C2 المضادة لSSP-4 (البرتقالي). تم الحصول على الصور باستخدام مجهر الفلورسينس المقلوب. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد اتسعت أهمية دراسة وظائف الخلايا الدبقية المعزولة في سياقات بيولوجية متميزة في العقدين الماضيين. فهم الجهاز العصبي المركزي وراء الخلايا العصبية لا يزال حقل متزايد في بيولوجيا الخلايا, خاصة في ظل العدوى أو الظروف الالتهابية8,9,24. الخلايا الدبقية هي حاسمة ليس فقط للخلايا العصبية الدعم المادي (كما كان معروفا سابقا), ولكن أيضا في العديد من الحالات الفسيولوجية الأخرى مثل إمدادات الطاقة العصبية, الأيض العصبي, مراقبة المناعة, التقليم متشابك, تشكيل وتعديل الأنسجة, من بين أمور أخرى3,,25,,26,,27,,28, 29,29.

منذ الخلايا الفلكية وmicroglia يمكن تعديلها بشكل تفاضلي أثناء العدوى أو التهاب معقم، فمن الأهمية بمكان أن نفهم الدور الفردي والنسبي لهذه الخلايا الدبقية. على الرغم من أن من المعروف أن microglia تمثل نظام البلعوم النووي الأحادي (MPS) في الجهاز العصبي المركزي ، فقد وصفت الخلايا الفلكية أيضًا كلاعب محوري في استجابات الجهاز المناعي للـ CNS8. من أجل مقارنة دور كل مجموعة فرعية غلية في سياق العدوى و / أو الالتهاب ، من الإلزامي الحصول عليها من نفس الاستخراج والظروف. هناك تقارير قليلة حول استجابات تأثير microglia والخلايا الفلكية للسيطرة على العدوى ، خاصة فيما يتعلق بالطفيليات الأولية. في هذا المعنى، أظهرنا مؤخرا شرط NLRP3 inflammasome للسيطرة على تكرار T. كروزي في microglia ولكن ليس في الخلايا الفلكية من قبل آلية تنطوي على أكسيد النيتريك (NO) إفراز11.

يصف هذا البروتوكول طريقة تركز على استخراج مجموعتين من الخلايا الدبقية الأكثر وفرة في نفس الوقت، الخلايا الفلكية والميكروجليا، من الفئران بعد الولادة (حتى 3 أيام). يمكن استخدام الفئران حديثو الولادة الذين يزيد عمرهم عن 3 أيام، ولكننا شهدنا أن إنتاجية كلتا الخلايا تنخفض قليلاً مع مرور الوقت (البيانات غير مبينة). تختلف طريقتنا عن بروتوكولات الخلايا الفلكية أو عزل الميكروجليا التي سبق وصفها لأننا ركزنا على الحصول على كل من نوعي الخلايا وعزلهفي نفس الاستخراج، في ظل نفس الظروف، وبالتالي تحسين استخدام الحيوانات التجريبية وتحسين دراسة الدور النسبي لتلك الخلايا في السياقات المناعية. وعلاوة على ذلك، بروتوكول لدينا أيضا الأمثل العائد من كل من أنواع الخلايا. العائد هو عادة 3-5 × 106 الخلايا الفلكية و 3-5 × 105 ميكروجليا لكل قارورة. قارن هذا بالبروتوكولات الأخرى التي تؤدي إلى خلايا أقل باستخدام المزيد من الحيوانات لكل قارورة T-75 (تستخدم بعض البروتوكولات 2-3 الحيوانات لكل قارورة)30،31.

ميزة أخرى لهذا البروتوكول هو الوقت اللازم للحصول على الخلايا الفلكية المعزولة وmicroglia. في غضون 14 يوما فمن الممكن الحصول على microglia ناضجة. في الواقع ، من المهم تسليط الضوء على أنه ، كما أظهر فولد وكومبس ، microglia أقدم من 14 يوما الحالية تضاؤل القدرة على إفراز السيتوكينات ؛ من المهم جدا أن تنظر في هذا في سياقات المناعة العصبية30. على الرغم من حقيقة أن صانعي ناضجة لastrocyte ليست مفهومة تماما، ويستخدم إلى حد كبير GFAP لتوصيف الخلايا الفلكية استجابة ونشطة. بعض البروتوكولات تحقيق مستويات 90٪ خلايا GFAP إيجابية فقط بعد 21 أو 28 يوما من الثقافة. لهذا السبب، اقترحنا طريقة توفر، الخلايا التي تستجيب للمناعة وتنضج في الغالب في غضون 7-14 يوما. على الرغم من أن النقاء يمكن أن يكون أقل من الطرق الأخرى لكل من الخلايا الفلكية31 وmicroglia30، كان التركيز الرئيسي على الحصول على microglia والخلايا الفلكية بكميات أكبر في استخراج المصاحبة. ونحن نفهم أن مجموعات الخلايا يمكن أن تكون أكثر فرزا أو معزولة مع فصل العمود لتحسين النقاء. ولهذا الغرض، يمكن إدراج علامات خلايا إضافية، مثل Iba1 أو TMEM119 للميكروجليا؛ Aquaporin-4 أو S100B للخلايا الفلكية, CC1 أو O4 لoligodendrocytes ونوين للخلايا العصبية22,,31,,32,,33. ومع ذلك، يجب النظر في فقدان خلية هامة في نهاية البروتوكول.

وهكذا، قدمنا طريقة معدلة للحصول على microglia في وقت واحد والخلايا الفلكية في بروتوكول كفاءة ورخيصة. وعلاوة على ذلك، يوفر هذا البروتوكول مزايا غلة كبيرة تسمح بالدراسات المقارنة للمجموعات الفرعية الدبقية في سياقات المناعة العصبية، كما هو موضح هنا خلال عدوى تي كروزي وت. غوندي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نود أن نشكر البروفيسور الدكتور ريناتو أ. هارومنتا من جامعة ساو باولو الاتحادية على برنامج MAb 2C2 المناهض لـ Ssp-4. وقد دعم هذا العمل بمنح مقدمة من مؤسسة امباساو دي أمبارو إي بيسكيسا دو استادو دي ساو باولو (FAPESP, منحة 2017/25942-0 إلى K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, منحة 402100/2016-6 إلى K.R.B.)، المعهد الوطني للعلوم والتكنولوجيا والعلوم (INCTV/CNPq) وCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Finance Code 001). تتلقى M.P.A. زمالة من CNPq، ويتلقى A.L.O.P. زمالة من CAPES، ويتلقى I.S.F.F.B. زمالة من FAPESP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol Dinâmica Química Contemporânea Cat: 2231 Sterilize
75 cm2 Flask Corning Cat: 430720U Plastic material
96 well cell culture plate Greiner Cellstar Cat: 655090 Cell culture
Ammonium Chloride (NH4Cl) Dinâmica Química Contemporânea Cat: C10337.01.AH Remove autofluorescence
Anti-GFAP antibody Abcam Cat.: ab49874 Immunofluorescence antidoby
Bottle Top Filter 0.22 μmm CA Corning Cat: 430513 Culture medium filter
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich Cat: A7906 FACS Buffer preparation
CD11b (FITC) BD Pharmigen Cat.: 553310 Flow cytometry antibody
CD45 (PE) Invitrogen Cat.: 12-0451-83 Flow cytometry antibody
Centrifuge Eppendorf Cat: 5810R Centrifugation
Centrifuge Eppendorf 5415R Centrifugation
Class II biosafety cabinet Pachane Cat: 200 Biosafety cabinet for sterile procedures
CO2 Incubator ThermoScientific Model: 3110 Primary cells maintenance
Conical tubes 15 mL Corning Cat: 430766 Plastic material
Conical tubes 50 mL Corning Cat: 352070 Plastic material
Countess automated cell counter Invitrogen Cat: C10281 Cell counter
DAPI Invitrogen Cat.: D1306 Immunofluorescence antidoby
Digital Microscope Camera Nikon Cat: DS-RI1 Capture images on microscope
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco Cat: 12800-058 Cell culture medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich Cat: E9884 FACS Buffer preparation
F12 Nutrient Mixture Gibco Cat: 21700-026 Cell culture medium
FACS Canto II BD Biosciences Unavaiable Flow cytometer
Fetal Bovine Serum (FBS) LGC Biotechnology Cat: 10-bio500-1 Cell culture medium supplement
Flow Jo (software) Flow Jo Version: Flow Jo_9.9.4 Data analysis
Fluorescence intenselight Nikon Cat: C-HGFI Fluorescence source
GFAP (APC) Invitrogen Cat.: 50-9892-82 Flow cytometry antibody
Goat - anti-mouse IgG (FITC) Kirkeegood&Perry Lab (KPL) Cat.: 172-1806 Immunofluorescence antidoby
HBSS - Hank's Balanced Salt Solution Gibco Cat: 14175079 Cell culture medium
HEPES Sigma Aldrich Cat: H4034 Cell culture medium supplement
IC Fixation Buffer Invitrogen Cat: 00-8222-49 Cell fixation for Flow Citometry
Inverted microscope Nikon Model: ECLIPSE TS100 Microscope
Isoflurane Cristália Cat: 21.2665 Inhaled anesthetic
Methanol Synth Cat: 01A1085.01.BJ Fixation for Immunofluorescence
Micro spatula ABC stainless Unavaiable Surgical material
Microtube 1.5 mL Axygen Cat: MCT-150-C Plastic material
Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 Non commercial Non commercial Immunofluorescence antidoby
Multichannel Pipette (p200) Corning Cat: 751630124 Pipette reagents
NIS Elements Software Nikon Version 4.0 Acquire and analyse images
Non-fat milk Nestlé Cat: 9442405 Blocking solution for immunofluorescence
Orbital Shaker Incubator ThermoScientific Model: 481 Cat: 11 Dissociate microglia from astrocytes
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich Cat: P6148 Fixation for Immunofluorescence
PBS Non commercial Non commercial Neutral Buffer
Penicillin G Sigma Aldrich Cat: P-7794 Cell culture medium supplement
Permeabilization Buffer (10x) Invitrogen Cat: 00-8333-56 Cell permeabilization for Flow Citometry
Petri dish 60 mm x 15 mm (Disposable, sterile) Prolab Cat: 0303-8 Plastic material
pH meter Kasvi K39-1014B Calibrate pH solution
RPMI 1640 Medium Gibco Cat: 31800-014 Cell culture medium
Scissors ABC stainless Cat: LO9-W4 Surgical material
Serological pipette 10 mL Corning Cat: 4101 Plastic material
Serological pipette 5 mL Corning Cat: 4051 Plastic material
Single Channel Pipette (p1000) Gilson Pipetman Cat: F123602 Pipette reagents
Single Channel Pipette (p200) Gilson Pipetman Cat: F123601 Pipette reagents
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich Cat: S6297 Cell culture medium supplement
Streptomycin sulfate salt Sigma Aldrich Cat: S9137 Cell culture medium supplement
Triton X-100 Sigma Aldrich Cat: T9284 Permeabilization for immunofluorescence
Trypsin Gibco Cat: 27250-018 Digestive enzyme
Tweezers ABC stainless Cat: L28-P4-172 Surgical material
Water Bath Novatecnica Model: 09020095 Digeste tissue at 37 °C with trypsin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
  2. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  3. Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
  4. Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
  5. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
  6. Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
  7. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  8. Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
  9. Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
  10. Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
  11. Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
  12. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
  13. Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
  14. Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
  15. Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
  16. Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
  17. Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
  18. Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
  19. Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
  20. Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
  21. Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  23. Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
  24. Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
  25. Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
  26. Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
  27. Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
  28. Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
  29. Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
  30. Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
  31. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
  32. Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
  33. Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 157، خلايا غليا، الخلايا الفلكية، microglia، عدوى بروتوزوا، T. cruzi، T. gondii
العزلة المصاحبة للخلايا الفلكية الأولية وMicroglia لعدوى طفيلي بروتوزوا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., More

Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., de Farias, I. S., Bottino, L. Z. M. F., Bortoluci, K. R. Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection. J. Vis. Exp. (157), e60680, doi:10.3791/60680 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter