Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

בידוד הראשוני של אסטרוציטים ומיקרוגליה לזיהום טפיל

Published: March 18, 2020 doi: 10.3791/60680
* These authors contributed equally

Summary

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להנחות כיצד לחלץ, לתחזק, ו הנתק מורטין אסטרוציט ו מיקרוגליה תאים ממערכת העצבים המרכזית, ואחריו זיהום עם טפילים פרוטותים.

Abstract

Astrocytes ו מיקרוגלייה הם התאים השופעים ביותר גליה. הם אחראים על תמיכה פיזיולוגית והומאוסטזיס תחזוקה במערכת העצבים המרכזית (CN). העדויות הגדלות של מעורבות שלהם בשליטה של מחלות זיהומיות להצדיק את העניין המתעוררים לשיפור של מתודולוגיות כדי לבודד אסטרוציטים הראשי מיקרוגליה כדי להעריך את התגובות שלהם זיהומים המשפיעים על ה-cn. בהתחשב ההשפעה של טריאנוסומה cruzi (t. cruzi) ו טוקסופלזמה gondii (t. gondii) זיהום ב-cn, כאן אנו מספקים שיטה לחלץ, לתחזק, לנתק ולהדביק murine האסטרוציטים ותאים מיקרוגלייה עם טפילים פרוטותים. תאים שחולצו מתוך היילוד מתוחזקות בתוך מבחנה 14 ימים עם החלפת מדיה דיפרנציאלית תקופתית. Astrocytes ו מיקרוגלייה מתקבלים באותו פרוטוקול החילוץ על ידי דיסוציאציה מכנית. לאחר פנוטיפים על ידי הזרימה cy, לנסות, תאים נגועים בטפילים פרוטותים. שיעור הזיהום נקבע על ידי מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית בנקודות זמן שונות, ובכך מאפשר הערכה של היכולת הדיפרנציאלית של תאי גליה כדי לשלוט על הפלישה פרוטוזוא ושכפול. טכניקות אלה מייצגות פשוטה, שיטות זולות ויעילות כדי ללמוד את התגובות של אסטרוציטים ו מיקרוגלייה לזיהומים, פתיחת השדה עבור ניתוח נוירואימונולוגיה נוספת.

Introduction

ה-cn מורכב בעיקר מנוירונים ותאי גלאל1,2,3. Microglia ו אסטרוציטים הם התאים הנפוצים ביותר של גליה ב-cn. Microglia, מקרופאג תושב, הוא החיסוני ואת התאים של הphagocytic ב-cn3,4, בעוד אסטרוציטים אחראים לשמירה על הומאוסטזיס ולהפעיל פונקציות תומכות5.

למרות התאים גליה הידוע באופן קלאסי להיות אחראי על תמיכה והגנה של נוירונים6,7, פונקציות המתעוררים של תאים אלה תוארו בספרות האחרונות, כולל התגובות שלהם זיהומים8,9,10,11. כך, יש דחיפה לפתח שיטות כדי לבודד אלה התאים גליה כדי להבין את הפונקציות שלהם בנפרד.

יש כמה דגמים חלופיים כדי ללמוד תאים גליה ולא התרבויות הראשיות, כמו לספירת תאים מונצח ומודלים vivo. עם זאת, תאים מונצח נוטים יותר לעבור שינויים גנטיים נסחף מורפולוגיים, בעוד במחקרים vivo להטיל תנאים מניפולציה מוגבלת. לעומת זאת, התרבויות הראשיות קל לטפל, טוב יותר להידמות vivo תאים וגם לאפשר לנו לשלוט גורמים ניסיוניים12,13. כאן, אנו לתאר הנחיות על איך לחלץ, לשמור ולנתק את מורטין אסטרוציטים ואת התאים הראשוניים מיקרוגלייה באותו פרוטוקול. יתרה מזאת, אנו גם מספקים דוגמאות לעבודה עם זיהום פרוטותים בתרבויות אלה.

תאי ה-cn שחולצו מעכברים הנמצאים במצב של עד 3 ימים, היו מתורבתים במשך 14 יום על מדיה דיפרנציאלית המאפשרת צמיחה מועדפים של התאים ה אסטרוציטים ו מיקרוגלייה. מאז השאר מיקרוגלייה מעל האסטרוציטים המצורפת, אוכלוסיות תאים היו מונתק מכנית בחממה מסלולית. לאחר מכן, אספנו את כל הסופרנטנט המכיל מיקרוגלייה וטריפסין שנוספו לניתוק האסטרוציטים. תאים גליה מבודדים היו פנופנזה בדרך כלל הוערך על ידי cy, לנסות ומצופה על פי הניסוי הרצוי.

כמו כן סיפקנו דוגמאות על איך להדביק אלה מיקרוגלייה מבודדים ו אסטרוציטים עם טפילים פרוטותים. T. gondii הוא מאוד נוירוטרופי פרוטומי אחראי לטוקסופלזמוזיס14, בעוד T. cruzאני אחראי על מחלת הצ אשר יכול להיות מוביל להתפתחות של הפרעות נוירולוגיות בתוך המוח15,16. יתר על כן, זה גם דווח כי זיהום עם T. gondii17,18 או T. cruzi19,20,21 היו הגורם אני של מוות בחולים בסיכון חיסוני. לכן, ההסבר של התפקיד החיסוני של התאים גליה מתוך ה-cn בשליטה בזיהומים פרוטותים הוא בעל חשיבות רבה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים הכרוכים בעכברים בוצעו בהתאם למשפט הלאומי הברזילאי (11.794/2008) ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ושימוש בוועדות (IACUC) של האוניברסיטה הפדרלית של סאו פאולו (UNIFESP).

1. הפקת תאים גליאל, תחזוקה ודיסוציאציה

הערה: מספר העכברים המשמשים להפקת התאים הגליאל תלוי בכמות התאים הדרושים לביצוע הניסויים הרצויים. בפרוטוקול זה, סך של 2.7 x 107 אסטרוציטים ו 4 x 106 מיקרוגלייה התקבלו שישה C57BL/6 עכברים. כל ההליכים בוצעו במצב סטרילי בארון בטיחות II class.

  1. היום הראשון
    1. הכינו תמיסת מלח מאוזנת טהורה של האנק (HBSS) ו-HBSS + 10% של סרום העוברי חום בלתי מופעל (FBS) (ראה טבלת חומרים).
    2. להכין מדיום הנשר השונה של dulbecco (dmem)/f12 (10% fbs + 0.08 מ ל פניצילין + 0.09 mm סטרפטומיצין + 12.5 mm הhepes + 30 מ"מ נתרן ביקרבונט, pH 7.2) ולסנן אותו עם מסנן ב0.22 יקרומטר (ראה טבלת חומרים).
      הערה: יש לאחסן את כל מדיית התרבות ב-4 ° c, אך יש צורך לחמם אותן מראש ב-37 לפני 20 דקות לפני תחילת הניסוי.
    3. לחטא את כל כלי הניתוח (מספריים, מרית ופינצטה) ב החיטוי ולהשתמש 70% אתנול במהלך ההליך.
    4. לשים ילודים (עד 3 יום בן) עכברים בחדר אטום המכיל כותנה ספוגה isof, 5 דקות להרדמה מעמיקה.
    5. רסס את גור העכבר עם 70% אתנול וערוף את ראשו של בעל החיים עם מספריים.
    6. לגרום משונן cut (אחורי לקדמי) עם מספריים לאורך הגולגולת כדי לפתוח אותו ולחשוף את המוח. הפרידו את הגולגולת מהמוח באמצעות מלקחיים. להסיר את המוח באמצעות מיקרו מרית כדי לשמור על שלמות המוח.
    7. מניחים את המוח בצלחת פטרי יבשה (6 ס מ קוטר). להסיר את הנורה ואת המוח הזעיר באמצעות מיקרו מרית. הזיזו את הקליפה לצלחת פטרי אחרת (בקוטר 6 ס מ) המכילה HBSS + 10% FBS (2 מ ל/צלחת פטרי).
    8. חותכים את רקמת המוח לחתיכות קטנות עם מספריים סטרילית באמצעות p1000 מיקרופיפטה להעביר כל רקמת המוח עם HBSS + 10% FBS שונים 15 מ"ל שפופרות חרוט. ודא שאמצעי האחסון הסופי הוא 2 mL/tube. אם לא, להשלים עם HBSS + 10% FBS.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. אם כן, צינורות חרועם רקמת ה-CN חייבים להיות ממוקמים על הקרח עד 1 h.
    9. רוחצים את רקמת המוח לחתוך עם 3 מ ל של HBSS + 10% FBS (לכל צינור) ולאחר ההתרוממות. הסר בזהירות את הסופרנטאנט. חזור על שלב זה 3 פעמים.
      הערה: שלב זה נועד להסיר את הפסולת כדי לשחזר את הרקמה המחולצים.
    10. רוחצים את רקמת המוח לחתוך עם 3 מ"ל של HBSS טהור (לצינור) ואחרי היין, להסיר בזהירות את supernatant. חזור על שלב זה 3 פעמים.
      הערה: שלב זה נועד להסיר את הנסיוב הנותר מן השטף הקודם, כמו תאים יהיה טריסינטזציה בשלב הבא.
    11. הוסיפו 3 מ ל טריפסין לצינור ומניחים באמבט מים ב-37 ° c למשך 30 דקות, מנענעת בעדינות את הצינורות כל 5 דקות. הימנע בועות על ידי היפוך או לפתע ערבוב צינורות.
      הערה: שלב זה נועד לעכל את הרקמה שנאספה.
    12. כדי להשבית את הטריפסין, שטוף את הרקמה עם 3 מ ל לצינור של HBSS + 10% FBS, ולאחר שהיה בקבוקי הרקמה, הסר בזהירות את הסופרנטאנט. חזור על שלב זה 3 פעמים.
    13. שטוף את הרקמה עם 3 מ ל לכל שפופרת של HBSS טהור ובזהירות להסיר supernatant. חזור על שלב זה 2 פעמים.
    14. הוסף 7 מ"ל לכל שפופרת של hbss טהור ו המגון לסדר את הרקמה באמצעות מעברים רצופים ב פיפטות: הראשון עם הצינור 10 ml סרולוגית, ואחריו 5 מ ל ולבסוף עם p1000 micropipette.
    15. לאחר הומוקות, צינורות צנטריפוגה ב 450 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
    16. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה עם 4 מ ל של HBSS + 10% FBS לכל צינור.
    17. העברת תאים לבקבוקון T-75 מטופל עבור הדבקה מיטבית של תרבות התא (ראה טבלת חומרים).
      הערה: רקמת התהליך מכל בעל חיים לכל בקבוקון.
    18. הניחו את הבקבוקון בחממה ב-37 ° c ו -5% CO2 ל -30 דקות לצורך הדבקות.
    19. הוסף 10 מ ל של שנוספו DMEM/F12 לבקבוקון ו-דגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
      הערה: אמצעי האחסון הסופי הוא 14 מ ל לכל בקבוקון.
  2. היום השלישי
    1. הסרת 7 מ ל של התרבות בינונית מ-T-75 בקבוקון ולהוסיף 7 מ ל של חדש שנוספו Dמאמ/F12.
      הערה: מבחנות יכיל הרבה פסולת תאית מראה מעונן.
  3. היום החמישה
    1. להסיר את כל המדיום מ-T-75 בקבוקון ולהוסיף 14 מ ל של חדש שנוספו Dמאמ/F12.
      הערה: בינוני מוחלף מבחנות כדי להסיר הריסות ותאים לא מחסיד.
    2. לאחר כל 48 h, להסיר 6 מ ל של supernatant ולהוסיף 7 מ ל של טריים שנוספו DMEM דיום/F12 בינוני עד יום 14 של תרבות.
  4. . היום ה -14
    1. לאחר הסרת 6 מ ל של סופרנטאנט והוספת 7 מ ל של מדיום טריים בתוספת/F12, סגור את T-75 מבחנות הדוק.
    2. מניחים אותם ברצפה מסלולית שייקר ב 200 סל ד ו 37 ° c לילה כדי מכנית הנתק המיקרוגליה מ astrocytes.
  5. . היום ה -15
    1. לקחת את מבחנות מן השייקר ובמרץ לשטוף אותם עם המדיום שלהם כדי למטב את דיסוציאציה התאים ואת הקציר המספר המירבי של microglia. לאחר מכן, לאסוף את supernatant (המכיל microglia) ולהעביר לשפופרת חרוט 50 mL.
    2. לאחר מכן, להוסיף 4 מ ל טריפסין לתוך כל בקבוקון ו דגירה עבור 5 דקות ב 37 ° c כדי לנתק את האסטרוציטים.
    3. הוסף 5 מ ל לכל בקבוקון של בתוספת Dמאמ/F12 כדי להשבית את טריפסין. לשטוף את מבחנות עם המדיום שלהם ואת התוכן להעביר לשפופרת חרוט 50 mL.
    4. צנטריפוגה את כל הצינורות המכילים מיקרוגלייה הנתק ו אסטרוציטים ב 450 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
    5. . מחק את הסופרנטאנט השהה מחדש את הגלולה מיקרוגלייה ב 1 מ ל ו אסטרוציטים ב 10 מ ל של שנוספו dמאמ/F12.
    6. המשך לספירת תאים בתוך תא נויבאואר או מונה תאים אוטומטי. לוחית את התאים עם בתוספת DMEM/F12 בצפיפות הרצויה בלוח התאים התחתון שטוח התחתונה הטבלה (מראש עבור המצורף לתא אופטימלי; ראה טבלת חומרים). התאים הדגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 24 שעות כדי לאפשר להם לצרף.
      הערה: שריין 1.5 x 106 של כל אחד מאוכלוסיית התאים כדי לאשר את הטוהר שלהם על ידי זרימה cy, try.
    7. בצע ניתוח ציטומטרי זרימה כדי לאמת את טוהר אוכלוסיית התאים.
      הערה: אנו מחשיבים מיקרוגלייה CD11b+/cd45+/gfap- ו אסטרוציטים CD11b-/cd45-/gfap+. Iba1 ו TMEM119 כתמים עשוי להיחשב על מנת לאפיין במלואו מיקרוגלייה22.
    8. הוסף FMO (זריחה פחות אחת)23 ומדגם לא מוכתם עבור כל האוכלוסייה תא (astrocytes ו microglia) כפקדים של זרימה cy, לנסות שיטת הפעולה.
    9. עבור כל אחד מאוכלוסיית התאים, הזמינו 5x 10 תאים עבור כל הדגימות המוכתמת והבלתי מוכתמות. עבור fmo, הזמינו שתי שפופרות אחרות של מיקרוגלייה המכיל 2.5 x 105 תאים כל אחד ושמור גם שפופרת אחר של 5 x 105 astrocytes.
      הערה: מאחר שמספרי מיקרוגלייה יכולים להיות גורם מגביל, ניתן להשתמש בפחות תאים עבור פקדים בלתי מוכתמים ו-fmo.
    10. צנטריפוגה את כל microtubes ב 450 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה עם 500 μL/microtube של מאגר FACS (פוספט באגירה מלוחים (PBS) + 0.5% בסרום שור (BSA) + 2 מ"מ EDTA, pH 7.2).
    11. צנטריפוגה את כל microtubes ב 450 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות. להיפטר supernatant ולהשעות את הגלולה עם 100 μl/microtubes של ANTI-CD16/CD32 (שיבוט 93) (1:50) מדולל במאגר facs. מודטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    12. הוסף 500 μL/microtube של מאגר FACS לתוך כל מיקרוצינורות וצנטריפוגה ב 450 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט. השעיה מחדש אסטרוציטים ו מיקרוגלייה מכתים צינורות וגם אסטרוציט fmo הצינור עם 50 μl/מיקרוגלייה של משטח סמנים לערבב: anti-CD45 (PE, שיבוט 30-F11) ו anti-CD11b (efluor 450, שיבוט M1/70) (שניהם מדולל ב 1:100 במאגר facs).
    13. עבור תאים שאינם מוכתמים, השהה מחדש עם אותו כמות של מאגר FACS. עבור מיקרוגלייה fmo, דגירה כל שפופרת מיקרוגלייה עם anti-CD45 או anti-CD11b. דגירה כל הדגימות ב 4 ° c עבור 20 דקות בחושך.
    14. הוסף 500 μL של מאגר FACS לכל מיקרו-צינורית. צנטריפוגה ב 450 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות. לבטל את supernatant ולהשעות את הגלולה עם 100 μl/microtube של מאגר קיבעון (ראה טבלת חומרים) עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    15. הוסף 500 μL/microtube של מאגר החדירות 1x (ראה טבלת חומרים) ו הדגירה ב 4 ° c עבור 5 דקות בחושך.
    16. צנטריפוגה את כל המיקרוצינוריות ב 450 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט. השעיה מחדש אסטרוציטים ו מיקרוגלייה מכתים צינורות וגם מיקרוגלייה fmo צינורות עם 50 μl/מיקרוגלייה של נוגדן תאיים anti-gfap (APC, שיבוט GA5) ב 1:100 דילול במאגר החדירות 1x. עבור תאים בלתי מוכתמים ו-אסטרוציט fmo, השהה מחדש את התאים באותו כמות של מאגר facs. מודטה את כל הדגימות ב 4 ° c עבור 30 דקות בחושך.
    17. לשטוף את כל הצינורות על ידי הוספת 500 μL/microtube של מאגר חדירות 1x. צנטריפוגה את כל המיקרוצינוריות ב 450 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° c. השהה מחדש כל מיקרוצינורית ב-200 μL של מאגר FACS. לרכוש 1 x 105 אירועים/מדגם על הזרימה cytometer.
    18. לצורך ניתוח, התאים חייבים להיות מגודרת הראשון על CD11b x CD45 ולאחר מכן GFAP היסטוגרמה.
      הערה: שליטה בלתי מוכתמת ובקרת FMO מועילה לקביעת השערים.

2. זיהום והערכה של שיעורי זיהום

  1. זיהום של תאים גליאל עם T. gondii
    1. צלחת 3 x 104 מיקרוגלייה או אסטרוציטים עם שיושלם dמאמ/F12 ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 24 שעות בלוח מקדים 96-ובכן שטוח (ראה לוח חומרים).
    2. הדביקו כל אחד מאוכלוסיית התאים בעזרת טכיון מ -T. gondii RH זן המבטא חלבון פלורסנט צהוב (yfp) בריבוי של זיהום (משרד הבית) של 1:1 (טפיל: תא) מדולל ב 200 μl/טוב של תוספת RPMI (3% fbs + 0.16 mm פניצילין + 0.18 mm סטרפטומיצין + 12.5 MM hepes + 30 מ"מ נתרן ביקרבונט, pH 7.2) (ראה לוח חומרים). מודטה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 48 h.
    3. לאחר מכן, למחוק את supernatant ולתקן את התאים על ידי הוספת 100 μL/טוב של 1% פאראפורמלדהיד (התחתית) מדולל ב-PBS ב 4 ° צ' עבור 24 h.
    4. החלף את התחתית עם 100 μL/טוב של PBS ב-pH 7.2.
    5. בזהירות להסיר את supernatant ואת התאים הכתם ' גרעינים על ידי pipetting 50 μL/טוב של DAPI (5 מ"ג/mL) מדולל ב-PBS pH 7.2 (1:1000) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    6. החלף פתרון DAPI מכתים עם 100 μL/טוב של PBS (pH 7.2) ולנתח אותו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית.
  2. זיהום של תאים גליאל עם T. cruzi
    1. צלחת 3 x 104 מיקרוגלייה או אסטרוציטים עם שיושלם dמאמ/F12 ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 24 שעות בלוח מקדים 96-ובכן שטוח (ראה לוח חומרים).
      הערה: עבור כל נקודה של זיהום, להשתמש בצלחת אחרת.
    2. להדביק את התאים גליה עם טריאואסטיגוטים מ T. cruzi Y זן ב-מע של 5:1 (טפילים: תא) מדולל ב 200 μl/טוב של בתוספת RPMI ו דגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 2 h.
      הערה: שלב זה חשוב עבור הפלישה התא על ידי הטפיל.
    3. הסר את כל supernatant ולשטוף את הבארות על ידי הוספת 200 μL/טוב של בתוספת RPMI כדי להסיר את כל טפילים מסחטות. הסר supernatant ולהוסיף 200 μL/טוב של טריים שנוספו RPMI.
      הערה: שלב זה מתכוון להסיר את כל הטפילים שלא פלשו לתאי החסיד.
    4. התאים הנגועים דגירה עבור 2 h, 48 h ו 96 h כדי להעריך את שכפול T. cruzi בתאי גליה11.
    5. לאחר כל נקודת זמן, להסיר את supernatant ולתקן את התאים עם 100 μL/טוב של מתנול עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להחליף מתנול עם 100 μL/טוב של PBS (pH 7.2).
    6. לאחר קיבעון, להכין את התאים עבור התיקון האימונוoforas כדלקמן.
      1. כדי למנוע התאמה אוטומטית, לטפל בתאים עם 100 μL/טוב של 50 mM NH4Cl מדולל ב-PBS (pH 8.0) עבור 15 דקות. לשטוף את התאים על ידי הוספת 100 μl/טוב של PBS ומיד להסיר אותו (לחזור על שלב זה 3 פעמים).
      2. הבא, לחלחל את התאים על ידי הוספת 100 μL/טוב של 0.5% טריטון מדולל ב-PBS עבור 15 דקות. לשטוף את התאים על ידי הוספת 100 μL/טוב של PBS ומיד להסיר אותו (לחזור על שלב זה 3 פעמים).
      3. לאחר מכן, מודלת את תרבות התא עם 100 μL/טוב של פתרון חסימה (5% לא שומן חלב + 2% BSA מדולל ב-PBS [pH 7.2]) עבור 1 h בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים על ידי הוספת 100 μL/טוב של PBS ומיד להסיר אותו (לחזור על שלב זה 3 פעמים).
      4. על מנת להכתים את amastigotes, דגירה עם 30 μL/טוב של אנטי מסחרי נוגדן חד שבטיים (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 חלבון (1:200) מדולל בפתרון חסימת עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
      5. לשטוף את התאים על ידי הוספת 100 μL/טוב של PBS ומיד להסיר אותו (לחזור על שלב זה 3 פעמים). מודלת את הצלחת עם 30 μL/היטב של הנוגדן נגד העכבר משני (1:500) מדולל ב-PBS עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
        הערה: החלבון שאינו מסחרי mAb 2C2 אנטי-Ssp-4 היה מתנה אדיבה מפרופסור ד ר רנאטו א. מורטרה מהמחלקה למיקרוביולוגיה, אימונולוגיה ו פרזיטולוגיה של האוניברסיטה הפדרלית של סאו פאולו.
      6. הסר בזהירות את הגרעין ואת גרעיני הכתם על ידי הוספת 50 μL/טוב של DAPI (5 מ"ג/mL) מדולל ב-PBS pH 7.2 (1:1000) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
      7. החלף פתרון DAPI מכתים עם 100 μL/טוב של PBS-pH 7.2 ולנתח אותו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ביוםה -14, התרבות של התאים הגליאל (איור 1א) עברה דיסוציאציהמכנית. אוכלוסיות מבודדות תאים נותחו על ידי הזרמת cy, לדברי CD11b, CD45 ו GFAP סמנים. אנו יכולים להתבונן טוהר של 89.5% עבור האוכלוסייה אסטרוציט ו 96.6% עבור האוכלוסייה מיקרוגלייה (איור 1B). לאחר בידוד, תאים היו מצופים בצלחת 96-היטב שטוח ואחרי 24 שעות הם היו מוכנים להידבק על ידי t. cruzi או t. gondii על פי פרוטוקולי זיהום בהתאמה. כאן סיפקנו זמן מסלול הזיהום של T. cruzi כדוגמה להערכת שיעור זיהום בתאי גליה אלה.

Astrocytes ו מיקרוגלייה (3 x 104 תאים/גם) נדבקו T. cruzi ב- מוי = 5:1 (טפילים: תא) עבור 2 – 96 h (איור 2). שיעור זיהום הוערך על ידי immunofluorescence על ידי ספירת מספר התאים ואת מספר טפילים מוכתם ב-DNA intercalator (DAPI). בקצרה, אנחנו יכולים לצפות כי T. cruzi הוא מסוגל לפלוש מיקרוגלייה ו אסטרוציטים בשיעורים דומים. יתר על כן, T. cruzi משכפל בשני סוגי התא, להגיע לשיעור הזיהום הגבוה ביותר ב 96 h לאחר הזיהום (חוקר פרטי). מעניין, ב 96 h חוקר שיעור זיהום מבוטא יותר אסטרוציטים מאשר מיקרוגלייה, הרומז כי התאים מיקרוגלייה מסוגלים לשלוט שכפול טפיל ביעילות רבה יותר אסטרוציטים, כפי שתיארנו בעבר11.

חשוב לציין כי השימוש של טפילים מהונדסים גנטית המבטא כתבים פלורסנט או טפילים המסומנים עם נוגדנים מסוימים פלורסנט יכול לשפר את מיקרוסקופ immunofluorescence מאז הם נבדלים יותר מאשר תא גרעין (איור 3). יתר על כן, שיעור זיהום של טפילים פלורסנט ניתן לקבוע על ידי טכניקות אחרות כגון הזרימה cy, לנסות. כאן סיפקנו דוגמאות של T. gondii לחות יחסית מבחינה מצטברת ביטוי yfp (איור 3A) ו- t. cruzi Y זן ויטראז ' לא מסחרי mab 2c2 אנטי-Ssp-4 חלבון (איור 3ב).

בסך הכל, פרוטוקול זה מתאר כיצד לחלץ, לתחזק, לנתק ולהדביק מיקרולייה מיקרוגלייה ו אסטרוציטים התאים הראשוניים, אשר יכול להיות כלי רב עוצמה כדי ללמוד, למשל, תגובות החיסונית של תאי גליה לזיהום הפרוטותים לזמן קצר מובהר כאן.

Figure 1
איור 1: האסטרוציטים הראשי ותאים מיקרוגלייה. (א) תמונות של C57BL/6 תאים גליה מורנהביום ה -14 לתרבות הושגו על ידי מיקרוסקופ הפוך (400 x). החץ האדום מציין את השכבה של אסטרוציטים ואת החץ השחור מציין את microglia. (ב) לאחר דיסוציאציה מכנית, אסטרוציטים ו מיקרוגלייה היו מוכתמים (5 x 105 תאים) עם פלורסנט anti-CD11b, anti-CD45 ו-anti-gfap והעריך על ידי הזרם cy, לנסות (1 x 105 תאים רכישה). Astrocytes נחשבים CD11b-/cd45- ו gfap+ תאים, בעוד מיקרוגלייה הם CD11b+/cd45+ ו gfap תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הזמן בקורס של T. cruzi זיהום בתאי גליה. Astrocytes ו מיקרוגלייה מ C57BL/6 עכברים נדבקו T. cruzi Y (משרד הבין = 5:1). לאחר 2 h, 48 h ו 96 h, צ'יימברס תוקנו עם מתנול ומוכתם עם סמן תא גרעין DAPI (כחול) ו-anti-GFAP (אדום). תמונות הושגו על ידי מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטית (400 x). מספר amastigotes בתוך התאים ואת התדירות של תאים נגועים הוערכו על ידי תוכנת מיקרוסקופ פלואורסצנטית (ראה לוח חומרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: האסטרוציטים וזיהום מיקרוגלייה with הניאון פרוטוזוזה טפילים. (A) 3 x 104 אסטרוציטים ו מיקרוגלייה מ C57BL/6 עכברים היו נגועים (מולי = 1:1) עם T. gondii RH yfp (ירוק) עבור 48 h, צ'יימברס תוקנו עם 1% הלגלט ומוכתם עם dapi (כחול). (ב) 3 x 104 אסטרוציטים ו מיקרוגלייה מ C57BL/6 עכברים היו נגועים (מולי = 5:1) עם T. cruzi Y עבור 96 h, ותאי היו קבועים עם מתנול טהור ומוכתם dapi (ירוק) ו-mab 2c2 אנטי Ssp-4 (כתום). התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

החשיבות של לימוד תאים גליאל מבודדים פונקציות בהקשרים ביולוגיים נפרדים התרחב בשני העשורים האחרונים. הבנה מעבר לנוירונים הוא עדיין תחום הולך וגדל בביולוגיה של התא, במיוחד תחת זיהומים או מצבים דלקתיים8,9,24. התאים glial חיוניים לא רק עבור הנוירונים תמיכה פיזית (כפי שהיה ידוע בעבר), אבל גם במצבים רבים אחרים פיסיולוגיים כגון אספקת אנרגיה תא העצב, neurometabolism, מעקב החיסונית, גיזום סינפטית, עיצוב ואפנון של הרקמה, בין אחרים3,25,26,27,28,29.

מאז אסטרוציטים ו מיקרוגלייה יכול להיות מאופנן במהלך זיהום או דלקת סטרילי, זה חשוב מאוד להבין את התפקיד היחיד והיחסי של התאים האלה גליה. למרות מיקרוגלייה ידועים לייצג את מערכת פגוציט מונמונומנט (MPS) ב-cn, אסטרוציטים יש גם תיאר כשחקן מרכזי התגובות החיסונית של ה-cn8. על מנת להשוות את התפקיד של כל קבוצת משנה גליה בהקשר של זיהום ו/או דלקת, זה הכרחי כדי להשיג אותם מפני החילוץ והתנאים. ישנם דיווחים מעטים על התגובות האפקטור של מיקרוגלייה ו אסטרוציטים לשלוט בזיהומים, במיוחד בנוגע לטפילים פרוטוזופן. במובן זה, לאחרונה הפגינו את הדרישה של NLRP3 דלקות לשליטה של T. cruzi שכפול ב מיקרוגלייה אבל לא אסטרוציטים על ידי מנגנון מעורבים תחמוצת החנקן (NO) הפרשה11.

פרוטוקול זה מתאר שיטה המתמקדת בו לחילוץ שני האוכלוסיות הנפוצות ביותר גליה תאים, אסטרוציטים ו microglia, מתוך לידה (עד 3 ימים-בן) עכברים. ניתן להשתמש בעכברים היילוד שגילם עולה על 3 ימים, אך אנו חווים כי התשואה של שני התאים פוחתת מעט לאורך זמן (הנתונים אינם מוצגים). השיטה שלנו שונה מפרוטוקולים שתוארו בעבר עבור אסטרוציטים או בידוד מיקרוגלייה כי התמקדנו בהשגת ובידוד שני סוגי התא באותו החילוץ, באותם תנאים, ובכך אופטימיזציה של השימוש בעלי חיים ניסיוניים ולשפר את המחקר של התפקיד היחסי עבור תאים אלה בהקשרים אימונולוגיים. יתר על כן, הפרוטוקול שלנו גם אופטימיזציה את התשואה של שני סוגי התא. התשואה היא בדרך כלל 3 – 5 x 106 אסטרוציטים ו 3 – 5 x 105 מיקרוגלייה לכל בקבוקון. להשוות את זה לפרוטוקולים אחרים היוצרים פחות תאים באמצעות בעלי חיים יותר עבור T-75 בקבוקון (כמה פרוטוקולים להשתמש 2 – 3 בעלי חיים לכל בקבוקון)30,31.

יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא הזמן הנדרש כדי לקבל מבודדים אסטרוציטים ו microglia. בתוך 14 ימים ניתן להשיג microglia בוגרת. למעשה, חשוב להדגיש כי, כמו flode ו קומבס הפגינו, מיקרוגלייה מבוגרים יותר 14 ימים להציג מופחתת היכולת להפריש ציטוקינים; חשוב מאוד לשקול זאת בהקשרים נוירואימונולוגיים30. למרות העובדה כי עושי בוגרים של אסטרוציט אינם מובנים לחלוטין, gfap משמש בעיקר כדי לאפיין תגובה ו astrocytes פעיל. פרוטוקולים מסוימים להשיג רמות של 90% GFAP תאים חיוביים רק לאחר 21 או 28 ימים של תרבות. מסיבה זו, אנו הציע שיטה שסיפקה, תאים שאינם מעוררי החיסונית ובוגרים בעיקר בתוך 7 – 14 ימים. למרות הטוהר יכול להיות נמוך יותר מאשר שיטות אחרות עבור שניהם אסטרוציט31 ו מיקרוגלייה30, המוקד העיקרי היה להשיג מיקרוגלייה ו אסטרוציטים בכמויות גדולות יותר בחילוץ במקביל. אנו מבינים שאוכלוסיות תאים יכולות להיות ממוינות או מבודדות עם הפרדת טור כדי לשפר את purities. בשביל זה, סמני תא נוספים עשויים להיכלל, כגון Iba1 או TMEM119 עבור microglia; אקופורטל 4 או S100B עבור astrocytes, CC1 או O4 עבור oligodendrocytes הפוך ו neun עבור נוירונים22,31,32,33. עם זאת, יש לשקול אובדן תאים חשוב בסוף הפרוטוקול.

כך, סיפקנו שיטה ששונתה במקביל להשיג מיקרוגלייה ו אסטרוציטים בפרוטוקול יעיל וזול. כמו-כן, פרוטוקול זה מספק את היתרונות של תשואה רבה המאפשרת את המחקרים השוואתיים של קבוצות משנה של גליאל בהקשרים נוירולוגיים, כפי שמודגם כאן במהלך ההידבקות בנגיף ה- t. cruzi ו -t. gondii .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

היינו רוצים להודות לפרופסור ד ר רנאטו A. Mortara מהאוניברסיטה הפדרלית של סאו פאולו (UNIFESP) עבור mAb 2C2 אנטי-Ssp-4. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים מפונדסאו דה Amparo à Pesquisa do Estado דה סאו פאולו (FAPESP, להעניק 2017/25942-0 ל K.R.B.), Conselho הלאומי דה Desenvolvimento Cientfico e Tecnológico (CNPq, להעניק 402100/2016-6 ל K.R.B.), המכון הלאומי לצ דה ווקאינאס דה ואקנאס (בטלוויזיה/CNPq) וכורדניצ דה אפרטפייטןדה פאויאל מעולה (שכמיות, מימון קוד 001). M.P.A. מקבל מלגת CNPq, A.L.O.P. מקבל האחווה מ שכמיות, ו-I. S. F ו L.Z.M.F.B. מקבל מלגת מ FAPESP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol Dinâmica Química Contemporânea Cat: 2231 Sterilize
75 cm2 Flask Corning Cat: 430720U Plastic material
96 well cell culture plate Greiner Cellstar Cat: 655090 Cell culture
Ammonium Chloride (NH4Cl) Dinâmica Química Contemporânea Cat: C10337.01.AH Remove autofluorescence
Anti-GFAP antibody Abcam Cat.: ab49874 Immunofluorescence antidoby
Bottle Top Filter 0.22 μmm CA Corning Cat: 430513 Culture medium filter
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich Cat: A7906 FACS Buffer preparation
CD11b (FITC) BD Pharmigen Cat.: 553310 Flow cytometry antibody
CD45 (PE) Invitrogen Cat.: 12-0451-83 Flow cytometry antibody
Centrifuge Eppendorf Cat: 5810R Centrifugation
Centrifuge Eppendorf 5415R Centrifugation
Class II biosafety cabinet Pachane Cat: 200 Biosafety cabinet for sterile procedures
CO2 Incubator ThermoScientific Model: 3110 Primary cells maintenance
Conical tubes 15 mL Corning Cat: 430766 Plastic material
Conical tubes 50 mL Corning Cat: 352070 Plastic material
Countess automated cell counter Invitrogen Cat: C10281 Cell counter
DAPI Invitrogen Cat.: D1306 Immunofluorescence antidoby
Digital Microscope Camera Nikon Cat: DS-RI1 Capture images on microscope
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco Cat: 12800-058 Cell culture medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich Cat: E9884 FACS Buffer preparation
F12 Nutrient Mixture Gibco Cat: 21700-026 Cell culture medium
FACS Canto II BD Biosciences Unavaiable Flow cytometer
Fetal Bovine Serum (FBS) LGC Biotechnology Cat: 10-bio500-1 Cell culture medium supplement
Flow Jo (software) Flow Jo Version: Flow Jo_9.9.4 Data analysis
Fluorescence intenselight Nikon Cat: C-HGFI Fluorescence source
GFAP (APC) Invitrogen Cat.: 50-9892-82 Flow cytometry antibody
Goat - anti-mouse IgG (FITC) Kirkeegood&Perry Lab (KPL) Cat.: 172-1806 Immunofluorescence antidoby
HBSS - Hank's Balanced Salt Solution Gibco Cat: 14175079 Cell culture medium
HEPES Sigma Aldrich Cat: H4034 Cell culture medium supplement
IC Fixation Buffer Invitrogen Cat: 00-8222-49 Cell fixation for Flow Citometry
Inverted microscope Nikon Model: ECLIPSE TS100 Microscope
Isoflurane Cristália Cat: 21.2665 Inhaled anesthetic
Methanol Synth Cat: 01A1085.01.BJ Fixation for Immunofluorescence
Micro spatula ABC stainless Unavaiable Surgical material
Microtube 1.5 mL Axygen Cat: MCT-150-C Plastic material
Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 Non commercial Non commercial Immunofluorescence antidoby
Multichannel Pipette (p200) Corning Cat: 751630124 Pipette reagents
NIS Elements Software Nikon Version 4.0 Acquire and analyse images
Non-fat milk Nestlé Cat: 9442405 Blocking solution for immunofluorescence
Orbital Shaker Incubator ThermoScientific Model: 481 Cat: 11 Dissociate microglia from astrocytes
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich Cat: P6148 Fixation for Immunofluorescence
PBS Non commercial Non commercial Neutral Buffer
Penicillin G Sigma Aldrich Cat: P-7794 Cell culture medium supplement
Permeabilization Buffer (10x) Invitrogen Cat: 00-8333-56 Cell permeabilization for Flow Citometry
Petri dish 60 mm x 15 mm (Disposable, sterile) Prolab Cat: 0303-8 Plastic material
pH meter Kasvi K39-1014B Calibrate pH solution
RPMI 1640 Medium Gibco Cat: 31800-014 Cell culture medium
Scissors ABC stainless Cat: LO9-W4 Surgical material
Serological pipette 10 mL Corning Cat: 4101 Plastic material
Serological pipette 5 mL Corning Cat: 4051 Plastic material
Single Channel Pipette (p1000) Gilson Pipetman Cat: F123602 Pipette reagents
Single Channel Pipette (p200) Gilson Pipetman Cat: F123601 Pipette reagents
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich Cat: S6297 Cell culture medium supplement
Streptomycin sulfate salt Sigma Aldrich Cat: S9137 Cell culture medium supplement
Triton X-100 Sigma Aldrich Cat: T9284 Permeabilization for immunofluorescence
Trypsin Gibco Cat: 27250-018 Digestive enzyme
Tweezers ABC stainless Cat: L28-P4-172 Surgical material
Water Bath Novatecnica Model: 09020095 Digeste tissue at 37 °C with trypsin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
  2. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  3. Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
  4. Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
  5. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
  6. Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
  7. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  8. Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
  9. Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
  10. Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
  11. Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
  12. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
  13. Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
  14. Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
  15. Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
  16. Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
  17. Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
  18. Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
  19. Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
  20. Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
  21. Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  23. Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
  24. Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
  25. Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
  26. Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
  27. Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
  28. Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
  29. Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
  30. Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
  31. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
  32. Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
  33. Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 157 התאים גליה אסטרוציטים microglia זיהום פרוטותים t. cruzi t. gondii
בידוד הראשוני של אסטרוציטים ומיקרוגליה לזיהום טפיל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., More

Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., de Farias, I. S., Bottino, L. Z. M. F., Bortoluci, K. R. Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection. J. Vis. Exp. (157), e60680, doi:10.3791/60680 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter