Summary
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di istruire come estrarre, mantenere e dissociare le cellule di astrocite e microglia dal sistema nervoso centrale, seguite da infezione da parassiti protozoi.
Abstract
Gli astrociti e la microglia sono le cellule gliali più abbondanti. Sono responsabili del supporto fisiologico e del mantenimento dell'omeostasi nel sistema nervoso centrale (SNC). Le crescenti prove del loro coinvolgimento nel controllo delle malattie infettive giustificano l'interesse emergente per il miglioramento delle metodologie per isolare gli astrociti primari e le microglia al fine di valutare le loro risposte alle infezioni che colpiscono il SNC. Considerando l'impatto dell'infezione da Trypanosoma cruzi (T. cruzi) e Toxoplasma gondii (T. gondii) nel SNC, qui forniamo un metodo per estrarre, mantenere, dissociare e infettare gli astrociti murini e le cellule di microglia con parassiti del protozoico. Le cellule estratte dalle cortice neonatali sono mantenute in vitro per 14 giorni con sostituzione periodica dei supporti differenziali. Gli astrociti e le microglie si ottengono dallo stesso protocollo di estrazione per dissociazione meccanica. Dopo la fenotipizzazione per citometria di flusso, le cellule vengono infettate da parassiti di protozoi. Il tasso di infezione è determinato dalla microscopia a fluorescenza in diversi punti temporali, consentendo così la valutazione della capacità differenziale delle cellule gliali di controllare l'invasione e la replicazione dei protozoi. Queste tecniche rappresentano metodi semplici, economici ed efficienti per studiare le risposte di astrociti e microglia alle infezioni, aprendo il campo per ulteriori analisi della neuroimmunologia.
Introduction
Il CNS è composto principalmente da neuroni e cellule gliali1,2,3. Microglia e astrociti sono le cellule glia più abbondanti nel SNC. La microglia, il macrofago residente, è l'immunocompetente e la cella glia fagocitica nel CNS3,4, mentre gli astrociti sono responsabili del mantenimento dell'omeostasi ed esercitano funzioni di supporto5.
Nonostante le cellule gliali siano classicamente note per essere responsabili del supporto e della protezione dei neuroni6,7, funzioni emergenti di queste cellule sono state descritte nella letteratura recente, comprese le loro risposte alle infezioni8,9,10,11. Quindi, c'è una spinta a sviluppare metodi per isolare queste cellule gliali per comprendere le loro funzioni individualmente.
Ci sono alcuni modelli alternativi per studiare le cellule gliali piuttosto che le colture primarie, come le linee cellulari immortalate e i modelli in vivo. Tuttavia, le cellule immortalate hanno maggiori probabilità di subire la deriva genetica e i cambiamenti morfologici, mentre gli studi in vivo impongono condizioni di manipolazione limitate. Al contrario, le colture primarie sono facili da gestire, assomigliano meglio alle cellule in vivo e ci permettono anche di controllare i fattori sperimentali12,13. Qui, descriviamo le linee guida su come estrarre, mantenere e dissociare gli astrociti murini e le cellule primarie della microglia nello stesso protocollo. Inoltre, forniamo anche esempi su come lavorare con l'infezione da protozoi in queste culture.
Le cellule del SNC estratte da topi neonatale (fino a 3 giorni) sono state coltivate per 14 giorni su supporti differenziali che consentono la crescita preferenziale di astrociti e cellule di microglia. Poiché le microglie riposano sopra gli astrociti attaccati, le popolazioni cellulari sono state dissociate meccanicamente in un'incubatrice orbitale. Successivamente, abbiamo raccolto tutti i supernatant contenenti microglia e aggiunto la prova per staccare gli astrociti. Le cellule gliali isolate sono state valutate fenotipicamente dalla citometria di flusso e placcate secondo l'esperimento desiderato.
Abbiamo anche fornito esempi su come infettare queste microglia isolate e astrociti con parassiti protozoi. T. gondii è un protozoo altamente neurotropico responsabile della toxoplasmosi14, mentre T. cruzi è responsabile della malattia di Chagas che può portare allo sviluppo di disturbi neurologici nel CNS15,16. Inoltre, è stato anche riferito che l'infezione da T. gondii17,18 o T. cruzi19,20,21 erano la presunta causa di morte nei pazienti immunocompromessi. Pertanto, il chiarimento del ruolo immunologico delle cellule gliali dal SNC nel controllo delle infezioni da protozoo è di grande importanza.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono i topi sono state eseguite in conformità alla legge nazionale brasiliana (11.794/2008) e approvate dai Comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università Federale di San Paolo (UNIFESP).
1. Estrazione, manutenzione e dissociazione delle cellule gliali
NOTA: Il numero di topi utilizzati per l'estrazione delle cellule gliali dipende dalla quantità di cellule necessarie per eseguire gli esperimenti desiderati. In questo protocollo, un totale di 2,7 x 107 astrociti e 4 x 106 microglia sono stati ottenuti da sei topi neoiatiC57BL/6. Tutte le procedure sono state eseguite in condizioni sterili in un mobile di biosicurezza di classe II.
- Giorno 1
- Preparare la soluzione di sale equilibrato di Hank puro (HBSS) e HBSS - 10% del siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS) (vedere Tabella dei materiali).
- Preparare il Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 (10% FBS - 0,08 mM Penicillin , 0,09 mM Streptomycin , 12,5 mM HEPES , 30 mM di bicarbonato di sodio, pH 7,2) e filtrarlo con un filtro da0,22 m (cfr.
NOTA: Tutti i supporti di coltura devono essere conservati a 4 gradi centigradi, ma è necessario preriscaldarli a 37 gradi centigradi per 20 min prima di iniziare l'esperimento. - Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici (forbici, spatole e pinzette) in un'autoclave e utilizzare il 70% di etanolo durante la procedura.
- Mettere i neonati (fino a 3 giorni) topi in una camera sigillata contenente cotone imbevuto di isoflurane per 5 min per l'anestesia profonda.
- Spruzzare il cucciolo di topo con il 70% di etanolo e decapitare l'animale con le forbici.
- Fare taglio sagittale (posteriore a anteriore) con le forbici lungo il cranio per aprirlo ed esporre il cervello. Separare il cranio dal cervello con una pinzetta. Rimuovere il cervello utilizzando una micro spatola per mantenere l'integrità del cervello.
- Collocare il cervello in un piatto Petri secco (6 cm di diametro). Rimuovere il bulbo olfattivo e il cervelletto utilizzando una micro spatola. Spostare la corteccia in un'altra parabola Petri (6 cm di diametro) contenente HBSS - 10% FBS (2 mL /piatto Petri).
- Tagliare il tessuto cerebrale in piccoli pezzi con forbici sterili e utilizzando un trasferimento p1000 micropipette ogni tessuto cerebrale con HBSS - 10% FBS a diversi tubi conici da 15 mL. Assicurarsi che il volume finale sia di 2 mL/tubo. In caso contrario, completare con HBSS - 10% FBS.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. In tal caso, i tubi conici con tessuto SNC devono essere posizionati sul ghiaccio fino a 1 h. - Lavare il tessuto cerebrale tagliato con 3 mL di HBSS - 10% FBS (per tubo) e dopo la decantazione. Rimuovere con attenzione il super-natante. Ripetere questo passaggio 3 volte.
NOTA: Questo passaggio ha lo scopo di rimuovere i detriti e di recuperare il tessuto estratto. - Lavare il tessuto cerebrale tagliato con 3 mL di HBSS puro (per tubo) e dopo la decantazione, rimuovere con attenzione il supernatante. Ripetere questo passaggio 3 volte.
NOTA: Questo passaggio ha lo scopo di rimuovere il siero rimanente dai fumi precedenti, poiché le cellule verranno pipsinizzate nel passaggio successivo. - Aggiungere 3 mL di cipina per tubo e mettere in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 30 min, scuotendo delicatamente i tubi ogni 5 min. Evitare le bolle invertendo o mescolando bruscamente i tubi.
NOTA: Questo passaggio ha lo scopo di digerire il tessuto raccolto. - Per disattivare la metapsina, lavare il tessuto con 3 mL per tubo di HBSS - 10% FBS e, dopo la decantazione del tessuto, rimuovere con attenzione il supernatante. Ripetere questo passaggio 3 volte.
- Lavare il tessuto con 3 mL per tubo di HBSS puro e rimuovere con cura il supernatante. Ripetere questo passaggio 2 volte.
- Aggiungere 7 mL per tubo di HBSS puro e omogeneizzare il tessuto attraverso passaggi successivi nelle pipette: prima con la pipetta sierologica da 10 mL, seguita da 5 mL e infine con la micropipetta p1000.
- Dopo l'omogeneizzazione, centrifugare i tubi a 450 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
- Scartare il supernatante e risospendere il pellet con 4 mL di HBSS - 10% FBS per tubo.
- Trasferire le cellule a un pallone T-75 pretrattato per una coltura cellulare ottimale (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Elaborare il tessuto di ogni animale per fiaschetta. - Collocare il pallone nell'incubatrice a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per 30 min per l'aderenza.
- Aggiungere 10 mL di DMEM/F12 integrati per fiaschetta e incubare a 37 gradi centigradi e 5% di CO2.
NOTA: il volume finale è di 14 mL per fiaschetta.
- Giorno 3
- Rimuovere 7 mL di supporto di coltura dal flacone T-75 e aggiungere 7 mL di Fresco integrato DMEM/F12.
NOTA: I flaconi conterranno un sacco di detriti cellulari e un aspetto nuvoloso.
- Rimuovere 7 mL di supporto di coltura dal flacone T-75 e aggiungere 7 mL di Fresco integrato DMEM/F12.
- Giorno 5
- Rimuovere tutto il supporto dal flacone T-75 e aggiungere 14 mL di Fresco integrato DMEM/F12.
NOTA: Il supporto viene sostituito dai flaconi per rimuovere i detriti e le cellule non aderenti. - Dopo ogni 48 h, rimuovere 6 mL del supernatante e aggiungere 7 mL di fresco integrato DMEM/ F12 medio fino al giorno 14 di coltura.
- Rimuovere tutto il supporto dal flacone T-75 e aggiungere 14 mL di Fresco integrato DMEM/F12.
- Giorno 14
- Dopo aver rimosso 6 mL del supernatante e aver aggiunto 7 mL di fresco supporto DMEM/F12 integrato, chiudere i flaconi T-75 saldamente.
- Mettetele nello shaker orbitale a 200 giri/min e 37 gradi durante la notte per dissociare meccanicamente la microglia dagli astrociti.
- Giorno 15
- Prendi i flaconi dallo shaker e lavegliali vigorosamente con il proprio mezzo per ottimizzare la dissociazione cellulare e raccogliere il numero massimo di microglia. Quindi, raccogliere il supernatante (contenente microglia) e trasferire in un tubo conico 50 mL.
- Aggiungere quindi 4 mL di ciuffo in ogni pallone e incubare per 5 min a 37 gradi centigradi per staccare gli astrociti.
- Aggiungere 5 mL per fiaschetta di DMEM/F12 integrato per disattivare la trypsin. Lavare i flaconi con il proprio mezzo e trasferire il contenuto in un tubo conico da 50 mL.
- Centrifuga tutti i tubi contenenti microglia dissociata e astrociti a 450 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
- Scartare il super-attardato. Risospendere il pellet di microglia in 1 mL e gli astrociti in 10 mL di DMEM/F12 integrati.
- Procedere al conteggio cellulare in una camera Neubauer o in un contatore cellulare automatico. Piastrare le cellule con DMEM/F12 integrato alla densità desiderata in una piastra di coltura cellulare piatta appropriata (pretrattata per l'attacco ottimale delle cellule; vedere Tabella dei materiali). Incubano le cellule a 37 e il 5% di CO2 per 24 h per consentire loro di attaccarsi.
NOTA: Riserva 1,5 x 106 di ogni popolazione cellulare per confermare la loro purezza dalla citometria di flusso. - Eseguire un'analisi citometrica del flusso per verificare la purezza delle popolazioni di cellule.
NOTA: Consideriamo microglia CD11b-/CD45-/GFAP- e astrociti CD11b-/CD45-/GFAP. Le colorazione Iba1 e TMEM119 potrebbero essere prese in considerazione al fine di caratterizzare appieno la microglia22. - Aggiungere un FMO (Fluorescence Minus One)23 e un campione incontaminato per ogni popolazione cellulare (astrociti e microglia) come controlli dell'analisi della citometria di flusso.
- Per ogni popolazione cellulare, riserva 5 x 105 celle per ogni campione macchiato e non colorato. Per FMO, riservare altri due tubi di microglia contenenti 2,5 x 105 celle ciascuno e riservare anche un altro tubo di 5 x 105 astrociti.
NOTA: Poiché i numeri di microglia possono essere un fattore limitante, è possibile utilizzare meno cellule per i controlli non statuati e FMO. - Centrifugare tutti i microtubi a 450 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente il pellet con 500 s/microtube di Tampone FACS (salina con buffer fosfato (PBS) - 0,5% di albumina di siero bovino (BSA) - 2 mM EDTA, pH 7.2).
- Centrifugare tutti i microtubi a 450 x g a 4 gradi centigradi per 5 min. Scartare il supernatante e sospendere il pellet con 100 l/microtube di anti-CD16/CD32 (clone 93) (1:50) diluito nel buffer FACS. Incubare per 10 min a temperatura ambiente.
- Aggiungere 500 l/microtubo di TAC buffer in tutti i microtubi e centrifugare a 450 x g a 4 gradi centigradi per 5 min. Scartare il supernatante. Risospendere gli astrociti e i tubi di colorazione delle microglie e anche il tubo FMO astrocito con 50 sl/microtubi di miscela di marcatori di superficie: anti-CD45 (PE, clone 30-F11) e anti-CD11b (eFluor 450, clone M1/70) (entrambi diluiti a 1: 100 nel buffer FACS).
- Per le celle non colorate, risospendere con lo stesso volume di buffer FACS. Per la microglia FMO, incubare ogni tubo di microglia con anti-CD45 o anti-CD11b. Incubare tutti i campioni a 4 gradi centigradi per 20 min al buio.
- Aggiungete 500 l di buffer FACS per microtubo. Centrifuga a 450 x g a 4 gradi centigradi per 5 min. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente il pellet con 100 l/microtubo di buffer di fissaggio (vedi Tabella dei materiali)per 20 min a temperatura ambiente al buio.
- Aggiungete 500 l/microtubo di buffer permeabilizzazione 1x (vedi Tabella dei materiali)e incubate a 4 gradi centigradi per 5 min al buio.
- Centrifugare tutti i microtubi a 450 x g a 4 gradi centigradi per 5 min. Scartare il supernatante. Risospendere gli astrociti e i tubi di colorazione delle microglie e anche i tubi FMO microglia con 50 tubi di anticorpo intracellulare anti-GFAP (APC, clone GA5) in un 1:100 di diluizione in 1x tampone permeabilizzazione. Per le cellule incontaminate e l'Astrocyte FMO, risospendere le cellule con lo stesso volume di buffer FACS. Incubare tutti i campioni a 4 gradi centigradi per 30 min al buio.
- Lavare tutti i tubi aggiungendo 500 l/microtubi di 1x tampone permeabilizzazione. Centrifugare tutti i microtubi a 450 x g, per 5 min a 4 gradi centigradi. Risospendere ogni microtubo in 200 l di tampone FACS. Acquisire 1 x 105 eventi/campione sul citometro di flusso.
- Per l'analisi, le celle devono essere gated prima su CD11b x CD45 e poi istogramma GFAP.
NOTA: i controlli Untined e FMO sono utili per determinare i gate.
2. Infezione e valutazione dei tassi di infezione
- Infezione delle cellule gliali con T. gondii
- Piastra 3 x 104 microglia o astrociti con DMEM/F12 integrato a 37 gradi centigradi e 5% di CO2 per 24 h in una piastra piatta pretrattata di 96 pozze (vedi Tabella dei materiali).
- Infettare ogni popolazione cellulare con tachizoiti da T. ceppo gondii RH che esprime proteine fluorescenti gialle (YFP) a una molteplicità di infezione (MOI) di 1:1 (parassita:cellulare) diluita in 200 gradi centigradi di RPMI (3% FBS - 0,16 mM Penicillina - 0,18 mM Streptomycin - 12,5 mM HEPES - bicarbonabidi bicarbonato di 30 m pH 7.2) (vedere Tabella dei materiali). Incubare a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per 48 h.
- Quindi, scartare il supernatante e fissare le cellule aggiungendo 100 l/podi di 1% di paraformaldeide (PFA) diluiti in PBS a 4 gradi centigradi per 24 h.
- Sostituire l'PFA con 100 gradi l/pozzetto di PBS a pH 7.2.
- Rimuovere con cura i nuclei delle cellule sovralimentate e macchiate con il pipettaggio di 50 gradi di DAPI (5 mg/mL) diluito in PBS pH 7.2 (1:1.000) per 1 min a temperatura ambiente al buio.
- Sostituire la soluzione di colorazione DAPI con 100 l/pozzelle di PBS (pH 7.2) e analizzarla mediante microscopia a fluorescenza.
- Infezione delle cellule gliali con T. cruzi
- Piastra 3 x 104 microglia o astrociti con DMEM/F12 integrato a 37 gradi centigradi e 5% di CO2 per 24 h in una piastra piatta pretrattata di 96 pozze (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: Per ogni punto di infezione, utilizzare una piastra diversa. - Infettare le cellule gliali con ceppo di T. cruzi Y a un MOI di 5:1 (parassiti:cellula) diluito in 200 /l/po di RPMI integrato e incubare a 37 e 5% DI CO2 per 2 h.
NOTA: Questo passaggio è importante per l'invasione cellulare da parte del parassita. - Rimuovere tutti i supernatali e lavare i pozzetti aggiungendo 200 l/po di RPMI integrato per rimuovere tutti i parassiti extracellulari. Rimuovere il supernatante e aggiungere 200 s/po di RPMI fresco integrato.
NOTA: Questo passaggio intende rimuovere tutti i parassiti che non hanno invaso le cellule aderenti. - Incubare cellule infette per 2 h, 48 h e 96 h per valutare la replicaZione T. cruzi nelle cellule gliali11.
- Dopo ogni time point, rimuovere il supernatante e fissare le celle con 100 l/po di metanolo per 15 min a temperatura ambiente, quindi sostituire il metanolo con 100 l/po di PBS (pH 7.2).
- Dopo la fissazione, preparare le cellule per l'immunofluorescenza assay come segue.
- Per evitare l'autofluorescenza, trattare le cellule con 100 S/h di 50 mM NH4Cl diluito in PBS (pH 8.0) per 15 m. Lavare le cellule aggiungendo 100 l/pozze di PBS e rimuoverle immediatamente (ripetere questo passaggio 3 volte).
- Successivamente, permeabilizzare le celle aggiungendo 100 L/pozzetto di 0,5% Triton diluito in PBS per 15 min.
- Quindi, incubare la coltura cellulare con 100 l/po di soluzione di blocco (5% di latte non grasso , 2% BSA diluito in PBS [pH 7.2]) per 1 h a temperatura ambiente. Lavare le cellule aggiungendo 100 l/po di PBS e rimuoverlo immediatamente (ripetere questo passaggio 3 volte).
- Al fine di macchiare gli amastigoti, incubare con 30 l/po di anticorpo monoclonale non commerciale (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 (1:200) diluito in soluzione di blocco per 1 h a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule aggiungendo 100 l/po di PBS e rimuoverlo immediatamente (ripetere questo passaggio 3 volte). Incubare la piastra con 30 l/po di anticorpo antito-tono secondario (1:500) diluito in PBS per 1 h a temperatura ambiente.
NOTA: La proteina non commerciale mAb 2C2 anti-Ssp-4 era un dono gentile del Prof. - Rimuovere con cura i nuclei del sovratalterra e delle macchie aggiungendo 50 l/po di DAPI (5 mg/mL) diluito in PBS pH 7.2 (1:1,000) per 1 min a temperatura ambiente al buio.
- Sostituire la soluzione di colorazione DAPI con 100 l/pozzelle di PBS pH 7.2 e analizzarla mediante microscopia a fluorescenza.
- Piastra 3 x 104 microglia o astrociti con DMEM/F12 integrato a 37 gradi centigradi e 5% di CO2 per 24 h in una piastra piatta pretrattata di 96 pozze (vedi Tabella dei materiali).
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Representative Results
Il giorno14, la coltura delle cellule gliali (Figura 1A) ha subito una dissociazione meccanica. Le popolazioni di cellule isolate sono state analizzate dalla citometria di flusso secondo i marcatori CD11b, CD45 e GFAP. Potremmo osservare una purezza dell'89,5% per la popolazione di astrociti e del 96,6% per lapopolazionedi microglia ( Figura 1B). Dopo l'isolamento, le cellule sono state placcate in una piastra piatta di 96 pozzetti e dopo 24 h erano pronte per essere infettate da T. cruzi o T. gondii secondo i rispettivi protocolli di infezione. Qui abbiamo fornito un'infezione del corso temporale di T. cruzi come esempio di valutazione del tasso di infezione in queste cellule gliali.
Gli astrociti e le microglie (3 x 104 cellule/pozzo) sono stati infettati da T. cruzi al MOI - 5:1 (parassiti:cellule) per 2-96 h(Figura 2). Il tasso di infezione è stato valutato dall'immunofluorescenza contando il numero di cellule e il numero di parassiti macchiati con un intercalatore di DNA (DAPI). In breve, potremmo osservare che T. cruzi è in grado di invadere microglia e astrociti a tassi simili. Inoltre, T. cruzi si replica in entrambi i tipi di cellule, raggiungendo il più alto tasso di infezione a 96 h post infezione (p.i.). È interessante notare che, a 96 h p.i. il tasso di infezione è più pronunciato negli astrociti che in microglia, suggerendo che le cellule di microglia sono in grado di controllare la replicazione dei parassiti in modo più efficiente rispetto agli astrociti, come abbiamo descritto in precedenza11.
È importante notare che l'uso di parassiti geneticamente modificati che esprimono reporter fluorescenti o parassiti etichettati con specifici anticorpi fluorescenti potrebbe migliorare la microscopia dell'immunofluorescenza, poiché sono meglio distinti dal nucleo cellulare (Figura 3). Inoltre, il tasso di infezione dei parassiti fluorescenti può essere determinato da altre tecniche come la citometria di flusso. Qui abbiamo fornito esempi di ceppo T. gondii RH che esprime esclusivamente YFP (Figura 3A) e T. cruzi Y ceppo macchiato con non-commerciale mAb 2C2 anti-Ssp-4 proteina (Figura 3B).
Complessivamente, questo protocollo descrive come estrarre, mantenere, dissociare e infettare microglia murine e astrociti cellule primarie, che potrebbe essere un potente strumento per studiare, ad esempio, le risposte immunitarie delle cellule gliali all'infezione da protozoi come brevemente chiarito Qui.
Figura 1: astrociti primari e microglia. (A) Le immagini delle cellule gliali murine C57BL/6 al14esimo giorno di coltura sono state ottenute al microscopio invertito (400x). La freccia rossa indica lo strato di astrociti e la freccia nera indica la microglia. (B) Dopo la dissociazione meccanica, gli astrociti e le microglie sono stati macchiati (5 x 105 cellule) con anti-CD11b fluorescente, anti-CD45 e anti-GFAP e valutati dalla citometria di flusso (1 x 105 cellule di acquisizione). Gli astrociti sono considerati come cellule CD11b-/CD45- e GFAP, mentre le microglia sono CD11b , /CD45 e GFAP. + ++ Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Decorso temporale dell'infezione da T. cruzi nelle cellule gliali. Gli astrociti e la microglia dei topi C57BL/6 sono stati infettati da T. cruzi Y (MOI - 5:1). Dopo 2 h, 48 h e 96 h, le camere sono state fissate con metanolo e macchiate con marcatore nucleo cellulare DAPI (blu) e anti-GFAP (rosso). Le immagini sono state ottenute al microscopio a fluorescenza invertita (400x). Il numero di amastigoti all'interno delle cellule e la frequenza delle cellule infette sono stati valutati dal software al microscopio a fluorescenza (vedi Tabella dei materiali). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Astrociti e infezione da microglia con parassiti protozoi fluorescenti. (A) 3 x 104 astrociti e microglia da topi C57BL/6 sono stati infettati (MOI - 1:1) con T. gondii RH YFP (verde) per 48 h, le camere sono state fissate con 1% PFA e macchiate con DAPI (blu). (B) 3 x 104 astrociti e microglia da topi C57BL/6 sono stati infettati (MOI - 5:1) con T. cruzi Y per 96 h, e le camere sono state fissate con metanolo puro e macchiate con DAPI (verde) e mAb 2C2 anti-Ssp-4 (arancione). Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'importanza di studiare le funzioni isolate delle cellule gliali in contesti biologici distinti si è espansa negli ultimi due decenni. Comprendere il CNS al di là dei neuroni è ancora un campo in crescita nella biologia cellulare, soprattutto in infezioni o condizioni infiammatorie8,9,24. Le cellule gliali sono cruciali non solo per i neuroni supporto fisico (come era precedentemente noto), ma anche in molte altre situazioni fisiologiche come l'approvvigionamento energetico del neurone, neurometabolismo, sorveglianza immunitaria, potatura sinaptica, modellazione e modulazione del tessuto, tra gli altri3,25,26,27,28,29.
Poiché gli astrociti e le microglie possono essere modulati in modo differenziale durante l'infezione o l'infiammazione sterile, è di grande importanza comprendere il ruolo individuale e relativo di queste cellule gliali. Anche se le microglia sono note per rappresentare il sistema di fagocite mononucleare (MPS) nel SNC, gli astrociti sono stati descritti anche come un giocatore cardine nelle risposte immunitarie del SNC8. Al fine di confrontare il ruolo di ogni sottoinsieme gliale nel contesto dell'infezione e/o dell'infiammazione, è obbligatorio ottenerli dalla stessa estrazione e dalle stesse condizioni. Ci sono poche segnalazioni sulle risposte degli effetti di microglia e astrociti per controllare le infezioni, soprattutto per quanto riguarda i parassiti protozoi. In questo senso, abbiamo recentemente dimostrato il requisito di NLRP3 infiammabile al controllo della replica T. cruzi in microglia, ma non in astrociti da un meccanismo che coinvolge la secrezione di ossido nitrico (NO)11.
Questo protocollo descrive un metodo che si concentra sull'estrazione simultanea delle due popolazioni di cellule gliali più abbondanti, astrociti e microglia, da topi postnatali (fino a 3 giorni fa). I topi neonati di età superiore ai 3 giorni possono essere utilizzati, ma abbiamo sperimentato che la resa di entrambe le cellule diminuisce leggermente nel tempo (dati non mostrati). Il nostro metodo differisce dai protocolli descritti in precedenza per l'isolamento degli astrociti o delle microglia perché ci siamo concentrati sull'ottenimento e l'isolamento di entrambi i tipi di cellule nella stessa estrazione, nelle stesse condizioni, ottimizzando così l'uso di animali sperimentali e migliorando il miglioramento dello studio del ruolo relativo per tali cellule nei contesti immunologici. Inoltre, il nostro protocollo ha anche ottimizzato la resa di entrambi i tipi di cellule. Il rendimento è di solito 3-5 x 106 astrociti e 3-5 x 105 microglia per fiaschetta. Confrontare questo con altri protocolli che si traducono in meno cellule utilizzando più animali per fiaschetta T-75 (alcuni protocolli utilizzano 2–3 animali per fiaschetta)30,31.
Un altro vantaggio di questo protocollo è il tempo necessario per ottenere astrociti isolati e microglia. Entro 14 giorni è possibile ottenere microglia matura. Infatti, è importante sottolineare che, come hanno dimostrato Flode e Combs, la microglia più vecchia di 14 giorni presenta una diminuita capacità di secernere delle citochine; è molto importante considerare questo nei contesti neuroimmunologici30. Nonostante il fatto che i produttori maturi per l'astrocito non siano completamente compresi, GFAP è ampiamente utilizzato per caratterizzare gli astrociti reattivi e attivi. Alcuni protocolli raggiungono livelli di 90% GFAP cellule positive solo dopo 21 o 28 giorni di coltura. Per questo motivo, abbiamo proposto un metodo che ha fornito, le cellule che sono immunoresponsive e per lo più mature entro 7-14 giorni. Anche se la purezza può essere inferiore rispetto ad altri metodi sia per l'astrocito31 che per la microglia30, l'obiettivo principale era quello di ottenere microglia e astrociti in quantità maggiori in un'estrazione concomitante. Comprendiamo che le popolazioni cellulari potrebbero essere ulteriormente ordinate o isolate con la separazione delle colonne per migliorare le loro purezze. Per questo, potrebbero essere inclusi marcatori cellulari aggiuntivi, come Iba1 o TMEM119 per la microglia; Aquaporina-4 o S100B per astrociti, CC1 o O4 per oligodendrociti e NeuN per neuroni22,31,32,33. Tuttavia, un'importante perdita di cellule alla fine del protocollo dovrebbe essere considerata.
Così, abbiamo fornito un metodo modificato per ottenere concomitante microglia e astrociti in un protocollo efficiente ed economico. Inoltre, questo protocollo offre i vantaggi di una grande resa che consente gli studi comparativi di sottoinsiemi gliali in contesti neuroimmunologici, come illustrato qui durante l'infezione da T. cruzi e T. gondii.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il professor Renato A. Mortara dell'Università Federale di San Paolo (UNIFESP) per mAb 2C2 anti-Ssp-4. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Fundao de Amparo à Pesquisa do Estado de San Paolo (FAPESP, sovvenzione 2017/25942-0 a K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient'fico e Tecnol'gico (CNPq, 402100/2016-6 a K.R.B.), Instituto Nacional de Ciància e De Vacinas (INCTV/CNPq) e Coordenao de Aperfei-oamento de Pessoal de N'vel Superior (CAPES, Codice Finanza 001). M.P.A. riceve una borsa di studio da CNPq, A.L.O.P. riceve borse di studio da CAPES, e I.S.F e L.M.F.B. riceve borse di studio da FAPESP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 μmm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat - anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS - Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10x) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60 mm x 15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 °C with trypsin |
References
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