Summary
El objetivo general de este protocolo es instruir cómo extraer, mantener y disociar las células de astrocitos murinoy y microglia del sistema nervioso central, seguida de una infección con parásitos protozoos.
Abstract
Los astrocitos y la microglia son las células gliales más abundantes. Son responsables del apoyo fisiológico y el mantenimiento de la homeostasis en el sistema nervioso central (SNC). Las crecientes evidencias de su participación en el control de enfermedades infecciosas justifican el interés emergente en la mejora de metodologías para aislar los astrocitos primarios y la microglia con el fin de evaluar sus respuestas a las infecciones que afectan al SNC. Teniendo en cuenta el impacto de la infección Trypanosoma cruzi (T. cruzi) y Toxoplasma gondii (T. gondii) en el SNC, aquí proporcionamos un método para extraer, mantener, disociar e infectar astrocitos murinos y células microglia con parásitos protozoos. Las células extraídas de cortices recién nacidos se mantienen in vitro durante 14 días con reemplazo diferencial periódico de medios. Los astrocitos y la microglia se obtienen del mismo protocolo de extracción por disociación mecánica. Después de fenotiar por citometría de flujo, las células se infectan con parásitos protozoos. La tasa de infección se determina mediante microscopía de fluorescencia en diferentes momentos, lo que permite la evaluación de la capacidad diferencial de las células gliales para controlar la invasión y replicación protozoaria. Estas técnicas representan métodos simples, baratos y eficientes para estudiar las respuestas de los astrocitos y la microglia a las infecciones, abriendo el campo para un análisis de neuroinmunología.
Introduction
El SNC se compone principalmente de neuronas y células gliales1,2,3. La microglia y los astrocitos son las células glias más abundantes del SNC. Microglia, el macrófago residente, es el inmunocompetente y la célula glia fagocítica en el SNC3,4, mientras que los astrocitos son responsables de mantener la homeostasis y ejercer funciones de apoyo5.
A pesar de que las células gliales son clásicamente conocidos por ser responsables del apoyo y la protección de las neuronas6,7, las funciones emergentes de estas células se han descrito en la literatura reciente, incluyendo sus respuestas a las infecciones8,9,10,11. Por lo tanto, hay un empujón para desarrollar métodos para aislar estas células gliales para entender sus funciones individualmente.
Existen algunos modelos alternativos para estudiar células gliales en lugar de cultivos primarios, como linajes celulares inmortalizados y modelos in vivo. Sin embargo, las células inmortalizadas son más propensas a sufrir cambios genéticos y morfológicos, mientras que los estudios in vivo imponen condiciones de manipulación limitadas. Por el contrario, los cultivos primarios son fáciles de manejar, se asemejan mejor a las células in vivo y también nos permiten controlar los factores experimentales12,,13. Aquí, describimos pautas sobre cómo extraer, mantener y disociar astrocitos murinos y células primarias de microglia en el mismo protocolo. Además, también proporcionamos ejemplos sobre cómo trabajar con la infección protozoa en estos cultivos.
Las células del SNC extraídas de ratones neonatales (hasta 3 días de edad) se cultivaron durante 14 días en medios diferenciales que permiten el crecimiento preferencial de astrocitos y células de microglia. Dado que la microglia descansa por encima de los astrocitos adjuntos, las poblaciones celulares se disociaron mecánicamente en una incubadora orbital. A continuación, recogimos todo el sobrenadante que contiene microglia y añadimos trippsina para separar los astrocitos. Las células gliales aisladas fueron evaluadas fenotípicamente por citometría de flujo y chapadas de acuerdo con el experimento deseado.
También proporcionamos ejemplos sobre cómo infectar a estas microglias aisladas y astrocitos con parásitos protozoos. T. gondii es un protozoo altamente neurotrópico responsable de la toxoplasmosis14,mientras que T. cruzi es responsable de la enfermedad de Chagas que puede conduce al desarrollo de trastornos neurológicos en el SNC15,,16. Además, también se ha informado de que la infección por T. gondii17,18 o T. cruzi19,20,21 fueron la causa presumible de muerte en pacientes inmunocomprometidos. Por lo tanto, el esclarecimiento del papel inmunológico de las células gliales del SNC en el control de las infecciones protozoarias es de gran importancia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los procedimientos experimentales relacionados con ratones fueron llevados a cabo de acuerdo con la Ley Nacional de Brasil (11.794/2008) y aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad Federal de Sao Paulo (UNIFESP).
1. Extracción, Mantenimiento y Disociación de Células Glial
NOTA: El número de ratones utilizados para la extracción de células gliales depende de la cantidad de células necesarias para realizar los experimentos deseados. En este protocolo, se obtuvieron un total de 2,7 x 107 astrocitos y 4 x 106 microglia de seis ratones C57BL/6 neonatales. Todos los procedimientos se realizaron en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad de clase II.
- Día 1
- Preparar la solución salina equilibrada (HBSS) y hbss de Hank pura + 10% del suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor (ver Tabla de materiales).
- Preparar el medio de águila modificado (DMEM) /F12 de Dulbecco complementado (10% FBS + 0,08 mM penicilina + 0,09 mM de estreptomicina + 12,5 mM HEPES + 30 mM de bicarbonato sódico, pH 7,2) y filtrarlo con un filtro de 0,22 mM (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Todos los medios de cultivo deben almacenarse a 4 oC, pero es necesario precalentarlos a 37 oC durante 20 minutos antes de iniciar el experimento. - Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos (tijeras, espátulas y pinzas) en un autoclave y utilice 70% de etanol durante el procedimiento.
- Coloque ratones recién nacidos (hasta 3 días de edad) en una cámara sellada que contenga algodón empapado con isoflurano durante 5 minutos para una anestesia profunda.
- Rocíe el cachorro de ratón con 70% de etanol y decapita al animal con tijeras.
- Hacer corte sagital (de adelante a anterior) con tijeras a lo largo del cráneo para abrirlo y exponer el cerebro. Separe el cráneo del cerebro usando pinzas. Retire el cerebro usando una micro espátula para mantener la integridad del cerebro.
- Coloque el cerebro en una placa De Petri seca (6 cm de diámetro). Retire la bombilla olfativa y el cerebelo con una micro espátula. Mueva la corteza a otra placa de Petri (6 cm de diámetro) que contenga HBSS + 10% FBS (2 mL/Petri dish).
- Cortar el tejido cerebral en trozos pequeños con tijeras estériles y usando una micropipeta p1000 transferir cada tejido cerebral con HBSS + 10% FBS a diferentes tubos cónicos de 15 ml. Asegúrese de que el volumen final es de 2 ml/tubo. Si no es así, complete con HBSS + 10% FBS.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Si es así, los tubos cónicos con tejido sNC deben colocarse en hielo hasta 1 h. - Lavar el tejido cerebral cortado con 3 ml de HBSS + 10% FBS (por tubo) y después de la decantación. Retire con cuidado el sobrenadante. Repita este paso 3 veces.
NOTA: Este paso tiene como objetivo eliminar los desechos y recuperar el tejido extraído. - Lavar el tejido cerebral cortado con 3 ml de HBSS puro (por tubo) y después de la decantación, retirar cuidadosamente el sobrenadante. Repita este paso 3 veces.
NOTA: Este paso tiene como objetivo eliminar el suero restante de los lavados anteriores, ya que las células se trippsinizarán en el siguiente paso. - Añadir 3 ml de trippsina por tubo y colocar en un baño de agua a 37 oC durante 30 minutos, agitando suavemente los tubos cada 5 minutos. Evitar burbujas invirtiendo o mezclando abruptamente los tubos.
NOTA: Este paso tiene como objetivo digerir el tejido recogido. - Para desactivar la tripsina, lave el tejido con 3 ml por tubo de HBSS + 10% FBS y, después de la decantación del tejido, retire cuidadosamente el sobrenadante. Repita este paso 3 veces.
- Lavar el tejido con 3 ml por tubo de HBSS puro y retirar cuidadosamente el sobrenadante. Repita este paso 2 veces.
- Añadir 7 ml por tubo de HBSS puro y homogeneizar el tejido a través de conductos sucesivos en pipetas: primero con la pipeta serológica de 10 ml, seguido de los 5 ml y finalmente con la micropipeta p1000.
- Después de la homogeneización, los tubos centrífugos a 450 x g durante 5 min a 4 oC.
- Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet con 4 ml de HBSS + 10% FBS por tubo.
- Transfiera las células a un matraz T-75 pretratado para una óptima adhesión al cultivo celular (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Procesar el tejido de cada animal por matraz. - Colocar el matraz en la incubadora a 37oC y 5%CO2 durante 30 min para adherencia.
- Añadir 10 ml de DMEM/F12 suplementado por matraz e incubar a 37oC y 5%CO2.
NOTA: El volumen final es de 14 ml por matraz.
- Día 3
- Retire 7 ml de medio de cultivo del matraz T-75 y añada 7 ml de DMEM/F12 recién suplementado.
NOTA: Los matraces contendrán una gran cantidad de residuos celulares y un aspecto turbio.
- Retire 7 ml de medio de cultivo del matraz T-75 y añada 7 ml de DMEM/F12 recién suplementado.
- Día 5
- Retire todo el medio del matraz T-75 y añada 14 ml de DMEM/F12 recién suplementado.
NOTA: El medio se sustituye de los matraces para eliminar los residuos y las células no adherentes. - Después de cada 48 h, quitar 6 ml del sobrenadante y añadir 7 ml de medio DMEM/F12 recién suplementado hasta el día 14 del cultivo.
- Retire todo el medio del matraz T-75 y añada 14 ml de DMEM/F12 recién suplementado.
- Día 14
- Después de quitar 6 ml del sobrenadante y añadir 7 ml de medio DMEM/F12 complementado fresco, cierre firmemente los matraces T-75.
- Colóquelos en el agitador orbital del suelo a 200 rpm y 37 oC durante la noche para disociar mecánicamente la microglia de los astrocitos.
- Día 15
- Tome los frascos de la coctelera y lávelos vigorosamente con su propio medio para optimizar la disociación celular y cosechar el número máximo de microglia. A continuación, recoja el sobrenadante (que contiene microglia) y transfiera a un tubo cónico de 50 ml.
- A continuación, añadir 4 ml de trippsina en cada matraz e incubar durante 5 min a 37 oC para separar los astrocitos.
- Añadir 5 ml por matraz de DMEM/F12 suplementado para inactivar la trippsina. Lavar los matraces con su propio medio y transferir el contenido a un tubo cónico de 50 ml.
- Centrifugar todos los tubos que contengan microglia disociada y astrocitos a 450 x g durante 5 min a 4oC.
- Descarta el sobrenadante. Resuspenda el pellet de microglia en 1 ml y los astrocitos en 10 ml de DMEM/F12 complementado.
- Proceda al conteo celular en una cámara Neubauer o en un contador de celdas automático. Placar las células con DMEM /F12 suplementado a la densidad deseada en una placa de cultivo de celda inferior plana adecuada (pretratada para un accesorio celular óptimo; ver Tabla de materiales). Incubar células a 37oC y 5% deCO2 durante 24 h para permitir que se adhieran.
NOTA: Reserve 1.5 x 106 de cada población celular para confirmar su pureza por citometría de flujo. - Realice un análisis citométrico de flujo para verificar la pureza de las poblaciones celulares.
NOTA: Consideramos microglia CD11b+/CD45+/GFAP- y astrocitos CD11b-/CD45-/GFAP+. Podría considerarse la tinción Iba1 y TMEM119 para caracterizar plenamente la microglia22. - Agregue un FMO (Fluorescence Minus One)23 y una muestra no manchada para cada población celular (astrocitos y microglia) como controles del ensayo de citometría de flujo.
- Para cada población celular, reserve 5 x 105 células por cada muestra manchada y no manchada. Para FMO, reserve otros dos tubos de microglia que contengan 2,5 x 105 células cada uno y también reserve otro tubo de 5 x 105 astrocitos.
NOTA: Dado que los números de microglia pueden ser un factor limitante, es posible utilizar menos celdas para controles de FMO y no manchados. - Centrifugar todos los microtubos a 450 x g durante 5 min a 4oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet con 500 l/microtubo de tampón FACS (solución salina con fosfato (PBS) + 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) + 2 mM EDTA, pH 7,2).
- Centrifugar todos los microtubos a 450 x g a 4 oC durante 5 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet con 100 l/microtubo de anti-CD16/CD32 (clon 93) (1:50) diluido en el búfer FACS. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
- Añadir 500 l/microtubo de tampón FACS en todos los microtubos y centrifugar a 450 x g a 4 oC durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Resuspenda los tubos de tinción de astrocitos y microglia y también el tubo FMO de astrocitos con mezcla de 50 l/microtubo de marcadores de superficie: anti-CD45 (PE, clon 30-F11) y anti-CD11b (eFluor 450, clon M1/70) (ambos diluidos a 1: 100 en búfer FACS).
- Para las celdas no manchadas, resuspenda con el mismo volumen del búfer FACS. Para la microglia FMO, incubar cada tubo de microglia con anti-CD45 o anti-CD11b. Incubar todas las muestras a 4 oC durante 20 minutos en la oscuridad.
- Añadir 500 l de tampón FACS por microtubo. Centrífuga a 450 x g a 4 oC durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con 100 l/microtubo de tampón de fijación (ver Tabla de materiales)durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Añadir 500 l/microtubo de tampón de permeabilización 1x (ver Tabla de Materiales)e incubar a 4 oC durante 5 minutos en la oscuridad.
- Centrifugar todos los microtubos a 450 x g a 4 oC durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Resuspenda los tubos de tinción de astrocitos y microglia y también los tubos de microglia FMO con 50 l/microtubo de anticuerpos intracelulares anti-GFAP (APC, clon GA5) en una dilución 1:100 en 1x tampón de permeabilización. Para las células no manchadas y la FMO astrocito, resuspenda las celdas con el mismo volumen de búfer FACS. Incubar todas las muestras a 4oC durante 30 min en la oscuridad.
- Lave todos los tubos añadiendo 500 l/microtubo de 1 tampón de permeabilización. Centrifugar todos los microtubos a 450 x g,durante 5 min a 4oC. Resuspenda cada microtubo en 200 ml de tampón FACS. Adquirir 1 x 105 eventos/muestra en el catómetro de flujo.
- Para el análisis, las celdas deben ser cerradas primero en CD11b x CD45 y luego el histograma GFAP.
NOTA: Los controles no manchados y FMO son útiles para determinar las puertas.
2. Infección y evaluación de las tasas de infección
- Infección de células gliales con T. gondii
- Placa 3 x 104 microglia o astrocitos con DMEM/F12 suplementado a 37oC y 5%CO2 para 24 h en una placa plana pretratada de 96 pocillos (ver Tabla de Materiales).
- Infectar cada población celular con taquizoitos de T. cepa gondii RH que expresa proteína fluorescente amarilla (YFP) a una multiplicidad de infección (MOI) de 1:1 (parásito:célula) diluida en 200 l/pozo de RPMI suplementada (3% FBS + 0,16 mM penicilina + 0,18 mM de estreptomicina + 12,5 mM de HEPES + 30 mM de bicarbonato de sodio, pH 7.2) (ver Tabla de Materiales). Incubar a 37oC y 5%CO2 durante 48 h.
- A continuación, deseche el sobrenadante y fije las células agregando 100 l/pozo de 1% de paraformaldehído (PFA) diluido en PBS a 4 oC durante 24 h.
- Sustituya el PFA por 100 l/pozo de PBS a pH 7.2.
- Retire cuidadosamente los núcleos de las células de sobrenadant y mancha pipeteando 50 l/pozo de DAPI (5 mg/ml) diluidos en PBS pH 7.2 (1:1,000) durante 1 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Sustituya la solución de tinción DAPI por 100 l/pozo de PBS (pH 7.2) y analícela mediante microscopía de fluorescencia.
- Infección de células gliales con T. cruzi
- Placa 3 x 104 microglia o astrocitos con DMEM/F12 suplementado a 37oC y 5%CO2 para 24 h en una placa plana pretratada de 96 pocillos (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Para cada punto de inflamación, utilice una placa diferente. - Infectar las células gliales con trippomastigotes de cepa T. cruzi Y a un MOI de 5:1 (parásitos:célula) diluido en 200 l/pozo de RPMI suplementada e incubar a 37 oC y 5% deCO2 durante 2 h.
NOTA: Este paso es importante para la invasión celular por el parásito. - Retire todos los sobrenadantes y lave los pozos añadiendo 200 l/bien de RPMI suplementada para eliminar todos los parásitos extracelulares. Retire el sobrenadante y agregue 200 l/bien de RPMI suplementada fresca.
NOTA: Este paso tiene la intención de eliminar todos los parásitos que no invadieron las células adherentes. - Incubar células infectadas durante 2 h, 48 h y 96 h para evaluar la replicación de T. cruzi en células gliales11.
- Después de cada punto de tiempo, retire el sobrenadante y fije las células con 100 l/pozo de metanol durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego reemplace el metanol por 100 l/bien de PBS (pH 7.2).
- Después de la fijación, prepare las células para el ensayo de inmunofluorescencia de la siguiente manera.
- Para evitar la autofluorescencia, trate las células con 100 ml/pozo de 50 mM NH4Cl diluidos en PBS (pH 8.0) durante 15 minutos.
- A continuación, permeabilizar las células agregando 100 l/pozo de 0.5% De tritón diluido en PBS durante 15 minutos.
- A continuación, incubar el cultivo celular con 100 l/pozo de solución de bloqueo (5% de leche sin grasa + 2% de BSA diluido en PBS [pH 7.2]) durante 1 h a temperatura ambiente. Lave las células añadiendo 100 l/bien de PBS y retírelas inmediatamente (repita este paso 3 veces).
- Para manchar alostigotes, incubar con 30 l/pozo de anticuerpo monoclonal no comercial (mAb) 2C2 proteína anti-Ssp-4 (1:200) diluida en solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lave las células añadiendo 100 l/bien de PBS y retírelas inmediatamente (repita este paso 3 veces). Incubar la placa con 30 l/pozo de anticuerpo antiratón secundario (1:500) diluido en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
NOTA: La proteína no comercial mAb 2C2 anti-Ssp-4 fue un regalo amable del Prof. Dr. Renato A. Mortara del Departamento de Microbiología, Inmunología y Parasitología de la Universidad Federal de Sao Paulo. - Retire cuidadosamente los núcleos de sobrenadant y mancha añadiendo 50 l/pozo de DAPI (5 mg/ml) diluido en PBS pH 7.2 (1:1,000) durante 1 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Sustituya la solución de tinción DAPI por 100 l/pozo de PBS pH 7.2 y analícela mediante microscopía de fluorescencia.
- Placa 3 x 104 microglia o astrocitos con DMEM/F12 suplementado a 37oC y 5%CO2 para 24 h en una placa plana pretratada de 96 pocillos (ver Tabla de Materiales).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En eldía 14, el cultivo de células gliales(Figura 1A)sufrió disociación mecánica. Las poblaciones de células aisladas fueron analizadas por citometría de flujo según los marcadores CD11b, CD45 y GFAP. Podríamos observar una pureza del 89,5% para la población de astrocitos y del 96,6% para la población de microglia(Figura 1B). Después del aislamiento, las células fueron chapadas en una placa plana de 96 pocillos y después de 24 h estaban listas para ser infectadas por T. cruzi o T. gondii de acuerdo con los respectivos protocolos de infección. Aquí proporcionamos una infección de curso de tiempo de T. cruzi como un ejemplo de evaluación de la tasa de infección en estas células gliales.
Los astrocitos y la microglia (3 x 104 células/pozo) se infectaron con T. cruzi en MOI 5:1 (parásitos:células) durante 2–96 h(Figura 2). La tasa de infección se evaluó mediante inmunofluorescencia contando el número de células y el número de parásitos manchados con un intercalador de ADN (DAPI). Brevemente, podríamos observar que T. cruzi es capaz de invadir microglia y astrocitos a tasas similares. Además, T. cruzi se replica en ambos tipos de células, alcanzando la tasa de infección más alta a 96 h después de la infección (p.i.). Curiosamente, a las 96 h p.i. la tasa de infección es más pronunciada en los astrocitos que en la microglia, lo que sugiere que las células de microglia son capaces de controlar la replicación del parásito de manera más eficiente que los astrocitos, como describimos anteriormente11.
Es importante señalar que el uso de parásitos modificados genéticamente que expresan reporteros fluorescentes o parásitos etiquetados con anticuerpos fluorescentes específicos podría mejorar la microscopía de inmunofluorescencia, ya que se distinguen mejor del núcleo celular(Figura 3). Además, la tasa de infección de los parásitos fluorescentes puede determinarse por otras técnicas como la citometría de flujo. Aquí proporcionamos ejemplos de cepa T. gondii RH que expresa constitutivamente ya YFP(Figura 3A)y cepa T. cruzi Y teñida con proteína no comercial mAb 2C2 anti-Ssp-4(Figura 3B).
En conjunto, este protocolo describe cómo extraer, mantener, disociar e infectar las células primarias de la microglia murina y los astrocitos, lo que podría ser una poderosa herramienta para estudiar, por ejemplo, las respuestas inmunitarias de las células gliales a la infección protozoa como brevemente eluciadas Aquí.
Figura 1: Astrocitos primarios y células de microglia. (A) Las imágenes de células gliales murinas C57BL/6 en el14o día de cultivo se obtuvieron por microscopio invertido (400x). La flecha roja indica la capa de astrocitos y la flecha negra indica la microglia. (B) Después de la disociación mecánica, se teñieron astrocitos y microglia (5 x 105 células) con fluorescente anti-CD11b, anti-CD45 y anti-GFAP y evaluados por citometría de flujo (1 x 105 células de adquisición). Los astrocitos se consideran como CD11b-/CD45- y GFAP+ celdas, mientras que la microglia son CD11b+/CD45+ y GFAP- células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Curso de tiempo de la infección por T. cruzi en células gliales. Los astrocitos y la microglia de ratones C57BL/6 fueron infectados con T. cruzi Y (MOI no 5:1). Después de 2 h, 48 h y 96 h, las cámaras se fijaron con metanol y se tiñeron con el marcador de núcleo celular DAPI (azul) y anti-GFAP (rojo). Las imágenes se obtuvieron mediante un microscopio de fluorescencia invertida (400x). El número de amastigotes dentro de las células y la frecuencia de las células infectadas fueron evaluados por el software del microscopio de fluorescencia (ver Tabla de Materiales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Infección por astrocitos y microglia con parásitos protozoarios fluorescentes. (A) 3 x 104 astrocitos y microglia de Ratones C57BL/6 se infectaron (MOI 1:1) con T. gondii RH YFP (verde) durante 48 h, las cámaras se fijaron con 1% de PFA y se teñiron con DAPI (azul). (B) 3 x 104 astrocitos y microglia de Ratones C57BL/6 se infectaron (MOI 5:1) con T. cruzi Y durante 96 h, y las cámaras se fijaron con metanol puro y se teñiron con DAPI (verde) y mAb 2C2 anti-Ssp-4 (naranja). Las imágenes fueron adquiridas utilizando un microscopio de fluorescencia invertida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La importancia de estudiar las funciones aisladas de las células gliales en contextos biológicos distintos se ha ido ampliando en las últimas dos décadas. Comprender el SNC más allá de las neuronas sigue siendo un campo creciente en la biología celular, especialmente en infecciones o condiciones inflamatorias8,9,24. Las células gliales son cruciales no sólo para el soporte físico de las neuronas (como se conocía anteriormente), sino también en muchas otras situaciones fisiológicas como el suministro de energía de las neuronas, neurometabolismo, vigilancia inmune, poda sináptica, modelado y modulación del tejido, entre otros3,25,26,27,28,29.
Dado que los astrocitos y la microglia pueden modularse diferencialmente durante la infección o la inflamación estéril, es de gran importancia comprender el papel individual y relativo de estas células gliales. Aunque se sabe que la microglia representa el sistema mononuclear de fagocitos (MPS) en el SNC, los astrocitos también han sido descritos como un actor fundamental en las respuestas inmunitarias del SNC8. Con el fin de comparar el papel de cada subconjunto glial en el contexto de la infección y / o inflamación, es obligatorio obtenerlos de la misma extracción y condiciones. Hay pocos informes sobre las respuestas de los efectores de la microglia y los astrocitos para controlar las infecciones, especialmente en lo que respecta a los parásitos protozoarios. En este sentido, recientemente demostramos el requisito de nlRP3 inflammasome para el control de la replicación de T. cruzi en microglia, pero no en astrocitos por un mecanismo que implica óxido nítrico (NO) secreción11.
Este protocolo describe un método que se centra en extraer simultáneamente las dos poblaciones de células gliales más abundantes, los astrocitos y la microglia, de ratones postnatales (hasta 3 días de edad). Se pueden utilizar ratones recién nacidos de más de 3 días de edad, pero experimentamos que el rendimiento de ambas células disminuye ligeramente con el tiempo (no se muestran los datos). Nuestro método difiere de los protocolos descritos anteriormente para los astrocitos o el aislamiento de microglia porque nos centramos en obtener y aislar ambos tipos de células en la misma extracción, en las mismas condiciones, optimizando así el uso de animales experimentales y mejorando el estudio del papel relativo de esas células en contextos inmunológicos. Además, nuestro protocolo también optimizó el rendimiento de ambos tipos de células. El rendimiento suele ser de 3-5 x 106 astrocitos y 3–5 x 105 microglia por matraz. Compare esto con otros protocolos que resultan en menos células que utilizan más animales por matraz T-75 (algunos protocolos utilizan 2-3 animales por matraz)30,31.
Otra ventaja de este protocolo es el tiempo necesario para obtener astrocitos aislados y microglia. Dentro de 14 días es posible obtener microglia madura. De hecho, es importante destacar que, como demostraron Flode y Combs, la microglia mayor de 14 días presenta una capacidad disminuida para secretar citoquinas; es muy importante considerar esto en contextos neuroinmunológicos30. A pesar del hecho de que los fabricantes maduros para el astrocito no se entienden completamente, GFAP se utiliza en gran medida para caracterizar astrocitos sensibles y activos. Algunos protocolos alcanzan niveles de 90% de células positivas GFAP sólo después de 21 o 28 días de cultivo. Por esa razón, propusimos un método que proporcionaba células que son inmunosensibles y que en su mayoría maduran dentro de 7-14 días. Aunque la pureza puede ser menor que otros métodos tanto paraastrocitos 31 como para microglia30,el enfoque principal fue obtener microglia y astrocitos en mayores cantidades en una extracción concomitante. Entendemos que las poblaciones celulares podrían clasificarse o aislarse aún más con la separación de columnas para mejorar sus purezas. Para ello, se pueden incluir marcadores de celda adicionales, como Iba1 o TMEM119 para microglia; Aquaporina-4 o S100B para astrocitos, CC1 u O4 para oligodendrocitos y NeuN para neuronas22,,31,32,33. Sin embargo, se debe considerar una pérdida de célula importante al final del protocolo.
Por lo tanto, proporcionamos un método modificado para obtener de forma concomitante microglia y astrocitos en un protocolo eficiente y barato. Además, este protocolo proporciona las ventajas de un gran rendimiento que permite los estudios comparativos de subconjuntos gliales en contextos neuroinmunológicos, como se ilustra aquí durante la infección por T. cruzi y T. gondii.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias al profesor Dr. Renato A. Mortara, de la Universidad Federal de Sao Paulo (UNIFESP), por mAb 2C2 anti-Ssp-4. Esta obra fue apoyada por subvenciones de la Fundación de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP, subvención 2017/25942-0 a K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, 402100/2016-6 a K.R.B., Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología de Vacinas (INCTV/CNPq) y Coordena-o de Aperfei-oamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Código De Finanzas 001). M.P.A. recibe beca de CNPq, A.L.O.P. recibe beca de CAPES, e I.S.F y L.Z.M.F.B. reciben beca de FAPESP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 μmm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat - anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS - Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10x) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60 mm x 15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 °C with trypsin |
References
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
- Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
- Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
- Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
- Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
- Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
- Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
- Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
- Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
- Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
- Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
- Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
- Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
- Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
- Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
- Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
- Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
- Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).
