Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تحديد كميه السمية الخلوية للسبحيه الذهبية ضد الكريات البيضاء البشرية الاحاديه النواة

Published: January 3, 2020 doi: 10.3791/60681
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Montana State University, 2University Communications, Montana State University

ERRATUM NOTICE

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقه لتنقيه الكريات البيضاء من الدم البشري الكامل واثنين من الاختبارات المتميزة التي تحدد كميه الخلايا العنقودية الذهبية ضد هذه الخلية المناعية الفطرية الهامه.

Abstract

المكورات العنقودية الذهبية قادره علي إفراز مجموعه واسعه من الكريات البيضاء التي تستهدف وتعطل سلامه الغشاء من الكريات البيضاء تعدد النوى (pmns أو العدلات). يصف هذا البروتوكول كلا من تنقيه PMNs البشرية والقياس الكمي للخلايا الخلوية s. ضد pmns في ثلاثه أقسام مختلفه. القسم 1 تفاصيل عزل PMNs والمصل من الدم البشري باستخدام كثافة طرد. القسم 2 اختبارات السمية الخلوية للبروتينات خارج الخلية التي تنتجها s. الذهبية ضد هذه السموم البشرية المنقية. ويقيس القسم 3 التسمم بالخلايا ضد pmns البشرية بعد كثرة الكريات الذهبية الحية. تقيس هذه الإجراءات الخلل في سلامه غشاء البلازما PMN بواسطة الكريات البيضاء الذهبية باستخدام تحليل تدفق الخلايا الخلوية من pmns تعامل مع يوديد بروبيديوم ، وهو فلوفيموري الحمض النووي ملزم ان غشاء الخلية غير منفذه. وبشكل جماعي ، فان هذه الأساليب لها ميزه الاختبار السريع للخلايا الذهبية ضد pmns البشرية الاوليه ويمكن تكييفها بسهوله لدراسة جوانب أخرى من التفاعلات بين المضيف والممرض.

Introduction

المكورات العنقودية الذهبية هي بكتيريا ايجابيه الجرام التي تسبب طيفا واسعا من الامراض في البشر. هذا الممرض البارز ينتج العديد من عوامل الضراوة التي تساهم في جوانب مختلفه من العدوى. وتشمل هذه الجزيئات السطحية التي تسمح s. الذهبية للانضمام إلى أنواع مختلفه من الانسجه المضيف1, البروتينات خارج الخلية التي تتداخل مع الاستجابة المناعية المضيف2, ومجموعه من السموم يفرز التي تستهدف أنواع مختلفه من الخلايا المضيفة3. في هذا التقرير ، ونحن وصف الطريقة التي تحدد كميه السمية الخلوية من البروتينات خارج الخلية التي تنتجها s. الذهبية ضد الكريات البيضاء البشرية تعدد النوى (pmns أو العدلات) ، والخلايا المستجيب الاولي للاستجابة المناعية الفطرية المضيف.

PMNs هي الكريات البيضاء الأكثر وفره في الثدييات. يتم تجنيد هذه الخلايا المناعية المتداولة بسرعة في موقع أهانه الانسجه المضيفة ردا علي إشارات الخطر التي تنتجها الخلايا المقيمة أو المركبات الفريدة لغزو الميكروبات. المدخلات خارج الخلية من هذه الجزيئات ومن الاتصالات المباشرة مع تنشيط الخلايا المضيفة المقيمين اثناء تسرب زيادة حاله تنشيط pmns في عمليه تعرف باسم فتيله4,5. تستعد PMNs التي وصلت الانسجه المتعثرة ثم تنفيذ الاستجابات المناعية الفطرية الهامه المصممة لمنع إنشاء العدوى. وتشمل هذه الملزمة والاستيعاب الداخل, أو كثرة, من الكائنات المجهرية الغازية التي تطلق سلسله من الاحداث داخل الخلايا التي تتراكم في الدمار ميكروب بواسطة بطارية من المركبات المضادة للميكروبات قويه5.

PMNs تلعب دورا أساسيا في حماية البشر من العوامل المسببة للامراض الغازية وهي مهمة بشكل خاص لمنع العدوى s. الذهبية4. ومع ذلك ، تنتج هذه البكتيريا مجموعه واسعه من الجينات ضراوة التي تعيق وظائف PMN مختلفه. وتشمل هذه البروتينات خارج الخلية التي تمنع التعرف علي جزيئات الإشارات ، ومنع التصاق الانسجه المضيفة ، وتمنع إنتاج المركبات المضادة للميكروبات ، والمساومة علي سلامه غشاء البلازما4. ينظم s. الذهبية التعبير الزماني لهذه الجينات ضراوة من خلال المدخلات الجماعية من النظم الحسية المكونة من عنصرين التي تعترف العظة البيئية المحددة. و saer/S نظام مكونات اثنين هو الرئيسية الأعلى المنظم لل s. الذهبية النسخ الجيني فيعه خلال العدوى6,7,8,9,10,11. وعلي وجه الخصوص ، تبين ان هذا النظام مكون من عنصرين حاسم لإنتاج الكريات البيضاء ثنائيه المكونات التي تستهدف علي وجه التحديد PMNs الإنسان12.

يتم تقسيم هذا البروتوكول إلى ثلاثه أقسام مختلفه. يصف القسم الأول تنقيه PMNs من الدم البشري باستخدام طرد التدرج الكثافة باستخدام بروتوكول تم تكييفه من الأساليب التي وضعتها Bøyum13 و نوفيف14. القسمين الثاني والثالث بالتفصيل اثنين من التقنيات المختلفة لفحص السمية الخلوية s. ; 1 تسمم PMNs مع البروتينات خارج الخلية التي تنتجها s. الذهبية في حين ان الآخر يفحص قدره البكتيريا الحية علي الاضرار pmns التالية كثرة المحببات. تستخدم هذه الإجراءات يوديد بروبيديوم لقياس فقدان سلامه غشاء البلازما PMN الناجمة عن السموم التي تشكل المسام . يوديد بروبيديوم هو فلوكوفيري ملزمه الحمض النووي الذي هو عاده غشاء الخلية غير نفاذه ولكن يمكن عبر اغشيه البلازما التي تم تعطيلها بواسطة السموم s. الذهبية. تحليل تدفق الخلوي يسمح بالتحديد الكمي السريع لل PMNs بروبيديوم يوديد الايجابيه لقياس السمية الذاتية النسبية لسلالات s. الذهبية. وقد تم التعرف علي المذهب الذهبي المقاوم ميثيسيلين ( جرثومه) الذي تم تحديده بأنه النوع الكهربي لجل الحقل النبضي USA300 ومتحولة الحذف من saer/s في هذه السلالة (USA300Δsaer/s) كنماذج لتوضيح كيف يمكن لهذه الإجراءات ان تحدد كميه السمية الخلوية للخلايا.

Protocol

تم جمع الدم الوريدي الHeparinized من متبرعين أصحاء وفقا للبروتوكول الذي وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية للمواضيع البشرية في جامعه ولاية مونتانا. وقدمت جميع الجهات المانحة موافقه خطيه للمشاركة في هذه الدراسة.

1. تنقيه الكريات البيضاء البشرية تعدد النوى وعزل المصل البشري

ملاحظه: يجب ان يتم فحص جميع الكواشف بشكل روتيني لوجود اندوتوكسين باستخدام مجموعه الكشف عن اندوتوكسين المتاحة تجاريا وينبغي ان تحتوي علي < 25.0 pg/mL اندوتوكسين لمنع فتيله غير المرغوب فيها من PMNs.

  1. جلب 50 مل من 3 ٪ ديكسسين-0.9 ٪ كلوريد الصوديوم (ث/v) ، 35 مل من 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم (ث/ف) ، 20 مل من 1.8 ٪ كلوريد الصوديوم (ث/ف) ، 12 مل من الحل التدرج الكثافة g/mL 1.077 ، و 20 مل من الحقن-أو الري الصف المياه إلى درجه حرارة الغرفة.
  2. لعزل المصل البشري ، احتضان 4 مل من الدم البشري المسحوب حديثا دون المضادة للتخثر في 37 درجه مئوية في أنبوب زجاجي 15 مل لمده 30 دقيقه. بعد الحضانة ، عينه الطرد المركزي في 2000-3000 × ز لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. نقل طبقه المصل العلوي إلى أنبوب الطرد المركزي المخروطية 15 مل جديده ومكان علي الجليد.
  3. الجمع بين 25 مل من heparinized المسحوبة حديثا (1000 وحده/مل) الدم البشري كله مع 25 مل من درجه حرارة الغرفة 3 ٪ ديكسسين-0.9 ٪ كلوريد الصوديوم (1:1 نسبه) في اثنين من تكرار 50 mL أنابيب الطرد المركزي المخروطية (50 مل حجم الإجمالي لكل أنبوب). مزيج من قبل هزاز بلطف كل أنبوب مخروطي 50 مل ومن ثم السماح الوقوف في درجه حرارة الغرفة لمده 30 دقيقه.
  4. بعد الحضانة في درجه حرارة الغرفة ، وسوف تظهر طبقتين منفصلة. انقل الطبقة العليا من كل خليط من الدم إلى الأنابيب المخروطية 50 mL الجديدة وأجهزه الطرد المركزي في 450 x g لمده 10 دقائق في درجه حرارة الغرفة مع المكابح منخفضه أو لا.
  5. يستنشق بعناية علي حد سواء supernatants وتجاهل دون إزعاج الكريات الخلية. أعاده التعليق بلطف كل خليه بيليه في 2 مل من درجه حرارة الغرفة 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم ، والجمع بين الكريات resuspend في أنبوب مخروطي واحد 50 مل ، ثم أضافه المتبقية 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم (الحجم النهائي من 35 mL).
  6. البطانة بعناية 10 مل من درجه حرارة الغرفة من 1.077 g/mL محلول التدرج كثافة تحت تعليق الخلية باستخدام ماصه اليد. تدور في 450 x g لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة مع انخفاض أو عدم وجود الفرامل. يستنشق بلطف ماده طافي دون إزعاج بيليه الخلية. سيحتوي supernatant علي خلايا كريات الدم الاحاديه الطرفية التي يمكن جمعها كما هو موضح سابقا14.
  7. Lyse خلايا الدم الحمراء عن طريق أعاده تعليق بيليه الخلية في 20 مل من درجه حرارة الغرفة المياه. امزجيه برفق بواسطة هزاز الأنبوب لمده 30 ثانيه. سيرافق تحلل خلايا الدم الحمراء انخفاضا واضحا في التعكر.
  8. فورا أضافه 20 مل من 1.8 ٪ كلوريد الصوديوم (في درجه حرارة الغرفة [RT]) وعينه الطرد المركزي في 450 × ز لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
    ملاحظه: من المهم تقليل الوقت الذي يتم ترك PMNs في الماء وحده بعد تحلل خلايا الدم الحمراء لتعظيم الغلة PMN ومنع PMN تحلل و/أو التنشيط.
  9. يستنشق بعناية ماده طافي دون إزعاج بيليه الخلية. أعاده التعليق برفق بيليه الخلية في 2 مل من RPMI 1640 المتوسطة ومكان علي الجليد.
  10. عد الخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية. أعاده التعليق المنقي PMNs بتركيز 1 × 107 خلايا/مل مع rpmi الباردة الجليد والحفاظ علي الجليد.
  11. الجمع بين 100 μL من PMNs تنقيه (1 × 106 خلايا) مع 300 μl من الجليد الباردة دولبيكو الفوسفات-مخزنه المالحة (dpbs) التي تحتوي علي 1 μl من بروبيديوم يوديد وصمه عار في اثنين من النسخ المتماثل تدفق أنابيب الخلوي. للسيطرة الايجابيه علي تلف غشاء البلازما ، أضافه 40 μL من 0.5 ٪ تريتون X-100 حل في واحده من أنابيب التدفق الخلوي وتخلط جيدا.
  12. استخدام التدفق الخلوي لقياس مبعثر إلى الامام ، مبعثر الجانب ، وبروبيديوم يوديد تلطيخ (الاثاره/الانبعاثات ماكسيما في 535/617 nm) من الخلايا المنقية (الشكل 1).
    ملاحظه: تحليل الجانب الامامي والجانبي سيحدد السكان غير المرغوب فيهم من الخلايا اللمفاوية والخلايا الاحاديه. سوف يوديد بروبيديوم فقط وصمه عار الخلايا مع غشاء البلازما للخطر وتنقيه PMNs التي لديها السكان وضوحا من الخلايا الموجبة يوديد بروبيديوم لا ينبغي ان تستخدم. لهذه الدراسات ، تم استخدام PMNs المنقي فقط إذا كانت تتالف من > 98 ٪ من الخلايا المنقية و < 5 ٪ الملون ايجابيه ليوديد بروبيديوم.
  13. اعداد لوحه 96-بئر لاختبارات الخلوية PMN عن طريق طلاء الآبار الفردية التي سيتم استخدامها في هذا الفحص مع 100 μL من 20% مصل الإنسان المعزولة التي تم تخفيفها مع DPBS.
    ملاحظه: سيؤدي تصفيح PMNs مباشره علي البلاستيك أو الزجاج تنشيط الخلايا. تاكد من تضمين واحد علي الأقل السيطرة السلبية جيدا التي سوف تتلقي فقط وسائل الاعلام وواحد علي الأقل السيطرة الايجابيه جيدا التي سوف تتلقي 0.05 ٪ تريتون X-100.
  14. احتضان لوحه في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه. بعد الحضانة ، اغسل الآبار المغلفة مرتين مع DPBS الباردة الجليد لأزاله اي المصل الزائد. اضغط برفق علي اللوحة راسا علي عقب لأزاله اي DPBS المتبقية ووضعها علي الجليد.
  15. أضافه بلطف 100 μL من الإنسان المنقي PMNs في 1 × 107 خلايا/مل لكل بئر المغلفة (1 × 106 pmns/well). السماح PMNs ليستقر في الآبار عن طريق احتضان لوحه علي الجليد لمده 5 دقائق علي الأقل. الحفاظ علي مستوي لوحه للسماح حتى توزيع الخلايا في كل بئر وترك علي الجليد لتجنب تنشيط غير المرغوب فيها من PMNs.

2- مقايسة الخلايا الخلوية للبروتينات الخارجة عن الخلية ضد الكريات البيضاء البشرية الوحيدة النواة

  1. الثقافة s. الذهبية بين عشيه وضحيها في مرق الصويا التريتيك (تقييس) باستخدام حاضنه الاهتزاز تعيين في 37 درجه مئوية. لهذه الدراسات ، تم تطعيم 20 مل من مكتب تقييس التعليم في قوارير 150 mL Erlenmeyer منفصلة مع الثقافات المجمدة من سلالات s. الذهبية USA300 أو USA300ΔSaer/S ونميت لحوالي 14 ساعة مع اهتزاز في 250 دوره في الدقيقة.
  2. الثقافة الفرعية s. الذهبية من خلال تنفيذ 1:100 التخفيف من الثقافة البكتيرية بين عشيه وضحيها مع وسائل الاعلام الطازجة. احتضان في 37 درجه مئوية مع الاهتزاز حتى تصل البكتيريا مرحله نمو ثابته في وقت مبكر.
    ملاحظه: بالنسبة لهذه التجارب ، تم تطعيم 20 مل من مرق الصويا التريتيك في 150 مل Erlenmeyer قوارير مع 200 μL من بين عشيه وضحيها مثقف USA300 أو USA300ΔSaer/S وحضنت في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 250 دوره في الدقيقة ل 5 ح.
  3. عندما وصلت البكتيريا مرحله النمو الثابتة في وقت مبكر, نقل 1 مل من المذهب الذهبي المستزرع في 1.5 ml أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي في 5,000 × ز لمده 5 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
  4. بعد طرد ، نقل ماده طافي إلى حقنه 3 مل. تمرير supernatants من خلال فلتر 0.22 μm والي جديد 1.5 mL أنبوب ميكروالطرد المركزي علي الجليد.
  5. اجراء التخفيفات التسلسلية من supernatants مع وسائل الاعلام الجليد الباردة المستخدمة في الثقافة s.الذهبية.
    ملاحظه: بالنسبة للتجارب المعروضة ، خضعت supernatants من USA300 و USA300Δsaer/S أربعه علي التوالي 1/2 تخفيفات السجل مع الجليد الباردة تقييس.
  6. أضافه برفق عينات ماده طافي أو وسائل الاعلام وحدها (للضوابط السلبية والايجابيه) إلى الآبار الفردية من لوحه 96-بئر تحتوي علي pmns علي الجليد من الخطوة 1.15. لهذه التجارب ، تم أضافه 10 μl من USA300 أو USA300Δsaer/S العينات ماده طافي إلى كل بئر. لوحه صخرية برفق لتوزيع سوبرناتانتس في الآبار واحتضان في 37 درجه مئوية.
  7. في الأوقات المطلوبة ، وأزاله لوحه من الحاضنة ومكان علي الجليد. أضافه 40 μL من 0.5% تريتون X-100 إلى السيطرة الايجابيه جيدا.
  8. ماصه بلطف عينات صعودا وهبوطا في كل بئر لسحب تماما قباله جميع PMNs الانضمام إلى لوحه ، ثم نقل عينات لتدفق أنابيب الخلوي علي الجليد التي تحتوي علي 300 μL من DPBS الجليد الباردة مع 1 μL من يوديد بروبيديوم.
  9. قياس نسبه بروبيديوم يوديد-ايجابيه PMNs باستخدام التدفق الخلوي (الشكل 2ا). عندما يرتبط إلى الحمض النووي ، يوديد بروبيديوم لديه الاثاره/الانبعاثات في 535/617 nm.

3. s. الذهبية المقايسة الخلوية ضد الكريات البيضاء البشرية تعدد النوى بعد كثرة الكريات

ملاحظه: منحنيات النمو التي حددتها الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) وتركيز البكتيريا يجب ان تحدد تجريبيا لسلالات s. الذهبية ليتم اختبارها قبل البدء في هذا الفحص. ويتطلب نجاح هذه التجارب الحصاد المستمر للتركيزات المتساوية لكل من السلالات الذهبية التي اختبرت في مرحله النمو الاسي المتوسط باستخدامال600 OD من البكتيريا شبه المستزرعة.

  1. بدء الثقافات بين عشيه وضحيها من سلالات s. الذهبية والبكتيريا الثقافة الفرعية كما هو موضح في الخطوات 2-1-1 و 2-1-2.
  2. حصاد تحت المثقف s. الذهبية عندما وصلت إلى النمو الاسي المتوسط عن طريق نقل 1 مل من البكتيريا المستزرعة إلى 1.5 ml أنبوب الطرد المركزي ويطرد في 5,000 × ز لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
    ملاحظه: في ظل ظروف النمو لدينا ، USA300 و USA300ΔSaer/S بلغت مرحله النمو الاسي المتوسط بعد حوالي 135 دقيقه من الحضانة6.
  3. يغسل s. الذهبية التالية طرد عن طريق شفط supernatant ، أعاده تعليق البكتيريا التي تغلف في 1 مل من dpbs ، vortexing العينة ل 30 ثانيه ، و يطرد في 5,000 × g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
  4. Opsonize s. الذهبية من خلال أعاده تعليق بيليه البكتيرية في 1 مل من 20 ٪ مصل الإنسان المخفف مع dpbs واحتضان في 37 درجه مئوية مع التحريض لمده 15 دقيقه.
  5. البكتيريا الطاردة للطرد المركزي في 5,000 x g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة. يغسل s. الذهبية التالية طرد عن طريق شفط supernatant ، أعاده تعليق البكتيريا التي تغلف في 1 مل dpbs ، ثم دوامه العينة حتى يتم كسر بيليه البكتيرية تماما بالاضافه إلى 30 ثانيه اضافيه. بكتيريا الطرد المركزي في 5,000 × g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
  6. أعاده تعليق السلالات الذهبية opsonized في 1 مل rpmi ، دوامه العينة حتى يتم تقسيم بيليه البكتيرية تماما ، وبعد ذلك لمده 30 ثانيه اضافيه. ضع البكتيريا علي الجليد.
  7. يخفف السلالات الذهبية opsonized إلى التركيز المطلوب مع rpmi الباردة الجليد. دوامه ل 30 ق ومكان علي الجليد.
  8. تاكيد تركيز opsonized s. الذهبية بالطلاء 1:10 المسلسل المخففات من البكتيريا علي أجار الصويا التريتيك.
    ملاحظه: لان الاختلافات في تركيز البكتيريا المستخدمة في هذا الفحص يمكن ان يكون لها تاثير كبير علي نفاذيه غشاء البلازما PMN اللاحقة (الشكل 3ا) ، من المهم جدا ان يتم تحديد تركيز كل سلاله اختبار لكل تجربه ويعادل بين السلالات.
  9. أضف برفق 100 μL/well لكل سلاله s. الذهبية أو rpmi (لعناصر التحكم الايجابيه والسلبية) إلى pmns في لوحه 96 علي الجليد من الخطوة 1.14. لوحه الصخور بلطف لتوزيع s. الذهبية في الآبار.
  10. مزامنة الفندره عن طريق يطرد لوحه في 500 × g لمده 8 دقائق في 4 °c15. احتضان لوحه في 37 درجه مئوية مباشره بعد طرد (T = 0).
  11. في الأوقات المطلوبة ، وأزاله لوحه من الحاضنة ومكان علي الجليد. أضافه 40 μL من 0.5% تريتون X-100 إلى السيطرة الايجابيه جيدا.
  12. ماصه بلطف عينات صعودا وهبوطا في كل بئر لسحب تماما قباله جميع PMNs الانضمام إلى لوحه ، ثم نقل عينات لتدفق أنابيب الخلوي علي الجليد التي تحتوي علي 200 μL من DPBS الجليد الباردة مع 1 μL من يوديد بروبيديوم.
  13. تحليل عينات لتلطيخ بروبيديوم يوديد باستخدام تدفق الخلوي كما هو موضح في الخطوة 2.9.

Representative Results

لقد أظهرنا كيف يمكن استخدام الإجراءات الموصوفة أعلاه لقياس نسبيا السمية الخلوية لل s. الذهبية ضد pmns البشرية باستخدام جرثومه pfge-نوع USA300 ومتحولة الحذف ايزوتون من saer/s في هذه السلالة (USA300Δsaer/s) المتولدة في الدراسات السابقة6. تم تلطيخ PMNs معزولة باستخدام الإجراءات الموضحة في القسم 1 من هذا البروتوكول مع يوديد بروبيديوم وفحصها باستخدام تدفق الخلوي. واستخدمت المؤامرات إلى الامام والجانب مبعثر لتوضيح تلوث PMNs المنقية من قبل الخلايا الاحاديه أو الخلايا الليمفاوية (الشكل 1ا ، ب) وتم تحديد سلامه pmn باستخدام بروبيديوم يوديد تلطيخ (الشكل 1ج). الطريقة الموصوفة لتنقيه PMN البشرية يمكن ان تسفر باستمرار 0.5 x 107 إلى 1 × 108 pmns التي هي > 98 ٪ نقيه وهي > 95 ٪ يوديد بروبيديوم سالب.

تم اختبار التسمم الخلوي للبروتينات خارج الخلية التي تنتجها USA300 و USA300ΔSaer/S ضد pmns المنقي (الشكل 2) وفقا للإجراءات الموصوفة في القسم 2 من هذا البروتوكول. هذه التجارب تظهر زيادة تعتمد علي تركيز في تلطيخ يوديد بروبيديوم من PMNs تنقيته بعد 30 دقيقه من التسمم مع البروتينات خارج الخلية التي تنتجها USA300 (الشكل 2ب). وقد أظهرت الدراسات السابقة ان النظام المكون من عنصرين saer/S مهم للتعبير عن العديد من الكريات البيضاء ثنائيه المكونات التي تستهدف الإنسان pmns6,10,11,16. التطابق مع هذه النتائج السابقة ، تم الكشف عن عدد قليل جدا من البروبيديوم الايجابيه لليوديد الموجبة بعد التعرض للبروتينات خارج الخلية التي تنتجها USA300ΔSaer/S (الشكل 2ب). وأظهرت التجارب الأخرى زيادة مطردة في نسبه pmns تفكيك بعد التسمم من قبل USA300 البروتينات خارج الخلية التي استقر بعد ما يقرب من 30 دقيقه (الشكل 2ج). ولوحظ الحد الأدنى من تحلل البشرية في جميع النقاط الزمنيه بعد التعرض للبروتينات خارج الخلية التي تنتجها USA300ΔSaer/S. وتوضح هذه النتائج فائده هذا الفحص للقياس الكمي النسبي للخلايا الخلوية بواسطة البروتينات الذهبية خارج الخلية ضد pmns البشرية.

اختبرنا USA300 و USA300ΔSaer/s باستخدام المقايسة الخلوية s. الذهبية ضد pmns البشرية التالية كثرة الندرة الموصوفة في القسم 3 من هذا البروتوكول (الشكل 3). ولوحظت زيادة التركيز تعتمد في نسبه بروبيديوم يوديد الموجبة PMNs 90 دقيقه بعد ندره المحببات من USA300 (الشكل 3ا). لوحظ انخفاض كبير في نسبه pmns التي كانت بروبيديوم يوديد ايجابيه بعد كثرة المحببات من USA300Δsaer/s (الشكل 3ا) ، ودعم النتائج الأخرى التي تشير إلى نظام saer/s المكونات اثنين من المهم للخلايا الخلوية من s. الذهبية ضد pmns الإنسان (الشكل 2)7،11. كما ذكر سابقا والمبينة في الشكل 3ا، الاختلافات في تركيز s. الذهبية لها تاثير واضح علي pmn تحلل التالية كثرة الكريات. وقد اظهر تعداد USA300 و USA300Δsaer/S في المستخدمة في كل من هذه التجارب ان التباين في السمية الخلوية بين هذه السلالات لم يكن بسبب الاختلافات في تركيز البكتيريا المستخدمة (الشكل 3ب). وتبين هذه النتائج كيف يمكن استخدام المقايسة الخلوية s. الذهبية ضد pmns البشرية التالية كثرة الكريات لتقييم قدره مختلف سلالات s. الذهبية لتسويه الإنسان pmn سلامه غشاء البلازما.

Figure 1
الشكل 1: تحليل تدفق الخلوي من PMNs المنقية. تمثيل تدفق الخلوية نقطه المؤامرات من (ا) الإنسان المنقي pmns و (ب) pmns التي تم الملوثة عمدا مع خلايا كريات الدم الاحاديه الطرفية. (ج) الرسم البياني للتدفق الخلوي التمثيلي مما يدل علي الحد الأدنى من تلطيخ بروبيديوم يوديد (< 1 ٪) من PMNs تنقيه (رمادي مظلل) بالمقارنة مع PMNs تعامل مع 0.05 ٪ تريتون X-100 (مظلله الأحمر). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحليل تدفق الخلايا المضخمة للخلايا المصابة بالتسمم بالبروتينات خارج الخلية التي تنتجها s.الذهبية. (ا) تمثيلي تدفق الرسم البياني الخلوي من pmns ملطخه بروبيديوم يوديد بعد 30 دقيقه من الاحتضان مع التحكم في وسائل الاعلام (الأزرق المظللة) ، تصفيه USA300 ماده طافي في تركيز نهائي من 1:110 (مظلله الرمادي) ، أو 0.05 ٪ تريتون X-100 (مظلله الأحمر). (ب) نسبه بروبيديوم يوديد الموجبة الايجابيه بعد 30 دقيقه من الاحتضان مع تركيزات مختلفه من USA300 أو USA300 ∆Saer/S supernatants. (ج) نسبه بروبيديوم يوديد الموجبة الايجابيه مع مرور الوقت بعد الاحتضان مع USA300 أو USA300 ∆saer/S ماده طافي في التركيز النهائي من 1:110. وتقدم البيانات كما يعني ± SEM من 3 تجارب منفصلة علي الأقل مع * p ≤ 0.05 و * * p ≤ 0.005 كما هو محدد من قبل اثنين من الذيل t-اختبار. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحليل تدفق الخلوية من PMNs بعد كثرة الكريات الذهبية. (ا) نسبه بروبيديوم يوديد الموجبة pmns 90 دقيقه بعد الندرة من تركيزات مختلفه من USA300 أو USA300 ∆saer/s. (ب) تركيز السلالات الذهبية المستخدمة في التجارب المبينة في اللوحة ا. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SEM من 4 تجارب منفصلة مع * p ≤ 0.01 كما هو محدد من قبل اثنين من الذيل يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يصف هذا البروتوكول تنقيه PMNs من الدم البشري واثنين من الاختبارات المتميزة التي تستخدم يوديد بروبيديوم لقياس السمية الخلوية لل s. الذهبية ضد هذه الخلايا المناعية الفطرية الهامه. سيعتمد نجاح هذه الإجراءات علي نوعيه PMNs المنقية والاعداد المناسب للبروتينات الذهبية وخارج الخلية التي ينتجها هذا الممرض. لعزل PMNs ، من المهم التقليل من التنشيط PMN اثناء وبعد تنقيه باستخدام الكواشف خاليه من التلوث اندوتوكسين ، وعلاج الاستعدادات الخلية بلطف ، والحفاظ علي الخلايا في درجه الحرارة المناسبة. وتشمل العلامات التي تشير إلى تنشيط PMNs كتل من الخلايا اثناء تنقيه وعندما أكثر من 5 ٪ من الخلايا المعزولة وصمه ايجابيه ليوديد بروبيديوم. بسبب فتره الحياة قصيرة نسبيا من PMNs ، يجب ان تكون هذه الخلايا معزولة عن الدم البشري واختبارها في نفس اليوم. وسوف تبدا PMNs لتظهر علامات المبرمج التلقائي إذا تركت علي الجليد لأكثر من 3 ساعات بعد تنقيه. كما ذكر في وقت سابق ، من المهم جدا ان يتم تقييم كل اعداد PMN بعناية باستخدام تحليل التدفق الخلوي للامام ومبعثر الجانب ، فضلا عن تلطيخ بروبيديوم يوديد لضمان نقاء وسلامه الخلايا المعزولة.

التعبير عن الكريات البيضاء ثنائيه المكونات بواسطة s. الذهبية هي المسؤولة عن معظم المساس pmn سلامه غشاء البلازما التي لوحظت باستخدام المقايسات الموصوفة في هذا البروتوكول. الاختلاف في التعبير عن هذه السموم وغيرها من الببتيدات تشكيل المسام ، مثل نمطيه الفينول القابلة للذوبان ، بين سلالات s. الذهبية سوف تنتج الاختلافات في السمية الخلوية ضد pmns البشرية. الانحرافات الكبيرة اثناء النمو في المختبر بين سلالات s. الذهبية سوف تؤثر أيضا علي التعبير عن السموم تشكيل المسام الاضافه إلى ذلك ، فان نسبه s. الذهبية إلى pmns في اختبارات كثرة الكريات له تاثير كبير علي نفاذيه غشاء البلازما pmn اللاحقة (الشكل 3ا) وتتطلب هذه التجارب حصاد متناسقة من تركيزات متساوية من كل السلالات الذهبية اختبارها في مرحله النمو الاسي المتوسط باستخدام OD600 البكتيريا المستزرعة. ونظرا لهذه الاعتبارات ، من المهم جدا تحديد منحنيات النمو لجميع السلالات التي سيتم فحصها قبل البدء في اختبارات التسمم الخلوي. نحن لا ننصح هذه الطرق لتحليل السمية الخلوية s. الذهبية مع سلالات التي تظهر الاختلافات الكبيرة في النمو في المختبر.

USA300 هو عزل جرثومه الخبيثة التي من المعروف ان تكون سامه للغاية ضد الإنسان pmns15 وفقدان saer/S في هذه السلالة يقلل بشكل كبير من النسخ العديد من الكريات البيضاء ثنائيه المكونات التي تستهدف الإنسان pmns6,12, مما يجعل هذه السلالات نماذج مثاليه للمقارنة الخلوية باستخدام المقايسات الموصوفة ومع ذلك ، هناك تباين الجينية واسعه النطاق بين مختلف العزلات s. الذهبية والمعلمات المفصلة في هذه البروتوكولات قد لا يؤدي إلى تغييرات كبيره في السمية الخلوية ضد pmns البشرية عند اختبار سلالات s. الذهبية الأخرى. الخياطة ظروف النمو ، وكميات من supernatants المضافة ، أو نسبه من البكتيريا إلى PMNs قد تكون مطلوبه للنجاح مع هذه الأساليب باستخدام سلالات أخرى من s.الذهبية.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الامريكيه للصحة المنح القومية-1R56AI135039-01A1, 1R56AI135039-01, U54GM115371 فضلا عن الأموال من محطه التجربة الزراعية جامعه ولاية مونتانا, ومنحه المعدات من الثقة الخيرية ميردوك .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container Baxter 2B1323Q PMN purification
1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps VWR 89000-044 Used in washing cells
1.8% Sodium Chloride Solution Sigma-Aldrich S5150 PMN purification
12x75mm Culture tubes VWR 60818-430 Used as flow cytometry tubes
20% (w/w) Dextran Sigma-Aldrich D8802 PMN purification
3125 Hand Tally Counter Traceable Products 3125CC For counting cells
50 mL conical centrifuge tubes VWR 89039-656 For dispensing media
Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium FischerScientific 211823 For growing cell cultures
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL FischerScientific BD 309657 For filtering supernatants
Bright-Line Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629 Cell counting apparatus
DPBS, 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium Corning 21-030-CV Used in washing cells
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 17-1440-02 PMN purification
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets FischerScientific 13-678-11E For aspirating liquid
Greiner CELLSTAR 96 well plates Millipore Sigma M0687 Plate for holding experimental samples
OMICRON Syringe Filters Omicron Scientific SFPV13R For filtering supernatants
Propidium iodide ThermoFisher Scientific P3566 Membrane impermeable DNA stain
PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks Cole-Parmer EW-34503-24 For growing cell cultures
RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red Corning 17-105-CV Used in resuspending cells
Sterile Water for Irrigation, USP Baxter 2F7113 PMN purification
The Pipette Pump Bel-Art Products F37898 For aspirating liquid
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Membrane integrity positive control

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foster, T. J., Geoghegan, J. A., Ganesh, V. K., Höök, M. Adhesion, invasion and evasion: The many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus. Nature Reviews Microbiology. , (2014).
  2. Thammavongsa, V., Kim, H. K., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcal manipulation of host immune responses. Nature Reviews Microbiology. 13 (9), 529-543 (2015).
  3. Otto, M. Staphylococcus aureus toxins. Current Opinion in Microbiology. , (2014).
  4. Guerra, F. E., Borgogna, T. R., Patel, D. M., Sward, E. W., Voyich, J. M. Epic Immune Battles of History: Neutrophils vs. Staphylococcus aureus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, (2017).
  5. Nygaard, T., Malachowa, N., Kobayashi, S. D., DeLeo, F. R. Phagocytes. Management of Infections in the Immunocompromised Host. , 1-25 (2018).
  6. Nygaard, T. K., Pallister, K. B., Ruzevich, P., Griffith, S., Vuong, C., Voyich, J. M. SaeR Binds a Consensus Sequence within Virulence Gene Promoters to Advance USA300 Pathogenesis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 241-254 (2010).
  7. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. J Infect Dis. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  8. Borgogna, T. R., et al. Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  9. Guerra, F. E., et al. Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1-6 (2016).
  10. Zurek, O. W., et al. The role of innate immunity in promoting SaeR/S-mediated virulence in Staphylococcus aureus. J Innate Immun. 6 (1), 21-30 (2014).
  11. Nygaard, T. K., et al. Aspartic Acid Residue 51 of SaeR Is Essential for Staphylococcus aureus Virulence. Frontiers in Microbiology. 9, at https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2018.03085 3085 (2018).
  12. Spaan, A. N., Van Strijp, J. A. G., Torres, V. J. Leukocidins: Staphylococcal bi-component pore-forming toxins find their receptors. Nature Reviews Microbiology. , (2017).
  13. Bøyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory. , (1968).
  14. Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. , (2014).
  15. Voyich, J. M., et al. Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils. J Immunol. 175 (6), 3907-3919 (2005).
  16. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. The Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).

Tags

المناعة والعدوى ، الإصدار 155 ، المكورات العنقوديةالذهبية ، جرثومه ، الكريات البيضاء البيضاء ، العدلات ، السموم ، السمية الخلوية ، الضراوة

Erratum

Formal Correction: Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes
Posted by JoVE Editors on 06/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes. The title was updated.

The title was updated from:

Quantifying the Cytotoxicity of Staphyloccus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

to:

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

تحديد كميه السمية الخلوية <em>للسبحيه</em> الذهبية ضد الكريات البيضاء البشرية الاحاديه النواة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dankoff, J. G., Pallister, K. B.,… More

Dankoff, J. G., Pallister, K. B., Guerra, F. E., Parks, A. J., Gorham, K., Mastandrea, S., Voyich, J. M., Nygaard, T. K. Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes. J. Vis. Exp. (155), e60681, doi:10.3791/60681 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter