Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantifiering av cytotoxiciteten hos staphyloccus aureus mot humana polymorfonukleära leukocyter

Published: January 3, 2020 doi: 10.3791/60681
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Montana State University, 2University Communications, Montana State University

ERRATUM NOTICE

Summary

Detta protokoll beskriver en metod för rening av polymorfonukleära leukocyter från hela humanblod och två distinkta analyser som kvantifierar cytotoxiciteten av Staphylococcus aureus mot dessa viktiga medfödda immunceller.

Abstract

Staphylococcus aureus kan utsöndrande ett brett spektrum av leukocidins att rikta och störa membranet integritet polymorfonukleära leukocyter (PMNs eller neutrofiler). Detta protokoll beskriver både rening av mänskliga PMNs och kvantifiering av S. aureus cytotoxicitet mot PMNs i tre olika sektioner. Avsnitt 1 specificerar isoleringen av PMNs och serum från humant blod med hjälp av densitetscentrifugering. Avsnitt 2 testar cytotoxiciteten av extracellulära proteiner som produceras av S. aureus mot dessa renade humana PMNs. avsnitt 3 mäter cytotoxiciteten mot humana PMNs efter fagocytos av levande S. aureus. Dessa förfaranden mäta störningar av PMN plasmamembran integritet av S. aureus leukocidins använder flödescytometri analys av PMNs behandlas med propidiumjodid jodid, en DNA-bindning fluorofore som är cellmembranet ogenomtränglig. Kollektivt, dessa metoder har fördelen av att snabbt testa S. aureus cytotoxicitet mot primära mänskliga PMNs och kan lätt anpassas för att studera andra aspekter av Host-patogen interaktioner.

Introduction

Staphylococcus aureus är en grampositiv bakterie som orsakar ett brett spektrum av sjukdomar hos människor. Denna framstående patogen producerar många virulensfaktorer som bidrar till olika aspekter av infektion. Dessa inkluderar ytan molekyler som gör att S. aureus att följa olika typer av värd vävnad1, extracellulära proteiner som stör värden immunsvar2, och en matris av utsöndras toxiner som riktar sig mot olika typer av värdceller3. I denna rapport beskriver vi en metod som kvantifierar cytotoxiciteten hos extracellulära proteiner som produceras av S. aureus mot humana polymorfonukleära leukocyter (PMNs eller neutrofiler), primära effektorceller i värdens medfödda immunsvar.

PMNs är de vanligast förekommande leukocyterna hos däggdjur. Dessa cirkulerande immunceller snabbt rekryteras till platsen för värd vävnad förolämpning som svar på varningssignaler som produceras av inhemska celler eller av föreningar som är unika för invaderande mikrober. Den extracellulära ingången från dessa molekyler och från direkta kontakter med aktiverade inhemska värdceller under extravasering ökar aktiveringstillståndet för PMNs i en process som kallas priming4,5. Primed PMNs som har nått nödställda vävnad sedan utföra viktiga medfödda immunsvar som utformats för att förhindra inrättandet av infektion. Dessa inkluderar bindning och internalisering, eller fagocytos, av invaderande mikroorganismer som utlöser en kaskad av intracellulära händelser kumulera i mikrobe förstörelse av ett batteri av potenta antimikrobiella föreningar5.

PMNs spelar en viktig roll som skyddar människor från invaderande patogener och är särskilt viktiga för att förebygga S. aureus infektion4. Denna bakterie producerar dock ett brett spektrum av virulensgener som hämmar olika PMN-funktioner. Dessa inkluderar extracellulära proteiner som blockerar erkännandet av signalmolekyler, förhindra vidhäftning till värd vävnad, hämma produktionen av antimikrobiella föreningar, och kompromiss plasmamembran integritet4. S. aureus iscengör det temporala uttrycket av dessa virulensgener genom den kollektiva ingången från flera sensoriska system med två komponenter som erkänner specifika Miljösignaler. Den Saer/S två-komponent-systemet är en större upp-regulator av S. aureus virulens gen transkription underinfektion 6,7,8,9,10,11. I synnerhet har detta två-komponent-system visat sig vara avgörande för produktionen av BI-komponent leukocidins som specifikt riktar sig till Human PMNs12.

Detta protokoll är uppdelat i tre olika sektioner. I det första avsnittet beskrivs rening av PMNs från humant blod med hjälp av densitetsgradientcentrifugering med hjälp av ett protokoll som har anpassats från de metoder som fastställts av Bøyum13 och Nauseef14. Den andra och tredje avsnitt detalj två olika tekniker för att undersöka S. aureus cytotoxicitet; en berusar PMNs med extracellulära proteiner som produceras av S. aureus medan den andra undersöker förmågan hos levande bakterier att skada PMNs efter fagocytos. Dessa förfaranden använder propidiumjodid jodid att mäta förlusten av PMN plasmamembran integritet orsakad av S. aureus pore-Forming toxiner. Propidium jodid är en DNA-bindande fluorophore som normalt är cellmembranet ogenomtränglig men kan korsa plasmamembran som har störts av S. aureus toxiner. Flödescytometrianalys gör det möjligt att snabbt kvantifiera propidiumjodid iodide-positiva PMNs för att mäta den relativa cytotoxiciteten hos S. aureus -stammar. Meticillinresistenta S. aureus (MRSA) identifierats som pulsad-fält gel elektrofores typ USA300 och en ISOGEN radering Mutant av Saer/s i denna stam (USA300ΔSaer/s) har använts som modeller för att visa hur dessa förfaranden kan kvantifiera cytotoxicitet av S. aureus mot mänskliga PMNs.

Protocol

Heparinized venöst blod från friska donatorer samlades in i enlighet med protokoll som godkänts av den institutionella prövnings nämnden för mänskliga ämnen vid Montana State University. Alla givare gav skriftligt medgivande till att delta i denna studie.

1. rening av humana polymorfonukleära leukocyter och isolering av humant serum

Anmärkning: alla reagenser bör rutinmässigt kontrolleras med avseende på förekomst av endotoxin med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt endotoxinhaltigt kit och bör innehålla < 25,0 pg/mL endotoxin för att förhindra oönskad priming av PMNs.

  1. Ta 50 mL 3% dextran-0,9% NaCl (w/v), 35 mL av 0,9% NaCl (w/v), 20 mL 1,8% NaCl (w/v), 12 mL av 1,077 g/mL densitet gradient lösning, och 20 mL av injektion-eller bevattning-grade vatten till rumstemperatur.
  2. För att isolera humant serum, inkubera 4 mL nydraget humant blod utan antikoagulantia vid 37 ° c i ett 15 mL glasrör i 30 min. Efter inkubering, Centrifugera provet vid 2000 – 3000 × g för 10 min vid rumstemperatur. Överför det övre serum skiktet till ett nytt 15 mL koniskt centrifugerör och placera på isen.
  3. Kombinera 25 mL nydragen hepariniserad (1000 enheter/mL) hela humanblod med 25 mL rumstemperatur 3% dextran-0,9% NaCl (1:1 ratio) i två replikat 50 mL koniska centrifugrör (50 mL total volym per tub). Blanda genom att försiktigt gunga varje 50 mL koniskt rör och låt stå i rumstemperatur i 30 min.
  4. Efter inkubering vid rumstemperatur visas två separata skikt. Överför det översta lagret av varje dextran-blodblandning till nya 50 mL koniska rör och centrifugera vid 450 x g i 10 min vid rumstemperatur med låga eller inga bromsar.
  5. Försiktigt aspirera både samman supernatanterna och kassera utan att störa cell pellets. Försiktigt Omsuspendera varje cell pellet i 2 mL rumstemperatur 0,9% NaCl, kombinera de återställd pellets i en enda 50 mL koniskt rör, tillsätt sedan resterande 0,9% NaCl (slutlig volym av 35 mL).
  6. Lägg försiktigt till 10 mL rumstemperatur på 1,077 g/mL densitet gradient lösning under cellsuspensionen med hjälp av en handpipett. Snurra på 450 x g i 30 min vid rumstemperatur med låga eller inga bromsar. Aspirera försiktigt supernatanten utan att störa cellpelleten. Supernatanten kommer att innehålla perifert blod mononukleära celler som kan samlas in som tidigare beskrivits14.
  7. Lysera de röda blodkropparna genom att omlägga cellpelleten i 20 mL rumstemperatur vatten. Blanda försiktigt genom att gunga röret i 30 s. Lys av röda blodkroppar kommer att åtföljas av en tydlig minskning av grumlighet.
  8. Tillsätt omedelbart 20 mL 1,8% NaCl (vid rumstemperatur [RT]) och centrifugera provet på 450 × g i 10 minuter vid rumstemperatur.
    Obs: det är viktigt att minimera den tid som PMNs lämnas i vatten ensamt efter röda blodkroppar Lys för att maximera PMN avkastning och förhindra PMN Lys och/eller aktivering.
  9. Aspirera försiktigt supernatanten utan att störa cellpelleten. Omsuspendera cellpelleten försiktigt i 2 mL RT RPMI 1640 medium och placera den på isen.
  10. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer. Resuspend renas PMNs vid en koncentration av 1 x 107 celler/ml med ISKALLA RPMI och hålla på is.
  11. Kombinera 100 μL renade PMNs (1 x 106 celler) med 300 μl av iskalla Dulbecco ' s fosfatbuffrad saltlösning (dpbs) innehållande 1 μl propidiumjodid jodid i två replikerande flödescytometerrör. För en positiv kontroll för plasmamembran skador, tillsätt 40 μL av 0,5% Triton X-100 lösning i en av flödescytometri rören och blanda grundligt.
  12. Använd flödescytometri för att mäta de renade cellernas framåtriktade spridnings-, sido spridnings-och propidiumjodid jodid-färgning (excitation/emission Maxima vid 535/617 nm) (figur 1).
    Anmärkning: framåt och sida scatter-analys kommer att identifiera oönskade populationer av lymfocyter och monocyter. Propidiumjodid jodid kommer endast att fläcka celler med ett komprometterat plasmamembran och renade PMNs som har uttalad population av propidiumjodid jodid positiva celler bör inte användas. För dessa studier användes renade PMNs endast om de bestod > 98% av renade celler och < 5% färgade positiva för propidiumjodid jodid.
  13. Förbered en 96-brunn plattan för PMN cytotoxicitet analyser genom beläggning enskilda brunnar som kommer att användas i denna analys med 100 μL av 20% isolerat humant serum som har späts med DPBS.
    Obs: bordläggningen PMNs direkt på plast eller glas kommer att orsaka aktivering av cellerna. Var noga med att inkludera minst en negativ kontroll väl som bara kommer att ta emot media och minst en positiv kontroll väl som kommer att få 0,05% Triton X-100.
  14. Inkubera plattan vid 37 ° c i 30 min. Efter inkubering tvättar du de belagda brunnarna två gånger med iskalla DPBS för att avlägsna eventuellt överskott av serum. Knacka försiktigt plattan upp och ner för att ta bort eventuella kvarvarande DPBS och placera på is.
  15. Tillsätt försiktigt 100 μL renad Human PMNs vid 1 x 107 celler/ml till varje belagd brunn (1 x 106 PMNs/well). Tillåt PMNs att bosätta sig i brunnar genom att ruinera plattan på isen i minst 5 min. Håll plattnivån för att möjliggöra jämn fördelning av celler i varje brunn och lämna på isen för att undvika oönskad aktivering av PMNs.

2. cytotoxicitetstest av S. aureus extracellulära proteiner mot humana polymorfonukleära leukocyter

  1. Kultur S. aureus över natten i Tryptic soy buljong (TSB) med hjälp av en skakning inkubator inställd på 37 ° c. För dessa studier inokulerades 20 mL TSB i separata 150 mL Erlenmeyer-kolvar med frysta kulturer av S. aureus -stammar USA300 eller USA300ΔSaer/s och odlas under cirka 14 timmar med skakning vid 250 RPM.
  2. Subculture S. aureus genom att utföra en 1:100 utspädning av natten bakteriell kultur med färska medier. Inkubera vid 37 ° c med skakning tills bakterierna når tidig stationär tillväxtfas.
    Anmärkning: för dessa experiment, 20 mL tryptic soja buljong i 150 mL Erlenmeyer flaskor inokulerades med 200 μL av natten odlade USA300 eller USA300ΔSaer/S och inkuberades vid 37 ° c med skakning vid 250 RPM för 5 h.
  3. När bakterierna har nått tidig stationär tillväxtfas, överför 1 mL av subodlade S. aureus till ett 1,5 ml microcentrifugerör och centrifugera vid 5 000 × g i 5 minuter vid rumstemperatur.
  4. Överför supernatanten till en 3 mL spruta efter centrifugering. Passera samman supernatanterna genom ett 0,22 μm filter och till en ny 1,5 ml microcentrifug rör på is.
  5. Utför seriella utspädningar av samman supernatanterna med iskallt material som används för att odla S. aureus.
    Anmärkning: för de experiment som visas, samman supernatanterna från USA300 och USA300ΔSaer/S genomgick fyra på varandra följande 1/2 log spädningar med iskalla TSB.
  6. Tillsätt försiktigt supernatanten prover eller media ensamt (för negativa och positiva kontroller) till enskilda brunnar i 96-brunn plattan som innehåller PMNs på is från steg 1,15. För dessa experiment lades 10 μL av USA300 eller USA300ΔSaer/S supernatanten prover till varje brunn. Försiktigt vagga plattan för att fördela samman supernatanterna i brunnar och inkubera vid 37 ° c.
  7. Vid önskade tidpunkter, ta bort plattan från inkubator och placera på isen. Tillsätt 40 μL 0,5% Triton X-100 till den positiva kontroll brunnen.
  8. Pipettera försiktigt proverna uppåt och nedåt i varje brunn för att helt dra av alla PMNs som sitter fast på plattan och överför sedan proverna till flödescytometerrör på is som innehåller 300 μL iskalla DPBS med 1 μL propidiumjodid iodide.
  9. Mät andelen propidiumjodid iodide-positiva PMNs med flödescytometri (figur 2A). När bunden till DNA, propidiumjodid jodid har excitation/emission vid 535/617 nm.

3. S. aureus cytotoxicitetstest mot humana polymorfonukleära leukocyter efter fagocytos

Anm: tillväxtkurvor som definieras av den optiska densiteten vid 600 Nm (OD600) och koncentrationen av bakterier måste bestämmas empiriskt för de S. aureus -stammar som ska testas innan denna analys påbörjas. Framgången för dessa experiment kräver konsekvent skörd av lika koncentrationer av varje S. aureus stam testas vid mitten av exponentiell tillväxtfas med hjälp av OD600 av sub-odlade bakterier.

  1. Börja över natten kulturer av S. aureus stammar och subkulturer bakterier som beskrivs i steg 2.1.1 och 2.1.2.
  2. Harvest subkultiverade S. aureus när den har nått mitten av exponentiell tillväxt genom att överföra 1 ml odlade bakterier till en 1,5 ml microcentrifug röret och centrifugering vid 5 000 × g för 5 min vid rumstemperatur.
    Obs: under våra tillväxtförhållanden, USA300 och USA300ΔSaer/S nådde mitten av exponentiell tillväxtfas efter cirka 135 min av inkubering6.
  3. Tvätta S. aureus efter centrifugering genom att aspirera på supernatanten, resuspendera pelleterade bakterier i 1 ml dpbs, vortexa provet för 30 S, och centrifugering vid 5 000 × g för 5 min vid rumstemperatur.
  4. Opsonize S. aureus genom att reomera den bakteriella pelleten i 1 ml 20% humant serum späddes med dpbs och inkuberas vid 37 ° c med agitation i 15 min.
  5. Centrifugera verksamhet bakterier vid 5 000 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Tvätta S. aureus efter centrifugering genom aspirera på supernatanten, resuspendera pelleterade bakterier i 1 ml dpbs, sedan Vortex provet tills bakterien pelleten är helt bruten isär plus ytterligare 30 sekunder. Centrifugera bakterier vid 5 000 × g i 5 min vid rumstemperatur.
  6. Omsuspendera verksamhet S. aureus stammar i 1 ml RPMI, Vortex provet tills bakteriell pellet är helt bruten isär, och sedan för ytterligare 30 S. Placera bakterier på is.
  7. Späd verksamhet S. aureus stammar till önskad koncentration med iskall RPMI. Vortex för 30 s och plats på is.
  8. Bekräfta koncentrationen av verksamhet S. aureus genom plätering 1:10 seriella utspädningar av bakterier på tryptic soja agar.
    Anmärkning: eftersom skillnader i koncentrationen av bakterier som används i denna analys kan ha en stor inverkan på efterföljande PMN plasmamembran permeabilitet (figur 3a), det är mycket viktigt att koncentrationen av varje stam testas bestäms för varje experiment och är likvärdig mellan stammar.
  9. Tillsätt försiktigt 100 μL/brunn av varje S. aureus -stam eller RPMI (för positiva och negativa kontroller) till PMNs i 96-brunnen plattan på is från steg 1,14. Försiktigt vagga plattan för att fördela S. aureus i brunnar.
  10. Synkronisera fagocytos genom centrifugering plattan vid 500 × g för 8 min vid 4 ° c15. Inkubera plattan vid 37 ° c omedelbart efter centrifugering (T = 0).
  11. Vid önskade tidpunkter, ta bort plattan från inkubator och placera på isen. Tillsätt 40 μL 0,5% Triton X-100 till den positiva kontroll brunnen.
  12. Pipettera försiktigt proverna uppåt och nedåt i varje brunn för att helt dra av alla PMNs som sitter fast på plattan och överför sedan proverna till flödescytometerrör på is som innehåller 200 μL iskall DPBS med 1 μL propidiumjodid jodid.
  13. Analysera prover för färgning av propidiumjodid jodid med flödescytometri enligt beskrivningen i steg 2,9.

Representative Results

Vi har visat hur de förfaranden som beskrivs ovan kan användas för att relativt kvantifiera cytotoxicitet av S. aureus mot mänskliga PMNs med MRSA PFGE-typ USA300 och en ISOGEN radering Mutant av Saer/s i denna stam (USA300ΔSaer/s) som genereras i tidigare studier6. PMNs som isolerats med de förfaranden som beskrivs i avsnitt 1 i detta protokoll färgas med propidiumjodid jodid och undersöktes med flödescytometri. Fram-och sido spridningsdiagram användes för att illustrera kontaminering av renade PMNs med monocyter eller lymfocyter (figur 1A, B) och PMN-integritet fastställdes med hjälp av propidiumjodid jodid-färgning (figur 1C). Den beskrivna metoden för mänsklig PMN rening kan konsekvent ge 0,5 x 107 till 1 x 108 PMNs som är > 98% ren och är > 95% propidiumjodid jodid negativ.

Den cytotoxicitet av extracellulära proteiner som produceras av USA300 och USA300ΔSaer/S testades mot renade PMNs (figur 2) enligt de förfaranden som beskrivs i avsnitt 2 i detta protokoll. Dessa experiment visar en koncentrationsberoende ökning av färgning av propidiumjodid jodid av renade PMNs efter 30 min av berusning med extracellulära proteiner som produceras av USA300 (figur 2B). Tidigare studier har visat att Saer/S Tvåkomponentsystem är viktigt för uttryck av många bi-komponent leukocidins som riktar sig till mänskliga PMNs6,10,11,16. Congruent med dessa tidigare fynd, mycket få propidiumjodid iodide-positiva PMNs upptäcktes efter exponering för extracellulära proteiner som produceras av USA300ΔSaer/S (figur 2B). Ytterligare experiment visade en stadig ökning av andelen lyserade PMNs efter förgiftning av USA300 extracellulära proteiner som nått sitt tak efter cirka 30 min (figur 2C). Minimal lys av humana PMNs noterades vid alla tidpunkter efter exponering för extracellulära proteiner som produceras av USA300ΔSaer/S. Dessa resultat illustrerar nyttan av denna analys för den relativa kvantifiering av cytotoxicitet av extracellulära S. aureus proteiner mot mänskliga PMNs.

Vi testade USA300 och USA300ΔSaer/s med hjälp av s. aureus Cytotoxicitetstest mot Human PMNs efter fagocytos som beskrivs i avsnitt 3 i detta protokoll (figur 3). En koncentrationsberoende ökning av andelen propidiumjodid jodid positiva PMNs observerades 90 min efter fagocytos av USA300 (figur 3A). En signifikant minskning observerades i andelen PMNs som var positiva för propidiumjodid jodid efter fagocytos av USA300ΔSaer/s (figur 3A), vilket stödde andra resultat som indikerar att Saer/s två-komponentsystem är viktigt för cytotoxiciteten av s. aureus mot humana PMNs (figur 2)7,11. Som tidigare nämnts och visat i figur 3A, skillnader i S. aureus koncentration har en uttalad inverkan på PMN Lys efter fagocytos. Uppräkning av USA300 och USA300ΔSaer/S inokulum som används i vart och ett av dessa experiment visade att kontrasten i cytotoxicitet mellan dessa stammar inte berodde på skillnader i koncentrationen av bakterier som används (figur 3B). Dessa fynd visar hur s. aureus cytotoxicitetstest mot humana PMNs efter fagocytos kan användas för att bedöma förmågan hos olika s. aureus stammar att äventyra människans PMN plasmamembran integritet.

Figure 1
Figur 1: flödescytometri analys av renade PMNs. Representativ flödescytometri dot tomter av (a) renade mänskliga PMNs och (B) PMNs som avsiktligt har kontaminerats med perifera mononukleära blodceller. (C) representativt flödescytometrihistogram som visar minimal färgning av propidiumjodid jodid (< 1%) av renade PMNs (skuggad grå) jämfört med PMNs som behandlats med 0,05% Triton X-100 (skuggad röd). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: flödescytometri analys av PMNs berusade med extracellulära proteiner som produceras av S. aureus. (A) representativt flödescytometri histogram över PMNs färgas med propidiumjodid jodid efter 30 min av inkubering med Media kontroll (skuggad blå), filtrerad USA300 supernatanten vid en slutlig koncentration av 1:110 (skuggad grå), eller 0,05% Triton X-100 (skuggad röd). B) andelen positiva PMNs av propidiumjodid-jodid efter 30 min inkubation med olika koncentrationer av USA300 eller USA300 ∆Saer/S- supernatanter. C) andelen propidiumjodid jodid positiva PMNs med tiden efter inkubering med USA300 eller USA300 ∆Saer/S supernatanten vid en slutlig koncentration av 1:110. Data presenteras som medelvärde ± SEM av minst 3 separata experiment med * p ≤ 0,05 och * * p ≤ 0,005, som bestäms av tvåsidiga t-test. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: flödescytometri analys av PMNs efter fagocytos av S. aureus. (A) andelen propidiumjodid jodid positiva PMNs 90 min efter fagocytos av olika koncentrationer av USA300 eller USA300 ∆Saer/S. B) koncentrationen av opsoniserade S. aureus -stammar som används för de experiment som visas i panel A. data presenteras som medelvärdet ± SEM av 4 separata experiment med * p ≤ 0,01, som bestäms av tvåsidiga t-test. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta protokoll beskriver rening av PMNs från humant blod och två distinkta analyser som använder propidiumjodid jodid för att kvantifiera cytotoxiciteten hos S. aureus mot dessa viktiga medfödda immunceller. Framgången för dessa förfaranden kommer att bero på kvaliteten på renade PMNs och lämplig beredning av S. aureus och extracellulära proteiner som produceras av denna patogen. För isolering av PMNs, är det viktigt att minimera PMN aktivering under och efter rening genom att använda reagenser fria från endotoxin förorening, behandla cell preparat försiktigt, och hålla celler vid lämplig temperatur. Tecken som indikerar aktivering av PMNs inkluderar klumpar av celler under rening och när mer än 5% av isolerade celler fläcken positiv för propidiumjodid jodid. På grund av PMNs relativt korta livslängd måste dessa celler isoleras från mänskligt blod och testas samma dag. PMNs kommer att börja uppvisa tecken på spontan apoptos om de lämnas på is under mer än 3 h efter rening. Som tidigare nämnts, det är mycket viktigt att varje PMN beredning utvärderas noggrant med hjälp av flödescytometri analys av framåt och sida scatter samt propidiumjodid jodid färgning för att säkerställa renhet och integritet isolerade celler.

Uttrycket av BI-komponent leukocidins av S. aureus är ansvarig för majoriteten av äventyras PMN plasmamembran integritet som observeras med hjälp av analyser som beskrivs i detta protokoll. Variation i uttrycket av dessa toxiner och andra Porbildande peptider, såsom fenollösliga Moduliner, mellan stammar av S. aureus kommer att producera skillnader i cytotoxicitet mot mänskliga PMNs. signifikanta avvikelser under in vitro-tillväxt mellan S. aureus stammar kommer också att påverka uttrycket av Porbildande toxiner och efterföljande cytotoxicitet. Dessutom, förhållandet mellan S. aureus till PMNs i fagocytos analyser har en stor inverkan på efterföljande PMN plasmamembran permeabilitet (figur 3a) och dessa experiment kräver konsekvent skörd av lika koncentrationer av varje S. aureus stam testas vid mitten av exponentiell tillväxtfas med hjälp av OD600 av subodlade bakterier. Med tanke på dessa överväganden, det är mycket viktigt att definiera tillväxtkurvor för alla stammar som kommer att undersökas innan du påbörjar cytotoxicitetsanalyser. Vi rekommenderar inte dessa metoder för att analysera S. aureus cytotoxicitet med stammar som uppvisar signifikanta tillväxtskillnader in vitro.

USA300 är ett virulent MRSA-isolat som är känt för att vara mycket cytotoxiskt mot humant PMNs15 och förlusten av Saer/S i denna stam minskar dramatiskt transkription av många bi-komponent leukocidins som riktar mänskliga PMNs6,12, vilket gör dessa stammar idealiska modeller för att jämföra cytotoxicitet med hjälp av de beskrivna analyserna. Emellertid, det finns omfattande genetisk variation mellan olika s. aureus isolat och de parametrar som beskrivs i dessa protokoll kan inte resultera i betydande förändringar i cytotoxicitet mot mänskliga PMNs när man testar andra S. aureus stammar. Att skräddarsy tillväxtförhållanden, volymer av supernatanter tillsätts eller förhållandet mellan bakterier till PMNs kan krävas för framgång med dessa metoder med hjälp av andra stammar av S. aureus.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av US National Institutes of Health beviljar NIH-1R56AI135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM115371 samt medel från Montana State University Agriculture experiment Station, och en utrustning bidrag från Murdock välgörenhet Trust .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container Baxter 2B1323Q PMN purification
1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps VWR 89000-044 Used in washing cells
1.8% Sodium Chloride Solution Sigma-Aldrich S5150 PMN purification
12x75mm Culture tubes VWR 60818-430 Used as flow cytometry tubes
20% (w/w) Dextran Sigma-Aldrich D8802 PMN purification
3125 Hand Tally Counter Traceable Products 3125CC For counting cells
50 mL conical centrifuge tubes VWR 89039-656 For dispensing media
Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium FischerScientific 211823 For growing cell cultures
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL FischerScientific BD 309657 For filtering supernatants
Bright-Line Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629 Cell counting apparatus
DPBS, 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium Corning 21-030-CV Used in washing cells
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 17-1440-02 PMN purification
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets FischerScientific 13-678-11E For aspirating liquid
Greiner CELLSTAR 96 well plates Millipore Sigma M0687 Plate for holding experimental samples
OMICRON Syringe Filters Omicron Scientific SFPV13R For filtering supernatants
Propidium iodide ThermoFisher Scientific P3566 Membrane impermeable DNA stain
PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks Cole-Parmer EW-34503-24 For growing cell cultures
RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red Corning 17-105-CV Used in resuspending cells
Sterile Water for Irrigation, USP Baxter 2F7113 PMN purification
The Pipette Pump Bel-Art Products F37898 For aspirating liquid
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Membrane integrity positive control

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foster, T. J., Geoghegan, J. A., Ganesh, V. K., Höök, M. Adhesion, invasion and evasion: The many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus. Nature Reviews Microbiology. , (2014).
  2. Thammavongsa, V., Kim, H. K., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcal manipulation of host immune responses. Nature Reviews Microbiology. 13 (9), 529-543 (2015).
  3. Otto, M. Staphylococcus aureus toxins. Current Opinion in Microbiology. , (2014).
  4. Guerra, F. E., Borgogna, T. R., Patel, D. M., Sward, E. W., Voyich, J. M. Epic Immune Battles of History: Neutrophils vs. Staphylococcus aureus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, (2017).
  5. Nygaard, T., Malachowa, N., Kobayashi, S. D., DeLeo, F. R. Phagocytes. Management of Infections in the Immunocompromised Host. , 1-25 (2018).
  6. Nygaard, T. K., Pallister, K. B., Ruzevich, P., Griffith, S., Vuong, C., Voyich, J. M. SaeR Binds a Consensus Sequence within Virulence Gene Promoters to Advance USA300 Pathogenesis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 241-254 (2010).
  7. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. J Infect Dis. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  8. Borgogna, T. R., et al. Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  9. Guerra, F. E., et al. Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1-6 (2016).
  10. Zurek, O. W., et al. The role of innate immunity in promoting SaeR/S-mediated virulence in Staphylococcus aureus. J Innate Immun. 6 (1), 21-30 (2014).
  11. Nygaard, T. K., et al. Aspartic Acid Residue 51 of SaeR Is Essential for Staphylococcus aureus Virulence. Frontiers in Microbiology. 9, at https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2018.03085 3085 (2018).
  12. Spaan, A. N., Van Strijp, J. A. G., Torres, V. J. Leukocidins: Staphylococcal bi-component pore-forming toxins find their receptors. Nature Reviews Microbiology. , (2017).
  13. Bøyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory. , (1968).
  14. Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. , (2014).
  15. Voyich, J. M., et al. Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils. J Immunol. 175 (6), 3907-3919 (2005).
  16. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. The Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).

Tags

Immunologi och infektion Staphylococcus aureus MRSA polymorfonukleärt leukocyter neutrofila toxin cytotoxicitet virulens

Erratum

Formal Correction: Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes
Posted by JoVE Editors on 06/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes. The title was updated.

The title was updated from:

Quantifying the Cytotoxicity of Staphyloccus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

to:

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Kvantifiering av cytotoxiciteten hos <em>staphyloccus aureus</em> mot humana polymorfonukleära leukocyter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dankoff, J. G., Pallister, K. B.,… More

Dankoff, J. G., Pallister, K. B., Guerra, F. E., Parks, A. J., Gorham, K., Mastandrea, S., Voyich, J. M., Nygaard, T. K. Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes. J. Vis. Exp. (155), e60681, doi:10.3791/60681 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter