Summary
Her presenterer vi en protokoll for å oppdage totale cellulære reaktive oksygenarter (ROS) ved hjelp av 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Denne metoden kan visualisere cellulær ROS lokalisering i tilhengerceller med et fluorescensmikroskop og kvantifisere ROS-intensitet med en fluorescensplateleser. Denne protokollen er enkel, effektiv og kostnadseffektiv.
Abstract
Oksidativt stress er en viktig hendelse under både fysiologiske og patologiske forhold. I denne studien viser vi hvordan man kvantifisere oksidativt stress ved å måle totale reaktive oksygenarter (ROS) ved hjelp av 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) farging i kolorektal kreftcellelinjer som et eksempel. Denne protokollen beskriver detaljerte trinn, inkludert utarbeidelse av DCFH-DA-løsning, inkubasjon av celler med DCFH-DA-løsning og måling av normalisert intensitet. DCFH-DA farging er en enkel og kostnadseffektiv måte å oppdage ROS i celler. Den kan brukes til å måle ROS generasjon etter kjemisk behandling eller genetiske modifikasjoner. Derfor er det nyttig for å bestemme cellulær oksidativt stress på miljøstress, og gir ledetråder til mekanistiske studier.
Introduction
Tre store reaktive oksygenarter (ROS) produsert av cellulær metabolisme som er av fysiologisk betydning er superoksidanion, hydroksylradikal og hydrogenperoksid1. Ved lave konsentrasjoner deltar de i fysiologiske celleprosesser, men ved høye konsentrasjoner har de bivirkninger på cellesignaler1. Kroppen vår har utviklet antioksidantsystemer, som er effektive mot overdreven ROS. Oksidativt stress kan imidlertid oppstå når ROS overvelder kroppens avgiftende evne, noe som bidrar til mange patologiske tilstander, inkludert betennelse, kreft og nevrodegenerativ sykdom2,3,4. Formålet med denne metoden er å bestemme total cellulær ROS i tilhengerceller ved hjelp av 2',7'-diklordiohydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) farging. Begrunnelsen er at oksidasjon av DCFH-DA til 2'-7'diklorofluorescein (DCF) har blitt brukt mye for total ROS-deteksjon, inkludert hydroksylradikaler (•OH) og nitrogendioksid (•NO2). Mekanistisk, DCFH-DA er tatt opp av celler der cellulær esterase cleaves av acetyl grupper, noe som resulterer i DCFH. Oksidasjon av DCFH av ROS konverterer molekylet til DCF, som avgir grønn fluorescens ved en eksitasjon bølgelengde på 485 nm og en utslipp bølgelengde på 530 nm. Sammenlignet med påvisning av fluorescens med strømningscytometri og andre alternative metoder5, fordeler med denne metoden ved hjelp av et fluorescensmikroskop og en plateleser er at den produserer tydelig synlige fluorescerende bilder, og er enkle å utføre, effektive og kostnadseffektive. Denne metoden har blitt mye brukt til å oppdage cellulær ROS for å studere ulike forhold6,7,8. Denne protokollen brukes til å oppdage total ROS i tilhengerceller. Ved hjelp av denne metoden for å oppdage ROS i suspensjon celler kan trenge noen modifikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellereding
- Frø 2 x 105 HCT116 kolorektal kreftceller per brønn i en 24-brønnplate og vedlikehold cellene i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) over natten ved 37 °C.
- Bytt kulturmediet med eller uten 100 μM jernsulfat (FS) eller 10 μM doksorubicin (DOX) som inneholder medium og inkuber i 24 timer.
2. Tilberedning av DCFH-DA-oppløsningen
- Oppløs 4,85 mg DCFH-DA i 1 ml dimetylsulfoksid (DMSO) for å lage en 10 mM lagerløsning.
- Fortynn lagerløsningen med forvarmet DMEM i 10 μM arbeidsløsning rett før du legger den til brønnene.
- Vortex arbeidsløsningen i 10 s.
3. DCFH-DA farging
- Fjern stoffet som inneholder medium og vask en gang med DMEM.
- Tilsett 500 μL av DCFH-DA arbeidsløsning i hver brønn og inkuber ved 37 °C i 30 min.
- Fjern DCFH-DA-arbeidsløsningen. Vask én gang med DMEM og 2x med 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
- Tilsett 500 μL 1x PBS til hver brønn.
4. Måling av bildeoppkjøp og intensitet
- Ta representative fluorescerende bilder for hver brønn ved hjelp av den grønne fluorescerende proteinkanalen (GFP) på et fluorescensmikroskop.
- Etter å ha tatt bilder, fjern PBS og legg til 200 μL radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer til hver brønn.
- Inkuber på is i 5 min, og samle deretter cellelysat i 1,5 ml rør.
- Sentrifuge ved 21 130 x g i 10 min ved 4 °C.
- Overfør 100 μL av supernatanten til en svart 96-brønnplate og mål fluorescensintensiteten ved hjelp av en fluorescens en mikroplateleser ved en eksitasjonsbølgelengde på 485 nm og en utslippsbølgelengde på 530 nm.
- Overfør 1 μL av supernatanten til en klar 96 brønnplate som inneholder 100 μL 1x proteinanalyseoppløsning for å måle proteinkonsentrasjonen ved hjelp av Bradford-analysen9.
- Normaliser fluorescensintensiteter med proteinkonsentrasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HCT116 kolorektal kreftceller ble behandlet med 100 μM FS eller 10 μM DOX for å indusere oksidativt stress7. Som vist i figur 1ble grønn fluorescens dramatisk økt med både FS og DOX som forventet. For å kvantifisere den relative intensitetsendringen ble cellene lysert etter å ha tatt bilder og normalisert med proteinkonsentrasjoner. Den kvantifiserte fluorescensintensiteten ble signifikant økt med FS- eller DOX i HCT116-celler.
Figur 1: Jernbehandling øker ROS i kolorektal kreftceller. Representative fluorescerende bilder tatt av et fluorescensmikroskop og intensitetskvantifisering av en mikroplateleser med fluorescens for 2',7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetate (DCFH-DA) i HCT116 celler etter ubehandlet kontroll (Ctrl), (A) 100 μM jernsulfat (FS) eller (B) 10 μM doksorubicin (DOX) behandling i 24 h. Skala bar = 400 μm. * = p < 0,05; = p < 0,001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den eksperimentelle protokollen som er beskrevet her er lett reproduserbar for å måle cellulær total ROS. De kritiske trinnene inkluderer å gjøre DCFH-DA-løsningen frisk og unngå lyseksponering, minimere cellestatusforstyrrelser og omfattende PBS-vask rett før du tar bilder. For fremstilling av DCFH-DA arbeidsløsning, bør lagerløsningen legges til pre-oppvarmet DMEM rett før du legger inn i 24 brønnplaten. Årsaken er at gamle løsninger som genererer høy bakgrunnsfluorescens eller lyseksponering vil føre til fotobleking. De fleste studier bruker 1x PBS eller 1x Hanks' balanserte saltoppløsning (HBSS) for å fortynne DCFH-DA og bruke den som reaksjonsbuffer10. Men når du bruker HCT116 og RKO, fortynning av DCFH-DA lagerløsning med PBS og føtal storfe serum fri DMEM generert høy bakgrunnssignal selv i ubehandlet celle. Dette kan skyldes cellestatusforstyrrelser. I tillegg bør DCFH-DA arbeidsløsning tilsettes sakte langs brønnveggen. Forstyrrelse av cellestatus vil generere høyt fluorescenssignal sammenlignet med det uforstyrrede nærliggende området. Det er også viktig å vaske minst to ganger med PBS før du tar bilder for å redusere automatisk fluorescens av fenol som inneholder DMEM. Fenolfri DMEM kan være et bedre valg, men vi viser her at PBS-vask var tilstrekkelig til å minimere autofluorescens. Som vist i figur 1kan to forskjellige grupper med eksperimenter føre til forskjellige representative bilder. For å kontrollere eksperimentelle variasjoner anbefaler vi at du behandler celler med fortynnet DCFH-DA-arbeidsløsning (som i protokollen) i stedet for å legge til lagerløsning direkte på cellene. Det bør også tas bilder i felt med lignende celletettheter og samme eksponeringstid. Til slutt er det viktig å utføre eksperimenter på alle sammenligningsgrupper samtidig.
På grunn av betydningen av ROS, har spesifikk ROS-deteksjon, i tillegg til total ROS-deteksjon, også blitt utviklet. For eksempel kan cellulær produksjon av superoksid oppdages av dihydroethidium, som ved oksidasjon resulterer i hydroksylering ved 2-posisjon for å danne 2-hydroksyethidium. Som 2-hydroksyethidium interkalater i cellulær DNA, kan rød fluorescens med eksitasjon og utslippsbølgelengder på henholdsvis 535 nm og 635 nm observeres. Mitokondriesuperoksid kan visualiseres med MitoSOX reagens, et kationisk derivat av dihydroehidium som kommer inn i levende celler og spesifikt retter seg mot mitokondrier. Oksidasjonsproduktet av Mitosox som genererer rød fluorescens kan interkalateres til mitokondrie-DNA. Chemoselective fluorescerende naphthylimide peroksid sonde ble utviklet for H2O2 deteksjon11. I tillegg ble det også rapportert12.
Oppsummert, her beskrev vi en enkel og optimalisert protokoll for å oppdage cellulær total ROS ved hjelp av kostnadseffektiv DCFH-DA-farging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health (K01DK114390), en forskerstipend fra American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), et forskningspilotprosjekt Stipend fra University of New Mexico Environmental Health Signature Program og Superfund (P42 ES025589), en Shared Resources Pilot Project Award og en Research Program Support Pilot Project Award fra UNM omfattende kreftsenter (P30CA118100) , og en ny etterforsker pris fra dedikerte helseforskning midler ved University of New Mexico School of Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
References
- Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
- Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
- Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17 (2014).
- Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
- Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).
- Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11 (4), (2016).
- Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
- Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).
- Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).
- Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).
- Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
- Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).
