Summary
Здесь мы представляем протокол для обнаружения общего клеточного реактивного вида кислорода (ROS) с использованием 2'-7'-dichlorodihydrofluorescein диацетат (DCFH-DA). Этот метод может визуализировать клеточной локализации ROS в адептовых клеток с флуоресценции микроскопа и количественно ROS интенсивности с флуоресценции пластины читателя. Этот протокол прост, эффективен и рентабельн.
Abstract
Оксидационный стресс является важным событием как в физиологических, так и в патологических условиях. В этом исследовании мы демонстрируем, как количественно окислительного стресса путем измерения общего реактивного вида кислорода (ROS) с использованием 2'-dichlorodihydroflucescein диацетат (DCFH-DA) окрашивания в колоректальных раковых клеток линий в качестве примера. Этот протокол описывает подробные шаги, включая подготовку решения DCFH-DA, инкубацию клеток с раствором DCFH-DA и измерение нормализоваем интенсивности. Окрашивание DCFH-DA является простым и экономичный способ обнаружения ROS в клетках. Он может быть использован для измерения поколения ROS после химической обработки или генетических модификаций. Таким образом, это полезно для определения клеточного окислительного стресса на окружающую среду стресс, предоставляя ключи к механистических исследований.
Introduction
Три основных реактивных видов кислорода (ROS), вырабатываемых клеточным метаболизмом, которые имеют физиологическое значение, являются супероксидной анионом, гидроксилом радикалом и перекисьюводорода 1. При низких концентрациях они участвуют в физиологических клеточных процессах, но при высоких концентрациях они оказывают неблагоприятное воздействие на клеточные сигнальные пути1. В нашем организме разработаны антиоксидантные системы, которые эффективны против чрезмерного РОС. Тем не менее, окислительный стресс может произойти, когда ROS переполняет детоксикационную способность нашего организма, что способствует многим патологическим состояниям, включая воспаление, рак и нейродегенеративные заболевания2,,3,,4. Цель этого метода заключается в определении общего клеточного РОС в адептовых клетках с помощью 2'-7'-dichlorodihydroflucescein диацетат (DCFH-DA) окрашивания. Обоснование заключается в том, что окисление DCFH-DA до 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) широко используется для общего обнаружения ROS, включая гидроксил-радикалы (ОГ) и диоксид азота (NO2). Механически, DCFH-DA занимает клетки, где клеточные эстеразы расщепляется от ацетиловых групп, в результате чего DCFH. Окисление DCFH ROS преобразует молекулу в DCF, который испускает зеленую флуоресценцию на длине возбуждения 485 нм и длиной волны выбросов 530 нм. По сравнению с обнаружением флуоресценции с цитометрией потока и другими альтернативными методами5,преимущества этого метода с использованием флуоресценции микроскопа и плиты читателя в том, что он производит четко видимые флуоресцентные изображения, и легко выполнять, эффективным и экономически эффективным. Этот метод широко используется для обнаружения клеточного ROS для изучения различных условий6,,7,,8. Этот протокол используется для обнаружения общего ROS в клетках-адептах. Использование этого метода для обнаружения ROS в подвесных камерах может потребоваться некоторые изменения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Посев клеток
- Семя 2 х 105 ХКТ116 колоректальных раковых клеток на хорошо в 24-хорошо пластины и поддерживать клетки в модифицированной среде Eagle Dulbecco (DMEM) на ночь на 37 градусов по Цельсию.
- Замените культурную среду или без 100 сульфатов железа (FS) или 10 доксорубицина (DOX), содержащего средний и инкубировать в течение 24 ч.
2. Подготовка решения DCFH-DA
- Растворите 4,85 мг DCFH-DA в 1 мл диметил сульфоксида (DMSO), чтобы сделать 10 мМ фондовый раствор.
- Разбавить раствор запаса предварительно разогретым DMEM в 10 ММ рабочий раствор прямо перед добавлением его в скважины.
- Vortex - рабочее решение для 10 с.
3. Окрашивание DCFH-DA
- Удалите препарат, содержащий средний и мыть один раз с DMEM.
- Добавьте 500 мл рабочего решения DCFH-DA в каждый колодец и инкубировать при 37 градусах в течение 30 мин.
- Удалите рабочее решение DCFH-DA. Вымойте один раз с DMEM и 2x с 1x фосфат-буферизированный солевой раствор (PBS).
- Добавьте 500 хл 1x PBS к каждому колодцу.
4. Измерение приобретения и интенсивности визуализации
- Возьмите репрезентативные флуоресцентные изображения для каждого колодца с помощью зеленого флуоресцентного белка (GFP) канала на флуоресценции микроскопа.
- После съемки снимков удалите PBS и добавьте 200 МЛ буфера радиоиммунопреципионации (RIPA) к каждой скважине.
- Инкубировать на льду в течение 5 мин, затем собирать лисировать клетки в 1,5 мл труб.
- Центрифуга при 21 130 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
- Перенесите 100 мл супернатанта на черную пластину 96 скважин и измерьте интенсивность флуоресценции с помощью флуоресценции микроплиты читателя на длине возбуждения 485 нм и длиной волны выбросов 530 нм.
- Передача 1 л супернатанта на четкую 96-ю хорошо пластину, содержащую 100 мл раствора протеина для измерения концентрации белка с помощью Брэдфордского анализа9.
- Нормализация интенсивности флуоресценции с концентрацией белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клеток колоректального рака HCT116 лечили 100 м ФС или 10 МЛ DOX, чтобы вызвать окислительный стресс7. Как показано на рисунке 1,зеленая флуоресценция была резко увеличена как FS, так и DOX, как и ожидалось. Для количественной оценки изменения относительной интенсивности клетки были пролистины после получения изображений и нормализованы с концентрацией белка. Количественная интенсивность флуоресценции была значительно увеличена FS или DOX в клетках HCT116.
Рисунок 1: Лечение железа увеличивает ROS в колоректальных раковых клетках. Представитель флуоресцентные изображения, сделанные флуоресценсовым микроскопом и интенсивность количественной оценки флуоресценции микроплиты для 2',7'-dichlorodihydrofluorescein диацетата (DCFH-DA) окрашивания в клетки HCT116 после необработанных контроль (Ctrl), (A) 100 qM сульфат железа (FS) или (B) 10 доксорубицин (DOX) лечение для 24 ч. Шкала бар No 400 мкм. - р-л; 0,05; р-л; 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Экспериментальный протокол, описанный здесь, легко воспроизводится для измерения клеточного общего ROS. Критические шаги включают в себя создание решения DCFH-DA свежим и избегание воздействия света, минимизация нарушения состояния клеток и обширная стирка PBS перед съемкой изображений. Для приготовления рабочего решения DCFH-DA, фондовый раствор должен быть добавлен в предварительно разогретый DMEM прямо перед добавлением в 24 пластины скважины. Причина в том, что старые решения, которые генерируют высокий фон флуоресценции или световой экспозиции приведет к фотоблескал. Большинство исследований используют 1x PBS или 1x Хэнкс 'сбалансированный раствор соли (HBSS) для разбавления DCFH-DA и использовать его в качестве буфера реакции10. Однако при использовании HCT116 и RKO разбавление стокового раствора DCFH-DA с ПОМОЩЬЮ PBS и сыворотки крупного рогатого скота плода БЕСПЛАТНО DMEM генерируется высокий фоновый сигнал даже в необработанных клетках. Это может быть связано с нарушением статуса клетки. Кроме того, рабочее решение DCFH-DA следует медленно добавлять вдоль стены скважины. Нарушение статуса клетки будет генерировать высокий сигнал флуоресценции по сравнению с нетронутой близлежащей области. Также очень важно мыть по крайней мере дважды с PBS, прежде чем принимать изображения, чтобы уменьшить автоматическое флуоресценцию фенола, содержащего DMEM. Phenol-бесплатно DMEM может быть лучшим выбором, но мы показываем здесь, что PBS стирки было достаточно, чтобы свести к минимуму автоматической флуоресценции. Как показано на рисунке 1, даже в необработанных контрольных групп две различные партии экспериментов может привести к различным репрезентативным изображениям. Для контроля экспериментальных вариаций мы рекомендуем обрабатывать клетки разбавленным рабочим раствором DCFH-DA (как в протоколе), вместо того, чтобы добавлять стоковое раствор непосредственно в клетки. Кроме того, изображения должны быть сделаны в полях с аналогичными плотности клеток и то же время экспозиции. Наконец, важно проводить эксперименты на всех группах сравнения одновременно.
В связи со значением ROS, конкретные обнаружения ROS, в дополнение к общей обнаружения ROS, также была разработана. Например, клеточное производство супероксида может быть обнаружено дигидроэтидом, который при окислением приводит к гидроксиляции на 2-позиционом для формирования 2-гидроксиетия. Как 2-гидроксиэтидий переплетается в клеточной ДНК, красная флуоресценция с возбуждением и длины волн выбросов 535 нм и 635 нм, соответственно, можно наблюдать. Митохондриальный супероксид может быть визуализирована с помощью реагента MitoSOX, катиохийного производного дигидроэтиума, который входит в живые клетки и, в частности, нацелен на митохондрии. Продукт окисления Mitosox, который генерирует красную флуоресценцию, может переплетаться в митохондриальную ДНК. Химиоселективный флуоресцентный зонд перекиси нафталимида был разработан для обнаружения H2O2 11. Кроме того, было также сообщено об обнаружении гидроксил-радикалов с использованием флуоресценции спектрофотометрии.12
Таким образом, здесь мы описали простой и оптимизированный протокол для обнаружения сотовой общей ROS с использованием экономически эффективных DCFH-DA окрашивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения (K01DK114390), научно-исследовательский грант Американского онкологического общества (RSG-18-050-01-NEC), экспериментальный исследовательский проект Грант из Университета Нью-Мексико экологического здоровья Подпись программы и Superfund (P42 ES025589), Общие ресурсы пилотный проект премии и научно-исследовательской программы поддержки экспериментального проекта премии от UNM всеобъемлющего онкологического центра (P30CA118100) , и новый следователь награду от выделенных фондов исследований в области здравоохранения в Университете Нью-Мексико школы медицины.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
References
- Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
- Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
- Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17 (2014).
- Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
- Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).
- Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11 (4), (2016).
- Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
- Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).
- Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).
- Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).
- Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
- Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).
