Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att upptäcka totala cellulära reaktiva syrearter (ROS) med 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Denna metod kan visualisera cellulära ROS lokalisering i vidhäftande celler med en fluorescens mikroskop och kvantifiera ROS intensitet med en fluorescens platta läsare. Detta protokoll är enkelt, effektivt och kostnadseffektivt.
Abstract
Oxidativ stress är en viktig händelse under både fysiologiska och patologiska förhållanden. I denna studie visar vi hur man kvantifierar oxidativ stress genom att mäta totala reaktiva syrearter (ROS) med 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) färgning i kolorektal cancer cellinjer som ett exempel. Detta protokoll beskriver detaljerade steg inklusive beredning av DCFH-DA lösning, inkubation av celler med DCFH-DA lösning och mätning av normaliserad intensitet. DCFH-DA färgning är ett enkelt och kostnadseffektivt sätt att upptäcka ROS i celler. Det kan användas för att mäta ROS-generering efter kemisk behandling eller genetiska modifieringar. Därför är det användbart för att bestämma cellulär oxidativ stress på miljöstr stress, vilket ger ledtrådar till mekanistiska studier.
Introduction
Tre stora reaktiva syrearter (ROS) som produceras av cellulär metabolism som är av fysiologisk betydelse är superoxid anjon, hydroxylradikal, och väteperoxid1. Vid låga koncentrationer deltar de i fysiologiska cellprocesser, men vid höga koncentrationer har de negativa effekter på cellsignaleringsvägarna1. Vår kropp har utvecklat antioxidant system, som är effektiva mot överdriven ROS. Emellertid, oxidativ stress kan uppstå när ROS överväldiga avgiftande förmåga vår kropp, vilket bidrar till många patologiska tillstånd, inklusive inflammation, cancer, och neurodegenerativa sjukdomar2,3,4. Syftet med denna metod är att bestämma totala cellulära ROS i vidhäftande celler med 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) färgning. Motiveringen är att oxidation av DCFH-DA till 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) har använts i stor utsträckning för total ROS-detektion inklusive hydroxylradikaler (•OH) och kvävedioxid (•NO2). Mekanistiskt tas DCFH-DA upp av celler där cellesteras klyver av acetylgrupperna, vilket resulterar i DCFH. Oxidation av DCFH av ROS omvandlar molekylen till DCF, som avger grön fluorescens vid en excitationvåglängd på 485 nm och en utsläppsvåglängd på 530 nm. Jämfört med detektion av fluorescens med flödescytometri och andra alternativa metoder5är fördelarna med denna metod med hjälp av ett fluorescensmikroskop och en plattläsare att den producerar väl synliga fluorescerande bilder och är lätt att utföra, effektiva och kostnadseffektiva. Denna metod har använts i stor utsträckning för att upptäcka cellulära ROS för att studera olika villkor6,7,8. Detta protokoll används för att upptäcka total AVKASTNING i vidhäftande celler. Använda denna metod för att upptäcka ROS i suspensionsceller kan behöva vissa ändringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellsåd
- Frö 2 x 105 HCT116 kolorektal cancerceller per brunn i en 24-brunnsplatta och underhåll cellerna i Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) över natten vid 37 °C.
- Byt ut odlingsmediet mot eller utan 100 μM järnsulfat (FS) eller 10 μM doxorubicin (DOX) som innehåller medium och inkubat i 24 timmar.
2. Förberedelse av DCFH-DA-lösningen
- Lös 4,85 mg DCFH-DA i 1 ml dimetylsulfat (DMSO) för att göra en 10 mM-stamlösning.
- Späd stamlösningen med förvärmd DMEM till 10 μM arbetslösning precis innan du lägger den i brunnarna.
- Vortex arbetslösningen för 10 s.
3. DCFH-DA färgning
- Ta bort läkemedlet som innehåller medium och tvätta en gång med DMEM.
- Tillsätt 500 μl av DCFH-DA-arbetslösningen i varje brunn och inkubera vid 37 °C i 30 min.
- Ta bort DCFH-DA-arbetslösningen. Tvätta en gång med DMEM och 2x med 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Tillsätt 500 μl 1x PBS till varje brunn.
4. Bildframställning förvärv och intensitet mätning
- Ta representativa fluorescerande bilder för varje brunn med hjälp av den gröna fluorescerande proteinkanalen (GFP) på ett fluorescensmikroskop.
- Efter att ha tagit bilder, ta bort PBS och tillsätt 200 μL radioimmunoprecipitation analys (RIPA) buffert till varje brunn.
- Inkubera på is i 5 min och samla sedan celllyst i 1,5 ml-rör.
- Centrifug vid 21 130 x g i 10 min vid 4 °C.
- Överför 100 μL av supernatanten till en svart 96-brunnsplatta och mät fluorescensintensiteten med hjälp av en fluorescens en mikroplåtsläsare vid en excitationsvåglängd på 485 nm och en utsläppsvåglängd på 530 nm.
- Överför 1 μl av supernatanten till en klar 96-brunnsplatta som innehåller 100 μL 1x proteinanalyslösning för att mäta proteinkoncentrationen med Bradford-analysen9.
- Normalisera fluorescensintensiteter med proteinkoncentrationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HCT116 kolorektal cancerceller behandlades med 100 μM FS eller 10 μM DOX för att inducera oxidativ stress7. Som framgår av figur 1ökade grön fluorescens dramatiskt av både FS och DOX som förväntat. För att kvantifiera den relativa intensitetsförändringen var cellerna lysed efter att ha tagit bilder och normaliserades med proteinkoncentrationer. Den kvantifierade fluorescensintensiteten ökade signifikant med FS eller DOX i HCT116-celler.
Figur 1: Järnbehandling ökar ROS i kolorektal cancerceller. Representativa fluorescerande bilder tagna av fluorescensmikroskop och intensitetskvantifiering av en fluorescensmikropningsläsare för 2',7'-diklordihydrofluoresceindiacetate (DCFH-DA) färgning i HCT116-celler efter (Ctrl), (A) 100 μM järnsulfat (FS) eller (B) 10 μM doxorubicin (DOX) behandling för 24 h. Skalstång = 400 μm. * = p < 0,05. = p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det experimentella protokoll som beskrivs här är lätt reproducerbara att mäta cellulära totala ROS. De kritiska stegen är att göra DCFH-DA lösning fräsch och undvika ljusexponering, minimera cellstatusstörningar och omfattande PBS-tvättning precis innan du tar bilder. För beredning av DCFH-DA arbetslösning bör stamlösningen läggas till förvärmd DMEM precis innan den läggs till i 24-brunnsplattan. Anledningen är att gamla lösningar som genererar hög bakgrund fluorescens eller ljusexponering kommer att leda till fotobleaching. De flesta studier använder 1x PBS eller 1x Hanks balanserade saltlösning (HBSS) för att späda UT DCFH-DA och använda den som reaktionsbuffert10. Vid användning av HCT116 och RKO genererade dock utspädning av DCFH-DA-stamlösning med PBS och fetala bovin serumfria DMEM hög bakgrundssignal även i obehandlad cell. Detta kan bero på cellstatusstörningar. Dessutom bör DCFH-DA arbetslösning läggas långsamt längs brunnsväggen. Störningar av cellstatus kommer att generera hög fluorescenssignal jämfört med det ostörda närliggande området. Det är också viktigt att tvätta minst två gånger med PBS innan du tar bilder för att minska auto-fluorescens av fenol som innehåller DMEM. Phenol-free DMEM kan vara ett bättre val men vi visar här att PBS tvätt var tillräckligt för att minimera auto-fluorescens. Som visas i figur 1kan två olika grupper av experiment resultera i olika representativa bilder även i obehandlade kontrollgrupper. För att kontrollera experimentella variationer rekommenderar vi att celler behandlas med utspädd DCFH-DA-arbetslösning (som i protokollet) istället för att lägga till stamlösning direkt på cellerna. Dessutom bör bilder tas i fält med liknande celltäthet och samma exponeringstid. Slutligen är det viktigt att utföra experiment på alla jämförelsegrupper samtidigt.
På grund av betydelsen av ROS har även specifik ROS-detektion, utöver den totala ROS-detektionen, utvecklats. Till exempel kan cellulär produktion av superoxid detekteras av dihydroethidium, vilket vid oxidation resulterar i hydroxylering vid 2-position för att bilda 2-hydroxyethidium. Som 2-hydroxyethidium intercalates i cellulära DNA, röd fluorescens med excitering och utsläpp våglängder av 535 nm och 635 nm, respektive, kan observeras. Mitokondriell superoxid kan visualiseras med MitoSOX reagens, ett katjoniskt derivat av dihydroethidium som kommer in i levande celler och specifikt mål mitokondrierna. Oxidationsprodukten av Mitoosox som genererar röd fluorescens kan intercalates till mitokondriellt DNA. Chemoselective fluorescerande naftamidoxid peroxid sond utvecklades för H2O2 detektion11. Dessutom rapporterades detektion av hydroxylradikaler med fluorescensspektrofotometri också12.
Sammanfattningsvis, här beskrev vi ett enkelt och optimerat protokoll för att upptäcka cellulära totala ROS med hjälp av kostnadseffektiva DCFH-DA färgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health (K01DK114390), ett forskningsstipendium från American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), ett pilotprojekt för forskning från American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), ett pilotprojekt för forskning Bidrag från University of New Mexico Environmental Health Signature Program och Superfund (P42 ES025589), en Shared Resources Pilot Project Award och ett forskningsprogram Support Pilot Project Award från UNM omfattande cancer center (P30CA118100) , och en ny utredare utmärkelse från de särskilda hälsoforskningsfonder vid University of New Mexico School of Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
References
- Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
- Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
- Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17 (2014).
- Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
- Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).
- Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11 (4), (2016).
- Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
- Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).
- Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).
- Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).
- Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
- Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).
