Summary
Burada, toplam hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diasetat (DCFH-DA) kullanarak tespit etmek için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, bir floresan mikroskobu ile yapışık hücrelerde hücresel ROS lokalizasyon görselleştirmek ve bir floresan plaka okuyucu ile ROS yoğunluğunu ölçmek. Bu protokol basit, verimli ve uygun maliyetlidir.
Abstract
Oksidatif stres hem fizyolojik hem de patolojik koşullarda önemli bir olaydır. Bu çalışmada kolorektal kanser hücre hatlarında 2',7'-diklorodihidrofloresensein diasetat (DCFH-DA) kullanılarak total reaktif oksijen türlerini (ROS) ölçerek oksidatif stresin nasıl ölçültüldüğü gösterilmiştir. Bu protokol, DCFH-DA çözeltisinin hazırlanması, DCFH-DA çözeltisi olan hücrelerin kuluçkaya yatırılması ve normalleştirilmiş yoğunluğun ölçülmesi gibi ayrıntılı adımları açıklar. DCFH-DA boyama hücrelerde ROS tespit etmek için basit ve uygun maliyetli bir yoldur. Kimyasal tedavi veya genetik modifikasyonlardan sonra ROS neslini ölçmek için kullanılabilir. Bu nedenle, çevre stresi üzerine hücresel oksidatif stres belirlenmesi için yararlıdır, mekanistik çalışmalariçin ipuçları sağlayan.
Introduction
Fizyolojik anlamı olan hücresel metabolizma tarafından üretilen üç büyük reaktif oksijen türü (ROS) süperoksit aniyon, hidroksil radikal ve hidrojen peroksit1. Düşük konsantrasyonlarda, fizyolojik hücre süreçlerine katılırlar, ancak yüksek konsantrasyonlarda hücre sinyal yolları üzerinde olumsuz etkileri vardır1. Vücudumuz aşırı ROS karşı etkili antioksidan sistemler geliştirmiştir. Ancak, oksidatif stres ROS vücudumuzun detoksifiye yeteneğini bastırmak oluşabilir, hangi birçok patolojik koşullara katkıda bulunur, inflamasyon da dahil olmak üzere, kanser, ve nörodejeneratif hastalık2,3,4. Bu yöntemin amacı 2',7'-diklorodihidrolüorescein diasetat (DCFH-DA) boyama kullanarak yapışık hücrelerde toplam hücresel ROS belirlemektir. Bunun mantığı, DCFH-DA'nın 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) oksidasyonunun hidroksil radikalleri (•OH) ve azot dioksit (•NO2)dahil olmak üzere toplam ROS tespiti için yaygın olarak kullanılmasıdır. Mekanistik olarak, DCFH-DA hücresel esterazın asetil gruplarını keserek DCFH ile sonuçlanan hücreler tarafından alınır. DCFH'nin ROS tarafından oksidasyonu molekülü DCF'ye dönüştürür, bu da 485 nm'lik uyarma dalga boyunda ve 530 nm emisyon dalga boyunda yeşil floresan yayar. Akış sitometrisi ve diğer alternatif yöntemlerle floresan tespiti ile karşılaştırıldığında5, floresan mikroskobu ve plaka okuyucu kullanarak bu yöntemin avantajları, açıkça görülebilir floresan görüntüler üretir, ve gerçekleştirmek kolay, verimli ve maliyet-etkin. Bu yöntem yaygın olarak çeşitli koşulları incelemek için hücresel ROS tespit etmek için kullanılmıştır6,7,8. Bu protokol, yapışık hücrelerdeki toplam ROS'u saptaması için kullanılır. Süspansiyon hücrelerinde ROS'u tespit etmek için bu yöntemi kullanmak için bazı değişiklikler gerekebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre tohumlama
- Tohum 2 x 105 HCT116 kolorektal kanser hücreleri 24-iyi plaka içinde iyi başına ve 37 °C gecede Dulbecco modifiye Eagle orta (DMEM) hücreleri korumak.
- 24 saat boyunca orta ve inkübat içeren 100 μM demir sülfat (FS) veya 10 μM doksorubisin (DOX) içeren kültür ortamını değiştirin.
2. DCFH-DA çözeltisinin hazırlanması
- 10 mM stok çözeltisi yapmak için 1 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 4.85 mg DCFH-DA çözün.
- Kuyulara eklemeden önce önceden ısıtılmış DMEM ile stok çözeltisini 10 μM çalışma çözeltisine seyreltin.
- Girdap 10 s için çalışma çözümü.
3. DCFH-DA boyama
- Orta içeren ilacı çıkarın ve DMEM ile bir kez yıkayın.
- Her kuyuya 500 μL DCFH-DA çalışma çözeltisi ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- DCFH-DA çalışma çözümlerini kaldırın. DMEM ve 2x ile 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez yıkayın.
- Her kuyuya 500 μL 1x PBS ekleyin.
4. Görüntüleme edinimi ve yoğunluk ölçümü
- Floresan mikroskobundaki yeşil floresan protein (GFP) kanalını kullanarak her kuyu için temsili floresan görüntüler alın.
- Görüntüleri aldıktan sonra, PBS'yi çıkarın ve her kuyuya 200 μL radyoimmünopreyağış (RIPA) tamponu ekleyin.
- 5 dakika buz üzerinde kuluçka, sonra 1.5 mL tüpler halinde hücre lysate toplamak.
- 4 °C'de 10 dk için 21.130 x g santrifüj.
- Süpernatantın 100 μL'sini siyah 96 kuyu plakasına aktarın ve floresan bir mikroplaka okuyucusu kullanarak floresan yoğunluğunu 485 nm uyarma dalga boyunda ve 530 nm emisyon dalga boyu ile ölçün.
- Bradford tsay9kullanarak protein konsantrasyonu ölçmek için 100 μL 1x protein istinat çözeltisi içeren net bir 96 kuyu plakasına supernatant 1 μL aktarın.
- Protein konsantrasyonları ile floresan yoğunlukları normalleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HCT116 kolorektal kanser hücreleri oksidatif strese neden olmak için 100 μM FS veya 10 μM DOX ile tedavi edildi7. Şekil 1'degösterildiği gibi, yeşil floresan beklendiği gibi hem FS hem de DOX tarafından önemli ölçüde artmıştır. Göreceli yoğunluk değişimini ölçmek için hücreler görüntü alındıktan sonra lysed edildi ve protein konsantrasyonları ile normale döndü. HCT116 hücrelerinde ölçülen floresan yoğunluğu FS veya DOX ile önemli ölçüde artmıştır.
Şekil 1: Demir tedavisi kolorektal kanser hücrelerinde ROS artar. HCT'de floresan mikroskobu ve yoğunluk hesaplaması ile 2',7'-diklorodihidrofloresescein diasetat (DCFH-DA) için floresan mikroplaka okuyucu tarafından alınan temsili floresan görüntüler İşlenmemiş kontrolden sonra 116 hücre (Ctrl), (A) 100 μM demir sülfat (FS) veya (B) 10 μM doksorubisin (DOX) tedavisi için 24 h. Ölçek çubuğu = 400 μm. * = p < 0.05; = p < 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan deneysel protokol hücresel toplam ROS ölçmek için kolayca tekrarlanabilir. Kritik adımlar arasında DCFH-DA çözümlerini taze hale getirmek ve ışığa maruz kalmaktan kaçınmak, hücre durumu bozukluğunu en aza indirmek ve fotoğraf çekmeden hemen önce kapsamlı PBS yıkama yer almaktadır. DCFH-DA çalışma solüsyonunun hazırlanması için, stok çözeltisi 24 kuyu plakasına eklemeden hemen önce önceden ısıtılmış DMEM'e eklenmelidir. Bunun nedeni, yüksek arka plan floresan veya ışık maruziyeti üreten eski çözümlerin fotobeyazlamaya yol açmasıdır. Çoğu çalışmada DCFH-DA'yı seyreltmek ve reaksiyon tamponuolarakkullanmak için 1x PBS veya 1x Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) kullanılır. Ancak, HCT116 ve RKO kullanırken, PBS ve fetal sığır serum ucretsiz DMEM ile DCFH-DA stok çözeltisinin seyreltilmesi tedavi edilmemiş hücrede bile yüksek arka plan sinyali üretti. Bunun nedeni hücre durumu bozukluğu olabilir. Buna ek olarak, DCFH-DA çalışma çözümü kuyu duvarı boyunca yavaş yavaş eklenmelidir. Hücre durumunun bozulması, yakındaki rahatsız edilmeyen alana kıyasla yüksek floresan sinyali oluşturur. DMEM içeren fenolün otomatik floresansını azaltmak için görüntü almadan önce PBS ile en az iki kez yıkamak da önemlidir. Fenol içermeyen DMEM daha iyi bir seçim olabilir ama burada PBS yıkamanın otomatik floresanyı en aza indirmek için yeterli olduğunu gösteriyoruz. Şekil 1'degösterildiği gibi, işlenmemiş kontrol gruplarında bile iki farklı deney grubu farklı temsili görüntülere neden olabilir. Deneysel varyasyonları kontrol etmek için, stok çözeltisini doğrudan hücrelere eklemek yerine seyreltilmiş DCFH-DA çalışma solüsyonu (protokoldeki gibi) hücreleri tedavi etmenizi öneririz. Ayrıca, benzer hücre yoğunlukları ve aynı pozlama süresi ile alanlarda görüntüler alınmalıdır. Son olarak, tüm karşılaştırma grupları üzerinde aynı anda denemeler yapmak önemlidir.
ROS'un önemi nedeniyle, spesifik ROS tespiti, toplam ROS tespitine ek olarak geliştirilmiştir. Örneğin, süperoksit hücresel üretim dihidroethidyum tarafından tespit edilebilir, oksidasyon üzerine 2-hidroksyethidyum oluşturmak için 2-pozisyonda hidroksilasyon sonuçları. 2-hidroksyethidyum hücresel DNA'ya intercalates olarak, uyarma ve emisyon dalga boyları ile kırmızı floresans 535 nm ve 635 nm sırasıyla görülebilir. Mitokondriyal süperoksit MitoSOX reaktifi ile görselleştirilebilir, canlı hücrelere giren ve özellikle mitokondriyi hedefleyen dihidroethidyumun katyonik bir türevi. Kırmızı floresan üreten Mitosksus'un oksidasyon ürünü mitokondriyal DNA'ya müdahale edebilir. H2O2 algılama11için kemoselsel floresan naftimid peroksit probu geliştirilmiştir. Buna ek olarak, floresan spektrofotometri kullanarak hidroksil radikallerin tespiti debildirilmiştir 12.
Özetle, burada uygun maliyetli DCFH-DA boyama kullanarak hücresel toplam ROS tespit etmek için basit ve optimize edilmiş bir protokol açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (K01DK114390), Amerikan Kanser Derneği (RSG-18-050-01-NEC), bir Araştırma Pilot Proje Hibe bir Araştırma Bursu tarafından desteklenmiştir New Mexico Üniversitesi Çevre Sağlığı İmza Programı ve Superfund (P42 ES025589), Paylaşılan Kaynaklar Pilot Proje Ödülü ve UNM kapsamlı kanser merkezinden Araştırma Programı Destek Pilot Proje Ödülü (P30CA118100) , ve New Mexico Tıp Fakültesi'nde Özel Sağlık Araştırma Fonları yeni bir araştırmacı ödülü.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
References
- Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
- Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
- Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17 (2014).
- Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
- Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).
- Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11 (4), (2016).
- Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
- Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).
- Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).
- Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).
- Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
- Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).
