Summary
هنا، نقدم بروتوكول للكشف عن مجموع أنواع الأكسجين التفاعلي الخلوي (ROS) باستخدام 2'،7'-ديكلوروديدروفلوريسين diacetate (DCFH-DA). يمكن لهذه الطريقة تصور تعريب ROS الخلوي في الخلايا المُلزِمة مع مجهر الفلوريسنس وقياس شدة ROS مع قارئ لوحة الفلوريسين. وهذا البروتوكول بسيط وفعال وفعال من حيث التكلفة.
Abstract
الإجهاد التأاكسدي هو حدث مهم في ظل كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية. في هذه الدراسة، ونحن نبين كيفية قياس الإجهاد التأكسي من خلال قياس مجموع أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) باستخدام 2'،7'-dichlorodihydrofluscein diacetcein (DCFH-DA) تلطيخ في خطوط الخلايا السرطانية القولونية كمثال. يصف هذا البروتوكول الخطوات التفصيلية بما في ذلك إعداد حل DCFH-DA، واحتضان الخلايا مع حل DCFH-DA، وقياس الكثافة الطبيعية. DCFH-DA تلطيخ هو وسيلة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة للكشف عن ROS في الخلايا. ويمكن استخدامه لقياس جيل ROS بعد العلاج الكيميائي أو التعديلات الجينية. ولذلك، فمن المفيد لتحديد الأكسدة الخلوية على الإجهاد البيئة، وتوفير أدلة على الدراسات الميكانيكية.
Introduction
ثلاثة أنواع الأكسجين التفاعلي الرئيسية (ROS) التي تنتجها الأيض الخلوية التي هي ذات معنى فسيولوجي هي أنيون أكسيد فائق، هيدروكسيل الراديكالية، و بيروكسيد الهيدروجين1. في تركيزات منخفضة، فإنها تشارك في عمليات الخلايا الفسيولوجية، ولكن في تركيزات عالية لديهم آثار سلبية على مسارات إشارة الخلية1. وقد طور الجسم أنظمة مضادة للأكسدة، والتي هي فعالة ضد الإفراط في ROS. ومع ذلك ، يمكن أن يحدث الإجهاد التأسدي عندما تطغى ROS على قدرة الجسم على إزالة السموم ، مما يساهم في العديد من الحالات المرضية ، بما في ذلك الالتهاب والسرطان والأمراض العصبيةالتنكسية 2،3،4. والغرض من هذه الطريقة هو تحديد مجموع الوردي الخلوي في الخلايا المتصونة باستخدام 2'،7'-ديكلوروديدروفلوريسين diacetate (DCFH-DA) تلطيخ. والأساس المنطقي هو أن أكسدة DCFH-DA إلى 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) قد استخدمت على نطاق واسع للكشف عن مجموع ROS بما في ذلك الجذور الهيدروكسيل (•OH) وثاني أكسيد النيتروجين (• NO2). ميكانيكيا, يتم تناول DCFH-DA من قبل الخلايا حيث شقوق esterase الخلوية قبالة مجموعات أسيتيل, مما أدى إلى DCFH. أكسدة DCFH من قبل ROS يحول الجزيء إلى DCF، الذي ينبعث الفلوروس الأخضر في الطول الموجي الإثارة من 485 نانومتر و طول موجة الانبعاثات من 530 نانومتر. بالمقارنة مع الكشف عن الفلوريسين مع تدفق الأساليب البديلة وغيرها من الطرق البديلة5، مزايا هذا الأسلوب باستخدام المجهر الفلوريس وقارئ لوحة هي أنه ينتج صورا الفلورسنت مرئية بوضوح ، وسهلة الأداء وفعالة وفعالة من حيث التكلفة. وقد استخدمت هذه الطريقة على نطاق واسع للكشف عن الوردي الخلوي لدراسة مختلف الشروط6,7,8. يستخدم هذا البروتوكول للكشف عن إجمالي ROS في الخلايا المُتصّنة. قد تحتاج هذه الطريقة للكشف عن ROS في الخلايا المعلقة بعض التعديلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. بذر الخلية
- البذور 2 × 105 HCT116 خلايا سرطان القولون والمستقيم في بئر في لوحة 24-well والحفاظ على الخلايا في المتوسط النسر Dulbecco المعدلة (DMEM) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- استبدال الوسط الثقافة مع أو بدون كبريتات حديدية 100 ميكرومتر (FS) أو 10 μm دوكسوروبيسين (DOX) التي تحتوي على المتوسطة واحتضان لمدة 24 ساعة.
2- إعداد حل DCFH-DA
- حل 4.85 ملغ من DCFH-DA في 1 مل من ثنائي الفينيل سلفوكسيد (DMSO) لجعل 10 mM حل الأسهم.
- تمييع حل الأسهم مع DMEM الدفء المسبق إلى حل عمل 10 ميكرومتر قبل إضافته إلى الآبار.
- دوامة حل العمل لمدة 10 ق.
3. DCFH-DA تلطيخ
- إزالة الدواء الذي يحتوي على المتوسطة وغسل مرة واحدة مع DMEM.
- أضف 500 ميكرولتر من حل عمل DCFH-DA في كل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إزالة حل العمل DCFH-DA. غسل مرة واحدة مع DMEM و 2x مع 1x الفوسفات المخزنة المالحة (PBS).
- إضافة 500 μL من 1X برنامج تلفزيوني لكل بئر.
4. التصوير اكتساب وقياس كثافة
- خذ صور الفلورسنت التمثيلية لكل بئر باستخدام قناة البروتين الفلوري الأخضر (GFP) على مجهر الفلورانس.
- بعد التقاط الصور، وإزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولتر من الفحص الإشعاعي المناعة (RIPA) العازلة لكل بئر.
- احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق، ثم جمع الخلية lysate في أنابيب 1.5 مل.
- جهاز طرد مركزي عند 21,130 x ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية.
- نقل 100 ميكرولتر من السوبر إلى لوحة سوداء 96 بئر وقياس كثافة الفلوريسين باستخدام الفلوريسين قارئ الصفيحة الدقيقة في الطول الموجي إثارة من 485 نانومتر والطول الموجي للانبعاثات من 530 نانومتر.
- نقل 1 ميكرولتر من عظمى إلى لوحة واضحة 96 جيدا تحتوي على 100 ميكرولتر من 1x محلول اختبار البروتين لقياس تركيز البروتين باستخدام اختبار برادفورد9.
- تطبيع كثافة الفلورس مع تركيزات البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم علاج خلايا سرطان القولون والمستقيم HCT116 مع 100 μM FS أو 10 μM DOX للحث على الإجهاد التأكسي7. كما هو مبين في الشكل 1، تم زيادة الفلوريسين الخضراء بشكل كبير من قبل كل من FS و DOX كما هو متوقع. لتحديد حجم التغير النسبي في الكثافة، تم lysed الخلايا بعد التقاط الصور وتطبيعها مع تركيزات البروتين. وقد زادت كثافة الفلورا كميا زيادة كبيرة من قبل FS أو DOX في خلايا HCT116.
الشكل 1: يزيد علاج الحديد من ROS في خلايا سرطان القولون والمستقيم. صور الفلورسنت التمثيلية التي التقطها مجهر الفلوريسنس والكمية كثافة من قبل قارئ الصهقر المفلور ل2'،7'-dichlorydrofluscein diacetate (DCFH-DA) تلطيخ في HCT11 6 خلايا بعد التحكم غير المعالجة (السيطرة)، (A) 100 ميكرومتر كبريتات حديدية (FS) أو (B) 10 μM دوكسوروبيسين (DOX) لعلاج 24 ساعة. شريط مقياس = 400 ميكرومتر. * = ف < 0.05; = p < 0.001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول التجريبي الموصوف هنا هو استنساخ بسهولة لقياس مجموع الوردي الخلوية. وتشمل الخطوات الهامة جعل DCFH-DA حل جديدة وتجنب التعرض للضوء، والتقليل من اضطراب حالة الخلية وغسل برنامج تلفزيوني واسعة النطاق الحق قبل التقاط الصور. لإعداد حل العمل DCFH-DA، ينبغي إضافة حل الأسهم إلى DMEM مسبقة الدفء قبل إضافة إلى لوحة 24 جيدا. والسبب هو أن الحلول القديمة التي تولد الفلوريسينت الخلفية العالية أو التعرض للضوء سيؤدي إلى photobleaching. معظم الدراسات استخدام 1X PBS أو 1x هانكس 'محلول الملح المتوازن (HBSS) لتخفيف DCFH-DA واستخدامه بمثابة رد فعلالعازلة 10. ومع ذلك، عند استخدام HCT116 وRKO، تخفيف من DCFH-DA حل الأسهم مع برنامج تلفزيوني والمصل الدم البقري الجنينية الحرة DMEM ولدت إشارة خلفية عالية حتى في الخلايا غير المعالجة. قد يكون هذا بسبب اضطراب حالة الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي إضافة حل العمل DCFH-DA ببطء على طول الجدار البئر. اضطراب حالة الخلية سوف تولد إشارة الفلوريسنس عالية بالمقارنة مع المنطقة المجاورة دون عائق. ومن الأهمية بمكان أيضا أن يغسل مرتين على الأقل مع برنامج تلفزيوني قبل التقاط الصور للحد من الفلورية التلقائية للفينول التي تحتوي على DMEM. قد يكون DMEM الخالي من الفينول خيارًا أفضل ولكننا نظهر هنا أن غسل PBS كان كافيًا لتقليل الفلورسيه التلقائي. كما هو مبين في الشكل 1، حتى في مجموعات التحكم غير المعالجة دفعتين مختلفتين من التجارب يمكن أن يؤدي إلى صور تمثيلية مختلفة. للتحكم في الاختلافات التجريبية، نوصي بمعالجة الخلايا التي تعمل DCFH-DA المخففة (كما هو الحال في البروتوكول) بدلاً من إضافة حل الأسهم مباشرة إلى الخلايا. كما ينبغي التقاط الصور في الحقول ذات كثافة الخلايا المماثلة ونفس وقت التعرض. وأخيراً، من المهم إجراء تجارب على كافة مجموعات المقارنة في نفس الوقت.
ونظراً لأهمية ROS، فقد تم أيضاً تطوير الكشف عن ROS المحدد، بالإضافة إلى الكشف الكامل عن ROS. على سبيل المثال، يمكن الكشف عن إنتاج الخلايا من أكسيد فائق بواسطة ديهيدروجي، والتي عند الأكسدة يؤدي في الهيدروكسيل في موقف 2-لتشكيل 2-هيدروكسيهيديوم. كما 2-هيدروكسيتهيديوم التحللات في الحمض النووي الخلوي، fluorescence الأحمر مع استثارة وأطوال موجية الانبعاثات من 535 نانومتر و 635 نانومتر، على التوالي، يمكن ملاحظة. يمكن تصور أكسيد الميتوكوندريا الفائق مع كاشف الميتوسOX، وهو مشتق الموجب من الديهيدرويديوم الذي يدخل الخلايا الحية ويستهدف على وجه التحديد الميتوكوندريا. يمكن أن يتشابك منتج الأكسدة ميتوسوإكس الذي يولد الفلورس الحمراء في الحمض النووي الميتوكوندريا. تم تطوير مسبار بيروكسيد الفلورسيد الفلوري الفلوري الفلوري الفلوري الفلوري الفلوري الكيميائي لH2O2 الكشف11. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن الكشف عن الجذور الهيدروكسيل باستخدام المنظار الفلوري كما تم الإبلاغ عن12.
باختصار ، هنا وصفنا بروتوكول بسيط والأمثل للكشف عن مجموع الوردي الخلوية باستخدام فعالة من حيث التكلفة DCFH - DA تلطيخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (K01DK114390)، وهي منحة باحث باحث من جمعية السرطان الأمريكية (RSG-050-01-NEC)، وهي منحة مشروع تجريبي بحثي من جامعة نيو مكسيكو برنامج الصحة البيئية التوقيع و Superfund (P42 ES025589)، وجائزة مشروع المشاريع التجريبية للموارد المشتركة وجائزة المشروع التجريبي لدعم برنامج البحوث من مركز السرطان الشامل لجمهورية الأمم المتحدة وMM (P30CA118100) ، وجائزة محقق جديد من صناديق البحوث الصحية المخصصة في كلية الطب بجامعة نيو مكسيكو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
References
- Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
- Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
- Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17 (2014).
- Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
- Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).
- Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11 (4), (2016).
- Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
- Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).
- Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).
- Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).
- Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
- Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).
