Summary
Her præsenterer vi en protokol til påvisning af total cellulære reaktive iltarter (ROS) ved hjælp af 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA). Denne metode kan visualisere cellulær ROS lokalisering i klæbende celler med en fluorescens mikroskop og kvantificere ROS intensitet med en fluorescens plade læser. Denne protokol er enkel, effektiv og omkostningseffektiv.
Abstract
Oxidativt stress er en vigtig begivenhed under både fysiologiske og patologiske forhold. I denne undersøgelse demonstrerer vi, hvordan man kvantificerer oxidativt stress ved at måle den samlede reaktive iltart (ROS) ved hjælp af 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) farvning i kolorektal cancer cellelinjer som et eksempel. Denne protokol beskriver detaljerede trin, herunder forberedelse af DCFH-DA-opløsning, inkubation af celler med DCFH-DA-opløsning og måling af normaliseret intensitet. DCFH-DA farvning er en enkel og omkostningseffektiv måde at opdage ROS i celler. Det kan bruges til at måle ROS generation efter kemisk behandling eller genetiske modifikationer. Derfor er det nyttigt til bestemmelse af cellulære oxidativstress på miljøstress, der giver spor til mekanistiske undersøgelser.
Introduction
Tre store reaktive ilt arter (ROS) produceret af cellulære stofskifte, der er af fysiologisk betydning er superoxid anion, hydroxyl radikal, og hydrogenperoxid1. Ved lave koncentrationer deltager de i fysiologiske celleprocesser, men ved høje koncentrationer har de negative virkninger på cellesignalveje1. Vores krop har udviklet antioxidantsystemer, som er effektive mod overdreven ROS. Men, oxidativ stress kan forekomme, når ROS overvælde afgiftende evne i vores krop, som bidrager til mange patologiske tilstande, herunder betændelse, kræft, og neurodegenerative sygdom2,3,4. Formålet med denne metode er at bestemme total cellulær ROS i klæbende celler ved hjælp af 2',7'-dichlordihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) farvning. Begrundelsen er, at oxidation af DCFH-DA til 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) er blevet anvendt i udstrakt grad til total ROS-detektion, herunder hydroxylradikals (•OH) og nitrogendioxid (•NO2). Mekanistisk, DCFH-DA er taget op af celler, hvor cellulære esterase kløver off acetyl grupper, hvilket resulterer i DCFH. Oxidation af DCFH ved ROS konverterer molekylet til DCF, som udsender grøn fluorescens ved en excitation bølgelængde på 485 nm og en emissionsbølgelængde på 530 nm. Sammenlignet med påvisning af fluorescens med flowcytometri og andre alternative metoder5er fordelene ved denne metode ved hjælp af et fluorescensmikroskop og en pladelæser, at den producerer klart synlige fluorescerende billeder og er let at udføre, effektiv og omkostningseffektiv. Denne metode er blevet anvendt i vid udstrækning til at opdage cellulære ROS for at studere forskellige betingelser6,7,8. Denne protokol bruges til at registrere total ROS i klæbende celler. Brug af denne metode til at opdage ROS i suspension celler kan have brug for nogle ændringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellesåning
- Seed 2 x 105 HCT116 kolorektal cancerceller pr godt i en 24-brønd plade og vedligeholde cellerne i Dulbecco modificerede Eagle medium (DMEM) natten ved 37 °C.
- Dyrkningsmediet udskiftes med eller uden 100 μM jernsulfat (FS) eller 10 μM doxorubicin (DOX), der indeholder medium og inkubat i 24 timer.
2. Forberedelse af DCFH-DA-løsningen
- 4,85 mg DCFH-DA opløses i 1 ml dimethylsulfoxid (DMSO) for at fremstille en 10 mM stamopløsning.
- Stamopløsningen fortyndes med forvarmet DMEM i 10 μM arbejdsopløsning, lige før den lægges til brøndene.
- Vortex arbejdsløsningen til 10 s.
3. DCFH-DA farvning
- Fjern stoffet indeholder medium og vask en gang med DMEM.
- Der tilsættes 500 μL af DCFH-DA-arbejdsopløsningen i hver brønd og inkuberes ved 37 °C i 30 min.
- Fjern DCFH-DA-arbejdsløsningen. Vask én gang med DMEM og 2x med 1x fosfat-buffered saltvand (PBS).
- Der tilsættes 500 μL 1x PBS til hver brønd.
4. Billeddannelse erhvervelse og intensitet måling
- Tag repræsentative fluorescerende billeder for hver brønd ved hjælp af den grønne fluorescerende protein (GFP) kanal på en fluorescens mikroskop.
- Når du har taget billeder, fjernes PBS og tilsættes 200 μL radioimmunopræskningsanalyse (RIPA) buffer til hver brønd.
- Inkuberes på is i 5 min., opsaml derefter cellelysate i 1,5 ml rør.
- Centrifuge ved 21.130 x g i 10 min. ved 4 °C.
- 100 μL af supernatanten overføres til en sort 96 brøndplade, og fluorescensintensiteten måles ved hjælp af en fluorescens en mikropladelæser ved en excitationsbølgelængde på 485 nm og en emissionsbølgelængde på 530 nm.
- 1 μL af supernatanten overføres til en klar 96 brøndplade indeholdende 100 μL 1x proteinanalyseopløsning for at måle proteinkoncentrationen ved hjælp af Bradford-analysen9.
- Normalisere fluorescensintensiteten med proteinkoncentrationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HCT116 kolorektal cancerceller blev behandlet med 100 μM FS eller 10 μM DOX for at fremkalde oxidativt stress7. Som vist i figur 1blev grøn fluorescens dramatisk forøget både FS og DOX som forventet. For at kvantificere den relative intensitetsændring blev cellerne lyset efter at have taget billeder og normaliseret med proteinkoncentrationer. Den kvantificerede fluorescensintensitet blev signifikant forøget af FS eller DOX i HCT116-celler.
Figur 1: Jernbehandling øger ROS i kolorektal cancerceller. Repræsentative fluorescerende billeder taget med fluorescensmikroskop og intensitetsindbelægning af en fluorescensmikropladelæser for farvning af farvning af 2',7'-dichlordhydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) i HCT11 6 celler efter ubehandlet kontrol (Ctrl), (A) 100 μM jernsulfat (FS) eller (B) 10 μM doxorubicin (DOX) behandling for 24 h. Skalabar = 400 μm. * = p < 0,05. = p < 0,001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den eksperimentelle protokol, der er beskrevet her, er let reproducerbar at måle cellulære samlede ROS. De kritiske trin omfatter at gøre DCFH-DA-løsningen frisk og undgå lyseksponering, minimere forstyrrelser i cellestatus og omfattende PBS-vask lige før du tager billeder. Til fremstilling af DCFH-DA arbejdsløsning skal stamopløsningen tilsættes til forvarmet DMEM lige før tilsætning i 24 brøndpladen. Årsagen er, at gamle løsninger, der genererer høj baggrund fluorescens eller lyseksponering vil føre til fotobleaching. De fleste undersøgelser bruger 1x PBS eller 1x Hanks' afbalancerede saltopløsning (HBSS) til at fortynde DCFH-DA og bruge den som reaktionsbuffer10. Ved brug af HCT116 og RKO genererede fortynding af DCFH-DA-stamopløsning med PBS og føtal kvægserumfri DMEM imidlertid et høj baggrundssignal selv i ubehandlet celle. Dette kan skyldes forstyrrelser i cellestatus. Desuden bør DCFH-DA arbejdsløsningen tilsættes langsomt langs brøndvæggen. Forstyrrelse af cellestatus vil generere et højt fluorescenssignal sammenlignet med det uforstyrrede område i nærheden. Det er også vigtigt at vaske mindst to gange med PBS, før du tager billeder for at reducere auto-fluorescens af fenol, der indeholder DMEM. Phenol-fri DMEM kan være et bedre valg, men vi viser her, at PBS vask var tilstrækkelig til at minimere auto-fluorescens. Som vist i figur 1kan selv i ubehandlede kontrolgrupper resultere i forskellige repræsentative billeder. For at kontrollere eksperimentelle variationer anbefaler vi at behandle celler med fortyndet DCFH-DA arbejdsløsning (som i protokollen) i stedet for at tilføje stamopløsning direkte på cellerne. Billeder skal også tages i felter med lignende celletætheder og samme eksponeringstid. Endelig er det vigtigt at udføre eksperimenter på alle sammenligningsgrupper på samme tid.
På grund af betydningen af ROS, specifikke ROS detektion, ud over den samlede ROS afsløring, er også blevet udviklet. For eksempel kan cellulær produktion af superoxid detekteres ved dihydroethidium, hvilket ved oxidation resulterer i hydroxylering i 2-position til 2-hydroxyethidium. Da 2-hydroxyethidium intercalater i cellulære DNA, rød fluorescens med excitation og emission bølgelængder på 535 nm og 635 nm, henholdsvis kan observeres. Mitokondriel superoxid kan visualiseres med MitoSOX reagens, en kationisk derivat af dihydroethidium, der kommer ind levende celler og specifikt mål mitokondrier. Mitosox- oxidationsproduktet af Mitosox, som genererer rød fluorescens, kan interkalateres til mitokondrielt DNA. Chemoselektruktiv fluorescerende naphthylimide peroxid sonde blev udviklet til H2O2 påvisning11. Desuden blev detektering af hydroxylradikaler ved hjælp af fluorescensspektrofotometri også rapporteret12.
Sammenfattende beskrev vi her en enkel og optimeret protokol til detektering af cellulær total ROS ved hjælp af omkostningseffektiv DCFH-DA farvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af National Institutes of Health (K01DK114390), et forskningsforskerlegattilskud fra American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), et pilotprojekt Tilskud fra University of New Mexico Environmental Health Signature Program og Superfund (P42 ES025589), en Shared Resources Pilot Project Award og et forskningsprogram Support Pilot Project Award fra UNM omfattende kræft center (P30CA118100) , og en ny investigator pris fra Dedicated Health Research Fonde ved University of New Mexico School of Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
References
- Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
- Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
- Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17 (2014).
- Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
- Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).
- Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11 (4), (2016).
- Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
- Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).
- Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).
- Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).
- Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
- Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).
