Summary
यहां, हम 2', 7'-डाइक्लोरोडीहहाइड्रोफ्फ्लूरोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफएच-डीए) का उपयोग करके कुल सेलुलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह विधि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ अनुयायी कोशिकाओं में सेलुलर आरओएस स्थानीयकरण की कल्पना कर सकती है और फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर के साथ आरओएस तीव्रता की मात्रा निर्धारित कर सकती है। यह प्रोटोकॉल सरल, कुशल और लागत प्रभावी है।
Abstract
ऑक्सीडेटिव तनाव शारीरिक और रोग दोनों स्थितियों के तहत एक महत्वपूर्ण घटना है। इस अध्ययन में, हम प्रदर्शित करते हैं कि 2', 7'-डाइक्लोरोइडिड्रोफ्फोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफएएच-डीए) का उपयोग करके कुल प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) को मापने के द्वारा ऑक्सीडेटिव तनाव को कैसे निर्धारित किया जाए। यह प्रोटोकॉल DCFH-DA समाधान की तैयारी, डीसीएफएच-डीए समाधान के साथ कोशिकाओं की इनक्यूबेशन और सामान्यीकृत तीव्रता के माप सहित विस्तृत चरणों का वर्णन करता है। डीसीएफएच-डीए धुंधला कोशिकाओं में आरओएस का पता लगाने का एक सरल और लागत प्रभावी तरीका है। इसका उपयोग रासायनिक उपचार या आनुवंशिक संशोधनों के बाद आरओएस पीढ़ी को मापने के लिए किया जा सकता है। इसलिए, यह पर्यावरण तनाव पर सेलुलर ऑक्सीडेटिव तनाव का निर्धारण करने, मशीनी अध्ययनों के लिए सुराग प्रदान करने के लिए उपयोगी है।
Introduction
सेलुलर मेटाबोलिज्म द्वारा उत्पादित तीन प्रमुख प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) जो शारीरिक अर्थ के हैं, सुपरऑक्साइड एनियन, हाइड्रोक्सिल रेडिकल और हाइड्रोजन पेरोक्साइड1हैं। कम सांद्रता पर, वे शारीरिक कोशिका प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं, लेकिन उच्च सांद्रता पर उनका सेल सिग्नलिंग पाथवे पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है1। हमारे शरीर में एंटीऑक्सीडेंट सिस्टम विकसित किया गया है, जो अत्यधिक आरओएस के खिलाफ प्रभावी हैं। हालांकि, ऑक्सीडेटिव तनाव तब हो सकता है जब आरओएस हमारे शरीर की विषहरण क्षमता को अभिभूत करता है, जो सूजन, कैंसर और,न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग2,3,,4सहित कई रोग स्थितियों में योगदान देता है। इस विधि का उद्देश्य 2', 7'-डाइक्लोरोडीहहाइड्रोफ्लोफोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफए-डीए) धुंधला का उपयोग करके अनुयायी कोशिकाओं में कुल सेलुलर आरओएस निर्धारित करना है। तर्क यह है कि डीसीएफएच-डीए से 2'-7'डाइक्लोरोफ्लोरोरेसेइन (डीसीएफ) के ऑक्सीकरण का उपयोग हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स (• ओह) और नाइट्रोजन डाइऑक्साइड (• नंबर2)सहित कुल आरओएस डिटेक्शन के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है। मशीनी रूप से, डीसीएफएच-डीए कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है जहां सेलुलर एस्टरेस एसिटिल समूहों से दूर होता है, जिसके परिणामस्वरूप डीसीएफएच होता है। आरओएम द्वारा डीसीएफएच का ऑक्सीकरण अणु को डीसीएफ में परिवर्तित करता है, जो 485 एनएम की उत्तेजन तरंगदैर्ध्य और 530 एनएम की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य पर हरे रंग की फ्लोरेसेंस उत्सर्जित करता है। प्रवाह साइटोमेट्री और अन्य वैकल्पिक विधियों के साथ फ्लोरेसेंस का पता लगाने की तुलना में5,फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप और प्लेट रीडर का उपयोग करके इस विधि के फायदे यह हैं कि यह स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली फ्लोरोसेंट छवियों का उत्पादन करता है, और प्रदर्शन करना आसान है, कुशल और लागत प्रभावी। इस विधि का व्यापक रूप से उपयोग सेलुलर आरओएस का विभिन्न स्थितियों का अध्ययन करने के लिए किया गया है6,7,8. इस प्रोटोकॉल का उपयोग अनुयायी कोशिकाओं में कुल आरओएस का पता लगाने के लिए किया जाता है। निलंबन कोशिकाओं में ROS का पता लगाने के लिए इस विधि का उपयोग कुछ संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है।
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Protocol
1. सेल सीडिंग
- बीज 2 x 105 एचसीटी116 कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाएं 24-वेल प्लेट में अच्छी तरह से और डल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बनाए रखें।
- संस्कृति माध्यम को 100 माइक्रोन फेरस सल्फेट (एफएस) या 10 माइक्रोन डॉक्सोरुबिसिन (डीओएक्स) के साथ या उसके बिना बदलें जिसमें मध्यम और 24 घंटे के लिए मध्यम और इनक्यूबेट होता है।
2. डीसीएफएच-डीए समाधान की तैयारी
- 10 एमएम स्टॉक सॉल्यूशन बनाने के लिए डिमेथिल सल्फॉक्साइड (डीएमएसओ) के 1 एमएल में 4.85 मिलीग्राम डीसीएफएच-डीए को भंग करें।
- कुओं में जोड़ने से पहले 10 माइक्रोन वर्किंग सॉल्यूशन में पूर्व-गर्म डीएमईएम के साथ स्टॉक समाधान को पतला करें।
- भंवर 10 एस के लिए काम कर समाधान।
3. डीसीएफएच-डीए धुंधला
- माध्यम युक्त दवा निकालें और DMEM के साथ एक बार धो लें।
- प्रत्येक कुएं में डीसीएफएच-डीए कार्य समाधान के 500 माइक्रोन जोड़ें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- डीसीएफएच-डीए वर्किंग सॉल्यूशन निकालें। डीएमईएम और 2x के साथ 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ एक बार धोएं।
- प्रत्येक अच्छी तरह से 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन जोड़ें।
4. इमेजिंग अधिग्रहण और तीव्रता माप
- फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) चैनल का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियों को लें।
- छवियों को लेने के बाद, पीबीएस को हटा दें और प्रत्येक अच्छी तरह से रेडियोइम्यूनोप्रिपिटेशन परख (रिपा) बफर के 200 माइक्रोल जोड़ें।
- 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट, तो 1.5 एमएल ट्यूब में सेल lysate इकट्ठा।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 21,130 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
- एक काले 96 अच्छी तरह से प्लेट के लिए सुपरनैंट के 100 μL हस्तांतरण और 485 एनएम की एक उत्तेजन तरंग दैर्ध्य और 530 एनएम की उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर एक फ्लोरेसेंस एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग कर फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापने।
- ब्रैडफोर्ड परख 9 का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए 1x प्रोटीन परख समाधान के 100 माइक्रोन युक्त एक स्पष्ट96अच्छी तरह से प्लेट में 1 माइक्रोनल स्थानांतरित करें।
- प्रोटीन सांद्रता के साथ फ्लोरेसेंस तीव्रता को सामान्य करें।
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Representative Results
एचसीटी 116 कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं को ऑक्सीडेटिव तनाव7को प्रेरित करने के लिए 100 माइक्रोन एफएस या 10 माइक्रोन डीओएक्स के साथ इलाज किया गया था। जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है, ग्रीन फ्लोरेसेंस को उम्मीद के अनुसार एफएस और डॉक्स दोनों द्वारा नाटकीय रूप से बढ़ाया गया था। सापेक्ष तीव्रता परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए, कोशिकाओं को छवियों को लेने और प्रोटीन सांद्रता के साथ सामान्यीकृत करने के बाद lysed किया गया । एचसीटी 116 कोशिकाओं में एफएस या डॉक्स द्वारा मात्रात्मक फ्लोरेसेंस तीव्रता में काफी वृद्धि हुई थी।
चित्रा 1: आयरन उपचार कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं में ROS बढ़ जाती है। 2',7'-डाइक्लोरोडीहहाइड्रोफोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफएच-डीए) एचसीटी1 में धुंधला करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोप्लेट रीडर द्वारा फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप और तीव्रता क्वांटिफिकेशन द्वारा ली गई प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियां अनुपचारित नियंत्रण (सीटीआरएल),(ए)100 माइक्रोन फेरस सल्फेट (एफएस) या(बी)10 माइक्रोनएम डॉक्सोरुबिसिन (डीओएक्स) उपचार के बाद 16 कोशिकाएं 24 घंटे स्केल बार = 400 माइक्रोन के लिए उपचार। * = पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05; = पी एंड एलटी; 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यहां वर्णित प्रायोगिक प्रोटोकॉल सेलुलर कुल ROS को मापने के लिए आसानी से प्रजनन योग्य है। महत्वपूर्ण कदमों में DCFH-DA समाधान को ताजा बनाना और प्रकाश जोखिम से बचना, सेल स्थिति अशांति को कम करना और छवियों को लेने से ठीक पहले व्यापक पीबीएस धोना शामिल है। DCFH-DA काम समाधान की तैयारी के लिए, स्टॉक समाधान 24 अच्छी तरह से थाली में जोड़ने से पहले पूर्व गरम DMEM में जोड़ा जाना चाहिए । इसका कारण यह है कि पुराने समाधान जो उच्च पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस या प्रकाश एक्सपोजर उत्पन्न करते हैं, फोटोब्लैचिंग का कारण बनेंगे। अधिकांश अध्ययन DCFH-DA को पतला करने के लिए 1x पीबीएस या 1x हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) का उपयोग करते हैं और इसे प्रतिक्रिया बफर10के रूप में उपयोग करते हैं। हालांकि, एचसीटी 116 और आरकेओ का उपयोग करते समय, पीबीएस और भ्रूण गोजातीय सीरम मुक्त डीएमईएम के साथ डीसीएफएच-डीए स्टॉक समाधान को कमजोर करने से अनुपचारित सेल में भी उच्च पृष्ठभूमि संकेत उत्पन्न हुआ। ऐसा सेल स्टेटस में गड़बड़ी के कारण हो सकता है। इसके अलावा, डीसीएफएच-डीए कार्य समाधान को अच्छी दीवार के साथ धीरे-धीरे जोड़ा जाना चाहिए। सेल स्थिति की अशांति से आस-पास के क्षेत्र की तुलना में उच्च फ्लोरेसेंस सिग्नल उत्पन्न होगा। डीएमईएम युक्त फिनोल के ऑटो-फ्लोरेसेंस को कम करने के लिए छवियों को लेने से पहले पीबीएस के साथ कम से कम दो बार धोना भी महत्वपूर्ण है। फिनोल-मुक्त डीएमईएम एक बेहतर विकल्प हो सकता है लेकिन हम यहां दिखाते हैं कि पीबीएस धोने ऑटो-फ्लोरेसेंस को कम करने के लिए पर्याप्त था। जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है, यहां तक कि अनुपचारित नियंत्रण समूहों में भी प्रयोगों के दो अलग-अलग बैचों के परिणामस्वरूप विभिन्न प्रतिनिधि छवियां हो सकती हैं। प्रयोगात्मक विविधताओं को नियंत्रित करने के लिए, हम कोशिकाओं पर सीधे स्टॉक समाधान जोड़ने के बजाय पतला डीसीएफएच-डीए वर्किंग सॉल्यूशन (प्रोटोकॉल के रूप में) के साथ कोशिकाओं का इलाज करने की सलाह देते हैं। इसके अलावा, छवियों को समान सेल घनत्व और एक ही जोखिम समय के साथ क्षेत्रों में लिया जाना चाहिए। अंत में, एक ही समय में सभी तुलना समूहों पर प्रयोग करना महत्वपूर्ण है।
आरओएस के महत्व के कारण, कुल आरओएस डिटेक्शन के अलावा विशिष्ट आरओएस डिटेक्शन भी विकसित किया गया है। उदाहरण के लिए, सुपरऑक्साइड के सेलुलर उत्पादन का पता डिडिड्रोएथिडियम द्वारा लगाया जा सकता है, जो ऑक्सीकरण पर हाइड्रोक्सिलेशन में 2-हाइड्रोक्सीथिडियम बनाने के लिए 2-स्थिति में परिणाम होता है। चूंकि सेलुलर डीएनए में 2-हाइड्रोक्सीथिडियम इंटरकैलेट करता है, इसलिए क्रमशः 535 एनएम और 635 एनएम की उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ लाल फ्लोरेसेंस देखा जा सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड को मिटोसॉक्स रिएजेंट के साथ कल्पना की जा सकती है, जो डिहाइड्रोएथिडियम का एक धिक व्युत्पन्न है जो जीवित कोशिकाओं में प्रवेश करता है और विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रिया को लक्षित करता है। माइटोलोक्स का ऑक्सीकरण उत्पाद जो लाल फ्लोरेसेंस उत्पन्न करता है, माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए में इंटरकैलेट कर सकता है। एच2ओ 2 डिटेक्शन11के लिए केमोसेलिटिव फ्लोरोसेंट नेफ्थाइलिमाइड पेरोक्साइड जांच विकसित की गई थी । इसके अलावा, फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री का उपयोग करके हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स का पता लगाने की भी रिपोर्ट की गईथी।
संक्षेप में, यहां हमने लागत प्रभावी डीसीएफएच-डीए धुंधला का उपयोग करके सेलुलर टोटल आरओ का पता लगाने के लिए एक सरल और अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन किया।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (K01DK1114390), अमेरिकन कैंसर सोसायटी (आरएसजी-18-050-01-एनईसी), एक अनुसंधान पायलट परियोजना अनुदान से एक अनुसंधान विद्वान अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था न्यू मेक्सिको पर्यावरण स्वास्थ्य हस्ताक्षर कार्यक्रम और Superfund विश्वविद्यालय (P42 ES025589), एक साझा संसाधन पायलट परियोजना पुरस्कार और यूएनएम व्यापक कैंसर केंद्र (P30CA118100) से एक अनुसंधान कार्यक्रम समर्थन पायलट परियोजना पुरस्कार से , और न्यू मेक्सिको स्कूल ऑफ मेडिसिन के विश्वविद्यालय में समर्पित स्वास्थ्य अनुसंधान कोष से एक नया अन्वेषक पुरस्कार ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
References
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