Summary
Qui, presentiamo un protocollo per rilevare le specie di ossigeno reattivo totale (ROS) utilizzando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Questo metodo può visualizzare la localizzazione cellulare ROS in cellule aderenti con un microscopio a fluorescenza e quantificare l'intensità ROS con un lettore di lastre di fluorescenza. Questo protocollo è semplice, efficiente e conveniente.
Abstract
Lo stress ossidativo è un evento importante sia in condizioni fisiologiche che patologiche. In questo studio, dimostriamo come quantificare lo stress ossidativo misurando le specie di ossigeno reattivo totale (ROS) utilizzando come esempio la colorazione di 2',7'-diclorohydrofluorescein (DCFH-DA). Questo protocollo descrive i passaggi dettagliati, tra cui la preparazione della soluzione DCFH-DA, l'incubazione di cellule con la soluzione DCFH-DA e la misurazione dell'intensità normalizzata. La colorazione DCFH-DA è un modo semplice ed economico per rilevare ROS nelle cellule. Può essere utilizzato per misurare la generazione di ROS dopo il trattamento chimico o le modifiche genetiche. Pertanto, è utile per determinare lo stress ossidativo cellulare sullo stress ambientale, fornendo indizi agli studi meccanicistici.
Introduction
Tre principali specie reattive dell'ossigeno (ROS) prodotte dal metabolismo cellulare che hanno un significato fisiologico sono l'anione di superossido, il radicale idrossile e il perossido di idrogeno1. A basse concentrazioni, partecipano a processi cellulari fisiologici, ma ad alte concentrazioni hanno effetti negativi sulle vie di segnalazione cellulare1. Il nostro corpo ha sviluppato sistemi antiossidanti, che sono efficaci contro il ROS eccessivo. Tuttavia, lo stress ossidativo può verificarsi quando ROS sopraffare la capacità disintossicante del nostro corpo, che contribuisce a molte condizioni patologiche, tra cui infiammazione, cancro, e malattia neurodegenerativa2,3,4.4 Lo scopo di questo metodo è quello di determinare il ROS cellulare totale nelle cellule aderenti utilizzando la colorazione di diattato (DCFH-DA) di 2',7'-diclorodiidrofluorescein (DCFH-DA). La logica è che l'ossidazione del DCFH-DA al 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) è stata ampiamente utilizzata per il rilevamento totale2del ROS, compresi i radicali idrossili (OH) e il biossido di azoto ( . Meccanicamente, DCFH-DA è occupato da cellule dove cellulare all'espegnimento dei fendi fuori i gruppi di acetil, con conseguente DCFH. L'ossidazione di DCFH da parte di ROS converte la molecola in DCF, che emette fluorescenza verde ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm. Rispetto al rilevamento della fluorescenza con citometria di flusso e altri metodi alternativi5, i vantaggi di questo metodo utilizzando un microscopio a fluorescenza e un lettore di lamiere sono che produce immagini fluorescenti chiaramente visibili, ed è facile da eseguire, efficiente e conveniente. Questo metodo è stato ampiamente utilizzato per rilevare ROS cellulare per studiare varie condizioni6,7,8. Questo protocollo viene utilizzato per rilevare ros totale nelle cellule aderenti. L'utilizzo di questo metodo per rilevare ROS nelle celle delle sospensioni potrebbe richiedere alcune modifiche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Semina delle cellule
- Seme 2 x 105 cellule tumorali dell'HCT116 per bene in una piastra di 24 pozzetti e mantengono le cellule nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) durante la notte a 37 gradi centigradi.
- Sostituire il mezzo di coltura con o senza 100 soflfato ferroso (FS) o 10 M doxorubicin (DOX) contenente mezzo e incubare per 24 h.
2. Preparazione della soluzione DCFH-DA
- Sciogliere 4,85 mg di DCFH-DA in 1 mL di solforo dimetilo (DMSO) per creare una soluzione di riserva di 10 mM.
- Diluire la soluzione di riserva con DMEM preriscaldato in una soluzione di lavoro da 10 M proprio prima di aggiungerla ai pozzi.
- Vorticare la soluzione di lavoro per 10 s.
3. Colorazione DCFH-DA
- Rimuovere il farmaco contenente il mezzo e lavare una volta con DMEM.
- Aggiungere 500 gradi della soluzione di lavoro DCFH-DA in ogni pozzo e incubare a 37 gradi centigradi per 30 min.
- Rimuovere la soluzione di lavoro DCFH-DA. Lavare una volta con DMEM e 2x con 1x salina con buffer fosfato (PBS).
- Aggiungere 500 l 1x PBS ad ogni pozzo.
4. Acquisizione dell'imaging e misurazione dell'intensità
- Prendere immagini fluorescenti rappresentative per ogni pozzo utilizzando il canale di proteina fluorescente verde (GFP) su un microscopio a fluorescenza.
- Dopo aver scattato le immagini, rimuovere PBS e aggiungere a ciascun pozzo il buffer RIPA (radioimmunoprecipitazionation assay) da 200 l.
- Incubare sul ghiaccio per 5 min, quindi raccogliere illisato cellulare in tubi da 1,5 mL.
- Centrifuga a 21.130 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
- Trasferire 100 l del supernatante su una piastra nera di 96 pozze e misurare l'intensità della fluorescenza utilizzando una fluorescenza un lettore di microplacia ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm.
- Trasferire 1 ll del supernatante su una piastra chiara 96 pozzo contenente 100 .L of 1x soluzione di prova proteica per misurare la concentrazione di proteine utilizzando il saggio Bradford9.
- Normalizzare le intensità di fluorescenza con concentrazioni proteiche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le cellule tumorali del colon-retto HCT116 sono state trattate con 100 FS o 10 -M DOX per indurre lo stress ossidativo7. Come mostrato nella Figura 1, la fluorescenza verde è stata drammaticamente aumentata sia da FS che da DOX come previsto. Per quantificare il cambiamento di intensità relativo, le cellule sono state lismilate dopo l'assunzione di immagini e normalizzate con concentrazioni di proteine. L'intensità quantificata della fluorescenza è stata significativamente aumentata da FS o DOX nelle cellule HCT116.
Figura 1: Il trattamento del ferro aumenta il ROS nelle cellule tumorali del colon-retto. Immagini fluorescenti rappresentative scattate da un microscopio a fluorescenza e quantificazione dell'intensità da parte di un lettore di microplamiche a fluorescenza per colorazione 2',7'-diclorohydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) in HCT 116 cellule dopo il controllo non trattato (Ctrl), (A) 100 soffaminati ferrosi (FS) o (B) 10 trattamento doxorubicin (DOX) per 24 h. Barra della scala - 400m. p < 0,05; p < 0.001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il protocollo sperimentale qui descritto è facilmente riproducibile per misurare il ROS totale cellulare. I passaggi critici includono la creazione di soluzioni DCFH-DA fresche ed evitando l'esposizione alla luce, la riduzione al minimo dei disturbi dello stato delle cellule e l'ampio lavaggio PBS prima di scattare le immagini. Per la preparazione della soluzione di lavoro DCFH-DA, la soluzione di stock deve essere aggiunta nel DMEM preriscaldato subito prima di aggiungerla alla piastra 24. Il motivo è che le vecchie soluzioni che generano un'elevata fluorescenza di fondo o esposizione alla luce porteranno al fotosbiancamento. La maggior parte degli studi utilizza 1x PBS o 1x Hanks' soluzione di sale equilibrato (HBSS) per diluire DCFH-DA e usarlo come buffer di reazione10. Tuttavia, quando si utilizzano HCT116 e RKO, la diluizione della soluzione stock DCFH-DA con PBS e DMEM senza siero bovino fetale ha generato un segnale di fondo elevato anche in celle non trattate. Ciò può essere dovuto a disturbi dello stato delle cellule. Inoltre, la soluzione di lavoro DCFH-DA dovrebbe essere aggiunta lentamente lungo la parete del pozzo. Il disturbo dello stato delle cellule genererà un segnale ad alta fluorescenza rispetto all'area vicina indisturbata. È anche fondamentale lavare almeno due volte con PBS prima di scattare immagini per ridurre la fluorescenza automatica del fenolo contenente DMEM. Il DMEM privo di fenoli può essere una scelta migliore, ma vi mostriamo qui che il lavaggio PBS è stato sufficiente a ridurre al minimo la fluorescenza automatica. Come illustrato nella Figura 1, anche nei gruppi di controllo non trattati due batch diversi di esperimenti potrebbero generare immagini rappresentative diverse. Per controllare le variazioni sperimentali, si consiglia di trattare le cellule con soluzione di lavoro DCFH-DA diluita (come nel protocollo) invece di aggiungere la soluzione stock direttamente sulle cellule. Inoltre, le immagini devono essere scattate in campi con densità di cellule simili e lo stesso tempo di esposizione. Infine, è importante eseguire esperimenti su tutti i gruppi di confronto contemporaneamente.
A causa dell'importanza del ROS, è stata sviluppata anche la rilevazione ROS specifica, oltre al rilevamento totale ROS. Ad esempio, la produzione cellulare di superossido può essere rilevata dal dihydroethidium, che al momento dell'ossidazione si traduce in idrossilazione in posizione 2 per formare 2-idrossitassio. Poiché 2-idrossixathidio intercala nel DNA cellulare, si può osservare la fluorescenza rossa con lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 535 e 635 nm. Il superossido mitocondriale può essere visualizzato con il reagente MitoSOX, un derivato cazionale del dihydroethidium che entra nelle cellule vive e in particolare si rivolge ai mitocondri. Il prodotto di ossidazione di Mitosox che genera fluorescenza rossa può intercalarsi nel DNA mitocondriale. La sonda di perossido di naofthylimide fluorescente chemiosese è stata sviluppata per il rilevamento H2O2 11. Inoltre, è stato segnalato anche il rilevamento di radicali idrossili utilizzando la spettrofotometria a fluorescenza12.
In sintesi, qui abbiamo descritto un protocollo semplice e ottimizzato per rilevare il ROS totale cellulare utilizzando una colorazione DCFH-DA conveniente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dai National Institutes of Health (K01DK114390), un sussidio di ricerca dell'American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), una sovvenzione per il progetto di progetto pilota di ricerca University of New Mexico Environmental Health Signature Program and Superfund (P42 ES025589), un Shared Resources Pilot Project Award e un Research Program Support Pilot Project Award del centro oncologico globale UNM (P30CA118100) , e un nuovo premio ricercatore dal Dedicated Health Research Funds presso la Scuola di Medicina dell'Università del Nuovo Messico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
References
- Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
- Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
- Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17 (2014).
- Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
- Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).
- Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11 (4), (2016).
- Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
- Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).
- Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).
- Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).
- Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
- Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).
