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Genetics

Un nuovo toolkit per la valutazione delle funzioni geniche utilizzando la stabilizzazione condizionale Cas9

Published: September 2, 2021 doi: 10.3791/60685
Automatic Translation
1,2, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

Summary

Qui, descriviamo uno strumento di modifica del genoma basato sulla stabilizzazione temporale e condizionale della proteina 9 (Cas9) associata a ripetizione palindromica corta (CRISPR)(Cas9) raggruppata regolarmente intervallata sotto la piccola molecola, Shield-1. Il metodo può essere utilizzato per cellule in coltura e modelli animali.

Abstract

La tecnologia clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associata alla proteina 9 (CRISPR/Cas9) è diventata uno strumento di laboratorio prevalente per introdurre modifiche accurate e mirate nel genoma. La sua enorme popolarità e la rapida diffusione sono attribuite alla sua facilità d'uso e precisione rispetto ai suoi predecessori. Tuttavia, l'attivazione costitutiva del sistema ha applicazioni limitate. In questo articolo, descriviamo un nuovo metodo che consente il controllo temporale dell'attività CRISPR / Cas9 basato sulla stabilizzazione condizionale della proteina Cas9. La fusione di un mutante ingegnerizzato della proteina legante la rapamicina FKBP12 a Cas9 (DD-Cas9) consente la rapida degradazione di Cas9 che a sua volta può essere stabilizzata dalla presenza di un ligando sintetico FKBP12 (Shield-1). A differenza di altri metodi inducibili, questo sistema può essere adattato facilmente per generare sistemi bi-cistronici per co-esprimere DD-Cas9 con un altro gene di interesse, senza regolazione condizionale del secondo gene. Questo metodo consente la generazione di sistemi tracciabili e la manipolazione parallela e indipendente degli alleli presi di mira dalla nucleasi Cas9. La piattaforma di questo metodo può essere utilizzata per l'identificazione sistematica e la caratterizzazione di geni essenziali e l'interrogazione delle interazioni funzionali dei geni in contesti in vitro e in vivo.

Introduction

CRISPR-Cas9 che sta per"clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9"è stato scoperto per la prima volta come parte di studi sull'immunità adattativa batterica1,2. Oggi, CRISPR / Cas9 è diventato lo strumento più riconosciuto per l'editing genetico programmabile e sono state sviluppate diverse iterazioni del sistema per consentire modulazioni trascrizionali ed epigenetiche3. Questa tecnologia consente la manipolazione genetica altamente precisa di quasi tutte le sequenze di DNA4.

I componenti essenziali di qualsiasi editing genetico CRISPR sono una sequenza di RNA guida personalizzabile e la nucleasi Cas95. La guida dell'RNA si lega alla sequenza bersaglio-complementare nel DNA, dirigendo la nucleasi Cas9 per eseguire una rottura a doppio filamento in un punto specifico del genoma3,4. Il sito di scissione risultante viene quindi riparato mediante end-joining non omologo (NHEJ) o riparazione diretta dall'omologia (HDR), con la conseguente introduzione di cambiamenti nella sequenza di DNA mirata5.

L'editing genetico basato su CRISPR / Cas9 è facile da usare e relativamente economico rispetto alle precedenti tecniche di modifica genetica e ha dimostrato di essere sia efficiente che robusto in una molteplicità di sistemi2,4,5. Tuttavia, il sistema presenta alcune limitazioni. L'espressione costitutiva di Cas9 ha spesso dimostrato di provocare un aumento del numero di off-target e un'elevata tossicità cellulare4,6,7,8. Inoltre, il targeting costitutivo di geni essenziali e di sopravvivenza cellulare da parte di Cas9 toglie la sua capacità di eseguire alcuni tipi di studi funzionali come gli studi cinetici sulla morte cellulare7.

Diversi strumenti CRISPR-Cas9 inducibili o controllati condizionatamente sono stati sviluppati per risolvere questi problemi6, come Tet-ON e Tet-Off9; ricombinazione sito-specifica10; prossimità indotta chimicamente11; giunzione dipendente dall'inteina3; e sistemi di localizzazione nucleare basati sul recettore degli estrogeni 4-idrossitamoxifene (ER)12. In generale, la maggior parte di queste procedure (intein splicing e sistemi di proximity split indotti chimicamente) non offrono un controllo reversibile, presentano una risposta cinetica molto lenta al trattamento farmacologico (sistema Tet-On/Off) o non sono suscettibili di manipolazione ad alto rendimento6.

Per affrontare queste limitazioni abbiamo sviluppato un nuovo toolkit che non solo fornisce un editing genetico rapido e robusto controllato nel tempo, ma garantisce anche tracciabilità, sintonizzazione e suscettibilità alla manipolazione genica ad alto rendimento. Questa nuova tecnologia può essere utilizzata in linee cellulari, organoidi e modelli animali. Il nostro sistema si basa su un dominio ingegnerizzato, quando fuso a Cas9, induce il suo rapido degrado. Tuttavia, può essere rapidamente stabilizzato con una piccola molecola altamente selettiva, non tossica e permeabile alle cellule. Più specificamente, abbiamo progettato il "dominio destabilizzante" (DD) mutante umano FKBP12 in Cas9, contrassegnando Cas9 per una degradazione rapida e costitutiva attraverso il sistema ubiquitina-proteasoma quando espresso in cellule di mammifero13. Il ligando sintetico DD, Shield-1 può stabilizzare la conformazione DD, impedendo così la degradazione delle proteine fuse a DD (come Cas9) in modo molto efficiente e con una risposta cinetica veloce14,15. Da notare, Shield-1 si lega con tre ordini di grandezza più stretto al mutante FKBP12 che alla sua controparte wild-type14.

La coppia DD-Cas9/Shield-1 può essere utilizzata per studiare l'identificazione sistematica e la caratterizzazione di geni essenziali in cellule in coltura e modelli animali come abbiamo precedentemente dimostrato prendendo di mira condizionatamente il gene CypD, che svolge un ruolo importante nel metabolismo dei mitocondri; EGFR, un attore chiave nella trasformazione oncogenica; e Tp53, un gene centrale nella risposta al danno al DNA. Oltre all'editing genetico controllato temporalmente e condizionatamente, un altro vantaggio del metodo è che la stabilizzazione di DD-Cas9 è indipendente dalla sua trascrizione. Questa caratteristica consente la co-espressione, sotto lo stesso promotore, di marcatori tracciabili e ricombinasi, come la ricombinasi dipendente dal recettore degli estrogeni, CREER. In questo lavoro, mostriamo come il nostro metodo può essere utilizzato con successo in vitro, per colpire condizionatamente, ad esempio, il gene di replicazione del DNA, RPA3.

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Protocol

1.Il vettore DD-Cas9

  1. Ottenere il vettore DD-Cas9 da Addgene (DD-Cas9 con sequenza di filler e Venere (EDCPV), Plasmide 90085).
    NOTA: Questo è un plasmide lentivirale DD-Cas9 con un promotore U6 che guida la trascrizione dell'RNA a guida singola (sgRNA) mentre il promotore EFS guida la trascrizione DD-Cas9. La sequenza DYKDDDDK (flag-tag) è presente al C-terminale di Cas9 seguita da 2A peptide auto-scissione (P2A) che separa DD-Cas9 e la proteina fluorescente modificata Venere (mVenus).

2. Piccolo design dell'RNA guida (sgRNA)

  1. Progettare un piccolo RNA guida (sgRNA) che verrà clonato nel vettore DD-Cas9 utilizzando uno dei numerosi algoritmi, mirando a una specifica regione genomica.
    NOTA: per ridurre gli effetti fuori bersaglio, selezionare le sequenze sgRNA con il punteggio più alto utilizzando il sito Web: http://crispr.mit.edu.
  2. Progettare e ordinare due oligonucleotidi per sequenza di sgRNA per creare un sgRNA completo.
    NOTA: Poiché il plasmide sarà digerito dall'enzima BsmBI, progettare l'oligonucleotide avanti e indietro aggiungendo sporgenze di digestione BsmBI alla sequenza sgRNA. Utilizzare il modello della Tabella 1.

3. Clonazione di sgRNA nel vettore lentivirale DD-Cas9

  1. Defosforilare le 5′-estremità del plasmide DD-Cas9 utilizzando la fosfatasi alcalina (FastAP) in una reazione di digestione enzimatica di restrizione.
    NOTA: I vettori possono ri-circolarizzare durante la legatura soprattutto quando sono linearizzati da un singolo enzima di restrizione. Per garantire che il vettore non si ri-circolarizzi, de-fosforilare il plasmide aggiungendo fosfatasi direttamente nella reazione di digestione.
    1. Defosforilare e digerire il plasmide con l'enzima BsmBI preparando una miscela di 5 μg di plasmide DD-Cas9, 6 μL di tampone digesto (10x), 0,6 μL di DTT (100 mM), 3 μL di BsmBI, 3 μL di FastAP, aggiungere fino a 60 μL di acqua priva di nucleasi per rendere 60 μL il volume totale di reazione.
      NOTA: Aggiungere l'enzima BsmBI e FastAP alla miscela alla fine.
    2. Incubare la miscela per 30 minuti a 37 °C blocco termico o termociclatore.
  2. Purificare il plasmide DD-Cas9 digerito.
    1. Preparare un gel di acarosio del DNA allo 0,8% per rimuovere il plasmide digerito in modo incompleto e le tracce di enzimi. Utilizzare un pettine gel più ampio per una migliore separazione ed eseguire il gel a 90 V.
    2. Visualizza le bande sotto la luce UV a 360-365 nm e taglia la banda plasmidica più grande dal gel. Scartare il frammento da 2 kb che corrisponde al riempitivo.
    3. Purificare il cinturino in gel tagliato di grandi dimensioni utilizzando un kit di purificazione del gel commerciale e seguire le istruzioni del produttore.
  3. Oligo ricotti ligate con plasmide DD-Cas9 digerito.
    1. Fosforilato e ricotto gli oligo sgRNA.
      1. Preparare la miscela di 1 μL di T4 Ligation Buffer (10x), 1 μL di Oligo 1 (100 μM), 1 μL di Oligo 2 (100 μM), 6,5 μL di acqua priva di nucleasi. Infine, aggiungere 0,5 μL di T4 PNK. Il volume totale di questa reazione è di 10 μL.
      2. Aggiungere la miscela di reazione al termociclatore con le seguenti condizioni: 37 °C per 30 min, 95 °C per 5 min, quindi scendere a 25 °C con la velocità di 5 °C/min.
        NOTA: Il PNK deve essere inattivato termicamente prima che gli oligonucleotidi vengano messi nella legatura altrimenti il PNK fosforilato il vettore. La fase di fosforilazione e la fase di ricottura vengono eseguite insieme in un termociclatore. La fase di fosforilazione in cui il fosfato 5' viene aggiunto agli oligonucleotidi sgRNA è necessaria affinché si verifichi la legatura.
    2. Ligate DD-Cas9 ha digerito plasmidi e sgRNA oligos.
      1. Diluire gli oligo ricotti a 1:200 in acqua priva di nucleasi e utilizzare 50 ng di DNA plasmidico nella reazione di legatura.
        NOTA: Utilizzare il rapporto molare del vettore 6 insert : 1, per promuovere l'integrazione dell'inserto o utilizzare un calcolatore di legatura per calcolare il rapporto molare: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation.
      2. Preparare la miscela di reazione di legatura: 50 ng di vettore DD-Cas9 digerito e purificato, volume appropriato di oligos ricotti diluiti, 1 μL di T4 Ligation Buffer (10x), 1 μL di T4 DNA Ligase, fino a 10 μL di acqua priva di nucleasi per ottenere il volume totale della reazione 10 μL.
      3. Se si utilizza una ligasi "ad alta concentrazione", incubare la reazione a temperatura ambiente per 5 minuti. Altrimenti, incubare a temperatura ambiente per 2 ore, o per ottenere una maggiore resa di legatura, incubare a 16 °C durante la notte.
        NOTA: Inattivare termicamente se si utilizza la T4 DNA Ligasi standard a 65 °C per 20 minuti. Non inattivare il calore se si utilizzano miscele master ligasi.

4. Trasformazione batterica

  1. Piastre di agar LB-ampicillina pre-calde da 10 cm a temperatura ambiente.
  2. Scongelare 50 μL di cellule batteriche competenti "One shot Stbl3" sul ghiaccio.
  3. Aggiungere 2-3 μL di miscela di legatura a 50 μL di cellule batteriche competenti e mescolare delicatamente facendo scorrere il fondo del tubo con un dito 4 volte. Incubare sul ghiaccio per 30 min.
  4. Shock termico delle celle a esattamente 42 °C per 40 secondi, utilizzando un timer. Raffreddare le cellule batteriche sul ghiaccio per 5 minuti.
  5. Aggiungere 500 μL di mezzi SOC senza antibiotico alle cellule batteriche e farli crescere nell'incubatore vibrante a 250 giri / min per 45 minuti, a 37 °C.
  6. Distribuire 100 μL di batteri trasformati su piastre LB-ampicillina pre-calde e incubare durante la notte a 37 °C.

5. Mini/maxi-prep del plasmide legato

  1. Prepara una cultura di avviamento maxi/mini-prep.
    1. Il giorno dopo scegli un singolo clone batterico e inocula una coltura iniziale con 8 ml di media LB contenenti ampicillina.
    2. Far crescere i batteri nell'incubatore vibrante a 250 giri / min, 37 ° C per 10-12 ore.
    3. Utilizzare 3-5 ml di batteri per la mini-preparazione o utilizzarlo come coltura di avviamento per la maxi-preparazione. Utilizzare il resto dei batteri come un glicerolo batterico aggiungendo 100% glicerolo nel rapporto di coltura batterica: glicerolo è 1: 1.
      NOTA: Qui descriveremo la procedura di mini-preparazione.
  2. Procedura di mini-preparazione
    1. Raccogliere 3-5 ml di cellule batteriche e centrifugare a 12.000 x g per 1 min.
    2. Sospendare il pellet di cellule batteriche con 200 μL di tampone P1, contenente RNasi A e conservato a 4 °C.
    3. Aggiungere 200 μL di tampone P2 e mescolare delicatamente invertendo il tubo 10 volte fino a quando il liquido non si chiarisce.
    4. Aggiungere 300 μL di tampone P3 e mescolare invertendo il tubo 10 volte. Il liquido diventerà torbido. Procedere immediatamente con la centrifugazione dei campioni a 12.000 x g per 10 min.
    5. Trasferire il surnatante trasparente alla colonna di centrifuga e centrifugare a 12.000 x g per 1 minuto.
      Scartare il flusso attraverso.
      NOTA: Assicurarsi che il surnatante sia chiarito. Le particelle possono ostruire la colonna di rotazione e ridurre l'efficacia della colonna.
    6. Aggiungere 400 μL di tampone PD e centrifugare a 12.000 x g per 1 min. Scartare il flusso attraverso.
    7. Aggiungere 600 μL di tampone PW per lavare la colonna di centrifuga e centrifugare a 12.000 x g per 1 minuto. Scartare il flusso attraverso.
    8. Centrifugare nuovamente la colonna di centrifuga alla massima velocità per 3 minuti per rimuovere i residui del tampone. Scartare il flusso e lasciarlo riposare per 2 minuti.
    9. Posizionare la colonna di rotazione su un tubo fresco e aggiungere 50 μL di tampone di eluizione. Incubare per 5 minuti e centrifugare alla massima velocità per 2 minuti.
    10. Utilizzare il dispositivo nanodrop per misurare la concentrazione di plasmide DD-Cas9 purificato con l'inserto sgRNA (ng/μL).
  3. Convalidare la clonazione sgRNA mediante sequenziamento del DNA del plasmide DD-Cas9. Utilizzare la sequenza di primer U6 nella Tabella 2.

6. Preparazione lentivirale

  1. Preparare le celle di imballaggio HEK293T per la trasfezione.
    1. Utilizzare HEK293T sani fino al passaggio 10 e seminarli uniformemente a densità 1-2 x 106 cellule per piastra di coltura tissutale di 10 cm. Utilizzare 10 ml di Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con il 10% di siero bovino fetale filtrato (FBS). Incubare le cellule nell'incubatore di colture tissutali, al 5% di CO2 e 37 °C per 20 ore.
    2. Il giorno dopo, conferma che le cellule hanno raggiunto il 70% di confluenza con la microscopia a campo luminoso e che sono uniformemente disperse attraverso la piastra. Cambiare il mezzo in celle 1 h prima della trasfezione con il volume finale di 10 ml.
      NOTA: I mezzi devono essere assenti da antibiotici e antimicotici.
    3. Preparare la miscela di 2 tubi con 500 μL di mezzi caldi (ad esempio, OptiMEM).
      1. Aggiungere 25 μL di reagente di trasfezione al tubo 1 contenente 500 μL caldi di mezzi e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
      2. Nel frattempo preparare una miscela di plasmidi nel tubo 2 contenente 3,5 μg di DD-Cas9 contenente sgRNA clonato, 6 μg del plasmide di imballaggio (psPAX2) e 3 μg del plasmide dell'involucro (pMD2.G) in 500 μL caldi di media.
      3. Mescolare il tubo 1 con il tubo 2 per formare una miscela di trasfezione e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.
      4. Dropwise la miscela di trasfezione in cellule HEK293T e la piastra di incubazione nell'incubatore di colture tissutali, al 5% di CO2 e 37 °C durante la notte.
      5. Dopo 18 ore, cambiare con attenzione il supporto a 10 ml di DMEM fresco con il 10% di FBS per rimuovere il reagente di trasfezione. Incubare per le prossime 48 ore.
      6. Dopo 48 ore, raccogliere il surnatante con una siringa da 10 ml e passarlo attraverso un filtro da 0,45 μm.
      7. Aliquota e immagazzinare il surnatante virale a -80 °C.

7. Determinazione del titolo del virus e dell'efficacia della trasduzione con la citometria a flusso

  1. Seminare le celle HEK293T con 5 x 105 celle / pozzo in una piastra a 6 pozzetti. Semina le cellule in due piastre a 6 pozzi. Utilizzare una piastra per contare il giorno successivo.
  2. Incubare le piastre nell'incubatore a 37 °C, 95% di umidità, 5% di CO2 durante la notte per raggiungere il 50-60% di confluenza il giorno successivo.
  3. Il giorno dopo, usa una delle piastre a 6 pozzi per contare le cellule in 6 pozzi.
  4. Scongelare l'aliquota del virus che verrà utilizzata per eseguire la diluizione seriale e aggiungere 8 μg/mL di reagente polibrene.
  5. Preparare DMEM con FBS al 10% per la diluizione seriale del virus e aggiungere 8 μg/mL di reagente polibrene.
  6. Preparare 2 mL di diluizioni seriali dieci volte del lentivirus da 1 x 10-1 a 1 x 10-4 in mezzi contenenti polibrene.
  7. Rimuovere i media dalla piastra a 6 pozzi e aggiungere 1 mL di diluizioni virali ai pozzi. Lascia uno bene con i media da solo come controllo negativo e uno bene con il virus al 100%.
  8. Incubare le cellule con il virus nell'incubatrice per 24 ore.
  9. Il giorno successivo, rimuovere il supporto con virus dalle piastre a 6 pozzi e cambiarlo per 2 ml di DMEM fresco con il 10% di FBS. Incubare le cellule per 48-72 ore. Osserva la GFP usando un microscopio fluorescente ogni giorno.
  10. Dopo 48-72 ore, staccare le cellule e risuscivarle nel buffer MACS.
  11. Utilizzare un citometro a flusso per determinare la percentuale di espressione della GFP.
  12. Calcolare il titolo del virus utilizzando la seguente formula: TU/mL = (Numero di cellule trasdotte x Percentuale fluorescente x Fattore di diluizione)/(Volume di trasduzione in mL)

8. Trasduzione lentivirale delle cellule bersaglio

  1. Placcare la linea cellulare di interesse su una piastra di 10 cm e incubare durante la notte per raggiungere la confluenza del 50-60% il giorno successivo.
    NOTA: Abbiamo utilizzato la linea cellulare A549 che esprime DD-Cas9 e due sgRNA indipendenti del gene RPA3. Abbiamo anche usato il vettore di espressione della linea cellulare A549 con controllo Renilla. Abbiamo seminato quelle cellule alla densità di 2 x 103cellule / cm2 e le abbiamo incubate a 37 ° C, 95% di umidità, 5% di CO2 durante la notte per raggiungere il 50-60% di confluenza il giorno successivo. Abbiamo utilizzato supporti RPMI con FBS filtrato al 10%. Abbiamo proceduto con i passaggi successivi come segue:
  2. Il giorno successivo, infettare le cellule con 500-2000 μL di particelle virali in 10 ml di volume totale del terreno di coltura. Incubare i mezzi virali per 24 ore.
  3. Il giorno successivo, cambia il mezzo virale in mezzo di coltura e determina la percentuale di cellule GFP positive usando la citometria a flusso.
  4. Selezionare le celle GFP positive mediante l'ordinamento delle cellule FACS o utilizzando la selezione della bleomicina.
  5. Espandere le celle selezionate positivamente e congelare un calcio.

9. Induzione condizionale dell'editing genetico mediato da Cas9

  1. Piastra positivamente selezionata cellule 24 ore dopo l'infezione e cellule non trasdotte a piastra a 12 pozzi separatamente. Attendere che le cellule si attacchino e cambino il supporto in un supporto di coltura cellulare contenente 200 nM di Shield-1. Sostituire il mezzo nelle piastre con cellule trasdotte e non trasdotte, lasciando 2 pozzetti per piastra con supporti regolari come controllo negativo.
  2. Incubare ed estrarre proteine da ciascun pozzo in diversi punti temporali: tempo 0, 2 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h e 72 h dopo aver aggiunto lo Shield-1 ai pozzi.
  3. Quindi rimuovere il supporto con Shield-1 dal resto dei pozzi e cambiarlo con il normale supporto cellulare.
  4. Raccogliere le proteine da quei pozzi 2 h, 6 h e 12 h dopo aver cambiato il mezzo.
  5. Visualizza con l'analisi western blot la reversibilità e la rapidità della regolazione destabilizzata della proteina DD-Cas9 dopo l'aggiunta e il ritiro del suo ligando, Shield-1. Utilizzare un anticorpo diretto verso DYKDDDDK Tag per visualizzare le proteine e un anticorpo di controllo mirato, ad esempio la beta-tubulina.
  6. Determinare la dose ottimale di Shield-1 in modo da una curva dose-risposta osservata dall'analisi Western Blot.

10. Validazione dell'editing genetico

NOTA: I saggi di espressione GFP, come l'analisi della citometria a flusso e il marcatore di selezione della bleomicina, confermano solo la corretta somministrazione del reagente CRISPR, ma non determinano se la sequenza desiderata è stata mirata con successo. I saggi più comuni per confermare il successo del targeting genico da parte dell'esperimento CRISPR sono il sequenziamento del DNA Sanger, il sequenziamento di nuova generazione, il Surveyor Nuclease Assay, il Tracking of Indels by Decomposition (TIDE) Assay o l'analisi western blot16,17,18.

  1. Placcare celle selezionate positivamente e cambiare il mezzo a 200 nM di supporto contenente Shield-1. Incubare le cellule per 5 giorni, cambiando i mezzi con Shield-1 ogni 3 giorni.
  2. Utilizzare le tecniche di convalida sopra menzionate 5 giorni dopo l'induzione DD-Cas9 da parte di Shield-1.

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Representative Results

Per consentire l'espressione condizionale di Cas9, abbiamo sviluppato un doppio costrutto vettoriale lentivirale costituito da un promotore guidato da U6 per esprimere costitutivamente sgRNA e un promotore core EF-1α per guidare l'espressione della proteina di fusione DD-Cas9 (Figura 1A)19. Come paradigma per illustrare la robustezza e l'efficienza del sistema, abbiamo trasdotto la linea cellulare A549 carcinomatosa polmonare con il costrutto lentivirale. I livelli di Cas9 in presenza o assenza del ligando Shield-1 sono stati misurati mediante reazione a catena trascrizione inversa-polimerasi (RT-PCR) e analisi Western blot utilizzando un anticorpo specifico anti-Flag. Abbiamo usato cellule non infette e cellule finte-infette (il veicolo) come controlli. Le cellule sono state trattate con una concentrazione di Shield-1 che va da 10 a 1000 nM per 7 d. Come mostrato, il trattamento con Shield-1 è stato in grado di regolare l'espressione di DD-Cas9 in modo forte dose-dipendente (Figura 1B e Figura 2A). L'analisi RT-PCR con primer specifici per DD-Cas9 e primer di controllo per la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) ha confermato che i livelli di espressione di mRNA di DD-Cas9 erano simili tra le cellule trasdotte e il veicolo nonostante la presenza o l'assenza di Shield-1 (Figura 2B). Ciò conferma che l'induzione della proteina Cas9 è un evento post-trascrizionale.

Questo sistema consente una stabilizzazione rapida e reversibile della proteina DD-Cas9. La Figura 3 mostra una sufficiente induzione dell'espressione di Cas9 nella linea cellulare A549 trasdotta 2 ore dopo il trattamento con 200 nM di Shield-1 rispetto alle cellule A549 non infette. Tuttavia, il ritiro di Shield-1 provoca una rapida diminuzione della proteina DD-Cas9, che diventa trascurabile entro 6-12 ore (Figura 3).

La proteina RPA3 è un componente dell'eterotrimero della proteina di replicazione umana A (RPA). È un complesso legante il DNA a singolo filamento che svolge un ruolo importante nella replicazione, ricombinazione e riparazione del DNA. Per convalidare l'uso del sistema per studiare i geni essenziali, abbiamo preso di mira il gene RPA3. A tal fine, abbiamo utilizzato due RNA a guida singola indipendenti specifici per locus (guide 25 e 44) e Renilla come controllo (guida 208). Le cellule A549 trasdotte con il costrutto lentivirale DD-Cas9 sono state trattate con 200 nM di Shield-1 per 3 d. Una diminuzione del numero di cellule nelle cellule A549 trasdotte trattate con Shield-1 contenenti l'RNA guida RPA3 è stata evidente dopo 48 ore di trattamento e non è stato osservato alcun effetto sul numero di cellule nel campione Renilla (Figura 4A). Per convalidare l'esaurimento della proteina RPA3, abbiamo eseguito un'analisi immunoblotting utilizzando un anticorpo contro RPA3 3 d dopo l'induzione di Sheild-1 (Figura 4B). Inoltre, abbiamo confermato l'inversione dell'editing genetico o le mutazioni indel utilizzando i saggi di nucleasi Surveyor e il sequenziamento del DNA (Figura 4C).

Il costrutto vettoriale lentivirale che abbiamo progettato ha una caratteristica unica: la regolazione della stabilità della proteina DD-Cas9 è indipendente dalla sua espressione di mRNA. Ciò consente alla generazione di sistemi bicistronici di esprimere un altro gene di interesse sotto lo stesso promotore EF-1a senza essere modulato dal destabilizzato DD-Cas9 (Figura 5A,5B). Abbiamo anche aggiunto un peptide auto-scissione 2A (P2A) tra DD-Cas9 e mVenus, una proteina fluorescente modificata che può essere utilizzata per tracciare le cellule infette (Figura 5A). Poiché mVenus viene posto dopo P2A, come mostrato dai risultati dell'analisi Western Blot nella Figura 5B,l'espressione della proteina mVenus è stata osservata nel veicolo e le cellule trasdotte A549 indipendentemente dall'espressione di DD-Cas9 e dal trattamento con Shield-1.

Figure 1
Figura 1: Schema del costrutto lentivirale e diversi strumenti di modifica genetica. A)La dorsale lentivirale DD-Cas9 contiene un promotore U6, sgRNA, promotore EF-1a, DD, spCas9, nucleoplasmina NLS e Flag-tag. B)Confronto tra il sistema DD-Cas9 (pannello di sinistra) e il diverso sistema Tet-On (pannello di destra) utilizzato come strumento di modifica genetica. Lad-ladder, NI-cellule non infette, Veh-vehicle, -Sh cellule trattate senza Shield-1, + cellule Sh trattate con 200 nM Shield, - Cellule Doxy senza trattamento con doxiciclina, + Cellule Doxy trattate con doxiciclina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Risultati rappresentativi della stabilizzazione DD-Cas9 dose-dipendente mediante Shield-1. A)Analisi Western Blot utilizzando un anticorpo anti-Flag-tag di espressione stabilizzata di DD-Cas9 in cellule trattate con concentrazioni crescenti di Shield-1. Come controllo, sono state utilizzate le cellule non infette (NI) e le cellule trattate in finto (Veh). La proteina di fusione DD-Cas9 non era rilevabile in entrambi i controlli. B)I risultati RT-PCR dei livelli di espressione di mRNA di DD-Cas9 nelle cellule trasdotte in assenza o nei trattamenti dose-dipendenti di Shield-1 erano simili tra le cellule trasdotte e il veicolo, utilizzando primer GAPDH come controllo interno. Questa cifra è stata modificata da Serif et al19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: L'analisi Western Blot illustra la reversibilità e la rapidità della regolazione destabilizzata della proteina DD-Cas9 dopo il ritiro del suo ligando Shield-1. La linea cellulare A549 trasdotta con DD-Cas9 e A549 non infetto come controllo sono state trattate 24 ore dopo l'infezione con 200 nM di ligando Shield-1 per i punti temporali indicati. Il livello proteico di DD-Cas9 nelle cellule di controllo fittizie non era rilevabile. Questa cifra è stata modificata da Serif et al19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Il sistema DD-Cas9 può indurre un robusto editing genico in contesti "in-vitro" e "in-vivo". A)La linea cellulare A549 trasdotta con un vettore che esprime sgRNA per il gene RPA3 e DD-Cas9 (RPA3). Come controllo è stato utilizzato A549 trasdotto con un vettore che esprime sgRNA per Renilla (Ren). Le cellule sono state trattate con Shield-1 (200 nM) per 3 giorni, il che ha comportato una rapida diminuzione della vitalità cellulare nelle cellule che esprimono SGRNA RPA3, senza alcun effetto sul numero di cellule nel campione di controllo Renilla. L'efficienza dell'editing genetico RPA3 nella linea cellulare A549 è stata convalidata dall'analisi B) Western Blot utilizzando l'anticorpo contro Flag-tag in RPA3 A549 e Renilla A549 in presenza e assenza di 3 giorni di trattamento Shield-1 (200 nM) e C) mediante test di nucleasi SURVEYOR. Le frecce nel pannello C) mostrano i frammenti del test della nucleasi SURVEYOR. Questa cifra è stata modificata da Serif et al19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Schema di un costrutto lentivirale bicistronico DD-Cas9 per guidare l'espressione di mVenus indipendentemente da DD-Cas9. A) Il costrutto è costituito da promotore U6, sgRNA, promotore EF-1a, DD-Cas9, P2A e mVenus. B)Le cellule A549 trasdotte con un plasmide lentivirale contenente DD-Cas9, P2A e mVenus sono state trattate con 50 mM ligando Shield-1 per 3 giorni. Il terzo giorno, l'analisi western blot è stata eseguita con lisito cellulare, utilizzando separatamente l'anticorpo contro GFP e Flag-tag. La figura 5B è stata modificata da Serif et al19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Avanti (Oligo 1) 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
Inverso (Oligo 2) 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'

Tabella 1:Il disegno dell'oligonucleotide sgRNA avanti e indietro. L'oligonucleotide avanti (Oligo 1) e il rovescio (Oligo 2) sono progettati aggiungendo la digestione enzimatica BsmBI sovrasta la sequenza sgRNA. "N" indica i diversi nucleotidi presenti nella sequenza sgRNA, il resto sono sporgenze per la digestione di BsmBI.

Sequenza di primer U6 5'-GACTATCATATGCTTACCGT-3'

Tabella 2: La sequenza del promotore U6 per la convalida della clonazione sgRNA. Per convalidare il successo della clonazione sgRNA, utilizzare la sequenza del promotore U6 per il sequenziamento del DNA del plasmide DD-Cas9.

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Discussion

La tecnologia CRISPR/Cas9 ha rivoluzionato la capacità di interrogare funzionalmente i genomi2. Tuttavia, l'inattivazione dei geni spesso si traduce in letalità cellulare, deficit funzionali e difetti dello sviluppo, limitando l'utilità di tali approcci per lo studio delle funzionigeniche 7. Inoltre, l'espressione costitutiva di Cas9 può provocare tossicità e la generazione di effetti fuori bersaglio6. Sono stati sviluppati diversi approcci per controllare temporalmente le tecnologie di editing del genoma basate su CRISPR-Cas96. Questi sistemi si basano sul controllo trascrizionale di Cas9 e/o sgRNA, o sull'attivazione post-trascrizionale e post-traduzionale di Cas921,22,23. In alternativa a questi sistemi, abbiamo sviluppato un nuovo toolkit basato sulla destabilizzazione condizionale di Cas9.

Il passo critico in questo protocollo è la progettazione di almeno due o tre sgRNA per un gene specifico per evitare effetti off-target e facilitare l'editing genetico efficiente. Un passo limitante la velocità è una trasformazione efficiente della linea cellulare con il vettore DD-Cas9. La qualità delle particelle di lentivirus (titoli elevati) si basa sulle cellule HEK-293T. È fondamentale utilizzare un numero di passaggio basso (fino al passaggio 10) delle celle HEK-293T che sono state mantenute correttamente (divise quando hanno raggiunto il 70% di confluenza, di solito due volte a settimana in un rapporto 1: 6). In alternativa, la linea cellulare HEK-293 Lenti-X, che è stata selezionata clonalmente per produrre 30× titoli virali più alti rispetto alle normali cellule HEK-293T, può essere utilizzata24. Un altro passo cruciale è l'ottimizzazione del rapporto tra il plasmide DD-Cas9, il plasmide di imballaggio psPAX2 e il plasmide dell'involucro pMD2.G. Nella nostra esperienza, sia il volume in cui viene preparata la miscela di trasfezione con lipofectamine, sia il rapporto plasmidico, hanno un effetto sostanziale sull'efficienza della trasfezione. Ti consigliamo di seguire i passaggi del nostro protocollo per ottenere i migliori risultati. Il prossimo passo cruciale per un efficiente editing genetico è l'ottimizzazione delle concentrazioni di Shield-1. Raccomandiamo una concentrazione finale di 200 nM ma per ottenere i migliori risultati, la concentrazione dovrebbe essere ottimizzata per una specifica linea cellulare trasdotta. Il sistema DD/ Shield-1 è stato utilizzato con successo in diverse colture cellulari, cellule germinali, il protozoo Entamoeba histolytica,il verme piatto Caenorhabditis elegans, xenotrapiantitransgenici, topi transgenici e medaka25. Una delle maggiori limitazioni è l'alto costo della molecola Shield-1, specialmente quando viene utilizzata in ambienti in vivo. Inoltre, è stato precedentemente dimostrato che le proteine mirate a determinati compartimenti cellulari, come la matrice mitocondriale o il lume del reticolo endoplasmatico, possono essere stabilizzate o accumulate in assenza di Shield-1. Questo perché diverse proteine hanno diversi macchinari locali per il controllo della qualità delle proteine26. Mentre le fusioni DD nel citoplasma o nel nucleo possono essere degradate in modo molto efficiente nelle cellule di mammifero e stabilizzate da Shield-1, per superare le limitazioni sopra menzionate, si consiglia di utilizzare un dominio destabilizzante alternativo derivato dalla diidrofolato reduttasi batterica27. Questo sistema utilizza trimetoprim come molecola legante per stabilizzare il dominio di destabilizzazione ed è anche un'alternativa meno costosa a Shield-127.

Oltre a raggiungere la trascrizione di DD-Cas9 come sua espressione indipendente, i vantaggi di questo metodo, rispetto ad altri strumenti di editing genetico CRISPR-Cas9 inducibili o controllati condizionatamente, sono l'editing genico controllato temporalmente e condizionatamente, meno effetto off-target e minore tossicità cellulare4,6,7,8. L'efficienza e la semplicità del metodo Shield-1/DD-Cas9 consentono la generazione di una varietà di strumenti che possono essere facilmente adattati e utilizzati in una molteplicità di applicazioni. Il sistema può essere facilmente utilizzato anche in ambienti in vivo, ed è stato dimostrato che Shield-1 può penetrare in modo efficiente attraverso il bariieremato-encefae 19,25,28,29. Sebbene questo articolo descrivesse l'uso della tecnologia CRISPR-Cas9 per la caratterizzazione di geni cellulari essenziali, lo stesso approccio potrebbe essere facilmente implementato per l'identificazione dei geni necessari per la sopravvivenza o la progressione dei tumori.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Ringraziamo i precedenti membri del nostro laboratorio e lo scienziato Serif Senturk per il lavoro precedente. Ringraziamo Danilo Segovia per aver letto criticamente questo manoscritto. Questo studio è stato possibile e supportato da Swim Across America e dal programma Cancer Target Discovery and Development Center del National Cancer Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100mM DTT Thermosfisher
10X FastDigest buffer Thermosfisher B64
10X T4 Ligation Buffer NEB M0202S
colorimetric BCA kit Pierce 23225
DMEM, high glucose, glutaMax Thermo Fisher 10566024
FastAP Thermosfisher EF0654
FastDigest BsmBI Thermosfisher FD0454
Flag [M2] mouse mAb Sigma F1804-50UG
Genomic DNA extraction kit Macherey Nagel 740952.1
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S
oligonucleotides Sigma Aldrich
pMD2.G Addgene 12259
polybrene Sigma Aldrich TR-1003-G
psPAX2 Addgene 12260
QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit Qiagen 28506
secondary antibodies LICOR
Shield-1 Cheminpharma
Stbl3 competent bacterial cells Thermofisher C737303
SURVEYOR Mutation Detection Kit Transgenomic/IDT
T4 PNK NEB M0201S
Taq DNA Polymerase NEB M0273S
α-tubulin [DM1A] mouse mAb Millipore CP06-100UG

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References

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Genetica Numero 175 Editing genetico studi genomici funzionali CRISPR Cas9 dominio destabilizzante inducibile
Un nuovo toolkit per la valutazione delle funzioni geniche utilizzando la stabilizzazione condizionale Cas9
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