Summary
여기서, 우리는 소분자, Shield-1 하에서 정기적으로 간격이 있는 짧은 palindromic 반복-(CRISPR-) 관련 단백질 9 (Cas9)의 시간적 및 조건부 안정화에 기초하여 게놈 편집 도구를 기술합니다. 이 방법은 배양 된 세포 및 동물 모델에 사용될 수있다.
Abstract
클러스터된 짧은 palindromic 반복-(CRISPR-) 관련 단백질 9 (CRISPR/Cas9) 기술은 게놈에 있는 정확하고 표적으로 한 수정을 소개하는 널리 퍼진 실험실 공구가 되었습니다. 그것의 엄청난 인기와 급속한 확산은 그것의 전임자에 비해 그것의 쉬운 사용 및 정확성에 기인한다. 그러나 시스템의 구성 활성화는 제한된 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 이 논문에서는 Cas9 단백질의 조건부 안정화에 기초하여 CRISPR/Cas9 활성을 측두식할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 라파마이신 결합 단백질 FKBP12의 엔지니어링 된 돌연변이를 Cas9 (DD-Cas9)에 융합하면 FKBP12 합성 리간드 (Shield-1)의 존재에 의해 안정화 될 수있는 Cas9의 급속한 분해를 가능하게합니다. 다른 유도 가능한 방법과 는 달리, 이 시스템은 두 번째 유전자의 조건부 조절 없이 다른 관심사 유전자와 DD-Cas9를 공동 발현하기 위해 바이 시트론 시스템을 생성하도록 쉽게 적응할 수 있다. 이 방법은 Cas9 뉴클레아아아제에 의해 표적화된 항선의 병렬, 독립적인 조작뿐만 아니라 추적 가능한 시스템의 생성을 가능하게 한다. 이 방법의 플랫폼은 필수 유전자의 체계적인 식별 및 특성화 및 시험관 내 및 생체 내 환경에서 유전자의 기능적 상호 작용의 심문을 위해 사용될 수 있다.
Introduction
CRISPR-Cas9는"정기적으로 간격이 짧은 palindromic 반복 관련 단백질 9"을의미하는 CRISPR-Cas9는 세균 적응 면역1,2에대한 연구의 일환으로 처음 발견되었다. 오늘날 CRISPR/Cas9는 프로그래밍 가능한 유전자 편집을 위한 가장 인정받는 도구가 되었으며 시스템의 상이한 반복은 전사 및 후성 유전학 변조3을허용하도록 개발되었다. 이 기술은 DNA 4의 거의 모든 순서의 매우 정밀한 유전 조작을 가능하게합니다.
CRISPR 유전자 편집의 필수 성분은 사용자 지정 가능한 가이드 RNA 서열 및 Cas9 nuclease5이다. RNA 가이드는 DNA내의 표적-보완 서열에 결합하여 Cas9 뉴클레아아아제에게 게놈3,4의특정 지점에서 이중 가닥 브레이크를 수행하도록 지시한다. 그 결과 골짜기 부위는 비동종 최종 결합(NHEJ) 또는 상동성 지향 수리(HDR)에 의해 수리되며, 결과적으로 표적 DNA 서열5의변화가 도입된다.
CRISPR/Cas9 계 유전자 편집은 사용하기 쉽고, 이전 유전자 편집 기술에 비해 상대적으로 저렴하며, 시스템2,4,5의복합성에서 효율적이고 견고하다는 것이 입증되었다. 그러나 시스템은 몇 가지 제한을 제시합니다. Cas9의 구성 발현은 종종 오프 타겟의 증가 수와 높은 세포 독성4,6,7,8의증가를 초래하는 것으로 나타났다. 추가적으로, Cas9에 의하여 필수 및 세포 생존 유전자의 구성 적인 표적은 세포 사멸의 운동 연구 결과와 같은 기능적인 연구의 특정 모형을 능력을 멀리취합니다 7.
Tet-ON 및 Tet-Off9와같은 이러한문제를해결하기 위해 다른 유도성 또는 조건부 제어 CRISPR-Cas9 도구가 개발되었습니다. 사이트별 재조합10; 화학적으로 유도된근접성 11; 인테인 종속 접합3; 및 4-하이드록시타목시펜 에스트로겐 수용체(ER) 기반 핵 국소화시스템(12). 일반적으로, 이러한 절차의 대부분(인테인 접합 및 화학적으로 유도된 근접 분할 시스템)은 가역적 제어를 제공하지 않으며, 약물 치료에 매우 느린 운동 반응을 제시하거나(Tet-On/Off 시스템), 또는 고처리량 조작6에의존하지 않는다.
이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 빠르고 강력한 측두식 유전자 편집을 제공 할뿐만 아니라 추적성, 튜닝성 및 높은 처리량 유전자 조작에 대한 편의성을 보장하는 새로운 툴킷을 개발했습니다. 이 새로운 기술은 세포주, 오르가노이드 및 동물 모델에서 사용할 수 있습니다. 우리의 시스템은 Cas9에 융합 될 때 엔지니어링 된 도메인을 기반으로, 그것은 그것의 급속한 저하를 유도. 그러나, 고도로 선택적, 비독성, 세포 투과성 소분자로 빠르게 안정화될 수 있다. 보다 구체적으로, 인간 FKBP12 돌연변이 "불안정 도메인"(DD)을 Cas9로 설계하여, 포유류세포(13)에서발현될 때 유비퀴틴-프로테솜 시스템을 통해 신속하고 구성적인 분해를 위해 Cas9를 표시하였다. DD 합성 리간드, 쉴드-1은 DD 변형을 안정화시켜 DD(Cas9 와 같은)에 융합된 단백질의 분해를 매우 효율적인 방식으로, 그리고 빠른 운동반응(14,15)으로방지할 수 있다. 참고로 Shield-1은 야생형 대응14보다돌연변이 FKBP12에 3배 더 단단하게 결합합니다.
DD-Cas9/Shield-1 쌍은 이전에 미토콘드리아대사에 중요한 역할을 하는 CypD 유전자를 조건부 대상으로 한 것으로 이전에 보여준 바와 같이 배양 세포 및 동물 모델에서 필수 유전자의 체계적인 식별 및 특성화를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. EGFR, 온코겐 변환의 핵심 플레이어; 및 Tp53, DNA 손상 반응에 있는 중앙 유전자. 시간적 및 조건부 제어 유전자 편집 외에도 DD-Cas9의 안정화가 전사와 무관하다는 것이 방법의 또 다른 장점이 있습니다. 이 기능은 에스트로겐 수용체 의존성 재조합, CRE ER과 같은 추적 가능한 마커뿐만 아니라 재조합의 동시 발현을 가능하게한다. 이 작품에서, 우리는 우리의 방법이 성공적으로 시험관 내에서 사용될 수있는 방법을 보여줍니다, 예를 들어 조건부 대상, DNA 복제 유전자, RPA3.
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Protocol
1. DD-Cas9 벡터
- Addgene (필러 서열 및 금성 (EDCPV), 플라스미드 90085와 DD-Cas9 벡터를 가져옵니다.
참고: 이것은 EFS 프로모터가 DD-Cas9 전사를 운전하는 동안 단일 가이드 RNA (sgRNA) 전사를 구동하는 U6 프로모터와 렌티바이러스 DD-Cas9 플라스미드입니다. DYKDDDDK 서열(flag-tag)은 Cas9의 C 단말에 존재하며, DD-Cas9및 변형형 형광 단백질 비너스(mVenus)를 분리하는 2A 자가 절단 펩티드(P2A)가 그 뒤를 잇고 있다.
2. 소형 가이드 RNA(sgRNA) 설계
- 특정 게놈 영역을 대상으로 여러 알고리즘 중 하나를 사용하여 DD-Cas9 벡터로 복제될 작은 가이드 RNA(sgRNA)를 설계한다.
참고: 오프 타겟 효과를 줄이려면 웹 사이트인 http://crispr.mit.edu 사용하여 가장 높은 점수를 받은 sgRNA 서열을 선택합니다. - sgRNA 서열당 2개의 올리고뉴클레오티드를 설계하고 주문하여 완전한 sgRNA를 만듭니다.
참고: 플라스미드는 BsmBI 효소에 의해 소화되기 때문에, SgRNA 서열에 BsmBI 소화 오버행을 추가하여 전방 및 역 올리고뉴클레오티드를 설계한다. 표 1에서템플릿을 사용합니다.
3. 렌즈피바이러스 DD-Cas9 벡터로 sgRNA 복제
- 탈포량은 제한 효소 소화 반응에서 알칼리성 인스파타제(FastAP)를 사용하여 DD-Cas9 플라스미드의 5′-ends를 사용한다.
참고: 벡터는 특히 단일 제한 효소에 의해 선형화될 때 결찰 중에 다시 순환할 수 있습니다. 벡터가 다시 순환되지 않도록 하기 위해 소화 반응에 직접 인산염을 추가하여 플라스미드를 인광합니다.- DD-Cas9 플라스미드 5μg, 소화 버퍼 6μL(10x), DTT 의 0.6 μL(100mMMM), BsmBI 3μL, FastAP의 3μL, 최대 60μL 핵을 첨가하여 BsmBI 효소로 플라스미드를 분해하고 소화합니다.
참고: BsmBI 효소와 FastAP를 혼합물에 결국 추가합니다. - 37°C 열 블록 또는 열사이클러에서 30분 동안 혼합물을 배양합니다.
- DD-Cas9 플라스미드 5μg, 소화 버퍼 6μL(10x), DTT 의 0.6 μL(100mMMM), BsmBI 3μL, FastAP의 3μL, 최대 60μL 핵을 첨가하여 BsmBI 효소로 플라스미드를 분해하고 소화합니다.
- 소화된 DD-Cas9 플라스미드를 정화합니다.
- 0.8% DNA 아가로즈 젤을 준비하여 불완전하게 소화된 플라스미드와 효소의 흔적을 제거합니다. 더 넓은 젤 콤을 사용하여 더 나은 분리를 하고 90 V에서 젤을 실행하십시오.
- 360-365 nm UV 빛 아래에서 밴드를 시각화하고 젤에서 더 큰 플라스미드 밴드를 잘라냅니다. 필러에 해당하는 2kb 조각을 폐기합니다.
- 상업용 젤 정제 키트를 사용하여 대형 컷 젤 밴드를 정화하고 제조업체의 지침을 따르십시오.
- 리게이트는 소화된 DD-Cas9 플라스미드로 올리고를 안다했다.
- 인광및 sgRNA 올리고를 음침.
- T4 리기션 버퍼(10x), 올리고 1μL 1μL(100 μM), 올리고 2(100 μM), 뉴클레아제 물 6.5 μL의 혼합을 준비한다. 마지막으로 T4 PNK의 0.5 μL을 추가합니다. 이 반응의 총 부피는 10 μL입니다.
- 다음 조건으로 써모사이클러에 반응 혼합을 추가하십시오: 30분 동안 37°C, 5분 동안 95°C, 5°C의 속도로 25°C까지 경사로.
참고: PNK는 올리고뉴클레오티드가 결찰에 투입되기 전에 열활성화되어야 하며 그렇지 않으면 PNK가 벡터를 인계합니다. 인산화 단계 및 어닐링 단계는 열순환기에서 함께 수행됩니다. 5' 인산염이 sgRNA 올리고뉴클레오티드에 첨가되는 인산화 단계는 결찰이 발생하기 위해 요구된다.
- Ligate DD-Cas9 소화 플라스미드 와 sgRNA 올리고.
- 아닐드 올리고를 핵이 없는 물에서 1:200으로 희석하고 결찰 반응에서 플라스미드 DNA 50 ng를 사용합니다.
참고: 6 인서트: 1 벡터의 어금니 비율을 사용하여 삽입 통합을 촉진하거나 계합 계산기를 사용하여 어금니 비율을 계산합니다: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation. - 결찰 반응 혼합준비: 소화 및 정제D-Cas9 벡터의 50 ng, 희석 된 어닐 리고의 적절한 부피, T4 리깅 버퍼 (10x), T4 DNA 리간제의 1 μL, 최대 10 μL 뉴클레아제 프리 워터의 총 부피를 얻기 위해 반응 10L μμ.
- "고농도" 리갈아제를 사용하는 경우 실온에서 5분 동안 반응을 배양한다. 그렇지 않으면, 2 h에 대한 실온에서 배양하거나, 또는 결찰의 높은 수율을 달성하기 위해, 하룻밤 16 °C에서 배양.
참고: 표준 T4 DNA 리개아제(65°C)를 20분 동안 사용하는 경우 열비활성화. 리구아제 마스터 믹스를 사용하는 경우 열 비활성화하지 마십시오.
- 아닐드 올리고를 핵이 없는 물에서 1:200으로 희석하고 결찰 반응에서 플라스미드 DNA 50 ng를 사용합니다.
- 인광및 sgRNA 올리고를 음침.
4. 세균 변환
- 실온에서 10cm LB-암피실린 아가르 플레이트를 미리 따뜻하게 합니다.
- 얼음에 "한 샷 Stbl3"유능한 세균 세포의 50 μL을 해동.
- 유능한 세균 세포의 50 μL에 2-3 μL의 결찰 혼합물을 넣고 손가락으로 튜브의 바닥을 4 번 가볍게 눌러 부드럽게 섞습니다. 30 분 동안 얼음에 배양.
- 타이머를 사용하여 40초 동안 정확히 42°C에서 세포를 열 충격. 얼음에 세균 세포를 5 분 동안 식힙니다.
- 세균 세포에 항생제없이 SOC 매체의 500 μL을 추가하고 37 ° C에서 45 분 동안 250 rpm에서 흔들리는 인큐베이터에서 성장합니다.
- 전침이 나는 LB-암피실린 플레이트에 변형된 박테리아 100 μL을 확산시키고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
5. 리그 플라스미드의 미니 /맥시 준비
- 맥시/미니 준비 스타터 문화를 준비합니다.
- 다음날 하나의 세균 클론을 선택하고 ampicillin을 포함하는 LB 미디어의 8 mL로 스타터 문화를 접종합니다.
- 10-12 h에 대한 250 rpm, 37 °C에서 흔들리는 인큐베이터에서 박테리아를 성장시다.
- 미니 준비에 박테리아의 3-5 mL을 사용 하거나 맥시 준비에 대 한 스타터 문화로 사용. 세균 배양비에 글리세롤을 100% 첨가하여 세균글리세롤 육수로 박테리아의 나머지 부분을 사용하십시오:글리세롤은 1:1이다.
참고 : 여기에, 우리는 미니 준비 절차를 설명합니다.
- 미니 준비 절차
- 세균 세포와 원심분리기의 3-5mL를 1분 동안 12,000 x g에서 수확하십시오.
- RNase A를 함유하고 4°C에 저장되는 P1 버퍼의 200 μL로 세균 세포의 펠릿을 다시 중단합니다.
- 완충 P2의 200 μL을 추가하고 액체가 명확해질 때까지 튜브를 10번 반전시켜 부드럽게 섞습니다.
- 완충 P3의 300 μL을 추가하고 튜브를 10 번 반전하여 혼합합니다. 액체는 흐리게 됩니다. 10 분 동안 12,000 x g에서 샘플을 원심 분리하여 즉시 진행하십시오.
- 투명 상체를 스핀 컬럼과 원심분리기로 1분 간 12,000 x g로 옮긴다.
흐름을 삭제합니다.
참고: 상체가 명확히 되었는지 확인합니다. 파티클은 스핀 열을 막고 열 효능을 줄일 수 있습니다. - 1분 동안 PD 버퍼와 원심분리기 400μL을 12,000 x g에 추가합니다. 흐름을 삭제합니다.
- PW 버퍼 600 μL을 추가하여 스핀 컬럼과 원심분리기를 1분 동안 12,000 x g로 세척합니다. 흐름을 삭제합니다.
- 원심분리기는 버퍼 잔류물을 제거하기 위해 3분 동안 최고 속도로 스핀 컬럼을 다시 제거합니다. 흐름을 버리고 2 분 동안 앉게하십시오.
- 스핀 컬럼을 신선한 튜브에 놓고 50 μL의 용출 버퍼를 추가합니다. 5분 동안 배양하고 원심분리기는 최고 속도로 2분 동안 사용할 수 있습니다.
- 나노 드롭 장치를 사용하여 sgRNA 인서식 (ng/μL)을 사용하여 정제 된 DD-Cas9 플라스미드의 농도를 측정하십시오.
- DD-Cas9 플라스미드의 DNA 염기서열분석에 의한 sgRNA 복제를 검증한다. 표 2에서U6 프라이머 시퀀스를 사용합니다.
6. 렌티바이러스 제제
- FEK293T 패키징 셀을 준비하여 트랜스페트합니다.
- 건강한 HEK293T를 10번 통로까지 사용하고 10cm 조직 배양판당 밀도 1-2 x 106 세포에서 균등하게 시드하십시오. 포도당 덜벡코의 수정 된 독수리 매체 (DMEM)의 10 mL을 사용하여 10 % 여과 된 태아 소 세럼 (FBS)을 사용하십시오. 조직 배양 인큐베이터에서 세포를 배양하고, 20시간 동안 5% CO2 및 37°C로 배양한다.
- 다음 날, 세포가 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 70%의 합류에 도달하고 그(것)들이 접시를 통해 고르게 분산된다는 것을 확인합니다. 10mL의 최종 부피로 전환하기 전에 1h의 세포로 미디어를 변경합니다.
참고: 미디어는 항생제와 항균제가 없어야 합니다. - 따뜻한 매체(예: OptiMEM)의 500μL로 2개의 튜브의 혼합물을 준비한다.
- 25 μL의 형질 전환 시약을 튜브 1에 추가하여 따뜻한 500 μL의 미디어를 포함하고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 한편, 플라스미드를 튜브 2에 혼합하여 복제된 sgRNA를 함유한 DD-Cas9, 포장 플라스미드(psPAX2)의 6μg, 봉투 플라스미드(pMD2.G)의 3μg을 포함하는 튜브 2를 사용하여 따뜻한 500μL의 미디어를 준비한다.
- 튜브 1과 튜브 2를 혼합하여 형질 혼합물을 형성하고 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.
- HEK293T 세포에 대한 배설 혼합물을 드롭와이즈 방향으로 하고 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양하고, 하룻밤 사이에 5% CO2 및 37°C로 한다.
- 18h 이후, 10% FBS로 미디어를 10mL의 신선한 DMEM으로 조심스럽게 변경하여 경질 시약을 제거합니다. 다음 48 h에 대한 인큐베이션.
- 48h 후, 10 mL 주사기로 상체를 수집하고 0.45 μm 필터를 통과합니다.
- Aliquot 및 -80 °C에 바이러스 상체를 저장합니다.
7. 유동 세포측정을 통해 바이러스 성도 및 트랜스듀션 효능 결정
- HEK293T 세포를 5 x 105 셀/웰로 6웰 플레이트에 시드합니다. 종자 세포는 두 개의 6 웰 플레이트로. 다음 날 계산에 하나의 접시를 사용합니다.
- 인큐베이터에서 플레이트를 37°C, 습도 95%, CO2 5%로 배양하여 다음날 50-60%에 도달합니다.
- 다음 날, 6 웰 플레이트 중 하나를 사용하여 6 개의 우물에서 세포를 계산하십시오.
- 직렬 희석을 수행하는 데 사용되는 바이러스 알리코트를 해동하고 폴리브레인 시약의 8 μg/mL을 추가합니다.
- 바이러스의 직렬 희석을 위해 10% FBS로 DMEM을 준비하고 폴리브레인 시약의 8 μg/mL을 추가합니다.
- 폴리브레인 함유 매체에서 렌티바이러스의 10배 직렬 희석 2mL를 1 x10-1 ~ 1 x10-4에서 준비한다.
- 6웰 플레이트에서 미디어를 제거하고 우물에 바이러스 희석 1mL을 추가합니다. 부정적인 제어로 혼자 미디어와 함께 하나를 잘 두고 100% 바이러스와 잘 하나.
- 24 시간 동안 인큐베이터에서 바이러스를 가진 세포를 배양한다.
- 다음 날, 6 웰 플레이트에서 바이러스로 미디어를 제거하고 10 % FBS와 신선한 DMEM의 2 mL에 대해 변경합니다. 48-72 h용 배양 세포. 매일 형광 현미경을 사용하여 GFP를 관찰하십시오.
- 48-72 h 후, 세포를 분리하고 MACS 버퍼에서 다시 일시 중단합니다.
- 흐름 사이토미터를 사용하여 GFP 식의 백분율을 결정합니다.
- 다음 수식을 사용하여 바이러스 티터를 계산: TU/mL = (세포 수 x % 형광 x 희석 계수)/(mL의 트랜스듀션 볼륨)
8. 표적 세포의 렌즈피바이러스 변환
- 관심있는 세포줄을 10cm 플레이트로 플레이트하고 다음 날 50-60 %의 합류에 도달하기 위해 하룻밤 동안 배양하십시오.
참고 : 우리는 DD-Cas9와 두 개의 독립적 인 RPA3 유전자 sgRNA를 표현하는 A549 세포주를 사용했습니다. 우리는 또한 레닐라 제어와 벡터를 표현하는 A549 세포주를 사용했다. 우리는 2 x 103세포 /cm2의 밀도로 그 세포를 시드하고 37 ° C, 95 % 습도, 5 % CO2 하룻밤50-60 %의 합류에 도달하여 배양했습니다. 우리는 10 % 필터링 된 FBS와 RPMI 미디어를 사용했다. 다음과 같이 다음 단계를 진행했습니다. - 다음 날, 배양 배지의 총 부피 10mL에서 바이러스 입자의 500-2000 μL로 세포를 감염시킵니다. 24 시간 동안 바이러스 성 미디어를 인큐베이션합니다.
- 다음 날, 바이러스 성 매체를 배양 매체로 변경하고 유동 세포 측정을 사용하여 GFP 양성 세포의 비율을 결정합니다.
- FACS 셀 정렬 또는 bleomycin 선택을 사용하여 GFP 양수 셀을 선택합니다.
- 긍정적으로 선택된 셀을 확장하고 재고를 동결합니다.
9. Cas9 중재 유전자 편집의 조건부 유도
- 플레이트는 감염 후 24h의 세포뿐만 아니라 12웰 플레이트에 별도로 분리된 분리된 세포를 선택하였다. 세포가 부착하고 쉴드-1의 200 nM을 포함하는 세포 배양 매체로 미디어를 변경할 때까지 기다립니다. 플레이트의 미디어를 변환 및 변환되지 않은 셀로 교체하여 플레이트당 2개의 우물을 음수 제어로 일반 미디어로 남깁니다.
- 웰에 쉴드-1을 추가한 후 시간 0, 2h, 6h, 12h, 24h, 48h 및 72h의 서로 다른 시점에서 각각의 잘 단백질을 배양하고 추출합니다.
- 그런 다음 나머지 우물에서 Shield-1로 미디어를 제거하고 일반 세포 매체를 변경합니다.
- 미디어를 변경한 후 2시간, 6시간, 12h의 우물에서 단백질을 수집합니다.
- 서부 블롯분석에 의해 시각화하여 리간드, Shield-1을 첨가하고 철수한 후 불안정한 DD-Cas9 단백질 조절의 가역성과 급속성을 분석한다. DYKDDDDK 태그를 향한 항체를 사용하여 단백질과 조절 항체 표적화를 예로 들 수 있습니다.
- 웨스턴 블롯 분석에 의해 관찰된 용량 반응 곡선에 의해 쉴드-1의 최적 용량을 결정한다.
10. 유전자 편집의 검증
참고: 유동 세포측정 분석 및 bleomycin 선택 마커와 같은 GFP 식 분석은 성공적인 CRISPR 시약 전달을 확인하지만 원하는 시퀀스가 성공적으로 표적화되었는지 는 결정하지 않습니다. CRISPR 실험에 의한 성공적인 유전자 표적화를 확인하는 가장 일반적인 분석은 Sanger DNA 시퀀싱, 차세대 시퀀싱, 측량자 핵분석, 분해(TIDE) 분석, 또는 서부 블롯분석에의한 인델의추적이다.
- 플레이트는 긍정적으로 선택된 세포를 포함하고 있는 쉴드-1의 200nM으로 미디어를 변경한다. 5 일 동안 세포를 배양하여 3 일마다 Shield-1로 미디어를 변경합니다.
- 상기 검증 기술을 DD-Cas9 유도 후 5일 쉴드-1에 사용한다.
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Representative Results
Cas9의 조건부 발현을 가능하게 하기 위해, DD-Cas9 융합단백질(도 1A)19의발현을 구동하기 위해 U6 구동 프로모터로 구성된 이중 렌티바이러스 벡터 구조를 개발하였다. 시스템의 견고성과 효율성을 보여주는 패러다임으로서 폐 암종 A549 세포주와 렌티바이러스 구조를 변형시켰습니다. 리간드 쉴드-1의 존재 또는 부재에서 Cas9의 수준은 항플래그 특이적 항체를 이용하여 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 및 서양 블롯 분석에 의해 측정되었다. 우리는 감염되지 않은 세포와 모의 감염 세포 (차량)를 대조군으로 사용했습니다. 세포는 7d에 대해 10에서 1000 nM에 이르는 쉴드-1의 농도로 처리되었다. 도시된 바와 같이, Shield-1을 통한 치료는 강력한 투여량 의존방식으로 DD-Cas9의 발현을 조절할 수있었다(도 1B 및 도 2A). RT-PCR 분석은 DD-Cas9및 글리세랄데히드3-인산염 탈수소효소(GAPDH)에 대한 제어 프라이머를 통한 특정 프라이머를 통해 DD-Cas9의 mRNA 발현 수준이 쉴드-1의 존재 또는 부재에도 불구하고 트랜스포메이트 셀 과 차량 간에 유사했다는 것을 확인하였다(도2B). 이것은 Cas9 단백질의 유도가 전사 후 이벤트임을 확인합니다.
이 시스템은 DD-Cas9 단백질의 빠르고 가역적인 안정화를 가능하게 합니다. 도 3은 감염되지 않은 A549 세포에 비해 쉴드-1의 200 nM을 치료한 후 2h로 처리된 A549 세포주에서 Cas9 발현의 충분한 유도를 나타낸다. 그러나, 쉴드-1의 철수는 DD-Cas9 단백질의 급격한 감소를 초래하며, 이는 6 에서 12h(그림3)내에서 무시할 수 있게 된다.
RPA3 단백질은 인간 복제 단백질 A(RPA) 이종절제의 성분이다. 그것은 DNA 복제, 재조합 및 복구에 중요한 역할을 하는 단가DNA 결합 복합체입니다. 필수 유전자를 연구하기 위해 시스템의 사용을 검증하기 위해 RPA3 유전자를 표적으로 삼았습니다. 이를 위해 두 개의 독립적인 메뚜기 별 단일 가이드 RNA(가이드 25 및 44)와 레닐라를 컨트롤(가이드 208)으로 사용했습니다. DD-Cas9 렌티바이러스 구조로 변환된 A549 세포는 3d에 대한 쉴드-1의 200 nM으로 처리되었다. RPA3 가이드 RNA를 함유한 쉴드-1 처리된 A549 세포에서 세포 수의 감소는 치료 후 명백해졌으며, 레닐라 샘플의 세포 수에 아무런 영향도 관찰되지않았다(도 4A). RPA3 단백질의 고갈을 검증하기 위해, 우리는 쉴드-1 유도 후 RPA3 3d에 대한 항체를 사용하여 면역 블로팅 분석을 수행하였다(도4B). 더욱이, 우리는 측량체 핵분석기 분석 및 DNA 염기서열 분석(도4C)을사용하여 유전자 편집 반전 또는 인델 돌연변이를 확인했습니다.
우리가 설계 한 렌즈 바이러스 벡터 구조는 독특한 특징을 지니고 있습니다 : DD-Cas9 단백질 안정성의 조절은 mRNA 발현과 무관합니다. 이를 통해 불안정한 DD-Cas9(도5A,5B)에의해 변조되지 않고 동일한 EF-1a 프로모터 하에서 다른 관심 유전자를 발현할 수 있습니다. 또한 DD-Cas9와 mVenus 사이에 2A 자가 분열 펩티드(P2A)를 추가했으며, 감염된 세포를 추적하는 데 사용할 수 있는 변형형광단백질(도 5A)을첨가하였다. mVenus는 도 5B에서서부 블롯 분석의 결과에 의해 도시된 바와 같이 P2A 후 배치됨에 따라, mVenus 단백질의 발현은 DD-Cas9 발현 및 쉴드-1 처리에 무관한 차량 및 A549 트랜스포이딩 세포에서 관찰되었다.
그림 1: 렌즈바이러스 구조및 다른 유전자 편집 도구의 회로도. A)DD-Cas9 렌티바이러스 백본에는 U6 프로모터, sgRNA, EF-1a 프로모터, DD, spCas9, 뉴클레오플라스민 NLS 및 플래그 태그가 포함되어 있습니다. B)유전자 편집 도구로 사용되는 DD-Cas9 시스템(왼쪽 패널)과 다른 Tet-On 시스템(오른쪽 패널)간의 비교. 래드 래더, NI-비감염 세포, Veh-vehicle, -Sh 세포 쉴드-1 없이 치료, + Sh 세포 200 nM 쉴드로 치료, - 독시사이클린 처리 없이 독시 세포, + 독시사이클린으로 처리 된 독시 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 쉴드-1에 의한 용량 의존형 DD-Cas9 안정화의 대표적인 결과. A)차드-1의 농도가 증가함에 따라 처리된 세포에서 안정화된 DD-Cas9 발현의 항플래그 태그 항체를 이용한 서부 블롯 분석. 대조군으로서, 감염되지 않은 세포(NI) 및 모의 처리된 세포(Veh)가 사용되었다. 융합 단백질 DD-Cas9는 두 컨트롤 모두에서 검출할 수 없었습니다. B)쉴드-1의 부재 또는 용량 의존적 치료법에서 트랜스포메이트 셀에서 DD-Cas9의 mRNA 발현 수준의 RT-PCR 결과는 GAPDH 프라이머를 내부 제어로 사용하여 트랜스포메이트 세포 및 차량 간에 유사하였다. 이 그림은 세리프 외19에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 웨스턴 블롯 분석은 리간드 쉴드-1의 철수 후 불안정한 DD-Cas9 단백질 조절의 가역성과 급속성을 보여줍니다. DD-Cas9와 A549 세포주변환 및 감염되지 않은 A549를 대조군으로 24시간 동안 쉴드-1 리간드200nM로 감염후 처리하였다. 모의 대조군 세포에서 DD-Cas9의 단백질 수준은 검출할 수 없었다. 이 그림은 세리프 외19에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: DD-Cas9 시스템은 "생체 내" 및 "생체 내" 설정에서 강력한 유전자 편집을 유도할 수 있다. A)세포주 A549는 RPA3 유전자 및 DD-Cas9(RPA3)에 대한 sgRNA를 발현하는 벡터로 변환된다. 레닐라(Ren)를 위한 sgRNA를 발현하는 벡터로 변환된 대조군 A549가 사용되었다. 세포는 3일 동안 Shield-1(200 nM)으로 처리되어 렌닐라 대조군 샘플의 세포 수에 영향을 미치지 않고 RPA3 sgRNA를 발현하는 세포에서 세포 생존율이 급격히 감소하였다. A549 세포주에서 RPA3 유전자 편집의 효율은 RPA3 A549 및 레닐라 A549의 플래그 태그에 대한 항체를 사용하여 서혈 블롯 분석에 의해 검증되었으며 3일간 쉴드-1(200nM) 처리 및 C)의 부재가 없었다. 패널 C)의 화살표는 SURVEYOR 핵 분석기의 단편을 보여줍니다. 이 그림은 세리프 외19에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: DD-Cas9과 독립적으로 mVenus의 표현을 구동하는 bicistronic DD-Cas9 렌티 바이러스 구조의 계획. A)구조는 U6 프로모터, sgRNA, EF-1a 프로모터, DD-Cas9, P2A 및 mVenus로 구성됩니다. B)DD-Cas9, P2A 및 mVenus를 포함하는 렌티바이러스 플라스미드로 A549 세포를 3일 동안 50m 리간드 쉴드-1로 처리하였다. 셋째 날, 서부 블롯 분석은 GFP 및 플래그 태그에 대한 항체를 별도로 사용하여 세포 용액으로 수행되었다. 도 5B는 세리프 외19에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 포워드 (올리고 1) | 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3' |
| 역(올리고 2) | 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3' |
표 1:전방 및 역sgRNA 올리고뉴클레오티드의 설계. 전방(Oligo 1) 및 반대(Oligo 2) 올리고뉴클레오티드는 BsmBI 효소 소화를 첨가하여 sgRNA 서열을 돌출하여 설계되었습니다. "N"은 sgRNA 서열에 존재하는 상이한 뉴클레오티드를 나타내며, 나머지는 BsmBI 소화를 위한 오버행입니다.
| U6 프라이머 시퀀스 | 5'-GACTATCATATGCTTACCGT-3' |
표 2: sgRNA 복제 유효성 검사를 위한 U6 프로모터 서열. sgRNA 복제가 얼마나 성공적이었는지 확인하려면 DD-Cas9 플라스미드의 DNA 염기서열에 U6 프로모터 서열을 사용하십시오.
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Discussion
CRISPR/Cas9 기술은 게놈2를기능적으로 심문하는 기능에 혁명을 일으켰습니다. 그러나, 유전자의 불활성화는 종종 세포 치사성, 기능적 적자 및 발달 결함을 초래하여 유전자 기능을 연구하기 위한 이러한 접근법의 유용성을 제한한다7. 또한, Cas9의 구성 발현은 독성 및 오프 타겟 효과6의생성을 초래할 수 있다. CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집 기술6을일시적으로 제어하기 위해 다양한 접근법이 개발되었다. 이들 시스템은 Cas9 및/또는 sgRNA 또는 Cas9 전사 후 및 번역 후활성화(21,22,23)의전사 제어를 기반으로 한다. 이러한 시스템의 대안으로 Cas9의 조건부 불안정화를 기반으로 새로운 툴킷을 개발했습니다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 특정 유전자에 대한 적어도 2 개 또는 3 개의 sgRNA의 설계로 오프 타겟 효과를 피하고 효율적인 유전자 편집을 용이하게합니다. 속도 제한 단계는 DD-Cas9 벡터를 통해 셀라인의 효율적인 변환입니다. 렌티바이러스 입자(하이 티터)의 품질은 HEK-293T 세포에 의존한다. 제대로 유지된 HEK-293T 세포의 낮은 통로 번호(통로 10까지)를 사용하는 것이 중요합니다(70%의 합류에 도달하면 분할되고, 보통 1:6 비율로 일주일에 두 번). 대안으로, HEK-293 렌티-X 세포주, 이는 일반 HEK-293T 세포보다 30× 더 높은 바이러스 성 적 티터를 산출하도록 복제선택된24를사용할 수 있다. 또 다른 중요한 단계는 DD-Cas9 플라스미드, psPAX2 패키징 플라스미드 및 pMD2.G 봉투 플라스미드의 비율의 최적화입니다. 우리의 경험에서, 리포펙타민과 형질 전환 믹스가 준비되는 부피뿐만 아니라 플라스미드 비율은, 트랜스포션 효율에 상당한 영향을 미칩니다. 최상의 결과를 위해 프로토콜의 단계를 따르는 것이 좋습니다. 효율적인 유전자 편집을 위한 다음 중요한 단계는 Shield-1 농도의 최적화입니다. 최종 농도는 200nM이지만 최상의 결과를 얻으려면 특정 트랜스듀서 생성된 세포주에 농도를 최적화해야 합니다. DD/Shield-1 시스템은 다양한 세포 배양, 세균 세포, 원생 동물 엔타모에바 히스토리카,편평한 벌레 케노르하비디스 아레간,형질전환 제노이식, 형질전환마우스 및 메다카25에서성공적으로 사용되고 있다. 가장 큰 한계 중 하나는 Shield-1 분자의 높은 비용, 특히 생체 내 설정에서 사용 되는 경우. 또한, 이전에는 미토콘드리아 매트릭스 또는 내피성 망상의 루멘과 같은 특정 세포 구획을 표적으로 하는 단백질이 Shield-1의 부재 시 안정화되거나 축적될 수 있음을 보여주었다. 이는 다른 단백질이 다른 국산 단백질 품질 관리기계(26)를가지고 있기 때문이다. 세포질 또는 핵내의 DD 융합은 포유류 세포에서 매우 효율적으로 분해되고 Shield-1에 의해 안정화될 수 있지만, 위에서 언급한 한계를 극복하기 위해, 세균성 이수성환원효소(27)로부터유래된 대체 불안정 도메인을 사용하는 것이 좋습니다. 이 시스템은 불안정 도메인을 안정화하기 위해 삼중항림을 결합 분자로 사용하며 Shield-127에대한 비용이 적게 드는 대안이기도 합니다.
DD-Cas9의 독립적인 발현을 달성하는 것 외에도, 다른 유도성 또는 조건부 제어 CRISPR-Cas9 유전자 편집 도구에 비해 이 방법의 장점은 시간적으로 조절되는 유전자 편집, 덜 오프 타겟 효과 및 낮은 세포 독성4,6,7,8이다. Shield-1/DD-Cas9 방법의 효율성과 단순성을 통해 다양한 응용 분야에 쉽게 적응하고 활용할 수 있는 다양한 도구를 생성할 수 있습니다. 이 시스템은 생체 내 설정에서도 쉽게 사용할 수 있으며, Shield-1은혈액-뇌 바리어(19,25,28,29)를통해 효율적으로 침투할 수 있는 것으로 나타났다. 이 논문은 필수 세포 유전자의 특성화를 위한 CRISPR-Cas9 기술의 사용을 기술했지만, 종양의 생존 또는 진행을 위해 요구되는 유전자의 식별을 위해 동일한 접근법을 쉽게 구현할 수 있었습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 전작에 대한 우리의 실험실과 과학자 세리프 Senturk의 이전 구성원에게 감사드립니다. 우리는 비판적으로이 원고를 읽고 다닐로 세고비아 감사합니다. 이 연구는 가능하 고 미국 전역 수영과 국립 암 연구소 암 대상 발견 및 개발 센터 프로그램에 의해 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest buffer | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S | |
| colorimetric BCA kit | Pierce | 23225 | |
| DMEM, high glucose, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| Genomic DNA extraction kit | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| oligonucleotides | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
| secondary antibodies | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3 competent bacterial cells | Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR Mutation Detection Kit | Transgenomic/IDT | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273S | |
| α-tubulin [DM1A] mouse mAb | Millipore | CP06-100UG |
References
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