Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Et nytt verktøysett for evaluering av genfunksjoner ved hjelp av betinget cas9-stabilisering

Published: September 2, 2021 doi: 10.3791/60685
Automatic Translation
1,2, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

Summary

Her beskriver vi et genomredigeringsverktøy basert på den tidsmessige og betingede stabiliseringen av klyngert regelmessig interspaced kort palindromisk repetisjon- (CRISPR-) assosiert protein 9 (Cas9) under det lille molekylet, Shield-1. Metoden kan brukes til dyrkede celler og dyremodeller.

Abstract

Den klyngede regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjons- (CRISPR-) assosierte protein 9 (CRISPR / Cas9) -teknologien har blitt et utbredt laboratorieverktøy for å introdusere nøyaktige og målrettede modifikasjoner i genomet. Den enorme populariteten og den raske spredningen tilskrives enkel bruk og nøyaktighet sammenlignet med forgjengerne. Likevel har den konstituerende aktiveringen av systemet begrensede applikasjoner. I dette dokumentet beskriver vi en ny metode som tillater tidsmessig kontroll av CRISPR/Cas9-aktivitet basert på betinget stabilisering av Cas9-proteinet. Fusing en konstruert mutant av rapamycin-bindende protein FKBP12 til Cas9 (DD-Cas9) muliggjør rask nedbrytning av Cas9 som igjen kan stabiliseres ved tilstedeværelsen av en FKBP12 syntetisk ligand (Shield-1). I motsetning til andre inducible metoder, kan dette systemet enkelt tilpasses for å generere bi-cistronic systemer for å co-uttrykke DD-Cas9 med et annet gen av interesse, uten betinget regulering av det andre genet. Denne metoden muliggjør generering av sporbare systemer samt parallell, uavhengig manipulering av alleler målrettet av Cas9-kjernease. Plattformen til denne metoden kan brukes til systematisk identifisering og karakterisering av essensielle gener og forhør av funksjonelle interaksjoner av gener i in vitro- og in vivo-innstillinger.

Introduction

CRISPR-Cas9 som står for"clustered regular interspaced short palindromic repeats-associated protein 9" ble først oppdaget som en del av studier på bakteriell adaptiv immunitet1,2. I dag har CRISPR/Cas9 blitt det mest anerkjente verktøyet for programmerbar genredigering, og forskjellige iterasjoner av systemet er utviklet for å tillate transkripsjons- og epigenetiske moduler3. Denne teknologien muliggjør den svært presise genetiske manipuleringen av nesten hvilken som helst sekvens av DNA4.

De viktigste komponentene i enhver CRISPR genredigering er en tilpassbar guide RNA-sekvens og Cas9-kjernen5. RNA-guiden binder seg til den mål-komplementære sekvensen i DNA-et, og leder Cas9-kjernen til å utføre en dobbeltstrengspause på et bestemt punkt i genomet3,4. Det resulterende spaltingsstedet repareres deretter ved ikke-homolog ende-sammenføyning (NHEJ) eller homologi-rettet reparasjon (HDR), med den påfølgende innføringen av endringer i den målrettede DNA-sekvensen5.

CRISPR/Cas9-basert genredigering er enkel å bruke, og relativt billig sammenlignet med tidligere genredigeringsteknikker, og det har vist seg å være både effektivt og robust i et mangfold av systemer2,4,5. Likevel presenterer systemet noen begrensninger. Det konstituerende uttrykket for Cas9 har ofte vist seg å resultere i et økt antall off-targets og høy celletoksisitet4,6,7,8. I tillegg tar den konstituerende målrettingen av essensielle og celleoverlevelsesgener av Cas9 bort fra sin evne til å utføre visse typer funksjonelle studier som kinetiske studier av celledød7.

Ulike inducible eller betinget kontrollerte CRISPR-Cas9-verktøy er utviklet for å løse disse problemene6, for eksempel Tet-ON og Tet-Off9; områdespesifikk rekombinasjon10; kjemisk indusert nærhet11; intein avhengig skjøting3; og 4-Hydroxytamoxifen østrogenreseptor (ER) baserte kjernefysiske lokaliseringssystemer12. Generelt tilbyr de fleste av disse prosedyrene (intein skjøting og kjemisk indusert nærhet splitt systemer) ikke reversibel kontroll, presentere en svært langsom kinetisk respons på narkotikabehandling (Tet-On / Off system), eller er ikke egnet til høy-gjennomstrømning manipulasjon6.

For å løse disse begrensningene utviklet vi et nytt verktøysett som ikke bare gir rask og robust temporalkontrollert genredigering, men som også sikrer sporbarhet, tunability og egnethet til genmanipulering med høy gjennomstrømning. Denne nye teknologien kan brukes i cellelinjer, organoider og dyremodeller. Systemet vårt er basert på et konstruert domene, når det smeltes sammen til Cas9, induserer det sin raske nedbrytning. Det kan imidlertid raskt stabiliseres med et svært selektivt, ikke-giftig, cellegjennomtrengelig lite molekyl. Mer spesifikt konstruerte vi det menneskelige FKBP12 mutant "destabiliserende domenet" (DD) til Cas9, og markerte Cas9 for rask og konstituerende nedbrytning via allestedsnærværende proteasomsystemet når det uttrykkes i pattedyrceller13. DD syntetisk ligand, Shield-1 kan stabilisere DD-konformasjon, og dermed forhindre nedbrytning av proteiner smeltet til DD (som Cas9) på en svært effektiv måte, og med en rask kinetisk respons14,15. Vær oppmerksom på at Shield-1 binder seg med tre størrelsesordener strammere til mutanten FKBP12 enn til den ville motparten14.

DD-Cas9/Shield-1-paret kan brukes til å studere systematisk identifisering og karakterisering av essensielle gener i dyrkede celler og dyremodeller som vi tidligere viste ved betinget målretting av CypD-genet, som spiller en viktig rolle i metabolismen av mitokondrier; EGFR, en nøkkelspiller i onkogen transformasjon; og Tp53, et sentralt gen i DNA-skaderespons. I tillegg til temporally og betinget kontrollert genredigering, er en annen fordel med metoden at stabiliseringen av DD-Cas9 er uavhengig av transkripsjonen. Denne funksjonen muliggjør samuttrykk, under samme promotor, av sporbare markører samt rekombinasjoner, for eksempel østrogenreseptoravhengig rekombininase, CREER. I dette arbeidet viser vi hvordan vår metode kan brukes in vitro, til betinget mål for eksempel DNA-replikasjonsgen, RPA3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.DD-Cas9 vektoren

  1. Få DD-Cas9 vektor fra Addgene (DD-Cas9 med filler sekvens og Venus (EDCPV), Plasmid 90085).
    MERK: Dette er en lentiviral DD-Cas9-plasmid med en U6-promotor som driver transkripsjonen av enkeltguiden RNA (sgRNA), mens EFS-promotoren driver DD-Cas9-transkripsjonen. DYKDDDDK-sekvensen (flagg-tag) er til stede på C-terminalen i Cas9 etterfulgt av 2A selvklebende peptid (P2A) som skiller DD-Cas9 og modifisert fluorescerende protein Venus (mVenus).

2. Liten guide RNA (sgRNA) design

  1. Design liten guide RNA (sgRNA) som vil bli klonet inn i DD-Cas9 vektoren ved hjelp av en av flere algoritmer, rettet mot en bestemt genomisk region.
    MERK: For å redusere off-target-effektene, velg sgRNA-sekvenser med høyest poengsum ved å bruke nettstedet: http://crispr.mit.edu.
  2. Design og bestill to oligonukleotider per sgRNA-sekvens for å lage en komplett sgRNA.
    MERK: Siden plasmidet vil bli fordøyd av BsmBI-enzymet, kan du designe fremover og omvendt oligonukleotid ved å legge til BsmBI fordøyelsesoverheng i sgRNA-sekvensen. Bruk malen fra Tabell 1.

3. Kloning av sgRNA i lentiviral DD-Cas9 vektor

  1. Defosforrylat de 5′-endene av DD-Cas9 plasmid ved hjelp av alkalisk fosfatase (FastAP) i en begrensning enzym fordøyelsesreaksjon.
    MERK: Vektorer kan sirkulæriseres på nytt under ligasjonen, spesielt når de lineariseres av et enkelt begrensningsenzym. For å sikre at vektoren ikke sirkulæriseres på nytt, de-fosforylat plasmid ved å legge fosfatase direkte inn i fordøyelsesreaksjonen.
    1. Defosforrylat og fordøye plasmidet med BsmBI-enzymet ved å forberede en blanding av 5 μg DD-Cas9 plasmid, 6 μL fordøyelsesbuffer (10x), 0,6 μL DTT (100 mM), 3 μL BsmBI, 3 μL FastAP, tilsett opptil 60 μL nukleasefritt vann for å gjøre 60 μL det totale reaksjonsvolumet.
      MERK: Tilsett BsmBI-enzymet og FastAP i blandingen til slutt.
    2. Inkuber blandingen i 30 min ved 37 °C varmeblokk eller termosykler.
  2. Rens den fordøyde DD-Cas9-plasmiden.
    1. Forbered en 0,8% DNA agarose gel for å fjerne ufullstendig fordøyd plasmid og spor av enzymer. Bruk en bredere gelkam for bedre separasjon og kjør gelen ved 90 V.
    2. Visualiser bånd under 360-365 nm UV-lys og kutt det større plasmidbåndet ut av gelen. Kast fragmentet på 2 kb som tilsvarer fyllstoffet.
    3. Rens det store kutt gelbåndet ved hjelp av et kommersielt gelrensesett og følg produsentens instruksjoner.
  3. Ligate annealed oligos med fordøyd DD-Cas9 plasmid.
    1. Fosforrylat og anneal sgRNA oligos.
      1. Forbered blandingen av 1 μL T4 Ligation Buffer (10x), 1 μL Oligo 1 (100 μM), 1 μL Oligo 2 (100 μM), 6,5 μL nukleasefritt vann. Til slutt, tilsett 0,5 μL T4 PNK. Det totale volumet av denne reaksjonen er 10 μL.
      2. Tilsett reaksjonsblandingen til termosykleren med følgende betingelser: 37 °C i 30 minutter, 95 °C i 5 minutter, og ramp deretter ned til 25 °C med en hastighet på 5 °C/min.
        MERK: PNK må varmeinaktiveres før oligonukleotidene settes inn i ligasjonen, ellers vil PNK fosforylate vektoren. Fosforyleringstrinnet og glødetrinnet utføres sammen i en termocycler. Fosforyleringstrinnet der 5' fosfat tilsetts sgRNA oligonukleotider er nødvendig for at ligasjonen skal skje.
    2. Ligate DD-Cas9 fordøyd plasmid og sgRNA oligos.
      1. Fortynn de glødede oligoene til 1:200 i nukleasefritt vann og bruk 50 ng plasmid DNA i ligasjonsreaksjonen.
        MERK: Bruk molarforholdet til 6-innsatsen: 1 vektor, for å fremme innsettingsintegrasjon eller bruk en ligasjonskalkulator for å beregne molarforholdet: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation.
      2. Forbered ligasjonsreaksjonsblandingen: 50 ng fordøyd og renset DD-Cas9-vektor, passende volum fortynnet glødet oligos, 1 μL T4 Ligation Buffer (10x), 1 μL T4 DNA Ligase, opptil 10 μL nukleasefritt vann for å oppnå det totale volumet av reaksjonen 10 μL.
      3. Hvis du bruker "høy konsentrasjon" ligase, inkuber reaksjonen ved romtemperatur i 5 min. Ellers inkuberer du ved romtemperatur i 2 timer, eller for å oppnå et høyere utbytte av ligasjon, inkuberer ved 16 °C over natten.
        MERK: Varmeinaktiver hvis du bruker standard T4 DNA Ligase ved 65 °C i 20 minutter. Ikke varm opp inaktivering hvis du bruker ligase masterblandinger.

4. Bakteriell transformasjon

  1. Forvarm 10 cm LB-ampicillin agarplater ved romtemperatur.
  2. Tin 50 μL av "Ett skudd Stbl3" kompetente bakterieceller på is.
  3. Tilsett 2-3 μL ligasjonsblanding til 50 μL kompetente bakterieceller og bland forsiktig ved å flikke bunnen av røret med en finger 4 ganger. Inkuber på is i 30 min.
  4. Varmsjokk cellene ved nøyaktig 42 °C i 40 sekunder ved hjelp av en timer. Avkjøl bakteriecellene på is i 5 min.
  5. Tilsett 500 μL SOC-medier uten antibiotika til bakteriecellene og vokse dem i ristende inkubator ved 250 rpm i 45 min, ved 37 °C.
  6. Spred 100 μL transformerte bakterier på forvarme LB-ampicillinplater og inkuber over natten ved 37 °C.

5. Mini/maxi-prep av ligated plasmid

  1. Forbered en maxi/mini-prep startkultur.
    1. Neste dag velger du en enkelt bakteriell klone og inokulerer en startkultur med 8 ml LB-medier som inneholder ampicillin.
    2. Dyrk bakteriene i risting inkubatoren ved 250 rpm, 37 °C i 10-12 timer.
    3. Bruk 3-5 ml bakterier for mini-prep eller bruk den som en startkultur for maxi-prep. Bruk resten av bakteriene som en bakteriell glyserolbestand ved å tilsette 100% glyserol i forholdet mellom bakteriekultur: glyserol er 1:1.
      MERK: Her vil vi beskrive mini-prep prosedyren.
  2. Prosedyre for miniforberedelse
    1. Høst 3-5 ml bakterieceller og sentrifuge ved 12.000 x g i 1 min.
    2. Resuspend pellet av bakterieceller med 200 μL P1 buffer, som inneholder RNase A og lagret ved 4 °C.
    3. Tilsett 200 μL buffer P2 og bland forsiktig ved å invertere røret 10 ganger til væsken klargjør.
    4. Tilsett 300 μL buffer P3 og bland ved å invertere røret 10 ganger. Væsken blir overskyet. Fortsett umiddelbart med sentrifugering av prøvene på 12.000 x g i 10 min.
    5. Overfør klar supernatant til spinnkolonnen og sentrifuger ved 12 000 x g i 1 min.
      Kast gjennomstrømningen.
      MERK: Kontroller at supernatanten er avklart. Partikler kan tette spinnkolonnen og redusere kolonneeffekten.
    6. Tilsett 400 μL PD-buffer og sentrifuge ved 12 000 x g i 1 min. Kast gjennomstrømningen.
    7. Tilsett 600 μL PW-buffer for å vaske spinnkolonnen og sentrifugen ved 12 000 x g i 1 min. Kast gjennomstrømningen.
    8. Sentrifuger igjen spinnkolonnen med topphastighet i 3 minutter for å fjerne bufferrester. Kast gjennomstrømningen og la den sitte i 2 minutter.
    9. Plasser spinnkolonnen på et nytt rør og tilsett 50 μL elutionbuffer. Inkuber i 5 min og sentrifuger i toppfart i 2 minutter.
    10. Bruk nanodråpeanordningen til å måle konsentrasjonen av renset DD-Cas9-plasmid med sgRNA-innsatsen (ng/μL).
  3. Valider sgRNA-kloningen ved DNA-sekvensering av DD-Cas9-plasmidet. Bruk U6-primersekvensen i tabell 2.

6. Lentiviral forberedelse

  1. Klargjør HEK293T-emballasjeceller for transfeksjon.
    1. Bruk sunn HEK293T opp til passasje 10 og frø dem jevnt ved tetthet 1-2 x 106 celler per 10 cm vev kultur plate. Bruk 10 ml glukose dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) med 10% filtrert foster bovint serum (FBS). Inkuber celler i vevskulturinkubatoren, ved 5% CO2 og 37 °C i 20 timer.
    2. Neste dag, bekreft at cellene nådde 70% samløp ved brightfield mikroskopi og at de er jevnt spredt over platen. Endre medier til celler 1 t før transfeksjonen med det endelige volumet på 10 ml.
      MERK: Mediene skal være fraværende av antibiotika og antimykotika.
    3. Forbered blandingen av 2 rør med 500 μL varme medier (f.eks.
      1. Tilsett 25 μL transfeksjonsreagens i rør 1 som inneholder varme 500 μL medier, og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
      2. I mellomtiden forberede en blanding av plasmider til rør 2 som inneholder 3,5 μg DD-Cas9 som inneholder klonet sgRNA, 6 μg av emballasjen plasmid (psPAX2), og 3 μg av konvolutten plasmid (pMD2.G) i varme 500 μL medier.
      3. Bland rør 1 med rør 2 for å danne en transfeksjonsblanding og inkubere ved romtemperatur i 20 minutter.
      4. Dropwise transfection blandingen til HEK293T celler og inkubere plate i vev kultur inkubator, ved 5% CO2 og 37 °C over natten.
      5. Etter 18 timer, bytt forsiktig mediet til 10 ml fersk DMEM med 10% FBS for å fjerne transfeksjonsreagensen. Inkuber for de neste 48 h.
      6. Etter 48 timer samler du supernatanten med en 10 ml sprøyte og sender den gjennom et filter på 0,45 μm.
      7. Aliquot og lagre viruset supernatant ved -80 °C.

7. Bestemme virustitre og transduksjonseffekt med strømningscytometri

  1. Frø HEK293T-cellene med 5 x 105 celler/brønn inn i en 6-brønns plate. Frøceller i to 6-brønns plater. Bruk én plate til telling neste dag.
  2. Inkuber platene i inkubatoren ved 37 °C, 95 % fuktighet, 5 % CO2 over natten for å nå 50–60 % samløp dagen etter.
  3. Neste dag bruker du en av de 6-brønnsplatene til å telle cellene i 6 brønner.
  4. Tine viruset aliquot som vil bli brukt til å utføre seriell fortynning og tilsett 8 μg / ml polybrene reagens.
  5. Forbered DMEM med 10% FBS for seriell fortynning av viruset og tilsett 8 μg/ml polybrenreagens.
  6. Forbered 2 ml ti ganger seriell fortynning av lentiviruset fra 1 x 10-1 til 1 x 10-4 i polybreneholdige medier.
  7. Fjern medier fra 6-brønns plate og tilsett 1 ml virale fortynninger til brønner. La en brønn med media alene som negativ kontroll og en brønn med 100% virus.
  8. Inkuber celler med viruset i inkubatoren i 24 timer.
  9. Neste dag fjerner du mediet med virus fra 6-brønnsplater og endrer det for 2 ml fersk DMEM med 10% FBS. Inkuber celler i 48-72 timer. Vær oppmerksom på GFP ved å bruke et fluorescerende mikroskop hver dag.
  10. Etter 48-72 timer løsner du cellene og bruker dem på nytt i MACS-buffer.
  11. Bruk et strømningscytometer til å bestemme prosentandelen av GFP-uttrykk.
  12. Beregn virustitren ved hjelp av følgende formel: TU/ml = (Antall celler transdusert x Prosent fluorescerende x fortynningsfaktor)/(Transduksjonsvolum i ml)

8. Lentiviral transduksjon av målceller

  1. Plate cellelinjen av interesse til en 10 cm plate og inkuber over natten for å nå samløp 50-60% neste dag.
    MERK: Vi brukte A549-cellelinjen som uttrykte DD-Cas9 og to uavhengige RPA3-gen-sgRNAer. Vi brukte også A549-cellelinjen som uttrykte vektor med Renilla-kontroll. Vi sådde disse cellene med en tetthet på 2 x 103celler/cm2 og inkuberte dem ved 37 °C, 95 % fuktighet, 5 % CO2 over natten for å nå 50–60 % samløp dagen etter. Vi brukte RPMI-medier med 10% filtrert FBS. Vi fortsatte med de neste trinnene som følger:
  2. Neste dag smitter cellene med 500-2000 μL viruspartikler i 10 ml totalt volum kulturmedium. Inkuber virale medier i 24 timer.
  3. Neste dag, endre virale medier til kulturmedier og bestemme prosentandelen av GFP positive celler ved hjelp av flow cytometri.
  4. Velg positive GFP-celler etter FACS-cellesortering eller ved hjelp av bleomycinvalg.
  5. Utvid positivt merkede celler og frys et lager.

9. Betinget induksjon av Cas9 mediert genredigering

  1. Plate positivt utvalgte celler 24 timer etter infeksjon samt utransdusert celler til 12-brønns plate separat. Vent til cellene fester og endrer mediet til cellekulturmedier som inneholder 200 nM Shield-1. Bytt ut mediet i platene med transinduserte og utransdusert celler, og la 2 brønner per plate med vanlige medier som en negativ kontroll.
  2. Inkuber og trekk ut proteiner fra hver brønn på forskjellige tidspunkter: tid 0, 2 t, 6 timer, 12 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer etter å ha lagt Shield-1 til brønnene.
  3. Fjern deretter mediet med Shield-1 fra resten av brønnene og endre det for vanlige cellemedier.
  4. Samle proteinene fra disse brønnene 2 t, 6 h og 12 timer etter å ha endret media.
  5. Visualiser ved vestlig blot analyse reversibiliteten og hurtigheten av destabilisert DD-Cas9 proteinregulering etter tilsetning og tilbaketrekking av sin ligand, Shield-1. Bruk antistoff rettet mot DYKDDDDK Tag for å visualisere proteiner og en kontroll antistoff målretting for eksempel beta-tubulin.
  6. Bestem den optimale dosen av Shield-1 ved doseresponskurve observert ved Western Blot-analyse.

10. Validering av genredigering

MERK: GFP-uttrykksanalysene, for eksempel flowcytometrianalyse og bleomycinvalgmarkør, bekrefter bare vellykket CRISPR-reagenslevering, men de bestemmer ikke om ønsket sekvens var vellykket målrettet. De vanligste analysene for å bekrefte vellykket genmålretting av CRISPR-eksperimentet er Sanger DNA-sekvensering, neste generasjons sekvensering, landmåleren Nuclease Assay, Sporing av indels ved dekomponering (TIDE) Assay, eller vestlig blotanalyse16,17,18.

  1. Plate positivt merkede celler og endre medium til 200 nM shield-1 som inneholder medier. Inkuber celler i 5 dager, endre media med Shield-1 hver tredje dag.
  2. Bruk de ovennevnte valideringsteknikkene 5 dager etter DD-Cas9-induksjon av Shield-1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å muliggjøre det betingede uttrykket til Cas9 utviklet vi en dobbel lentiviral vektorkonstruksjon bestående av en U6-drevet promotor for å uttrykke sgRNA, og en EF-1α kjernepromotor for å drive uttrykket av DD-Cas9 fusjonsproteinet (Figur 1A)19. Som et paradigme for å illustrere systemets robusthet og effektivitet, transduserte vi lungekarsinomisk A549-cellelinje med lentiviral konstruksjon. Nivåene av Cas9 i nærvær eller fravær av ligand Shield-1 ble målt ved omvendt transkripsjon-polymerase kjedereaksjon (RT-PCR) og vestlig blotanalyse ved hjelp av et antiflagg spesifikt antistoff. Vi brukte uinfiserte celler og mock-infiserte celler (kjøretøyet) som kontroller. Cellene ble behandlet med en konsentrasjon av Shield-1 fra 10 til 1000 nM i 7 d. Som vist var behandlingen med Shield-1 i stand til å regulere uttrykket av DD-Cas9 på en sterk doseavhengig måte (figur 1B og figur 2A). RT-PCR-analyse med spesifikke primere for DD-Cas9 og kontrollprimere for glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) bekreftet at nivåene av mRNA-uttrykk for DD-Cas9 var like blant de transinduserte cellene og kjøretøyet til tross for tilstedeværelsen eller fraværet av Shield-1 (Figur 2B). Dette bekrefter at induksjonen av Cas9-protein er en posttranskripsjonell hendelse.

Dette systemet muliggjør rask og reversibel stabilisering av DD-Cas9-proteinet. Figur 3 viser tilstrekkelig induksjon av Cas9-uttrykk i den transinduserte A549-cellelinjen 2 t etter behandling med 200 nM Skjold-1 sammenlignet med de uinferte A549-cellene. Tilbaketrekking av Shield-1 resulterer imidlertid i en rask reduksjon av DD-Cas9-proteinet, som blir ubetydelig innen 6 til 12 timer (figur 3).

RPA3-proteinet er en komponent i heterotrimeren humant replikasjonsprotein A (RPA). Det er et enkeltstrenget DNA-bindingskompleks som spiller en viktig rolle i DNA-replikasjon, rekombinasjon og reparasjon. For å validere bruken av systemet for å studere essensielle gener, målrettet vi RPA3-genet. Til dette formål brukte vi to uavhengige locus-spesifikke enkeltguide RNAer (guider 25 og 44) samt Renilla som kontroll (guide 208). A549-cellene transdusert med DD-Cas9 lentiviral konstruksjon ble behandlet med 200 nM Shield-1 i 3 d. En reduksjon i cellenummer i Shield-1-behandlede transproduserte A549-celler som inneholder RPA3-guiden RNA, var tydelig etter 48 timers behandling, og det ble ikke observert noen effekt på cellenummeret i Renilla-prøven (figur 4A). For å validere uttømmingen av RPA3-proteinet utførte vi en immunoblottingsanalyse ved hjelp av et antistoff mot RPA3 3 d etter Sheild-1 induksjon (figur 4B). Videre bekreftet vi genredigeringsinversjon eller indelmutasjoner ved hjelp av Surveyor nucleaseanalyser og DNA-sekvensering (Figur 4C).

Den lentivirale vektorkonstruksjonen vi designet har en unik funksjon: reguleringen av DD-Cas9 proteinstabilitet er uavhengig av mRNA-uttrykket. Dette gjør det mulig for genereringen av bicistronic-systemer å uttrykke et annet gen av interesse under samme EF-1a-promotor uten å bli modulert av destabiliserte DD-Cas9 (Figur 5A,5B). Vi har også lagt til et 2A selvklebende peptid (P2A) mellom DD-Cas9 og mVenus, et modifisert fluorescerende protein som kan brukes til å spore infiserte celler (Figur 5A). Som mVenus er plassert etter P2A, som vist av resultatene av Western Blot-analysen i figur 5B, ble uttrykket av mVenus-proteinet observert i kjøretøyet og A549 transinduserte celler uavhengig av DD-Cas9-uttrykk og Shield-1-behandling.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk for lentiviral konstruksjon og forskjellige genredigeringsverktøy. A) DD-Cas9 lentiviral ryggrad inneholder en U6-promotor, sgRNA, EF-1a-promotor, DD, spCas9, nukleoplasmin NLS og Flag-tag. B) Sammenligning mellom DD-Cas9-system (venstre panel) og forskjellige Tet-On-system (høyre panel) som brukes som genredigeringsverktøy. Lad-ladder, NI-ikke-infiserte celler, Veh-kjøretøy, -Sh celler behandlet uten Shield-1, + Sh celler behandlet med 200 nM Shield, - Doxy celler uten doxycyklin behandling, + Doxy celler behandlet med doxycyklin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative resultater av doseavhengig DD-Cas9-stabilisering med Shield-1. A) Western Blot analyse ved hjelp av et anti-flagg-tag antistoff av stabilisert DD-Cas9 uttrykk i celler behandlet med økende konsentrasjoner av Shield-1. Som en kontroll ble de uinferte cellene (NI) og mock-behandlede celler (Veh) brukt. Fusjonsproteinet DD-Cas9 var uoppdagelig i begge kontrollene. B) RT-PCR-resultatene av mRNA-uttrykksnivåer av DD-Cas9 i transinduserte celler i fravær eller doseavhengige behandlinger av Shield-1 var like blant transinduserte celler og kjøretøy, ved hjelp av GAPDH-primere som internkontroll. Denne figuren er endret fra Serif et al19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Western Blot-analysen illustrerer reversibiliteten og hurtigheten til destabilisert DD-Cas9 proteinregulering etter tilbaketrekkingen av ligand Shield-1. Transduced A549 celle linje med DD-Cas9 og uinfisert A549 som kontroll ble behandlet 24 h etter infeksjon med 200 nM Shield-1 ligand for de angitte tidspunktene. Proteinnivået til DD-Cas9 i mock control-celler var uoppdagelig. Denne figuren er endret fra Serif et al19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: DD-Cas9-systemet kan indusere robust genredigering i innstillingene "in-vitro" og "in-vivo". A) Cellelinjen A549 transduced med en vektor som uttrykker sgRNA for RPA3 gen og DD-Cas9 (RPA3). Som en kontroll ble A549 transduced med en vektor som uttrykker sgRNA for Renilla (Ren) brukt. Celler ble behandlet med Shield-1 (200 nM) i 3 dager, noe som resulterte i en rask reduksjon i celle levedyktighet i celler som uttrykker RPA3 sgRNA, uten effekt på cellenummer i Renilla kontrollprøven. Effektiviteten av RPA3 genredigering i A549 cellelinjen ble validert av B) Western Blot analyse ved hjelp av antistoffet mot Flag-tag i RPA3 A549 og Renilla A549 i nærvær og fravær av 3 dager Shield-1 (200 nM) behandling og C) av SURVEYOR nuclease analyse. Pilene i panel C) viser fragmentene av SURVEYOR-nukleaseanalysen. Denne figuren er endret fra Serif et al19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Ordning av en bicistronic DD-Cas9 lentiviral konstruksjon for å drive uttrykket av mVenus uavhengig av DD-Cas9. A) Konstruksjonen består av U6 promotør, sgRNA, EF-1a promotør, DD-Cas9, P2A og mVenus. B) Transduced A549 celler med en lentiviral plasmid som inneholder DD-Cas9, P2A og mVenus ble behandlet med 50 mM ligand Shield-1 i 3 dager. På den tredje dagen ble den vestlige blotanalysen utført med cellelysat, ved hjelp av antistoffet mot GFP og Flag-tag separat. Figur 5B er endret fra Serif et al19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Fremover (Oligo 1) 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
Omvendt (Oligo 2) 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3'

Tabell 1:Utformingen av det fremre og omvendte sgRNA oligonukleotidet. Fremover (Oligo 1) og omvendt (Oligo 2) oligonukleotid er designet ved å legge til BsmBI enzym fordøyelse overhenger sgRNA sekvensen. "N" betegner de forskjellige nukleotidene som finnes i sgRNA-sekvensen din, resten er overheng for BsmBI-fordøyelsen.

U6 primer sekvens 5'-GACTATCATATGCTTACCGT-3'

Tabell 2: U6-promotorsekvensen for sgRNA-kloningsvalidering. For å validere hvor vellykket er sgRNA-kloningen, bruk U6-promotorsekvensen for DNA-sekvensering av DD-Cas9-plasmidet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CRISPR/Cas9-teknologien har revolusjonert evnen til funksjonelt å forhøre genomer2. Inaktivering av gener resulterer imidlertid ofte i celledødelighet, funksjonelle underskudd og utviklingsfeil, noe som begrenser nytten av slike tilnærminger for å studere genfunksjoner7. I tillegg kan konstituerende uttrykk for Cas9 føre til toksisitet og generering av off-target effekter6. Ulike tilnærminger er utviklet for å kontrollere CRISPR-Cas9-baserte genomredigeringsteknologier6. Disse systemene er basert enten på transkripsjonskontroll av Cas9 og/eller sgRNA, eller Cas9 posttranskripsjonell og post-translasjonell aktivering21,22,23. Som et alternativ til disse systemene utviklet vi et nytt verktøysett basert på den betingede destabiliseringen av Cas9.

Det kritiske trinnet i denne protokollen er utformingen av minst to eller tre sgRNA for et spesifikt gen for å unngå off-target effekter og legge til rette for effektiv genredigering. Et trinn som begrenser hastigheten, er en effektiv transformasjon av cellelinjen med DD-Cas9-vektoren. Kvaliteten på lentiviruspartikler (høye titere) er avhengig av HEK-293T-cellene. Det er viktig å bruke et lavt passasjenummer (opptil passasje 10) av HEK-293T-cellene som ble riktig vedlikeholdt (delt når de nådde 70% samløp, vanligvis to ganger i uken i et 1: 6-forhold). Som et alternativ kan HEK-293 Lenti-X-cellelinjen, som ble clonally valgt for å gi 30× høyere virale titere enn vanlige HEK-293T-celler, brukes24. Et annet viktig skritt er optimaliseringen av forholdet mellom DD-Cas9-plasmid, psPAX2-emballasjeplasmid og pMD2.G-konvoluttplasmid. Vår erfaring er at både volumet der transfeksjonsblandingen med lipofektamin fremstilles, samt plasmidforholdet, har en betydelig effekt på transfeksjonseffektiviteten. Vi anbefaler at du følger trinnene i protokollen vår for å få best mulig resultat. Det neste avgjørende trinnet for effektiv genredigering er optimalisering av Shield-1-konsentrasjoner. Vi anbefaler en endelig konsentrasjon på 200 nM, men for å oppnå de beste resultatene, bør konsentrasjonen optimaliseres til en bestemt transindusert cellelinje. DD / Shield-1-systemet har blitt vellykket brukt i forskjellige cellekulturer, bakterieceller, protozoen Entamoeba histolytica, flatorm Caenorhabditis elegans, transgene xenografts, transgene mus og medaka25. En av de største begrensningene er den høye prisen på Shield-1-molekylet, spesielt når det brukes i in vivo-innstillinger. I tillegg har det tidligere blitt vist at proteinene som er rettet mot visse cellerom, for eksempel mitokondriematrisen eller lumen av endoplasmic retikulum, kan stabiliseres eller akkumuleres i fravær av Shield-1. Dette er fordi forskjellige proteiner har forskjellige lokale protein kvalitetskontroll maskiner26. Mens DD-fusjoner i cytoplasma eller kjerne kan bli svært effektivt degradert i pattedyrceller og stabilisert av Shield-1, for å overvinne begrensningene nevnt ovenfor, anbefaler vi å bruke et alternativt destabiliserende domene avledet fra bakteriell dihydrofolat reduktase27. Dette systemet bruker trimetoprim som et bindende molekyl for å stabilisere destabiliseringsdomenet og er også et billigere alternativ til Shield-127.

I tillegg til å oppnå transkripsjonen av DD-Cas9 som sitt uavhengige uttrykk, er fordelene ved denne metoden, sammenlignet med andre inducible eller betinget kontrollerte CRISPR-Cas9 genredigeringsverktøy, tidsmessig og betinget kontrollert genredigering, mindre off-target effekt og lavere celletoksisitet4,6,7,8. Effektiviteten og enkelheten til Shield-1/DD-Cas9-metoden muliggjør generering av en rekke verktøy som enkelt kan tilpasses og brukes i et mangfold av applikasjoner. Systemet kan også enkelt brukes i in vivo-innstillinger, og det har vist seg at Shield-1 effektivt kan trenge gjennom blod-hjerne barier19,25,28,29. Selv om dette dokumentet beskrev bruken av CRISPR-Cas9-teknologi for karakterisering av essensielle cellegener, kan den samme tilnærmingen enkelt implementeres for identifisering av gener som kreves for overlevelse eller progresjon av svulster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker tidligere medlemmer av vårt laboratorium og forsker Serif Senturk for tidligere arbeid. Vi takker Danilo Segovia for at han kritisk leste dette manuskriptet. Denne studien var mulig og støttet av Swim Across America og National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center-programmet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100mM DTT Thermosfisher
10X FastDigest buffer Thermosfisher B64
10X T4 Ligation Buffer NEB M0202S
colorimetric BCA kit Pierce 23225
DMEM, high glucose, glutaMax Thermo Fisher 10566024
FastAP Thermosfisher EF0654
FastDigest BsmBI Thermosfisher FD0454
Flag [M2] mouse mAb Sigma F1804-50UG
Genomic DNA extraction kit Macherey Nagel 740952.1
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S
oligonucleotides Sigma Aldrich
pMD2.G Addgene 12259
polybrene Sigma Aldrich TR-1003-G
psPAX2 Addgene 12260
QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit Qiagen 28506
secondary antibodies LICOR
Shield-1 Cheminpharma
Stbl3 competent bacterial cells Thermofisher C737303
SURVEYOR Mutation Detection Kit Transgenomic/IDT
T4 PNK NEB M0201S
Taq DNA Polymerase NEB M0273S
α-tubulin [DM1A] mouse mAb Millipore CP06-100UG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, New York, N.Y. 816-821 (2012).
  2. Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
  3. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
  4. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, New York, N.Y. 823-826 (2013).
  5. Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
  6. Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
  7. Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
  8. Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
  9. Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).
  10. Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
  11. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  12. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).
  13. Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
  14. Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
  15. Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
  16. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  17. Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
  18. Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
  19. Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370 (2017).
  20. McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).
  21. Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
  22. Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
  23. Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
  24. Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
  25. Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).
  27. Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
  28. Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).
  29. Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293 (2016).

Tags

Genetikk Utgave 175 Genredigering funksjonelle genomiske studier CRISPR Cas9 destabiliserende domene inducible
Et nytt verktøysett for evaluering av genfunksjoner ved hjelp av betinget cas9-stabilisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Šafarič Tepeš, P.,… More

Šafarič Tepeš, P., Sordella, R. A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization. J. Vis. Exp. (175), e60685, doi:10.3791/60685 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter