Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Новый инструментарий для оценки функций генов с использованием условной стабилизации Cas9

Published: September 2, 2021 doi: 10.3791/60685
Automatic Translation
1,2, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

Summary

Здесь мы описываем инструмент редактирования генома, основанный на временной и условной стабилизации кластеризованного регулярно интерширизованного короткого палиндромного повторного (CRISPR-) ассоциированного белка 9 (Cas9) под небольшой молекулой Shield-1. Метод может быть использован для культивированных клеток и животных моделей.

Abstract

Кластерная регулярно интерширидная технология короткого палиндромного повторного (CRISPR-) белка 9 (CRISPR / Cas9) стала распространенным лабораторным инструментом для введения точных и целенаправленных модификаций в геном. Его огромная популярность и быстрое распространение объясняются его простотой использования и точностью по сравнению с предшественниками. Тем не менее, конститутивная активация системы имеет ограниченное применение. В данной работе описан новый метод, позволяющий временно контролировать активность CRISPR/Cas9 на основе условной стабилизации белка Cas9. Слияние инженерного мутанта рапамицин-связывающего белка FKBP12 с Cas9 (DD-Cas9) позволяет быстро разбавлять Cas9, что, в свою очередь, может быть стабилизировано присутствием синтетического лиганда FKBP12 (Shield-1). В отличие от других индуцируемых методов, эта система может быть легко адаптирована для генерации бицистронных систем для совместной экспрессии DD-Cas9 с другим интересуемым геном без условной регуляции второго гена. Этот метод позволяет создавать прослеживаемые системы, а также параллельное, независимое манипулирование аллелями, на которые нацелена нуклеаза Cas9. Платформа этого метода может быть использована для систематической идентификации и характеристики эссенциального гена и опроса функциональных взаимодействий генов in vitro и in vivo.

Introduction

CRISPR-Cas9, который расшифровывается как«кластеризованный регулярно чередуемый короткий палиндромно-связанный с повторами белок 9»,был впервые обнаружен в рамках исследований бактериального адаптивного иммунитета1,2. Сегодня CRISPR/Cas9 стал наиболее признанным инструментом для программируемого редактирования генов, и были разработаны различные итерации системы, позволяющие транскрипционные и эпигенетические модуляции3. Эта технология позволяет высокоточную генетическую манипуляцию практически с любой последовательностью ДНК4.

Основными компонентами любого редактирования гена CRISPR являются настраиваемая направляющая последовательность РНК и нуклеаза Cas95. Направляющая РНК связывается с мишенью-комплементарной последовательностью в ДНК, направляя нуклеазу Cas9 на выполнение двухцепочечного разрыва в определенной точкегенома3,4. Полученный участок расщепления затем восстанавливается путем негомологичного конечного соединения (NHEJ) или гомологического репарации (HDR) с последующим введением изменений в целевую последовательность ДНК5.

Редактирование генов на основе CRISPR / Cas9 просто в использовании и относительно недорого по сравнению с предыдущими методами редактирования генов, и было доказано, что оно эффективно и надежно во множестве систем2,4,5. Тем не менее, система имеет некоторые ограничения. Часто было показано, что конститутивная экспрессия Cas9 приводит к увеличению числа нецелей и высокой клеточной токсичности4,6,7,8. Кроме того, конститутивное нацеливание на эссенциальности и гены выживания клеток Cas9 низводит его способность выполнять определенные типы функциональных исследований, таких как кинетические исследования гибели клеток7.

Для решения этих проблем6были разработаны различные индуцируемые или условно управляемые инструменты CRISPR-Cas9, такие как Tet-ON и Tet-Off9; сайт-специфическая рекомбинация10; химически индуцированная близость11; интейн-зависимый сращивание3; и системы ядерной локализации на основе 4-гидрокситамоксифен-эстроген-рецептора (ER)12. В целом, большинство из этих процедур (сращивание интеина и химически индуцированные системы бесконтактного расщепления) не обеспечивают обратимого контроля, представляют очень медленный кинетический ответ на медикаментозное лечение (система Tet-On/Off) или не поддаются высокопроизводительный манипуляции6.

Для устранения этих ограничений мы разработали новый инструментарий, который не только обеспечивает быстрое и надежное редактирование генов, контролируемое временем, но также обеспечивает прослеживаемость, настраиваемость и пригодность для высокопроизводительных манипуляций с генами. Эта новая технология может быть использована в клеточных линиях, органоидах и животных моделях. Наша система основана на инженерном домене, при сращений с Cas9 она вызывает его быструю деградацию. Тем не менее, он может быть быстро стабилизирован с помощью высокоселективной, нетоксичной, проницаемой для клеток малой молекулы. Более конкретно, мы спроектировали мутантный «дестабилизирующее домен» человека FKBP12 (DD) в Cas9, обозначив Cas9 для быстрой и конститутивной деградации через систему убиквитин-протеасома при экспрессии в клетках млекопитающих13. Синтетический лиганд DD Shield-1 может стабилизировать конформацию DD, тем самым предотвращая деградацию белков, слитых с DD (таких как Cas9) очень эффективным образом и с быстрым кинетическим ответом14,15. Следует отметить, что Shield-1 связывается на три порядка плотнее с мутантом FKBP12, чем с его аналогом дикого типа14.

Пара DD-Cas9/Shield-1 может быть использована для изучения систематической идентификации и характеристики основных генов в культивируемых клетках и животных моделях, как мы ранее показали, путем условного нацеливания на ген CypD, который играет важную роль в метаболизме митохондрий; EGFR, ключевой игрок в онкогенной трансформации; и Tp53, центральный ген в реакции на повреждение ДНК. В дополнение к временному и условно контролируемому редактированию генов, еще одним преимуществом метода является то, что стабилизация DD-Cas9 не зависит от его транскрипции. Эта функция обеспечивает коэкспрессию под одним и тем же промотором прослеживаемых маркеров, а также рекомбиназ, таких как эстроген-рецептор-зависимая рекомбиназа, CREER. В этой работе мы показываем, как наш метод может быть успешно использован in vitro, чтобы условно нацеливаться, например, на ген репликации ДНК, RPA3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.Вектор DD-Cas9

  1. Получить вектор DD-Cas9 из Адджеина (DD-Cas9 с последовательностью наполнителя и Венеры (EDCPV), Плазмида 90085).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это лентивирусная плазмида DD-Cas9 с промотором U6, который управляет транскрипцией одной направляющей РНК (sgRNA), в то время как промодер EFS управляет транскрипцией DD-Cas9. Последовательность DYKDDDDK (флаг-метка) присутствует на С-конце Cas9, за которой следует саморасщепляющийся пептид 2A (P2A), который разделяет DD-Cas9 и модифицированный флуоресцентный белок Venus (mVenus).

2. Малый дизайн направляющей РНК (sgRNA)

  1. Разработайте небольшую направляющую РНК (sgRNA), которая будет клонирована в вектор DD-Cas9 с помощью одного из нескольких алгоритмов, нацеленных на конкретную геномную область.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить нецелевые эффекты, выберите последовательности sgRNA с наибольшим баллом с помощью веб-сайта: http://crispr.mit.edu.
  2. Спроектируйте и закажите два олигонуклеотида на последовательность sgRNA, чтобы получить полную sgRNA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку плазмида будет перевариваться ферментом BsmBI, разработайте прямой и обратный олигонуклеотид, добавив навесы пищеварения BsmBI к последовательности sgRNA. Используйте шаблон из таблицы 1.

3. Клонирование sgRNA в лентивирусный вектор DD-Cas9

  1. Дефосфорилируют 5'-концы плазмиды DD-Cas9 с помощью щелочной фосфатазы (FastAP) в реакции переваривания фермента рестрикции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Векторы могут циркуляризироваться во время лигирования, особенно когда они линеаризованы одним ферментом рестрикции. Чтобы вектор не циркуляризировался, дефосфорилируйте плазмиду, добавляя фосфатазу непосредственно в реакцию пищеварения.
    1. Дефосфорилат и переваривание плазмиды с ферментом BsmBI путем получения смеси из 5 мкг плазмиды DD-Cas9, 6 мкл пищеварительного буфера (10x), 0,6 мкл DTT (100 мМ), 3 мкл BsmBI, 3 мкл FastAP, добавьте до 60 мкл воды без нуклеазы, чтобы сделать 60 мкл общего реакционного объема.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте фермент BsmBI и FastAP в смесь в конце.
    2. Инкубировать смесь в течение 30 мин при температуре 37 °C тепловой блок или термоциклер.
  2. Очистите переваренную плазмиду DD-Cas9.
    1. Приготовьте 0,8% ДНК агарозный гель для удаления неполностью переваренной плазмиды и следов ферментов. Используйте более широкую гелевую расческу для лучшего разделения и запустите гель при 90 В.
    2. Визуализируйте полосы под ультрафиолетовым светом 360-365 нм и вырежьте большую плазмидную полосу из геля. Отбросьте фрагмент 2 кб, соответствующий наполнитеру.
    3. Очистите большую разрезанную гелевую ленту с помощью коммерческого набора для очистки геля и следуйте инструкциям производителя.
  3. Лигат отожженные олиго с переваренной плазмидой DD-Cas9.
    1. Фосфорилирует и отжигает олигос сгРНК.
      1. Приготовьте смесь из 1 мкл буфера лигирования Т4 (10x), 1 мкл Олиго 1 (100 мкМ), 1 мкл Олиго 2 (100 мкМ), 6,5 мкл воды без нуклеазы. Наконец, добавьте 0,5 мкл Т4 PNK. Общий объем этой реакции составляет 10 мкл.
      2. Добавьте реакционную смесь в термоциклер со следующими условиями: 37 °C в течение 30 мин, 95 °C в течение 5 мин, а затем опускайтесь до 25 °C со скоростью 5 °C /мин.
        ПРИМЕЧАНИЕ: PNK должен быть термоинактивирован до того, как олигонуклеотиды будут введены в лигирование, иначе PNK будет фосфорилировать вектор. Этап фосфорилирования и этап отжига выполняются вместе в термоциклере. Для лигирования требуется этап фосфорилирования, на котором 5' фосфат добавляется к олигонуклеотидам sgRNA.
    2. Ligate DD-Cas9 переваривает плазмиды и олигосы сгРНК.
      1. Разбавьте отожженные олиго до 1:200 в воде без нуклеаз и используйте 50 нг плазмидной ДНК в реакции лигирования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте молярное отношение вставки 6: 1 вектор, чтобы способствовать интеграции вставки, или используйте калькулятор лигирования для расчета молярного соотношения: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation.
      2. Готовят реакционную смесь лигирования: 50 нг переваренного и очищенного вектора DD-Cas9, соответствующий объем разбавленных отожженных олигов, 1 мкл буфера лигации Т4 (10x), 1 мкл ДНК-лигазы Т4, до 10 мкл безнуклеазной воды для получения общего объема реакции 10 мкл.
      3. При использовании лигазы «высокой концентрации» инкубируют реакцию при комнатной температуре в течение 5 мин. В противном случае инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч или для достижения более высокого выхода перевязки инкубируют при 16 °C в течение ночи.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Термо-инактивировать при использовании стандартной Т4 ДНК-лигазы при 65 °C в течение 20 минут. Не нагревайте-инактивируйте, если вы используете лигазные мастер-смеси.

4. Бактериальная трансформация

  1. Предварительно прогреть 10 см LB-ампициллиновые агаровые пластины при комнатной температуре.
  2. Разморозить 50 мкл компетентных бактериальных клеток "One shot Stbl3" на льду.
  3. Добавьте 2-3 мкл лигационной смеси к 50 мкл компетентных бактериальных клеток и аккуратно перемешайте, щелкнув пальцем пальцем по дну трубки. Насиживать на льду в течение 30 мин.
  4. Тепловой удар по ячейкам при температуре ровно 42 °C в течение 40 секунд, используя таймер. Охладите бактериальные клетки на льду в течение 5 мин.
  5. Добавьте 500 мкл SOC-среды без антибиотика к бактериальным клеткам и выращивайте их в встряхивательном инкубаторе при 250 об/мин в течение 45 мин, при 37 °C.
  6. Выкладывают 100 мкл трансформированных бактерий на предварительно теплые пластины LB-ампициллина и инкубируют в течение ночи при 37 °C.

5. Мини/макси-преп лигатированной плазмиды

  1. Подготовьте закваску макси/мини-подготовки.
    1. На следующий день выберите один бактериальный клон и привите заквасочную культуру 8 мл среды LB, содержащей ампициллин.
    2. Выращивайте бактерии в встряхивательном инкубаторе при 250 об/мин, 37 °C в течение 10-12 ч.
    3. Используйте 3-5 мл бактерий для мини-подготовки или используйте его в качестве закваски для макси-преп. Используют остальные бактерии в качестве бактериального глицерина-бульона, добавляя 100% глицерин в соотношении бактериальной культуры:глицерин составляет 1:1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы опишем процедуру мини-подготовки.
  2. Процедура мини-подготовки
    1. Соберите 3-5 мл бактериальных клеток и центрифугу при 12 000 х г в течение 1 мин.
    2. Повторно суспендируют гранулы бактериальных клеток с 200 мкл буфера Р1, содержащего РНКазу А и хранящегося при 4 °C.
    3. Добавьте 200 мкл буфера P2 и осторожно перемешайте, перевернутый в трубку 10 раз, пока жидкость не осветится.
    4. Добавьте 300 мкл буфера P3 и перемешайте, перевергнув трубку 10 раз. Жидкость станет мутной. Немедленно приступайте к центрифугированию образцов при 12 000 х г в течение 10 мин.
    5. Перенесите прозрачный супернатант в спиновую колонну и центрифугу при 12 000 х г в течение 1 мин.
      Отбросьте сквозной поток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что супернатант прояснен. Частицы могут засорять спиновую колонну и снижать эффективность колонки.
    6. Добавьте 400 мкл буфера PD и центрифуги при 12 000 х г в течение 1 мин. Отбросьте сквозной поток.
    7. Добавьте 600 мкл буфера PW для промывки спиновой колонны и центрифуги при 12 000 х г в течение 1 мин. Отбросьте сквозной поток.
    8. Центрифуг снова отжимную колонну на максимальной скорости в течение 3 мин для удаления буферных остатков. Отбросьте проточную часть и дайте ей постоять в течение 2 минут.
    9. Поместите спиновой столб в свежую трубку и добавьте 50 мкл буфера элюдения. Инкубировать в течение 5 мин и центрифугу на максимальной скорости в течение 2 мин.
    10. Используйте нанокапрующее устройство для измерения концентрации очищенной плазмиды DD-Cas9 с помощью вставки sgRNA (нг/мкл).
  3. Подтвердить клонирование sgRNA путем секвенирования ДНК плазмиды DD-Cas9. Используйте последовательность праймеров U6 в таблице 2.

6. Лентивирусный препарат

  1. Подготовьте упаковочные ячейки HEK293T к трансфекции.
    1. Используйте здоровый HEK293T до прохода 10 и высевайте их равномерно при плотности 1-2 х 106 клеток на 10 см тканевой культурной пластины. Используйте 10 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) глюкозы Dulbecco с 10% фильтрованной фетальной бычий сывороткой (FBS). Инкубировать клетки в инкубаторе тканевых культур при 5%СО2 и 37 °С в течение 20 ч.
    2. На следующий день подтвердите, что клетки достигли 70% слияния с помощью микроскопии Брайтфилда и что они равномерно распределены по пластине. Изменение среды на ячейки за 1 ч до трансфекции с конечным объемом 10 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В средствах массовой информации должны отсутствовать антибиотики и антимикотические средства.
    3. Приготовьте смесь из 2 пробирок с 500 мкл теплой среды (например, OptiMEM).
      1. Добавьте 25 мкл трансфекционного реагента в пробирку 1, содержащую теплые 500 мкл среды, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин.
      2. Тем временем готовят смесь плазмид к трубке 2, содержащей 3,5 мкг DD-Cas9, содержащей клонированную сгРНК, 6 мкг упаковочной плазмиды (psPAX2) и 3 мкг плазмиды оболочки (pMD2.G) в теплые 500 мкл среды.
      3. Смешайте трубку 1 с пробиркой 2 с образованием трансфекционной смеси и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 мин.
      4. Капельно трансфекционную смесь в клетки HEK293T и инкубируют пластину в инкубаторе культуры тканей при 5%CO2 и 37 °C в течение ночи.
      5. Через 18 ч осторожно измените месть на 10 мл свежего DMEM с 10% FBS для удаления трансфекционного реагента. Инкубировать в течение следующих 48 ч.
      6. Через 48 ч соберите супернатант со шприцем 10 мл и пропустите его через фильтр 0,45 мкм.
      7. Аликвот и хранят вирус-супернатант при -80 °C.

7. Определение титра вируса и эффективности трансдукции с помощью проточной цитометрии

  1. Засеять ячейки HEK293T 5 x 105 клетками / скважину в 6-скважинную пластину. Засеять ячейки в две 6-ю колодезные пластины. Используйте одну тарелку для подсчета на следующий день.
  2. Инкубировать пластины в инкубаторе при 37 °C, влажности 95%, 5% CO2 на ночь, чтобы достичь 50-60% слияния на следующий день.
  3. На следующий день используйте одну из 6-скважинных пластин, чтобы подсчитать ячейки в 6 скважинах.
  4. Разморозить вирусную аликвоту, которая будет использоваться для выполнения последовательного разведения, и добавить 8 мкг/мл полибренореагена.
  5. Приготовьте DMEM с 10% FBS для серийного разбавления вируса и добавьте 8 мкг/мл полибреного реагента.
  6. Готовят 2 мл десятикратных последовательных разведений лентивируса от 1 х 10-1 до 1 х 10-4 в полибреносодержащих средах.
  7. Удалите жимы из 6-ю скважинной пластины и добавьте в колодцы 1 мл вирусных разведений. Оставьте один колодец со средой в покое как отрицательный контроль, а один с 100% вирусом.
  8. Инкубировать клетки с вирусом в инкубаторе в течение 24 ч.
  9. На следующий день удалите носитель с вирусом из 6-скважинных пластин и замените его на 2 мл свежего ДМЭМ с 10% FBS. Инкубировать клетки в течение 48-72 ч. Наблюдайте за GFP с помощью флуоресцентного микроскопа каждый день.
  10. Через 48-72 ч отсоединяйте клетки и повторно суспендируете их в буфере MACS.
  11. Используйте проточный цитометр для определения процента экспрессии GFP.
  12. Рассчитайте титр вируса по следующей формуле: TU/mL = (Количество трансдуцированных клеток x Процент флуоресцентных x Коэффициент разбавления)/(Объем трансдукции в мл)

8. Лентивирусная трансдукция клеток-мишеней

  1. Налейте интересуемую клеточную линию на пластину 10 см и высиживая в течение ночи, чтобы достичь слияния 50-60% на следующий день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали клеточную линию A549, экспрессииВШую DD-Cas9, и две независимые SgRNAs гена RPA3. Мы также использовали вектор экспрессии клеточной линии A549 с управлением Renilla. Мы засеяли эти клетки плотностью 2 х 103клеток /см2 и инкубировали их при 37 ° C, влажности 95%, 5% CO2 в течение ночи, чтобы достичь 50-60% слияния на следующий день. Мы использовали RPMI носитель с 10% фильтрованным FBS. Мы приступили к следующим шагам:
  2. На следующий день заражают клетки 500-2000 мкл вирусных частиц в 10 мл общего объема питательной среды. Инкубировать вирусные среды в течение 24 ч.
  3. На следующий день измените вирусные среды на культурную жиму и определите процент положительных клеток GFP с помощью проточной цитометрии.
  4. Выделите положительные ячейки GFP путем сортировки клеток FACS или с помощью выделения блеомицина.
  5. Разверните положительно выбранные клетки и заморозьте запас.

9. Условная индукция опосредоованного Cas9 редактирования генов

  1. Пластина положительно выбирает клетки через 24 ч после заражения, а также нетрансдуцированные клетки на 12-ю скважинную пластину отдельно. Подождите, пока клетки прикрепятся и изменят жиму на питательную жиму, содержащую 200 нМ Shield-1. Замените среды в пластинах трансдуцированными и нетрансдуцированными ячейками, оставив 2 скважины на пластину с обычными средами в качестве отрицательного контроля.
  2. Инкубировать и извлекать белки из каждой скважины в разные моменты времени: время 0, 2 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч после добавления Щита-1 в скважины.
  3. Затем удалите муляй с Shield-1 из остальных скважин и замените ее на обычную клеточную целлюлозу.
  4. Соберите белки из этих колодцев через 2 ч, 6 ч и 12 ч после смены среды.
  5. Визуализируйте с помощью анализа вестерн-блот обратимость и быстроту дестабилизированной регуляции белка DD-Cas9 после добавления и вывода его лиганда Shield-1. Используйте антитела, направленное на DYKDDDDK Tag, для визуализации белков и контрольного антитела, нацеленного, например, на бета-тубулин.
  6. Определить оптимальную дозу Шилд-1 по кривой доза-реакция, наблюдаемой с помощью анализа Вестерн Блот.

10. Валидация редактирования генов

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализы экспрессии GFP, такие как анализ проточной цитометрии и маркер отбора блеомицина, только подтверждают успешную доставку реагента CRISPR, но они не определяют, была ли желаемая последовательность успешно нацелена. Наиболее распространенными анализами для подтверждения успешного нацеливания генов с помощью эксперимента CRISPR являются секвенирование ДНК Сэнгера, секвенирование следующего поколения, анализ нуклеазы Surveyor, анализ indels by Decomposition (TIDE) или анализ западного пятна16,17,18.

  1. Пластинчатые положительно выбирают ячейки и изменяют м среды на 200 нМ Щит-1, содержащие среды. Инкубируют клетки в течение 5 дней, меняя жижи с Помощью Щита-1 каждые 3 дня.
  2. Используйте вышеупомянутые методы валидации через 5 дней после индукции DD-Cas9 с помощью Shield-1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы обеспечить условную экспрессию Cas9, мы разработали двойную лентивирусную векторную конструкцию, состоящую из U6-управляемого промотора для конститутивной экспрессии sgRNA и промотора ядра EF-1α для управления экспрессией белка слияния DD-Cas9(рисунок 1A)19. В качестве парадигмы, иллюстрируя надежность и эффективность системы, мы трансдуцировали канцероматозную клеточную линию A549 легких с помощью лентивирусной конструкции. Уровни Cas9 в присутствии или отсутствии лиганда Shield-1 измеряли методом обратной транскрипционно-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) и анализа вестерн-блот с использованием антифангеспецифического антитела. Мы использовали неинфицированные клетки и фиктивно-инфицированные клетки (транспортное средство) в качестве контроля. Клетки обрабатывали концентрацией Щита-1 в диапазоне от 10 до 1000 нМ в течение 7 д. Как показано, лечение Shield-1 было способно регулировать экспрессию DD-Cas9 сильным дозозависимым образом(Фиг.1В и Фиг.2А). Анализ ОТ-ПЦР со специфическими праймерами для DD-Cas9 и контрольными праймерами для глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) подтвердил, что уровни экспрессии мРНК DD-Cas9 были одинаковыми среди трансдуцированных клеток и транспортного средства, несмотря на наличие или отсутствие Shield-1(Рисунок 2B). Это подтверждает, что индукция белка Cas9 является посткрипционным событием.

Эта система обеспечивает быструю и обратимую стабилизацию белка DD-Cas9. На фиг.3 показана достаточная индукция экспрессии Cas9 в трансдуцированной клеточной линии A549 через 2 ч после лечения 200 нМ Shield-1 по сравнению с неинфицированными клетками A549. Однако изъятие Shield-1 приводит к быстрому снижению белка DD-Cas9, который становится незначительным в течение 6-12 ч(рисунок 3).

Белок RPA3 является компонентом гетеротримера репликации белка А (RPA) человека. Это одноцепочечный комплекс связывания ДНК, который играет важную роль в репликации, рекомбинации и репарации ДНК. Чтобы подтвердить использование системы для изучения основных генов, мы нацелились на ген RPA3. С этой целью мы использовали две независимые локус-специфические однонаправленные РНК (направляющие 25 и 44), а также Renilla в качестве элемента управления (руководство 208). Клетки A549, трансдуцированные лентивирусной конструкцией DD-Cas9, обрабатывали 200 нМ Shield-1 в течение 3 d. Снижение количества клеток в обработанных Shield-1 трансдуцированных клетках A549, содержащих направляющую РНК RPA3, было очевидным после 48 ч лечения, и не наблюдалось никакого влияния на номер клеток в образце Renilla(рисунок 4A). Чтобы подтвердить истощение белка RPA3, мы провели иммуноблоттинговый анализ с использованием антитела против RPA3 3 d после индукции Sheild-1(рисунок 4B). Кроме того, мы подтвердили инверсию редактирования генов или мутации инделя с использованием анализов нуклеазы Surveyor и секвенирования ДНК(рисунок 4C).

Разработанная ими конструкция лентивирусного вектора имеет уникальную особенность: регуляция стабильности белка DD-Cas9 не зависит от экспрессии его мРНК. Это позволяет генерации бицистронных систем экспрессировать другой ген, представляющий интерес под тем же промотером EF-1a, не модулируясь дестабилизированным DD-Cas9(рисунок 5A,5B). Мы также добавили саморасщепляющийся пептид 2A (P2A) между DD-Cas9 и mVenus, модифицированный флуоресцентный белок, который можно использовать для отслеживания инфицированных клеток(рисунок 5A). Поскольку mVenus помещают после P2A, как показали результаты анализа Western Blot на рисунке 5B,экспрессия белка mVenus наблюдалась в транспортном средстве и трансдуцированных клетках A549 независимо от экспрессии DD-Cas9 и лечения Shield-1.

Figure 1
Рисунок 1:Схема лентивирусной конструкции и различные инструменты редактирования генов. A) Лентивирусная основа DD-Cas9 содержит промотор U6, sgRNA, промотор EF-1a, DD, spCas9, нуклеоплазмин NLS и флаг-метку. B)Сравнение между системой DD-Cas9 (левая панель) и различными системами Tet-On (правая панель), используемыми в качестве инструментов редактирования генов. Lad-ladder, NI-неинфицированные клетки, Veh-транспортные, -Sh клетки, обработанные без Shield-1, + Sh-клетки, обработанные 200 nM Shield, - Doxy-клетки без лечения доксициклином, + Doxy-клетки, обработанные доксициклином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Репрезентативные результаты дозозависимой стабилизации DD-Cas9 с помощью Shield-1. A)Анализ Вестерн-Блота с использованием антитела против флаг-метки стабилизированной экспрессии DD-Cas9 в клетках, получавших повышение концентрации Shield-1. В качестве контроля использовались неинфицированные клетки (NI) и пробно обработанные клетки (Veh). Слитый белок DD-Cas9 не был обнаружен в обоих контрольных группах. B)Результаты ОТ-ПЦР уровней экспрессии мРНК DD-Cas9 в трансдуцированных клетках в отсутствие или дозозависимые методы лечения Shield-1 были сходны среди трансдуцированных клеток и транспортных средств, используя праймеры GAPDH в качестве внутреннего контроля. Этот показатель был изменен по сравнению с Serif et al19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Анализ Вестерн Блот иллюстрирует обратимость и быстроту дестабилизированной регуляции белка DD-Cas9 после отмены его лиганда Shield-1. Трансдуцированную клеточную линию A549 с DD-Cas9 и неинфицированным A549 в качестве контрольного лечили через 24 ч после заражения 200 нМ лиганда Shield-1 для указанных временных точек. Уровень белка DD-Cas9 в имитационных контрольных клетках был неопределяемым. Этот показатель был изменен по сравнению с Serif et al19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4:Система DD-Cas9 может вызывать надежное редактирование генов в настройках «in-vitro» и «in-vivo». A) Клеточная линия A549 трансдуцирована вектором, экспрессивляющим sgRNA для гена RPA3 и DD-Cas9 (RPA3). В качестве контрольного A549 трансдуцировался вектором экспрессировки sgRNA для Renilla (Ren). Клетки обрабатывали Щитом-1 (200 нМ) в течение 3 дней, что приводило к быстрому снижению жизнеспособности клеток в клетках, экспрессирующих RPA3 sgRNA, без влияния на количество клеток в контрольном образце Renilla. Эффективность редактирования гена RPA3 в клеточной линии A549 была подтверждена анализом B) Western Blot с использованием антител против Flag-tag в RPA3 A549 и Renilla A549 в присутствии и отсутствии 3 дней лечения Shield-1 (200 нМ) и C) методом анализа нуклеазы SURVEYOR. Стрелки на панели C) показывают фрагменты анализа нуклеазы SURVEYOR. Этот показатель был изменен по сравнению с Serif et al19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5:Схема бицистронной лентивирусной конструкции DD-Cas9 для управления экспрессией mVenus независимо от DD-Cas9. A) Конструкция состоит из промотора U6, sgRNA, промотора EF-1a, DD-Cas9, P2A и mVenus. B)Трансдуцированные клетки A549 с лентивирусной плазмидой, содержащей DD-Cas9, P2A и mVenus, обрабатывали лигандом Shield-1 50 мМ в течение 3 дней. На третий день анализ вестерн-блот проводили с использованием клеточного лизата, используя антитела против GFP и Flag-tag отдельно. Рисунок 5B был изменен по сравнению с Serif et al19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Форвард (Олиго 1) 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
Реверс (Олиго 2) 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'

Таблица 1:Конструкция прямого и обратного олигонуклеотида сгРНК. Прямой (олиго 1) и обратный (олиго 2) олигонуклеотид разработан путем добавления фермента BsmBI, переваривающего навесы вашей последовательности sgRNA. «N» обозначает различные нуклеотиды, присутствующие в вашей последовательности sgRNA, остальные являются навесами для пищеварения BsmBI.

Последовательность праймеров U6 5'-GACTATCATATGCTTACCGT-3'

Таблица 2: Последовательность промоторов U6 для валидации клонирования сгРНК. Чтобы проверить, насколько успешным является клонирование sgRNA, используйте последовательность промоторов U6 для секвенирования ДНК плазмиды DD-Cas9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Технология CRISPR/Cas9 произвела революцию в возможности функционального опроса геномов2. Однако инактивация генов часто приводит к летальности клеток, функциональному дефициту и дефектам развития, ограничивая полезность таких подходов для изучения функций генов7. Кроме того, конститутивная экспрессия Cas9 может привести к токсичности и генерации нецелевого воздействия6. Были разработаны различные подходы к временному управлению технологиями редактирования генома на основе CRISPR-Cas96. Эти системы основаны либо на транскрипционном контроле Cas9 и/или sgRNA, либо на посткрипционной и постпереводной активации Cas921,22,23. В качестве альтернативы этим системам мы разработали новый инструментарий, основанный на условной дестабилизации Cas9.

Критическим шагом в этом протоколе является разработка по крайней мере двух или трех sgRNA для конкретного гена, чтобы избежать нецелевого воздействия и облегчить эффективное редактирование генов. Шаг ограничения скорости представляет собой эффективное преобразование клеточной линии с вектором DD-Cas9. Качество лентивирусных частиц (высокие титры) зависит от клеток HEK-293T. Крайне важно использовать низкое число пассажа (до прохода 10) клеток HEK-293T, которые были должным образом поддержаны (разделены, когда они достигли 70% слияния, обычно два раза в неделю в соотношении 1:6). В качестве альтернативы можно использовать клеточную линию HEK-293 Lenti-X, которая была клонально выбрана для получения 30× более высоких вирусных титров, чем обычные клетки HEK-293T24. Другим важным шагом является оптимизация соотношения плазмиды DD-Cas9, упаковочной плазмиды psPAX2 и плазмиды оболочки pMD2.G. По нашему опыту, как объем, в котором готовится трансфекционная смесь с липофектамином, так и соотношение плазмид оказывают существенное влияние на эффективность трансфекции. Мы рекомендуем следовать шагам в нашем протоколе для достижения наилучших результатов. Следующим важным шагом для эффективного редактирования генов является оптимизация концентраций Shield-1. Мы рекомендуем конечную концентрацию 200 нМ, но для достижения наилучших результатов концентрация должна быть оптимизирована для конкретной трансдуцированной клеточной линии. Система DD/Shield-1 успешно используется в различных клеточных культурах, половых клетках, простейших Entamoeba histolytica,плоском черве Caenorhabditis elegans,трансгенных ксенотрансплантатах, трансгенных мышах и медака25. Одним из самых больших ограничений является высокая стоимость молекулы Shield-1, особенно при использовании в условиях in vivo. Кроме того, ранее было показано, что белки, которые нацелены на определенные клеточные компартменты, такие как митохондриальный матрикс или просвет эндоплазматического стикулума, могут быть стабилизированы или накоплены в отсутствие Shield-1. Это связано с тем, что разные белки имеют разные местные механизмы контроля качества белка26. В то время как слияния DD в цитоплазме или ядре могут быть очень эффективно деградированы в клетках млекопитающих и стабилизированы Shield-1, для преодоления ограничений, упомянутых выше, мы рекомендуем использовать альтернативный дестабилизирующее домен, полученный из бактериальной дигидрофолатредуктазы27. Эта система использует триметоприм в качестве связующей молекулы для стабилизации дестабилизирующего домена, а также является менее дорогой альтернативой Shield-127.

Помимо достижения транскрипции DD-Cas9 как его независимой экспрессии, преимуществами этого метода, по сравнению с другими индуцируемыми или условно контролируемыми инструментами редактирования генов CRISPR-Cas9, являются временное и условно контролируемое редактирование генов, меньший нецелевой эффект и более низкая токсичность клеток4,6,7,8. Эффективность и простота метода Shield-1/DD-Cas9 позволяют создавать различные инструменты, которые могут быть легко адаптированы и использованы в различных приложениях. Система может быть легко использована и в настройках in vivo, и было показано, что Shield-1 может эффективно проникать через кровеносно-мозговой барьер19,25,28,29. Хотя в этой статье описано использование технологии CRISPR-Cas9 для характеристики генов основных клеток, тот же подход может быть легко реализован для идентификации генов, необходимых для выживания или прогрессирования опухолей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим предыдущих сотрудников нашей лаборатории и ученого Серифа Сентурка за предыдущую работу. Мы благодарим Данило Сеговию за критическое прочтение этой рукописи. Это исследование было возможным и поддержано программой Swim Across America и Национального института рака Cancer Target Discovery and Development Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100mM DTT Thermosfisher
10X FastDigest buffer Thermosfisher B64
10X T4 Ligation Buffer NEB M0202S
colorimetric BCA kit Pierce 23225
DMEM, high glucose, glutaMax Thermo Fisher 10566024
FastAP Thermosfisher EF0654
FastDigest BsmBI Thermosfisher FD0454
Flag [M2] mouse mAb Sigma F1804-50UG
Genomic DNA extraction kit Macherey Nagel 740952.1
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S
oligonucleotides Sigma Aldrich
pMD2.G Addgene 12259
polybrene Sigma Aldrich TR-1003-G
psPAX2 Addgene 12260
QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit Qiagen 28506
secondary antibodies LICOR
Shield-1 Cheminpharma
Stbl3 competent bacterial cells Thermofisher C737303
SURVEYOR Mutation Detection Kit Transgenomic/IDT
T4 PNK NEB M0201S
Taq DNA Polymerase NEB M0273S
α-tubulin [DM1A] mouse mAb Millipore CP06-100UG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, New York, N.Y. 816-821 (2012).
  2. Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
  3. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
  4. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, New York, N.Y. 823-826 (2013).
  5. Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
  6. Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
  7. Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
  8. Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
  9. Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).
  10. Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
  11. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  12. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).
  13. Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
  14. Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
  15. Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
  16. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  17. Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
  18. Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
  19. Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370 (2017).
  20. McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).
  21. Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
  22. Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
  23. Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
  24. Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
  25. Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).
  27. Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
  28. Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).
  29. Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293 (2016).

Tags

Генетика Выпуск 175 Редактирование генов функциональные геномные исследования CRISPR Cas9 дестабилизирующее доменное индуцируемое
Новый инструментарий для оценки функций генов с использованием условной стабилизации Cas9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Šafarič Tepeš, P.,… More

Šafarič Tepeš, P., Sordella, R. A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization. J. Vis. Exp. (175), e60685, doi:10.3791/60685 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter