Summary
يوضح هذا البروتوكول التسجيل في الوقت الحقيقي لعلاقات الجرعة والاستجابة الكاملة لتنشيط GPCR الناجم عن الجرعة من طبقة خلية واحدة تزرع على قطب صغير واحد باستخدام قياسات مقاومة خالية من التسمية. يزيد نظام الدوس الجديد بشكل كبير من الإنتاجية دون فقدان في دقة الوقت.
Abstract
يتم استخدام الاختبارات المستندة إلى المعاوقة الخالية من الملصقات بشكل متزايد لدراسة تنشيط GPCR الناجم عن ligand غير الغازية في تجارب زراعة الخلايا. يوفر هذا النهج في الوقت الحقيقي رصد الخلية مع دقة الوقت التي تعتمد على الجهاز وصولا الى عدة عشرات من ميلي ثانية وأنه مؤتمتة للغاية. ومع ذلك، عندما ترتفع أعداد العينات (على سبيل المثال، دراسات الاستجابة للجرعة لمختلف الليغاندات المختلفة)، قد تصبح تكلفة صفائف الأقطاب الكهربائية التي يمكن التخلص منها وكذلك دقة الوقت المتاحة للتسجيلات المتسلسلة من قبل البئر محدودة. ولذلك ، فإننا نقدم هنا بروتوكول إضافة ناهض المسلسل الذي لديه القدرة على زيادة كبيرة في الناتج من تخفيضات GPCR خالية من التسمية. باستخدام بروتوكول إضافة الناضر التسلسلي ، يتم إضافة جهاز GPCR agonist بالتتابع في زيادة التركيزات إلى طبقة خلية واحدة مع مراقبة مقاومة العينة باستمرار (وضع الناضر). مع هذا النهج التسلسلي، فمن الممكن الآن لإنشاء منحنى الجرعة استجابة كاملة لGPCR الناقد من طبقة خلية واحدة فقط. ينطبق بروتوكول الإضافة المؤنّد التسلسلي على أنواع اقتران GPCR المختلفة ، Gq Gi/0 أوG s وهو متوافق مع مستويات التعبير المؤتلفة والذاتية للمستقبلات قيد الدراسة. مستقبلات منع من قبل خصوم GPCR هو تقييم كذلك (وضع الخصم).
Introduction
يقدم هذا التقرير وصفاً مفصلاً لبروتوكول الإضافة التسلسلية الذي تم تطويره للقياس الكمي لتنشيط مستقبلات البروتين المقترنة بالبروتين (GPCR) التي يسببها ليغاند (GPCR) في الخلايا المزروعة بالارتباط بواسطة قياسات المعاوقة الخالية من التسمية. وتشارك مستقبلات البروتين G مقرونة (GPCRs) في العديد من الوظائف الفسيولوجية والأمراض البشرية1. وبسبب هذا وسهولة الوصول إليها على سطح الخلية ، GPCRs هي واحدة من أهم أهداف المخدرات. وينعكس هذا التقييم في عدد يقدر بنحو 700 دواء معتمد يستهدف الـ GPCRs، أي ما يعادل حصة تبلغ ~ 35٪ على جميع الأدوية المسوقة2.
ويشمل استحداث عقاقير جديدة عمليتين رئيسيتين هما: '1' تحديد الجزيئات البيولوجية المستهدفة وتوصيفها الوظيفي، و'2' اكتشاف مواد الرصاص الجديدة وتطويرها لتصبح أدوية قابلة للإدارة. وفي كلتا العمليتين، يلزم استخدام أساليب فعالة لتقييم التفاعلات بين المخدِّرات والأهداف والاستجابة البيولوجية اللاحقة. مراحل مختلفة من عملية تطوير المخدرات قبل السريرية الاستفادة من أساليب مختلفة للتحليل تتراوح بين دراسات التفاعل الجزيئي الحيوي بين المخدرات والهدف، على الدراسات الوظيفية على الخلايا في الثقافة، إلى التجارب على مواد الأعضاء المستأصلة أو الحيوانات بأكملها. على حد سواء ، والأهمية الفسيولوجية والتعقيد البيولوجي زيادة من السابق إلى3الأخيرة. على الرغم من أن الهدف العام هو تقليل التجارب الحيوانية ، إلا أن الدراسات الدوائية باستخدام الأعضاء المعزولة من الحيوانات المختبرية أو حتى الحيوانات الكاملة تعتبر حتمية لتوصيف شامل للمرشحين الجدد للأدوية. من حيث القراءة التحليلية ، توفر دراسات علم أدوية الأعضاء استجابة وظيفية "شاملة" متكاملة ذات أهمية فسيولوجية أعلى. ومن عيوب هذه التجارب أنها لا تتوافق مع فحص الإنتاجية العالية لأسباب تقنية وأخلاقية، وقد تم استبدالها إلى حد كبير بدراسات تستند إلى ثقافة الخلية المختبرية4.
طرق لقياس تنشيط GPCR في ثقافات الخلايا تشمل مختلف الاختبارات الكيميائية القائمة على التسمية، والتي تكشف على وجه التحديد الرسل الثانية، وحالة الفوسفور من البروتينات الإشارات المصب، وتفعيل النسخ عبر عوامل النسخ معينة أو ligand الناجمة عن الاتجار مستقبلات داخل الخلايا4،5. ومن عيوب هذه المقالات المستندة إلى التسميات ضرورة تسمية الخلايا بأصباغ أو علامات مشعة قد تكون ضارة. وهذا غالباً ما يتطلب تشغيل المنقّأ كـ تحديد نقطة النهاية لوقت تعرض يجب أن يتم تحديده مسبقاً. إن استخدام اختبارات نقطة النهاية المستندة إلى التسميات يعاني من هذا التوقيت المحدود والمتحيز للغاية للتجربة وخطر أن التسميات الكيميائية والمسابير قد تتداخل مع فسيولوجيا الخلايا العادية - التي قد لا يلاحظها المجرب.
في السنوات الأخيرة ، ظهرت مقالات خالية من التسمية لرصد تنشيط GPCR ، مثل التقنيات القائمة على المعاوقة أو الأساليب البصرية التي تطبق صريف اتصال الرنانة5،6. ولا يشترط وضع علامات على الخلايا من الناحية التجريبية في هذه النُهج. كما هذه القراءة المادية تعمل على إشارات السعة المنخفضة، وتعتبر هذه الأساليب غير الغازية، فإنها تسمح للرصد المستمر الخلية يحتمل في الوقت الحقيقي ووقت المراقبة محدودة فقط من قبل ثقافة الخلية وليس من قبل القراءة. على غرار عمليات القراءة من أجهزة كاملة ، وعادة ما يقدم نهج خالية من التسمية على استجابات الخلايا الشاملة ، بعيدا المصب من تنشيط مستقبلات عندما التكامل على طول شبكة الإشارات بأكملها يؤدي إلى تغييرات تعتمد على الوقت ولكن بدلا غير محددة في مورفولوجيا الخلية أو إعادة توزيع الشامل. في حين أن الاختبارات المستندة إلى المعاوقة تقيس التوقيع العازل للتغيرات في شكل الخلية7،8، فإن القياسات التي تستخدم صريفات الموجات الرنانة حساسة للتغيرات في مؤشر الانكسار في واجهة الركيزة الخلوية الناشئة عن إعادة توزيع الكتلة الديناميكية (DMR)9. الطابع التكاملي يجعل أساليب خالية من التسمية حساسة للغاية للأحداث بوساطة مستقبلات بغض النظر عن نوع (ق) من البروتين G (Gس،Gi/0،Gs،G12/13)أو α-arrestin المشاركة في سلسلة الإشارات6 ومناسبة تماما لمستويات التعبير الذاتية من المستقبلات.
في معيار المعاوقة خالية من المعاوقة على أساس المعاوقة نمت الخلايا في لوحات متعددة الآبار مع أقطاب coplanar الذهب فيلم المودعة في الجزء السفلي من كل بئر10. وترتبط هذه الصفائف القطب إلى محلل المعاوقة ويتم تسجيل استجابات الخلية إلى التحفيز التجريبي من الآبار الفردية عن طريق قراءات المعاوقة حل الوقت. في مقاضد GPCR نموذجي يتم إضافة ligand في تركيزات مختلفة بشكل فردي لكل فرد بشكل جيد. ثم يتم تحليل التغييرات الناجمة عن ligand في مسار وقت المعاوقة فيما يتعلق بميزات المنحنى المميزة مثل الحد الأقصى لتغيير الإشارة ، والمساحة تحت المنحنى ، وتغيير الإشارة في غضون فترة زمنية معينة أو ميل المنحنى في نقطة زمنية محددة ، من أجل تحديد فعالية وفعالية ligand11.
قد تحد تكلفة صفائف الأقطاب الكهربائية من تطبيق هذه التقنية في حملات الفحص عالي الإنتاجية (HTS). وعلاوة على ذلك ، مع تزايد أعداد العينات التي يتعين اتباعها بالتوازي ، يزيد عدد القياسات الفردية وبالتالي يقلل من دقة الوقت المتاحة لكل بئر تدريجيا - حتى بالنسبة للتسجيلات المتعددة القنوات. في ظل هذه الظروف قد الاستجابات الخلية سريعة وعابرة الهروب من القياس. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أحد الأساليب التقليدية - نهج تركيز واحد يفرض عامل وقت وتكلفة كبير على التطورات المُطَلَّبة على الأجزاء أو الأجزاء على الشريحة فيما يتعلق بملاءمتها في تحليل تفاعل ligand-GPCR.
لهذا السبب، وضعنا بروتوكول الجرعات خطوة خطوة خطوة التي تمكن من تسجيل منحنيات الاستجابة الجرعة الكاملة من تنشيط GPCR الناجم عن ligand في أحادية الخلية المستزرعة عن طريق الرصد المستمر لمعاوقة بئر واحد في حين يتم زيادة تركيز ناهدي خطوة بخطوة. يزيد بروتوكول الإضافة المغطورية التسلسلي بشكل كبير من الإنتاجية لكل بئر من تركيز واحد إلى 10 تركيزات أو أكثر ، كما هو موضح في المثال الحالي لخلايا U-373 MG البشرية ، والتي تعبر بشكل داخلي عن مستقبلات الهيستامين 1 (H1R). وبالتالي، فإن الأسلوب لديه القدرة على تحسين الإنتاجية بشكل كبير في دراسات الاستجابة للجرعة الخالية من التسمية، في حين يتم الاحتفاظ بالدقة الزمنية في الحد الأقصى الفعال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. البذر الخلية على صفائف القطب الكهربائي
ملاحظة: اختيار تخطيط القطب الكهربائي هو مفاضلة بين الحساسية وعدد الخلايا قيد الدراسة. كلما كان القطب الكهربائي أصغر ، كلما كان القياس أكثر حساسية ، ولكن الأصغر هو عدد الخلايا قيد الدراسة. بالنسبة للخلايا التي تظهر تقلبات مقاومة قوية بمرور الوقت في ظل ظروف خط الأساس، يفضل وجود أقطاب كهربائية أكبر أو متداخلة.
- ما قبل الدفء جميع الحلول اللازمة لتمرير الخلايا القياسية والبذر في حمام مائي 37 درجة مئوية. للحصول على المقالات مع الإنسان U-373 MG الخلايا التي يستغرقها: الفوسفات احتياطية المالحة (PBS) دون الكالسيوم والمغنيسيوم, 0.05% (ث/v) التربسين, خلية ثقافة المتوسطة (النسر الحد الأدنى المتوسط الأساسي (EMEM) تستكمل مع 5% (v/v) مصل ربلة الساق الجنينية (FCS), 2 m M L-الجلوتامين و 100 ميكروغرام/mL penicillin/strepmy
- شطف طبقة الخلية من ثقافة الأسهم نمت على الجزء السفلي من قوارير الخلايا التقليدية أو الأطباق مع برنامج تلفزيوني مرتين.
- إزالة PBS، إضافة حل التربسين (1 مل ل25 سم2)والسماح للخلايا احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة (ينطبق على خلايا U-373 MG).
- السيطرة على انفصال كامل من الخلايا من الجزء السفلي من الركيزة النمو عن طريق المجهر.
- وقف تفاعل التربسين بمجرد فصل الخلايا تماما عن طريق إضافة 9 مل من وسط ثقافة الخلية لكل 1 مل من التربسين إلى تعليق الخلية. شطف بعناية الخلايا المتبقية من الجزء السفلي من الركيزة ثقافة الخلية عن طريق الأنابيب تعليق على الركيزة.
- جمع تعليق الخلية مع ماصة ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي (15 مل أو 50 مل أنبوب).
- قم بتدوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 110 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة supernatant بعناية وإعادة تعليق بيليه الخلية بدقة في وسط الثقافة قبل عد الخلايا (على سبيل المثال باستخدام مقياس الهيمنتو متر لمجاهر تباين المرحلة والعد اليدوي).
- ضبط تعليق الخلية إلى كثافة الخلية المطلوبة. للتجارب مع خلايا U-373 MG، استخدم 100 000 خلية/سم2 لزراعة طبقة خلية متشنجة في غضون 48 ساعة. وهذا يترجم إلى كثافة خلايا قدرها 000 200 خلية/مل لصفائف أقطاب كهربائية ذات 8 آبار تبلغ مساحتها 0.8 سم2 وحجم بئر قدره 400 ميكرولتر.
ملاحظة: بالنسبة لتجارب تنشيط GPCR القابلة للتكرار، يجب أن تزرع الخلايا لتقوم بطبقات أحادية متجانسة على صفائف الأقطاب الكهربائية. لضمان التعبير مستقبلات السليم على سطح الخلية, يجب أن تكون الخلايا بذر ما لا يقل عن 36 ساعة قبل إجراء التجربة. اختبار كثافات الخلايا المختلفة لبذر الخلايا غالبا ما تكون ذات مغزى لتحديد أفضل الظروف التجريبية. - إضافة تعليق الخلية إلى آبار مجموعة القطب وترك يبيع يستقر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 - 15 دقيقة من أجل ضمان توزيع متجانس من الخلايا في الجزء السفلي من الآبار.
- تنمو الخلايا لمدة 36 ساعة على الأقل في حاضنة ثقافة الخلايا القياسية مع 5٪ CO2 (تعتمد على نوع متوسط) في 37 درجة مئوية والغلاف الجوي المرطب. تغيير متوسط ثقافة الخلية 24 ساعة قبل التجربة.
- في يوم التجربة، تفقد طبقات الخلية على صفائف الأقطاب الكهربائية عن طريق المجهر (تباين المرحلة) لضمان التغطية الكاملة للأقطاب الكهربائية مع الخلايا.
2. توازن الخلايا في وسط خالية من المصل
- قبل الحارة المتوسطة خالية من المصل، في هذه الدراسة: وسيلة L15 Leibovitz.
- قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من الخلايا التي تزرع على صفائف الأقطاب الكهربائية واستبدلها بوسيط خالٍ من المصل تم تسخينه مسبقًا. استخدم 200 ميكرولتر لصفائف أقطاب كهربائية بتنسيق 8-well، و150 ميكرولتر لصفائف أقطاب كهربائية 96-well.
- السماح للخلايا equilibrate في وسط خالية من المصل في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل. يعتمد وقت المعادلة بشدة على نوع الخلية. على سبيل المثال، خلايا U-373 MG تحتاج إلى 2 ساعة، خلايا CHO تحتاج إلى 4 ساعة، BAEC قد تتطلب التوازن بين عشية وضحاها في المتوسط L-15.
ملاحظة: L-15 المتوسطة هو CO2 مستقلة ويتطلب ثاني أكسيد الكربون2خالية من الغلاف الجوي. للتوازن في L-15 تعيين الحاضنة إلى 0 ٪ CO2. يمكن رصد التوازن عن طريق قراءات المعاوقة ، والتي نوصي بالقيام بها للتجارب الأولى.
3- رصد توازن الخلايا مع قراءات المعاوقة
- ضع صفيف القطب الكهربائي في حامل الصفيف المتصل لمحلل المعاوقة.
- ضمان الاتصال منخفضة المعاوقة السليم بين الأقطاب الكهربائية ومحلل المعاوقة. هذا الاختيار يختلف بشكل فردي عن الأدوات المختلفة.
ملاحظة: إذا فشل الصك لإجراء اتصال إلى الأقطاب الكهربائية، افتح المشبك الاتصال مرة أخرى، إعادة تعديل صفيف القطب لتحديد المواقع المناسبة داخل حامل وإعادة المحاولة. - حدد نوع القطب و / أو تنسيق متعدد الآبار من واجهة المستخدم للبرنامج.
- إعداد معلمات القياس. تتوفر خيارات مختلفة.
ملاحظة: لتحديد تردد التيار المتردد الأكثر حساسية، نشير إلى أدلة الأدب والصك لأنه يعتمد على تخطيط القطب الكهربائي ونوع الخلية قيد الدراسة. عادة، يكون تردد الاستشعار في حدود 4 كيلو هرتز – 50 كيلو هرتز. هنا، نمت خلايا U-373 MG على أقطاب كهربائية تعمل دائرية قطرها 250 ميكرومتر وتم رصدها بتردد AC 12 كيلو هرتز.- في حالة توفر أوضاع الحصول على بيانات التردد الواحد والمتعدد، حدد وضع التردد الواحد لضمان أقصى دقة للوقت. سيتم إجراء القياس على هذا التردد الوحيد. بالنسبة للأجهزة الأكثر انتشارًا ، هناك عدد من الترددات المحددة مسبقًا على طول نافذة التردد المتاحة.
- إذا كان عدد الآبار قيد الدراسة منخفضًا أو لم يكن دقة الوقت حرجًا، فحدد تسجيلات تكرار متعددة بدلاً من ذلك. سيتم تسجيل قراءات المعاوقة في عدد محدد من الترددات لكل بئر للتحليل المتعمق في وقت لاحق.
ملاحظة: انخفاض دقة الوقت مع زيادة عدد الترددات المسجلة لكل بئر وزيادة عدد الآبار. تختلف خيارات تحديد وضع التردد واكتساب البيانات باختلاف نوع الجهاز وإصداره.
- ابدأ في الحصول على بيانات المقرر الدراسي الزمني.
- اتبع مقاومة طبقة الخلية (على الأقل 2 ساعة) حتى استقرت المعاوقة. في غضون ذلك، إعداد الحلول الأعنف.
- عندما وصلت طبقات الخلية إلى مستوى مقاومة مستقر، إما (1) انتقل إلى إضافة الناضر التسلسلي ضمن نفس التجربة أو (2) إنهاء اكتساب البيانات وبدء مجموعة بيانات جديدة لرصد تنشيط المستقبلات الناجمة عن الآضوّاد.
4. إعداد حلول الآفنيست للتجارب في وضع الآفنيست
- حساب تركيز المحاليل الناضر ة حسب الحاجة لكل خطوة من الدوس التسلسلي وفقا للمعادلة (1). n يتراوح من 1 إلى العدد الإجمالي للإضافات التسلسلية i. x يدل على التركيز والحجم في البئر عند الخطوة n. y يدل على تركيز وحجم "الحل الذي يجب إضافته" في الخطوة n.
ملاحظة: خذ بعين الاعتبار عدد النسخ المتماثلة وحساب الحجم الإجمالي "الحل الذي يجب إضافته" لكل خطوة تركيز. يتم إعطاء نتائج عملية حسابية نموذجية في الجداول 1-4. يتطلب الأمر فكرة عامة حول نطاق التركيز الواضور ليتم دراسته اما المدى فيحدد التركيزات وعدد الأجزاء التي يجب أن تدار خلال الجمع التسلسلي. باستخدام بروتوكول إضافة الناضر التسلسلي يتم زيادة تركيز الناضر خطوة بخطوة. لذلك ، يجب أن تؤخذ في الاعتبار كمية الناضر الموجودة بالفعل في البئر عند إضافة الجرعة التالية. عندما يكون عدد الجزيئات الناضية الموجودة بالفعل في البئر هو nx = cx X X(مع التركيز الحالي cx والحجم Vx) وعدد الجزيئات في البئر بعد الإضافة التالية هو nx +y، يتم تحديد عدد الجزيئات التي سيتم إضافتها ny بواسطة تركيز cy والحجم Vy من الحل الذي سيتم تطبيقه على البئر (ny = cy yy). After adding a portion of agonist, the new amount of agonist molecules in the well is: cx+y ∙ Vx+y = cx ∙ Vx + cy ∙ Vy. ينطبق هذا الحساب على كل خطوة لاحقة. بسبب الترابط بين تركيز الآفنيست في البئر وكمية الناضر في الأجزاء التي سيتم إضافتها مع كل خطوة ، من المهم تحديد التركيزات النهائية بعد كل خطوة مقدما.
الوضع 1: سوف يزيد حجم في البئر مع كل خطوة كما يتم إضافة السائل باستمرار.
باستخدام هذا الوضع وشكل 8-well، استخدم Vx1 = 200 ميكرولتر وVy1 .... Vyi = 30 ميكرولتر.
طريقة 2: وحدة التخزين في البئر ثابت كما تتم إزالة وحدة التخزين المضافة مع كل خطوة قبل الإضافة اللاحقة.
باستخدام هذا الوضع وشكل 96-well، استخدم Vx1 = 150 ميكرولتر وVy1 .... Vyi = 75 ميكرولتر.
- طباعة ورقة البيانات مع الحجم الإجمالي لكل تركيز وتعليمات مفصلة لpipetting.
- إعداد جميع الحلول بالمبلغ المطلوب. جعل جميع الحلول الهامدة في نفس وسط خالية من المصل كما تستخدم لتوازن الخلايا.
تنبيه: يعتبر هيدروكلوريد الهيستامين خطيرًا بموجب معيار التواصل الخطر OSHA 2012 (29 CFR 1910.1200). الهستامين يسبب تهيج الجلد، تهيج العين خطيرة، قد يسبب حساسية الجلد، حساسية، أعراض الربو أو صعوبات في التنفس إذا استنشاقه، ويمكن أن يسبب تهيج الجهاز التنفسي. يرجى النظر في ورقة بيانات السلامة.
ملاحظة: جعل الحلول الهاوناً طازجة قدر الإمكان. استقرار ناهضين في الحل قد تختلف اختلافا كبيرا. تخزين الحلول عند 4 درجات مئوية أو أقل حتى استخدامها في التجربة. بالنسبة لبعض الجزيئات يمكن اعتبار إضافات استقرار إضافية ، مثل BSA عند استخدام الجزيئات المستندة إلى الببتيد أو الدهون ، لمنع الامتزاز إلى جدران الآبار والأنابيب. - إذا كان تنفيذ التجربة في شكل 96 جيدا، ونقل الحلول إلى لوحة 96-جيدا التقليدية (لا أقطاب كهربائية) واستخدام أنبوب قناة 8-(أو 12-) لنقل السائل السريع إلى صفيف القطب.
5. إعداد حلول نافنيست للتجربة في وضع الخصم
ملاحظة: إعداد حل (ق) خصم مع التركيز ليتم تطبيقها في جميع أنحاء. حجم وتركيز حل الخصم تعتمد على وضع إضافة الناضر (1 أو 2). أمثلة للتجارب في شكل 8-well أو 96-well في طريقة الإضافة 2: (A) تنسيق 8-well (V x1 = 200 ميكرولتر، V Antagonist = 200 ميكرولتر)؛ (أ) تنسيق 8 آبار (V x1 = 200 ميكرولتر، V Antagonist = 200 ميكرولتر)؛ (أ) تنسيق 8 آبار (V x1 = 200 ميكرولتر، V Antagonist = 200 ميكرولتر)؛ (أ) تنسيق 8 آبار (V x1 = 200 ميكرولتر، V Antagonist = 200 ميكرولتر)؛ (أ) تنسيق 8 آبار (Vx1 = 200 ميكرولتر، VAntagonist = (ب) تنسيق 96 بئر (Vx1 = 150 ميكرولتر، VAntagonist = 75 ميكرولتر).
- حساب تركيز كل حل ناضر اللازمة لكل خطوة من الدوس التسلسلي كما هو موضح في الخطوة 4.1.
- جعل جميع الحلول الهامدة في نفس وسط خالية من المصل كما تستخدم لتوازن الخلايا وإضافة الخصم في نفس التركيز النهائي كما هو مخطط للآبار المعنية في التجربة.
ملاحظة: في هذه الحالة يتم إعداد حل مخزون الهيستامين (10 مM) في L-15 المتوسطة. عندما يتم حل ناهضات في المذيبات الأخرى (على سبيل المثال، ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO)، والإيثانول) ينبغي إدراج عنصر تحكم المذيبات لحساب الحمل المتزايد المذيبات مع كل خطوة من الإضافة.
6. تنفيذ بروتوكول الإضافة التسلسلية في وضع الآفنيست
- ابدأ الحصول على البيانات كما هو موضح في الخطوات 3.1 - 3.5.
- ما قبل تسخين حلول الناضر قبل استخدامها عن طريق وضعها في الحاضنة حوالي 10 - 15 دقيقة قبل الإضافة.
ملاحظة: عند استخدام المواد الحرارية لابيل، لا ينبغي أن تبقى الحلول في 37 درجة مئوية لفترة طويلة جدا. إذا كان ما قبل الاحترار لمدة 10 - 15 دقيقة تعتبر حاسمة، وجلب الحلول إلى 37 درجة مئوية قبل وقت قصير من إضافة في حمام مائي. - تشغيل التصيد التسلسلي الأعنف تعتمد على وضع الإضافة المحددة. اتباع الوضع 1 يزيد الحجم الإجمالي في البئر مع كل إضافة للجرعة التالية. في الوضع 2 تتم إزالة نفس الحجم الذي يضاف مع كل خطوة أيضا مرة أخرى فقط قبل إضافة الجرعة العليا القادمة.
ملاحظة: يعتمد الوقت اللازم لتوازن طبقة الخلية بين جرعتين من الجرعات اللاحقة للاعَد على وقت استجابة الخلايا. وتكشف تجربة أولية في وضع مواز (بئر واحد - تركيز واحد) عن (1) أوقات استجابة الخلايا لتركيزات مختلفة من النهاد و(2) معلمة المنحنى الأكثر حساسية (على سبيل المثال، الحد الأقصى للمعاوقة، والمعاوقة بعد الوقت العاشر).
ج: تنسيق الوضع 1 / 8-well
- أضف 30 ميكرولتر من المحلول الأول بأقل تركيز للناضون إلى الخلايا التي تم معادلة 200 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل.
- دع الخلايا تستجيب وتوازنها للفترة الزمنية المحددة مسبقًا (على سبيل المثال، 15 دقيقة).
- أضف 30 ميكرولتر من المحلول الثاني مع التركيز العالي التالي.
- كرر الخطوات 6.3.1-6.3.3 مع الحل الثالث والرابع وهكذا، الناقد.
ملاحظة: سيؤدي العمل بخطوات تركيز 10 إلى حجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر في نهاية التجربة، وهو أقل بقليل من الحد الأقصى للحجم المطبق لهذه الآبار البالغ ~ 550 ميكرولتر.
B: وضع 2 / 96-جيد تنسيق
ملاحظة: إيقاف الحصول على البيانات مؤقتًا أثناء كل خطوة مناولة سائلة (إضافة/إزالة) عبر برنامج أداة المعاوقة عند تشغيل التجارب بتنسيق 96-well. قد تتداخل معالجة السوائل الأكثر تفصيلاً مع الحصول على البيانات. استخدام ماصة متعددة القنوات.
- إيقاف الحصول على البيانات مؤقتًا.
- أضف 75 ميكرولتر من المحلول الأول بأقل تركيز للناضون إلى الخلايا التي تم توازنها في 150 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل.
- استئناف الحصول على البيانات.
- دع الخلايا تستجيب وتوازنها للفترة الزمنية المحددة مسبقًا (على سبيل المثال، 15 دقيقة).
- حوالي 1 - 2 دقيقة قبل انتهاء وقت المعادلة العادية ، إيقاف القياس وإزالة 75 ميكرولتر من كل بئر.
ملاحظة: تعتمد النقطة الزمنية التي يجب إزالة الحل عندها على عدد الآبار التي يتم مراقبتها بالتوازي وسرعة الأنابيب. وينبغي ألا يتجاوز الوقت اللازم لإزالة الحلول الوقت الفاصل بين الخطوات اللاحقة. - أضف 75 ميكرولتر من المحلول الثاني مع التركيز الأعلى التالي واستأنف القياس.
- كرر الخطوات 6.3.8-6.3.10 مع الحل الثالث والرابع وهكذا، الناقد.
7. تنفيذ بروتوكول الإضافة التسلسلية في وضع الخصم
- بدء القياس كما هو موضح في الخطوات 3.1 - 3.5.
- أثناء توازن طبقات الخلية، قم بإعداد محلول خصم (على سبيل المثال، 200 ميكرولتر من هيدروكلوريد ديفينهيدرامين 1.5 ميكرومتر في المتوسط L15).
تنبيه: هيدروكلوريد ديفينهيدرامين له آثار صحية حادة محتملة. ومن الضار إذا ابتلع أو استنشاقه، قد يسبب تهيج العين والجلد. قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي والجهاز الهضمي. يرجى النظر في ورقة بيانات السلامة. - قبل تسخين الخصم والحلول الناضر عن طريق وضعها في الحاضنة حوالي 10 - 15 دقيقة قبل إضافة إلى ثقافات الخلية (راجع 6.2). إذا تم تضمين الآبار الخالية من الخصوم في النسخة المجانية أيضًا ، أيضًا وسيطًا خاليًا من المصل مسبقًا.
- إضافة حل الخصم إلى الآبار المعينة. اسمحوا الخلايا equilibrate مع خصم لمدة 15 - 20 دقيقة. إذا تم تضمين الآبار الخالية من الخصوم، فأضف نفس الحجم من الوسائط الخالية من المصل إلى هذه الآبار.
- وفقا لخصم إضافة في وضع 2، إزالة الحل من الآبار
(أ) تنسيق 8 آبار (200 ميكرولتر)
(ب) شكل 96 بئراً (75 ميكرولتر) - تشغيل تسلسل الإضافة الآضوية كما هو موضح في الخطوة 6.3.
8 - تصدير البيانات وتحليلها
- تصدير البيانات باستخدام برنامج أداة المعاوقة من أجل تحويل جميع البيانات المسجلة من الملكية إلى أشكال بيانات مشتركة (على سبيل المثال، CSV). تسمح هذه الخطوة بإعادة تنظيم البيانات وعرضها التقديمي مع حزم البرامج الأخرى.
- تحميل البيانات بتنسيق CSV إلى برنامج تحليل البيانات العلمية.
- تطبيع قيم المعاوقة عن طريق طرح مقاومة نقطة البيانات الأخيرة قبل الإضافة الأولى للحل الناضر وعن طريق تعيين وقت الإضافة إلى t = 0. رسم مسار الوقت من المقاومة تطبيع.
- رسم دورات الوقت الفردية وتحديد ماكسيما في المعاوقة بعد كل خطوة إضافة. إنشاء ورقة بيانات بهذه القيم.
- رسم قيم الحد الأقصى (أو الحد الأدنى، إن وجد) التغييرات المعاوقة كدالة تركيز المؤن. ويمكن القيام بذلك للآبار الفردية أو للمتوسطات (متوسط ± SD).
- استخدم روتين تركيب البيانات لتحديد التركيزات الفعالة نصف القصوى (EC50)والاستجابة القصوى (EMax)باستخدام النموذج اللوجستي للمعلمة الأربعة (المعادلة 2):
ملاحظة: ج يشير إلى تركيز الأعنف، A1 هو الحد الأدنى وA2 هو الحد الأقصى لمنحنى الجرعة والاستجابة السينية(A2 = EMax). EC50 هو التركيز عند نقطة انقلاب المنحنى، وn يتوافق مع ميل التل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر مخطط نموذجي لإعداد مختلف الحلول الناضعة لتجربة باستخدام صفائف أقطاب كهربائية 8-well مع الهستامين كما في الجداول 1-4. الجدول 1 والجدول 2 يقدمان أحجاماً وتركيزات لتجربة باستخدام طريقة الإضافة 1 (انظر الشكل 1)،في حين يقدم الجدول 3 والجدول 4 الأحجام والتركيزات الحالية للتجربة التي تتبع طريقة الإضافة 2 (راجع الشكل 1). تم حساب البيانات باستخدام المعادلة (1).
تظهر تجربة تمثيلية في الشكل 2 للطبقات المُلَكَّمة من خلايا U-373 MG، التي تعبر عن مستقبلات الهستامين 1، التي تزرع على مجموعة أقطاب كهربائية ذات 8 آبار مع قطب كهربائي يعمل بقطر 250 ميكرومتر باستخدام الهستامين كناض. وقد أُجري القياس بتردد واحد قدره 12 كيلوهرتز. تم تنفيذ إضافة سلسلة تركيز الآفنيست باتباع الوضع 1. في التجربة المختارة 10 حلول مع زيادة تركيز الهستامين (أعدت وفقا للخطوة 4) أضيفت بالتسلسل كل 15 دقيقة(الشكل 2A). تم تطبيق مخطط الدوس التسلسلي على سبعة من ثمانية آبار. في واحدة جيدا الخالية من الانضاج المتوسطة (L-15) تمت إضافتها بالتتابع كسيطرة سلبية في تسع من عشر خطوات. وكانت آخر إضافة إلى هذه السيطرة محلول الهيستامين الذي يوفر تركيزًا نهائيًا قدره 100 ميكرومتر هيستامين في البئر. تم رسم البيانات باستخدام برنامج تحليل البيانات وتظهر كتغير في المعاوقة Z| 12 كيلو هرتز / كيلوهرتز على طول التجربة ، مع تغيير المعاوقة ونقطة زمنية للإضافة الأولى التي يتم تعيينها إلى الصفر. لا يظهر وقت المعادلة الأولي في المخزن المؤقت التجريبي لـ 2 h في هذه المؤامرة. يشار إلى النقاط الزمنية للإضافة الناضر بواسطة الأسهم.
تم استخراج التغير في المعاوقة بالنسبة إلى خط الأساس بعد استخراج كل خطوة تركيز من المنحنيات باستخدام مؤشر بيانات. في الخطوات بدون حد أقصى واضح، تم استخدام نقطة البيانات الأخيرة قبل الإضافة التالية للتحليل. المعوقة تتغير | Z| تم رسم 12 كيلو هرتز كدالة لتركيز الهيستامين (cx+y)(الشكل 2B، الرموز). تم تركيب وظيفة نقل نموذج لوجستي معلمي أربعة (راجع الخطوة 8.6) إلى نقاط البيانات التجريبية من سبعة آبار(الشكل 2B، خطوط). تظهر النتائج الملائمة في الجدول 5. الشكل 2C والشكل 2D تظهر نتيجة متوسط البيانات في الشكل 2ألف والشكل 2باء، وتقديم متوسط ± SD لسبع آبار. يتم تلخيص متوسط بيانات الدورة الزمنية في الشكل 2C، في حين يتم توفير منحنى الجرعة الاستجابة المتوسط في الشكل 2D.
في علاقات الجرعة والاستجابة كما هو موضح في الشكل 2B, D، تم تطبيق إجراء التركيب على نطاق التركيز بأكمله العائد EC50 = (0.86 ± 0.13) ميكرومتر. تزيد استجابة المعاوقة بشكل رتيب مع زيادة تركيز الهيستامين باستثناء خطوتي التركيز الأخيرتين (30 ميكرومتر، 100 ميكرومتر تركيز نهائي). ويفترض أن يتم تفسير هذه الاستجابة عن طريق خفض تنظيم مستقبلات الهستامين، وإزالة الحساسية أو التحفيز المفرط للخلايا (انظر المناقشة). ولحساب هذا التأثير، تم تخفيض نطاق البيانات للتحليل، كما هو مبين في تجربة واحدة للدوس التسلسلي(الشكل 3؛وأيضا1) تم اختيارها من البيانات الموضحة في الشكل 2. وعلاوة على ذلك، فإن وضع الـ asymptote السفلي(A1)إلى الصفر خلال التحسين المربع الأقل افتراض عدم وجود تغيير في المعاوقة استجابة لـ 0 ميكرومتر له ما يبرره. تطبيق هذا التحسين المعلمة الثلاثة يوفرEC 50 من (0.75 ± 0.12) ميكرومتر (راجع، الشكل 3B). ووجد أن قيم EC50 غير حساسة لأي من أوضاع تحليل البيانات ولم تكن مختلفة بشكل كبير.
يتم تلخيص النتائج النموذجية لتجربة لوحة 96-well في الشكل 4. تم زراعة خلايا U-373 MG على صفائف أقطاب كهربائية 96 بئرًا كما هو موضح أعلاه. وشمل القياس 32 بئرا. 8 آبار بمثابة الضوابط خالية من الآضوين، تتعرض للوسط فقط. 24 بئراً تعرضت لسلسلة من تركيزات الهيستامين المتزايدة محسوبة ومعدة لطريقة الإضافة 2. يظهر المسار الزمني لتغيير المعاوقة لجميع الآبار الفردية 32 في الشكل 4A. واحد من المنحنيات (أبرز باللون الأحمر) يظهر مسار زمني غير عادي وتم استبعاده من مزيد من التحليل. وبناء على ذلك، تم متوسط البيانات من 23 بئرا ورسمها كمسار زمني لمتوسط التغير في المعاوقة (المتوسط ± SD) في الشكل 4باء. تم تحليل كل منحنى فردي كما هو موضح أعلاه للعلاقة بين الجرعة والاستجابة. تم حساب متوسط نقاط البيانات ورسمها كدالة لتركيز الهستامين النهائي(الشكل 4C). وتم تحليل بيانات الاستجابة للجرعة عن طريق النموذج اللوجستي للمعلمة الأربعة، الذي أعاد متوسط قيمةEC 50 قدره (1.0 ± 0.3) ميكرومتر.
تظهر نتيجة نموذجية لبروتوكول الإضافة الناضر التسلسلي في وضع الخصم في الشكل 5. هنا ، تم معالجة بئر واحد مسبقًا مع 0.75 ميكرومتر من خصم مستقبلات الهيستامين ديفينهيدرامين (منحنى أحمر) 20 دقيقة قبل إضافة الهستامين الأول(الشكل 5A). تلقى عنصر التحكم وسيطًا خاليًا من الخصوم (منحنى أزرق). تمت إضافة الخصم بعد الوضع 2، مما يعني أنه تمت إزالة 200 ميكرولتر من 400 ميكرولتر أخيرًا قبل تطبيق سلسلة الآفنيست. تمت إضافة الناضر (الهستامين) بعد وضع الدوس التسلسلي 1 كما هو موضح في الأمثلة أعلاه. من المهم للتجارب في وضع الخصم أن يتم الاحتفاظ تركيز الخصم ثابتًا طوال الوقت الذي تم فيه إجراء التجربة. وبناء على ذلك، فإن جميع الحلول الناضوية المضافة إلى البئر يجب أن تحتوي أيضاً على تركيز خصم محدد مسبقاً (في هذه الحالة، 0.75 ميكرومتر)، في حين أن التحكم لا يزال خالياً من الخصوم. يصبح التأثير العدائي واضحًا من خلال زيادة "متأخرة" للمعاوقة داخل مخطط الجرعات التسلسلية المقابلة لتركيزات الناضر الأعلى اللازمة للحث على استجابة الخلية. في العلاقة بين الجرعة والاستجابة يتم التعبير عن تأثير الخصم كتحول يميني للمنحنيات ، والذي يتوافق مع زيادة في EC50، شريطة أن يكون الخصم هو ليغاند تنافسي بالنسبة إلى الناضر(الشكل 5B). تم تحديد EC50 إلى (0.92 ± 0.05) ميكرومتر في حالة عدم وجود الخصم و (14.7 ± 0.6) ميكرومتر في وجوده.
الشكل 1: أوضاع إضافة القدّم التسلسلي. (أ)التخطيطي يوضح حسابات التركيز. بإضافة محلول أقدين للتركيز جy والحجم Vy إلى بئر مع حجم Vx وتركيز نادوست cx، يزيد الحجم إلى V x+ y ويزيد التركيز إلى c x+ y. (B)وضعين مختلفين للإضافة إلى الناضر التسلسلي. الأسلوب 1: يزيد الحجم الإجمالي في البئر Vx+y مع كل إضافة. الطريقة 2: تتم إزالة الحجم المضاف في كل خطوة تركيز مرة أخرى قبل إضافة الجرعة التالية ، مما يحافظ على الحجم الإجمالي في ثابت البئر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نتائج تجربة نموذجية في شكل 8-well. (أ)مسار الوقت لتغيير المعاوقة في 12 كيلو هرتز لطبقات الخلية U-373 MG المتآكلة نمت على أقطاب العمل الدائرية من قطر 250 ميكرومتر. في سبعة من ثمانية آبار تم تطبيق إضافة المسلسل من الهستامين. تم تحميل بئر واحد (منحنى رمادي) بالتتابع مع المخزن المؤقت الخالي من الهستامين في كل خطوة (الوضع 1)، باستثناء الخطوة الأخيرة عندما تمت إضافة 100 ميكرومتر الهستامين كتحكم إيجابي. (ب)العلاقات بين الجرعة والاستجابة الناتجة عن التغير الأقصى للمعاوقة بالنسبة إلى خط الأساس لسبعة آبار فردية بعد كل خطوة تركيز. (C)متوسط الوقت بالطبع من تغيير المعاوقة (متوسط ± SD) ولدت من سبعة آبار فردية كما هو مبين في(A). (D)متوسط علاقات الجرعة والاستجابة الناتجة عن مجموعات البيانات الفردية كما هو موضح في(B). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تكييف أوضاع تحليل البيانات. (أ)مسار زمني نموذجي لتغيير المعاوقة عند 12 كيلو هرتز لطبقة خلية واحدة متشنجة U-373 MG تزرع على أقطاب العمل الدائرية التي يبلغ قطرها 250 ميكرومترًا. (ب)علاقة الجرعة والاستجابة التجريبية (الرموز المعبأة) الناتجة عن التغير الأقصى للمعاوقة بالنسبة لخط الأساس بعد كل زيادة في التركيز. إما أن مجموعة البيانات الكاملة خضعت لإجراء التركيب (منحنى أسود ورمادي) أو تم حذف آخر نقطة بيانات - تشير إلى بداية إزالة الحساسية و/ أو الاستيعاب الداخلي - من التحليل الكمي (منحنى أحمر وأرجواني). تم تعديل جميع المعلمات الأربعة أثناء التحسين المربع الأقل (منحنى أسود وأحمر) أو تم تعيين المعلمة A1 ، التي تمثل المتقارب السفلي ، وثابتة إلى الصفر (منحنى رمادي وأرجواني). ولم تختلف قيم EC50 اختلافا كبيرا بالنسبة لأوضاع تحليل البيانات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تجربة نموذجية في شكل 96-well. (أ)مسار الوقت من تغيير المعاوقة تقاس في 12 كيلو هرتز لconfluent U-373 MG طبقات الخلية نمت على مجموعة القطب 96 جيدا. وترد بيانات عن 32 بئرا. 24 الآبار تعرضت لسلسلة من تركيزات الهستامين المتزايدة المضافة مع وقت التوازن من 15 دقيقة بين كل خطوة. تم استبعاد المنحنى الذي تم تمييزه باللون الأحمر من المتوسط. وعولجت ثمانية آبار (مراقبة) بوسيط خال من الهستامين في كل نقطة من نقاط الإضافة. (ب)مسار الوقت من متوسط التغير المعاوقة ل23 الآبار الفردية استجابة لإضافة المسلسل الهستامين وثمانية آبار التحكم كما هو مبين في (أ). (ج)متوسط علاقة الجرعة والاستجابة الناتجة عن التغير الأقصى للمعاوقة بالنسبة إلى خط الأساس بعد كل زيادة في التركيز (متوسط ± SD). وزودت البيانات بوظيفة لوجستية للبارامترات الأربعة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تجربة نموذجية في وضع الخصم. (أ)مسار الوقت من تغيير المعاوقة في 12 كيلو هرتز لconfluent U-373 MG طبقات الخلية نمت على أقطاب العمل الدائرية من قطر 250 ميكرومتر عند إضافة تركيزات متزايدة من الهستامين مع أو بدون وجود مستقبلات الهستامين خصم ديفينهيدرامين. تمت إضافة ديفينهيدرامين (0.75 ميكرومتر) أو وسيط خالي من الخصوم (L15) قبل 20 دقيقة من بدء الدوس التسلسلي الواضور. (ب)العلاقات بين الجرعة والاستجابة الناتجة عن التغير الأقصى للمعاوقة بالنسبة لخط الأساس بعد كل زيادة في التركيز من البيانات الموضحة في (أ). وجود 0.75 ميكرومتر ديفينهيدرامين زاد EC50 من (0.92 ± 0.05) ميكرومتر إلى (14.7 ± 0.6) ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| حل # | جx+y (μM) | جس (ميكرومتر) | Vx (μL) | Vx+y (μL) | Vy (μL) | جy (μM) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 230 | 30 | 0.08 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 230 | 260 | 30 | 0.79 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 260 | 290 | 30 | 2.03 |
| 4 | 1 | 0.3 | 290 | 320 | 30 | 7.77 |
| 5 | 3 | 1 | 320 | 350 | 30 | 24.33 |
| 6 | 10 | 3 | 350 | 380 | 30 | 91.67 |
| 7 | 30 | 10 | 380 | 410 | 30 | 283.33 |
| 8 | 100 | 30 | 410 | 440 | 30 | 1056.67 |
الجدول 1: مخطط حساب التركيز للتجارب التي تستخدم صفائف أقطاب كهربائية من 8 آبار باتباع وضع الإضافة 1.
| حل # | جy (μM) | Vy (μL) | جعل من | ج (ميكرومتر) | عامل التخفيف | جعل مجموع V (μl) | استخدام (μl) | إضافة V (μl) |
| 1 | 0.08 | 30 | 3 | 2.03 | 26.52 | 600 | 22.6 | 577.4 |
| 2 | 0.79 | 30 | 4 | 7.77 | 9.83 | 600 | 61 | 539 |
| 3 | 2.03 | 30 | 5 | 24.33 | 11.97 | 600 | 50.1 | 549.9 |
| 4 | 7.77 | 30 | 6 | 91.67 | 11.8 | 600 | 50.8 | 549.2 |
| 5 | 24.33 | 30 | 7 | 283.33 | 11.64 | 600 | 51.5 | 548.5 |
| 6 | 91.67 | 30 | 8 | 1056.67 | 11.53 | 600 | 52.1 | 547.9 |
| 7 | 283.33 | 30 | 8 | 1056.67 | 3.73 | 600 | 160.9 | 439.1 |
| 8 | 1056.67 | 30 | 10 مM الأسهم | 10000 | 9.46 | 800 | 84.5 | 715.5 |
الجدول 2: مخطط الأنابيب للتجارب باستخدام صفائف أقطاب كهربائية من 8 آبار تتبع وضع الإضافة 1.
| حل # | جx+y (μM) | جس (ميكرومتر) | Vx (μL) | Vx+y (μL) | Vy (μL) | جy (μM) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 400 | 200 | 0.02 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 200 | 400 | 200 | 0.19 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 200 | 400 | 200 | 0.5 |
| 4 | 1 | 0.3 | 200 | 400 | 200 | 1.7 |
| 5 | 3 | 1 | 200 | 400 | 200 | 5 |
| 6 | 10 | 3 | 200 | 400 | 200 | 17 |
| 7 | 30 | 10 | 200 | 400 | 200 | 50 |
| 8 | 100 | 30 | 200 | 400 | 200 | 170 |
الجدول 3: مخطط حساب التركيز للتجارب التي تستخدم صفائف أقطاب كهربائية من 8 آبار باتباع وضع الإضافة 2.
| حل # | جy (μM) | Vy (μL) | جعل من | ج (ميكرومتر) | عامل التخفيف | جعل مجموع V (μl) | استخدام (μl) | إضافة V (μl) |
| 1 | 0.02 | 200 | 3 | 0.5 | 25 | 1000 | 40 | 960 |
| 2 | 0.19 | 200 | 4 | 1.7 | 8.95 | 1000 | 111.8 | 888.2 |
| 3 | 0.5 | 200 | 5 | 5 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 4 | 1.7 | 200 | 6 | 17 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 5 | 5 | 200 | 7 | 50 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 6 | 17 | 200 | 8 | 170 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 7 | 50 | 200 | 8 | 170 | 3.4 | 1000 | 294.1 | 705.9 |
| 8 | 170 | 200 | مخزون 200 ميكرومتر | 200 | 1.18 | 1300 | 1105 | 195 |
الجدول 4: مخطط الأنابيب للتجارب باستخدام صفائف أقطاب كهربائية من 8 آبار تتبع وضع الإضافة 2.
| حسنا | EC50 | Eماكس (= A2) | أ1 | ن |
| (ميكرومتر) | (كيلووات) | (Ο) | ||
| 1 | 0.9 ± 0.1 | 1680 ± 70 | 150 ± 80 | 1.9 ± 0.5 |
| 2 | 0.7 ± 0.2 | 1770 ± 90 | 200 ± 140 | 1.3 ± 0.4 |
| 3 | 0.6 ± 0.2 | 1700 ± 100 | 60 ± 250 | 1.1 ± 0.5 |
| 4 | 0.6 ± 0.2 | 2000 ± 100 | 140 ± 180 | 1.3 ± 0.4 |
| 5 | 0.9 ± 0.1 | 1810 ± 60 | 160 ± 80 | 1.4 ± 0.3 |
| 6 | 0.8 ± 0.1 | 1950 ± 70 | 200 ± 110 | 1.3 ± 0.3 |
| 7 | 0.6 ± 0.3 | 1700 ± 200 | 260 ± 250 | 1.6 ± 1.0 |
| 1 – 7 | 0.7 ± 0.2 | 1900 ± 100 | 100 ± 100 | 1.1 ± 0.2 |
الجدول 5: النتائج التي تم الحصول عليها من أربعة تناسبات لوجستية للبارامترات تنطبق على البيانات النموذجية للاستجابة للجرعات. وترد بيانات الاستجابة للجرعة المستخدمة في التحليل في الشكل 2. تم تطبيق نطاق التركيز الكامل للتحليل بالنسبة للآبار الفردية من واحد إلى سبعة(الشكل 2B)ومتوسط البيانات التي تم الحصول عليها من الآبار من 1 إلى 7(الشكل 2D). لم يتم إصلاح أي من معلمات الوظيفة اللوجستية أثناء التحسين المربع الأقل. تم تقريب نتائج الملاءمة إلى عقد الخطأ، إلا إذا كانت القيمة أصغر من الخطأ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة لقياسات المعاوقة الخالية من الملصقات لتحديد علاقة الجرعة والاستجابة لتنشيط GPCR الناجم عن الالوطنية في غياب أو وجود مضادات محددة لنفس المستقبلات. وقد تم تقديم إثبات مفهوم هذه الطريقة في منشور صدر مؤخرا12. على حد علمنا هو أول دراسة تصف إنشاء منحنى الجرعة استجابة كاملة من تنشيط GPCR بوساطة العناق باستخدام طبقة خلية واحدة في المختبر. يتطلب هذا النهج حتما استخدام نهج مراقبة الخلية الخالية من التسمية ولن ينطبق على مقالات نقطة النهاية.
وقد ثبت البروتوكول على سبيل المثال من خلايا U-373 MG, التي تعبر الذاتية مستقبلات الهستامين 1 الإنسان (hHR1) التي يتم تحفيزها مع سلسلة من تركيزات متزايدة من الهستامين الذاتية في حين يتم تسجيل مقاومة الخلايا باستمرار. ولإثبات انطباق البروتوكول على الدراسات المعادية، تكررت التجارب في وجود تركيز ثابت واحد من ديفينهيدرامين، وهو خصم تنافسي لhH1R. كما تم استخدام تسجيلات المعاوقة بنجاح لدراسة ناهضات H1R الأخرى (على سبيل المثال، UR-KUM53011، الدوس الفردي والتدريجي) والخصوم (مثل Mepyramine)12 بالإضافة إلى الأمثلة الموضحة هنا. وعلاوة على ذلك، تم تطبيق البروتوكول على خطوط الخلايا الأخرى ومستقبلات كذلك، على سبيل المثال CHO-D2R التعبير عن مستقبلات D2 الدوبامين (D2R) أو BAEC التعبير عن مستقبلات ß 2-adrenergic (ß2AR)12 تشير إلى أنه يقدم مخطط عام لتوليد فعالة جدا ً من بيانات الاستجابة الجرعة. في حين أن خلايا U373-MG و BAEC تعبر عن مستقبلات كل منها H1R و ß2AR عند مستويات داخلية ، فإن CHO-D2R هو مثال لنموذج الخلية المؤتلفة. وينطبق البروتوكول التسلسلي معاً بشكل عام على أنواع الخلايا ذات التعبير الذاتي أو خارج الرحم GPCR، وGPCRs بأنواع اقتران مختلفة Gq (على سبيل المثال، H1R)، Gs (على سبيل المثال، ß2AR)، Gi (على سبيل المثال، D2R) بالإضافة إلى أنواع مختلفة من الليغاند (ناهض/خصم). في جميع تلك الأنواع الخلية / مستقبلات المذكورة أعلاه، وزيادة المعاوقة مع زيادة تركيز النهاد. ومع ذلك، تستجيب بعض الخلايا لتنشيط GPCR عن طريق انخفاض المعاوقة. لقد اختبرنا البروتوكول لحالة واحدة من هذه الحالات (HaCaT/histamine) ووجدنا أيضًا انخفاضًا تدريجيًا يعتمد على التركيز ، مما يدعم فكرة النهج القابل للتطبيق بشكل عام ومتوافق أيضًا مع تغييرات المعاوقة العكسية. وقد اقترح أن مسار الوقت مفصلة من بيانات المعاوقة يشير إلى نوع من G-البروتين اقتران مستقبلات معينة. على الرغم من أن المفهوم جذاب ، إلا أن مجموعة بياناتنا لا تدعم قاعدة قابلة للتطبيق بشكل عام تربط ملف تعريف وقت المعاوقة باقتران G-protein لـ GPCR6.
بروتوكول الإضافة التسلسلية قابل للتكيف مع أنواع مختلفة من تخطيطات الأقطاب الكهربائية وتنسيقات متعددة الآبار. وهو ينطبق على أنظمة التروية على رقاقة، وهو ميزة كبيرة على العديد من النهج القائمة على التسمية التي غالبا ما تتطلب طبقة خلية واحدة لتركيز واحد ليتم اختبارها. وبناء على ذلك، قد يمهد مخطط الجرعات المتسلسلة الطريق لدراسات الاستجابة للجرعة في نماذج بيولوجية أكثر تعقيدا مثل نهج التخلص من الأعضاء أو حتى نهج الإنسان على رقاقة. تكشف قياسات المعاوقة عن استجابة متكاملة وبعيدالخلايا لتنشيط المستقبلات التي تحفز في نهاية المطاف تغييرات مورفولوجيا الخلية. هذا غير محدد بدلا ً من ذلك ولكن غير متحيزة أيضاً قراءة الأساس لتطبيقها واسعة النطاق التي لا تقتصر على GPCRs ولكن قد تعمل أيضاً لفئات أخرى من مستقبلات سطح الخلية، مستقبلات السيتوبلازمية أو حتى البروتينات داخل الخلايا كأهداف.
ومن الأهمية بمكان بالنسبة لبروتوكول إضافة الكثف أن يعمل مع طبقات الخلايا المحيرة على الأقطاب الكهربائية، حيث أن الثقافات المتناثرة سوف تتداخل مع الحساسية والاستنساخ وتفسير البيانات. شرط أساسي إضافي للرصد الناجح لتنشيط مستقبلات حتى في أحادية الخلية المحيرة هو تغيير في شكل الخلية على طول سلسلة نقل الإشارة. إذا كانت الخلايا قيد الدراسة لا تغير مورفولوجيا على طول التجربة، والقراءة القائمة على المعاوقة أعمى ولن تقرير عن أي تغيير في نشاط المستقبلات. لتخطيط بروتوكول الإضافة التسلسلي بشكل صحيح ، يوصى بإجراء اختبار مسبق أولي في وضع التركيز التقليدي أحادي التركيز لتحديد نطاق تركيز الناضر تقريبًا والفاصل الزمني بين الإضافات اللاحقة. وينبغي أن تكون مصممة فترات زمنية بين جرعات متتابعة من الناضر بحيث يعتمد النظام توازن جديد قبل المقبل، تضاف جرعة أعلى. وفقا لذلك، قد تكون الطريقة أقل فائدة للمستقبلات التي تؤدي إلى استجابة سريعة جدا وعابرة فقط من الخلايا أو استجابة بطيئة جدا التي قد تستغرق ساعات لإكمال. ومن شأن هذا الوضع الأخير أن يزيد من الوقت الإجمالي للتجربة ويدعو إلى بروتوكولات إضافة موازية لاختصار وقت المختبر. في الأمثلة المعروضة أعلاه، كان إجمالي وقت تشغيل التجربة 2.5 - 3.5 ساعة، اعتماداً على عدد التركيزات (8 أو 10) واحتمال الحضانة المسبقة مع الخصم. نفس التجربة في وضع الإضافة المتوازية التقليدية لن تستغرق سوى ~ 1 ساعة لنفس نموذج مستقبلات الخلية ولكن مع إنتاجية أصغر بكثير. ومن المزايا الواضحة للنهج التسلسلي أن عدد التركيزات التي يلزم اختبارها للحصول على علاقة كاملة بين الجرعة والاستجابة لا يحده عدد الآبار المتاحة. إذا كانت هناك حاجة إلى تركيزات أكثر من أيعت، يتم تمديد التجربة بسهولة والانتهاء منها دون أي عمل زراعة الخلايا إضافية. يجب أن يتم إضافة Agonist نفسها بعناية ، حيث أن بعض الخلايا حساسة لإجهاد القص وتستجيب مع تغييرات مقاومة كبيرة ببساطة بسبب التحفيز الميكانيكي الذي يفرضه التعامل مع السائل. قد تخرج الخلايا حتى من القطب الكهربائي. هذه المشكلة، ومع ذلك، ليست فريدة من نوعها لرصد الخلايا القائمة على المعاوقة ولكن ينطبق على تقنيات أخرى أيضا. بالنسبة للخلايا الحساسة، يوصى بوضع الإضافة 1 بسبب انخفاض الحمل الميكانيكي على الخلايا. ومع ذلك ، يعمل هذا الوضع مع أحجام سائلة أقل أثناء الإضافة مما يزيد من خطر الاختلاط غير الكامل نظرًا لعدم التوصية بالانفعالات المكثفة لتجنب استجابات الخلايا غير المحددة.
إضافة وضع 1 يذهب جنبا إلى جنب مع زيادة تدريجية من الحجم الإجمالي في البئر في حين أن الوضع 2 يحافظ على إجمالي حجم ثابت منذ تتم إزالة كميات متساوية من الحل بالتسلسل. هذه ليست سوى اثنين من الاستراتيجيات المتطرفة ويمكن تكييفها لأنواع الخلايا الخاصة ، وأشكال متعددة الآبار أو تخطيطات القطب بأي طريقة وسيطة. في حالة نموذج U373-MG/H1R لوحظت اختلافات طفيفة في قيم EC50 و EMax لوضع الإضافة التسلسليمقارنة مع وضع الإضافة المتوازي التقليدي (تسلسلي، N = 30: EC50:(0.8 ± 0.3) ميكرومتر، EMax:(1.9 ± 0.2) kΟ؛ متوازي، N = 15: EC50:(0.5 ± 0.2) ميكرومتر، EMax:(1.3 ± 0.3) kΟ)، في حين أن نماذج الخلايا/المستقبلات الأخرى لم تظهر أي اختلافات. يمكن أن تنشأ التحولات في قيم EC50 و EMax من إزالة الحساسية للمستقبلات التي من المرجح أن تحدث عندما تتعرض المستقبلات للناضر لأوقات أطول. وسوف تعتمد بشدة على تأثير إزالة الحساسية على المستقبلات وligand قيد الدراسة. يبقى أن يتم توضيح ما إذا كان تحليل مفصل للإضافة المتسلسلة والموازية قد يوفر وسيلة جديدة لدراسة إزالة الحساسية مستقبلات.
نوصي بإجراء تجربة تحكم مع إضافة الجرعة الواضر في الوضع الموازي التقليدي من أجل اختبار التحولات المحتملة في منحنيات استجابة الجرعة. وينبغي أن تشمل الضوابط الأخرى عينة تعامل فقط مع المتوسطة / المذيبات في جرعات مناسبة لكشف أي آثار بسبب الحمل المذيبات أو الإجهاد الميكانيكي على إضافة متوسطة. هذا يصبح مهم بشكل خاص إذا تم إعداد حل الأسهم من ليغاند في المذيبات الأخرى من المتوسطة (على سبيل المثال، DMSO، الإيثانول). عند التحقيق في تأثير ligands مختلفة ينبغي أن تدرج في الغمن القياسية كمرجع.
وينبغي أن تشمل الاتجاهات المستقبلية وحدات مناولة سائلة آلية، مما قد يسمح بالغسل الآلي أو المعايرة بالكامل. تطبيق وضع الإضافة التسلسلية في أنظمة التروية يحمل إمكانات كبيرة لمختبر على رقاقة والجهاز على رقاقة النهج، وكذلك للتجارب التي أجريت تحت ضغط القص السائل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر باربرا غوريك وناديا هينترتيتر على مساعدتهما في زراعة الخلايا وإعداد الحلول التجريبية. وينوه بامتنان المؤلفون بالدعم المالي من قبل مجموعة التدريب البحثي 1910 "الكيمياء الطبية للجي بيندس الانتقائية GPCR" الممولة من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) تحت رقم المنحة 222125149. وتعرب وزارة الشؤون الاجتماعية عن امتنانها بصفة خاصة للمنحة الدراسية التي منحها برنامج بافاريا للمساواة بين الجنسين.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | |
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 - 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 - 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) | \ |
References
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs. Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).
- Kaitin, K. I. Deconstructing the drug development process: The new face of innovation. Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).
- Kenakin, T. P. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).
- Scott, C. W., Peters, M. F. Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening. Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophysical Journal. 91, 16 (2006).
- Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).
- Lieb, S., et al. Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor. Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).
- Stolwijk, J. A., et al. Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol. Integrative Biology. 11, 10 (2019).
