Summary
该协议演示了使用无标签阻抗测量从单个微电极上生长的单个细胞层的激动剂诱导GPCR活化的全剂量-反应关系的实时记录。新的配量方案显著提高了吞吐量，而不会损失时间分辨率。
Abstract
在细胞培养实验中，基于标签的阻抗测定越来越多地用于非侵入性研究配体诱导的GPCR活化。该方法提供实时单元监控，与设备相关的时间分辨率降低至几十毫秒，并且高度自动化。然而，当样本数量变高（例如，不同配体的剂量反应研究）时，一次性电极阵列的成本以及连续井记录的可用时间分辨率可能会受到限制。因此，我们在这里提出了一个串行的激动剂添加协议，它有可能显著增加无标签GPCR检测的输出。使用串行激动剂添加协议，GPCR激动剂按顺序添加到单个细胞层，同时持续监测样品的阻抗（激动器模式）。通过这种串行方法，现在可以从单个细胞层为GPCR激动剂建立一个完整的剂量反应曲线。序列激动剂添加方案适用于不同的GPCR耦合类型，Gq Gi/0或Gs，与所研究受体的重组和内源表达水平兼容。GPCR 拮抗剂的受体阻塞也是可评估的（拮抗模式）。
Introduction
本报告详细介绍了通过无标签阻抗测量，为在粘附生长细胞中结合诱导的G蛋白耦合受体（GPCR）激活的定量而开发的串行添加方案。G蛋白耦合受体（GPCRs）涉及多种生理功能和人类疾病1。由于这一点，并且在细胞表面具有良好的可访问性，GPCRs是最重要的药物靶点之一。这一评估反映在估计的700个针对全环苯酚的核准药物数量上，相当于所有上市药物2的35%的份额。
新药的开发包括两个中心过程：（一） 生物靶分子的鉴定和功能表征，和（二）发现新的铅物质及其发展成可管理药物。在这两个过程中，都需要有效的方法来定量评估药物-目标相互作用和随后的生物下游反应。临床前药物开发过程的不同阶段使用不同的分析方法，从药物和目标之间的生物分子相互作用研究，对培养细胞的功能研究，到切除器官材料或整个动物的实验。生理意义和生物复杂性从前者增加到后3。虽然尽量减少动物实验是总体目标，但使用实验室动物甚至整个动物的分离器官进行药理学研究对于全面描述新药候选者是不可避免的。在分析读出方面，器官药理学研究提供了一个与生理相关性最高的远端、综合的"整体"功能反应。这种实验的一个缺点是，由于技术原因和道德原因，它们与高通量筛选不兼容，并且在很大程度上被基于体外细胞培养4的研究所取代。
在细胞培养物中量化GPCR活化的方法包括不同的基于标签的化学测定，它专门检测第二信使、下游信号蛋白的磷酸化状态、通过某些转录因子转录激活或配体诱导的细胞内受体贩运4、5。这种基于标签的检测的缺点是有必要给细胞贴上可能有害的染料或放射性标记标签。这通常需要在必须先验指定的曝光时间中运行测定作为端点确定。使用基于标签的端点检测会受到实验时间非常有限和偏颇的影响，以及化学标签和探针可能干扰正常细胞生理学的风险，而实验者可能没有注意到。
近年来，用于监测GPCR活化的无标签检测已经出现，如基于阻抗的技术或应用谐振波导光栅5、6的光学方法。用这些方法在实验上不需要给细胞贴上标签。由于这些物理读出在低振幅信号上运行，这些方法被认为是非侵入性的，它们允许实时连续的细胞监测，观察时间仅受细胞培养的限制，而不是由读出。与来自整个器官的读出类似，无标签方法通常报告整体细胞反应，当沿整个信令网络集成导致细胞形态或大规模再分配的时间依赖性但非特定变化时，受体激活的下游。基于阻抗的测定测量细胞形状7、8变化的介电特征，使用谐振波导光栅的测量对动态质量再分配（DMR）9引起的细胞基体界面折射率的变化很敏感。综合特性使得无标签方法对受体介导事件极其敏感，而不管G蛋白（Gq、Gi/0、G12/13）或信号级联6中涉及的β-逮捕素，非常适合受体的内源表达水平。
在标准无标签阻抗测定中，细胞附着生长在多孔板中，共平面金膜电极沉积在每口井10的底部。这些电极阵列连接到阻抗分析仪，并且通过时间解析阻抗读数从单个孔中记录对实验刺激的单元响应。在典型的GPCR测定中，配体以不同的浓度分别添加到每个井中。然后，根据特征曲线特征（如最大信号变化、曲线下面积、给定时间间隔内的信号变化或指定时间点的曲线斜率）分析阻抗时间过程中的配体引起的变化，以量化配体的效力和功效11。
电极阵列的成本可能会限制该技术在高通量筛选（HTS） 运动中的应用。此外，随着要并行跟踪的样本数量不断增加，单个测量的数量也会增加，从而逐渐降低每个油井的可用时间分辨率，甚至对于最先进的多通道记录也是如此。在这种情况下，快速和瞬态细胞响应可能逃避测量。此外，传统的一井-一种浓度方法对片上或片上机的注入器官开发在配体-GPCR相互作用分析中的适用性而言，具有显著的时间和成本因素。
为此，我们开发了一种分步剂量协议，通过持续监测单孔的阻抗，同时逐步增加激动剂浓度，从而记录培养细胞单层中配体诱导GPCR活化的全剂量-反应曲线。序列激动剂添加方案显著提高了每口井的通量，从一种浓度增加到10个或更多浓度，如目前人类U-373 MG细胞的例子所示，该细胞内分泌表达组胺1受体（H1R）。因此，该方法有可能在无标签剂量反应研究中显著提高吞吐量，同时将时间分辨率保持在仪器最大值。
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Protocol
1. 电极阵列上的电池播种
注：选择电极布局是灵敏度和所研究的电池数量之间的权衡。电极越小，测量越敏感，但所研究的细胞数量越小。对于在基线条件下随时间显示强阻抗波动的电池，更可取的是较大的或数字间电极。
- 在 37°C 水浴中预加热标准细胞通过和播种所需的所有解决方案。对于人体U-373 MG细胞的检测，它需要：不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水（PBS），0.05%（w/v）胰蛋白酶，细胞培养基（Eagle的最小基本介质（EMEM）辅以5%（v/v）胎儿小牛血清（FCS），2mM L-谷氨酰胺和100μg/mL青霉素/链霉素）。
- 用PBS冲洗传统细胞培养瓶或菜肴底部生长的库存培养液的细胞层。
- 取出PBS，加入胰蛋白酶溶液（1 mL代表25cm2），让细胞在37°C孵育5分钟（适用于U-373 MG细胞）。
- 通过显微镜控制细胞从生长基底完全分离。
- 停止胰蛋白酶反应，只要细胞完全分离，添加9 mL的细胞培养基每1mL的胰蛋白酶到细胞悬浮液。通过移液在基板上的悬浮液，仔细冲洗细胞培养基底中的剩余细胞。
- 用移液器收集细胞悬浮液并将其转移到离心管（15 mL 或 50 mL 管）。
- 在室温下，在110 x g下通过离心使细胞旋转10分钟。
- 在计算细胞之前，小心地去除上清液并彻底重新悬浮培养基中的细胞颗粒（例如，使用造血仪进行相对比显微镜和手动计数）。
- 调整细胞悬浮液到所需的细胞密度。对于U-373MG细胞的实验，使用100 000细胞/cm2在48小时内生长一个汇体细胞层。这意味着8孔电极阵列的细胞密度为200 000细胞/mL，生长面积为±0.8 cm2，井体积为400μL。
注：对于可重复的GPCR激活实验，应将细胞生长到电极阵列上的单层。为了确保细胞表面的受体表达正确，在进行实验前，细胞应至少播种36小时。测试细胞种子的不同细胞密度通常对确定最佳实验条件有意义。 - 将电池悬浮液添加到电极阵列的孔中，让销售在室温下稳定10~15分钟，以确保在井底的细胞均匀分布。
- 在标准细胞培养箱中，在37°C和加湿大气中，在5%CO2（取决于介质类型）中生长细胞至少36小时。在实验前24小时改变细胞培养基。
- 在实验当天，通过（相对比）显微镜检查电极阵列上的细胞层，以确保电极与电池完全覆盖。
2. 无血清培养基中细胞的均衡
- 预温无血清介质，在这项研究中：莱博维茨的L15培养基。
- 从电极阵列上生长的细胞中去除细胞培养基，代之以预加热的无血清培养基。对于 8 口格式电极阵列使用 200 μL，对 96 口电极阵列使用 150 μL。
- 让细胞在37°C无血清培养基中平衡至少2小时。平衡时间在很大程度上取决于单元格类型。例如，U-373 MG细胞需要2小时，CHO细胞需要4小时，BAEC可能需要在L-15培养基内过夜平衡。
注：L-15 介质与CO2无关，需要无 CO2大气。为了在L-15中进行平衡，将培养箱设置为0 % CO2。平衡可以通过阻抗读数进行监控，我们建议在第一个实验中执行该读数。
3. 使用阻抗读数监控细胞平衡
- 将电极阵列放入阻抗分析仪的连接阵列支架中。
- 确保电极和阻抗分析仪之间的低阻抗接触。对于不同的仪器，此检查是不同的。
注：如果仪器无法连接到电极，请再次打开触点夹，重新调整电极阵列，使其正确定位在支架内并重试。 - 从软件的用户界面中选择电极类型和/或多井格式。
- 设置测量参数。提供不同的选项。
注：为了选择最敏感的交流频率，我们参考文献和仪器手册，因为它取决于电极布局和正在研究的电池类型。通常，感应频率在 4 kHz = 50 kHz 的范围内。在这里，U-373 MG细胞生长在直径为250微米的圆形工作电极上，并在12 kHz的交流频率下进行监测。- 如果提供单频和多频数据采集模式，请选择单频模式以确保最大时间分辨率。测量将在此单频率下执行。对于传播最广泛的仪器，沿可用频率窗口有许多预设频率。
- 如果研究的井数较低或时间分辨率不严重，请改为选择多个频率记录。将记录指定频率数的阻抗读数，以便以后进行深入分析。
注：随着每口井记录的频率增加和井数的增加，时间分辨率降低。频率和数据采集模式选择选项因仪器类型和版本而异。
- 开始获取时间课程数据。
- 跟随单元层阻抗（至少 2 小时），直到阻抗稳定。同时，准备激动剂解决方案。
- 当细胞层达到稳定的阻抗水平时，要么 （i） 在同一实验中继续序列激动剂添加，或者 （ii） 终止数据采集并启动用于监测激动剂诱导受体激活的新数据集。
4. 为激动器模式下的实验准备激动剂溶液
- 根据方程 （1） 计算序列分量每个步骤所需的激动剂溶液的浓度。n 范围从 1 到序列添加的总数（x 表示井中的浓度和体积，以步骤 n. y 表示步骤 n 中"要添加的溶液"的浓度和体积）。
注：考虑复制数并计算每个浓度步骤的"要添加的解决方案"的总量。典型计算的结果在表1-4中给出。研究对激动剂浓度范围的一般想法，因为该范围定义了在序列添加过程中要施用的浓度和份数。使用串行激动剂添加方案，激动剂浓度逐步增加。因此，在添加下一个剂量时，井中已有的激动剂的量必须加以考虑。当井中已经存在的激动剂分子数为 nx =c = v x （具有当前浓度 c x和体积 Vx）且下一次添加后井中的分子数为 nx_y时，要添加的分子数量由要应用于井的溶液的浓度 cy和体积 Vy确定（ny = c= vy）。加入一部分激动剂后，井中新量的激动剂分子为：cx_y = Vx_y = cx = Vx = c= y = Vy。此计算适用于每个后续步骤。由于油井中激动剂浓度的相互依赖性以及每一步中要添加的部分的激动剂量，因此在每次步骤后确定最终浓度非常重要。
模式 1：随着液体的不断添加，井中的体积会随着每一步的增加而增加。
使用此模式和 8 口格式，使用 Vx1 = 200 μL 和 Vy1 ...V yi = 30 μL。
模式 2：井中的卷是恒定的，因为每个步骤添加的卷在后续添加之前被删除。
使用此模式和 96 井格式，使用 Vx1 = 150 μL 和 Vy1 ...... V yi = 75 μL。
- 打印数据手册，其中包含每个浓度的总体积和移液的详细说明。
- 以所需数量准备所有解决方案。使所有激动剂溶液与用于细胞平衡的相同无血清培养基。
注意：2012 年 OSHA 危险通信标准 （29 CFR 1910.1200） 认为二盐酸组胺具有危险性。组胺引起皮肤刺激，严重眼睛刺激，可能导致过敏性皮肤反应，过敏，哮喘症状或呼吸困难，如果吸入，并可能导致呼吸道刺激。请考虑安全数据表。
注意：使激动剂解决方案尽可能新鲜。溶液中激动剂的稳定性可能有很大差异。将溶液储存在 4°C 或以下，直到在实验中使用。对于某些分子，在使用肽基或脂基分子时，可考虑添加额外的稳定添加剂，如BSA，以防止吸附到水井和管壁。 - 如果以 96 孔格式执行实验，则将溶液转移到传统的 96 孔板（无电极），并使用 8（或 12-） 通道移液器快速将液体传输到电极阵列。
5. 为拮抗剂模式下的实验准备激动剂溶液
注：准备拮抗剂溶液，并在整个过程中应用浓度。拮抗剂溶液的体积和浓度取决于激动剂添加模式（1 或2）。附加模式 2 中 8 口或 96 井格式的实验示例：（A） 8 井格式（Vx1 = 200 μL，V拮抗剂= 200 μL）;（B） 96 井格式（Vx1 = 150 μL，V拮抗剂= 75 μL）。
- 如步骤 4.1 所述，计算串行给给每个步骤所需的每个激动剂溶液的浓度。
- 使所有激动剂溶液与用于细胞平衡的相同无血清培养基中，并在实验中各井中计划的相同最终浓度中添加拮抗剂。
注：在这种情况下，组胺库存溶液（10 mM）在L-15介质中制备。当激动剂溶解在其他溶剂中（例如二甲基磺酸酯（DMSO），乙醇）时，应包括溶剂控制，以考虑到每一步添加的溶剂负荷增加。
6. 在激动器模式下执行串行添加协议
- 如步骤 3.1 和 3.5 中所述开始数据采集。
- 在使用前预热激动剂溶液，在添加前约 10 - 15 分钟将其放入培养箱中。
注：使用热实验室物质时，溶液不应在37°C中保持太久。如果预热 10 - 15 分钟被认为是关键，在水浴中加入之前，将溶液温度带到 37°C。 - 根据所选的添加模式运行激动剂串行加法。按照模式 1，井中的总体积随着下一个剂量的每次增加而增加。在模式 2中，在添加下一个更高剂量之前，每个步骤添加的相同体积也会再次被删除。
注：在两个后续激动剂剂量之间平衡细胞层所需的时间取决于细胞的响应时间。并行模式下的初始实验（一孔 = 一浓度）显示（i） 不同激动剂浓度的细胞响应时间和 （ii） 最敏感的曲线参数（例如阻抗最大值、时间后阻抗 x）。
A： 模式 1 / 8 井格式
- 在200μL无血清培养基中均衡的细胞中，将激动剂浓度最低的第一溶液加入30μL。
- 让细胞在预定义的时间段内（例如 15 分钟）做出反应和平衡。
- 加入30μL的第二个溶液，下一个更高的浓度。
- 对第三、第四步等激动剂溶液重复步骤 6.3.1-6.3.3。
注：使用10个浓度步骤将导致实验结束时的总体积为500μL，略低于这些油井的最大适用体积=550μL。
B： 模式 2 / 96 井格式
注：在以 96 孔格式运行实验时，通过阻抗仪器的软件暂停每个液体处理步骤（添加/移除）的数据采集。更精细的液体处理可能会干扰数据采集。使用多通道移液器。
- 暂停数据采集。
- 在150μL无血清培养基中均衡的细胞中，将第一个激动剂浓度最低的溶液加入75μL。
- 恢复数据采集。
- 让细胞在预定义的时间段内（例如 15 分钟）做出反应和平衡。
- 在常规平衡时间结束前约 1 % 2 分钟，暂停测量并从每个井中取出 75 μL。
注： 应移除溶液的时间点取决于并行监测的井数和移液速度。删除解决方案所需的时间不应超过后续步骤之间的时间。 - 加入75 μL的第二个溶液与下一个更高的浓度，并恢复测量。
- 对第三、第四步等激动剂溶液重复步骤 6.3.8-6.3.10。
7. 在拮抗模式下执行串行添加协议
- 如步骤 3.1 和 3.5 中所述开始测量。
- 在细胞层平衡期间，制备拮抗剂溶液（例如，L15介质中盐酸二苯胺的200 μL为1.5 μM二苯胺）。
注意：盐酸二苯胺具有潜在的急性健康影响。如果吞咽或吸入有害，可能导致眼睛和皮肤刺激。它可能导致呼吸道和消化道刺激。请考虑安全数据表。 - 在加入细胞培养之前，将拮抗剂和激动剂溶液置于培养箱中约 10 - 15 分钟，预先加热拮抗剂和激动剂溶液（参见 6.2）。如果无拮抗剂的井也包含在测定中，也预温无血清培养基。
- 将拮抗溶液添加到指定的井中。让细胞与拮抗剂平衡15~20分钟。如果包括无拮抗剂的井，则向这些井中加入相同量的无血清介质。
- 根据模式2中的拮抗剂添加，从井中取出溶液
（A） 8 井格式 （200 μL）
（B） 96 井格式 （75 μL） - 运行步骤 6.3 中描述的激动剂添加序列。
8. 数据导出和分析
- 使用阻抗仪器的软件导出数据，以便将所有记录的数据从专有格式转换为通用数据格式（例如，csv）。此步骤允许使用其他软件包重新组织和演示数据。
- 将 csv 格式的数据加载到科学数据分析软件中。
- 通过在第一次添加激动剂溶液之前减去最后一个数据点的阻抗，并将添加时间设置为 t = 0，使阻抗值标准化。绘制规范化阻抗的时间过程。
- 绘制各个时间过程，并确定每个加法步骤后阻抗的最大值。使用这些值编写数据表。
- 将最大（或最小，如果适用）阻抗变化的值绘制为激动剂浓度的函数。这可以针对单个井或平均值（均值 = SD）进行。
- 使用数据拟合例程使用四个参数逻辑模型（方程 2）确定半最大有效浓度 （EC50） 和最大响应 （EMax）：
注：c表示激动剂浓度，A1为最小值，A2为sigmoidal剂量-反应曲线（A2 = EMax）的最大亚数托。EC50是曲线拐点处的浓度，n对应于坡度。
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Representative Results
在表1-4中，使用8井电极阵列，将组胺作为激动剂的实验，展示了一种制备各种激动剂溶液的典型方案。表 1和表 2提供了使用加法模式1的实验的体积和浓度（参见图 1），而表 3 和表 4则显示添加模式 2之后的实验的体积和浓度（参见图 1）。数据是使用方程 （1） 计算的。
图2显示了一个代表性的实验，用于U-373 MG细胞的汇层，该细胞内敏地表达组胺1受体，在8孔电极阵列上生长，工作电极直径为250μm，使用组胺作为激动剂。测量以12 kHz的单频进行。在模式1之后执行激动剂浓度系列的添加。在选定的实验中，每15分钟按顺序添加10种增加组胺浓度的溶液（根据步骤4制备）（图2A）。串行给给方案应用于8口井中的7口。在一个无抗激动剂介质（L-15）中，在十个步骤中的九个步骤中按顺序添加为负对照。该控制的最后一项新增是组胺溶液，在井中提供100μM组胺的最终浓度。数据已使用数据分析软件绘制，显示为阻抗变化 |Z=12 kHz / kΩ 沿实验，阻抗变化和第一次添加的时间点设置为零。此图未显示实验缓冲区 2 h 中的初始平衡时间。激动剂添加的时间点用箭头表示。
使用数据光标从曲线中提取每个浓度步骤后相对于基线的阻抗变化。在没有明确最大值的步骤中，下一次添加前的最后一个数据点用于分析。阻抗变化 |Z=12 kHz被绘制为组胺浓度（cx+y）的函数（图2B，符号）。四个参数物流模型（参见步骤8.6）的传输函数被安装在七口井的实验数据点上（图2B，线）。拟合结果如表5所示。图 2C和图2D显示了图2A和图2B中平均数据的结果，显示了七口井的平均值 = SD。平均时间过程数据在图2C中汇总，而平均剂量反应曲线在图2D中提供。
在剂量-反应关系中，如图2B，D所示，拟合程序应用于返回EC50 +（0.86 × 0.13）μM的整个浓度范围。阻抗响应随着组胺浓度的增加而单调增加，但最后两个浓度步骤（30 μM，100 μM最终浓度）除外。这种反应大概是由组胺受体的降低调节、细胞脱敏或过度刺激来解释的（见讨论）。为了考虑这种影响，分析的数据范围已经减小，如从图2所示的数据中选择的单个串行给给实验（图3;井1）所示。此外，在最小平方优化期间将较低的亚星（A1）设置为零，假设响应0 μM组胺没有阻抗变化，这是有充分理由的。应用这三个参数优化可提供 EC50的 （0.75 × 0.12） μM （参见图3B）。EC50值对任一种数据分析模式都不敏感，且没有显著差异。
图4总结了96孔板实验的典型结果。U-373 MG细胞在96井电极阵列上生长，如上所述。测量中包括32口井。8口井作为无激动剂控制，只暴露于介质中。24口井受到一系列增加组胺浓度的计算和准备，以加法方式2。阻抗变化的时间过程显示了图4A中所有32个单独井的时间过程。其中一条曲线（以红色突出显示）显示一个不寻常的时间过程，并且被排除在进一步分析之外。因此，在图4B中，23口井的数据被作为平均阻抗变化（均值 = SD）的时间过程进行平均和绘制。如上所述，对每条曲线都进行了剂量-反应关系分析。数据点被平均和绘制为最终组胺浓度的函数（图4C）。通过四个参数逻辑模型对剂量-响应数据进行了分析，该模型返回的平均EC50值（1.0 ± 0.3）μM。
图5显示了拮抗剂模式下串行激动剂添加协议的典型结果。在这里，一口井在添加第一组胺前20分钟用0.75 μM的组胺受体对手二苯胺（红色曲线）预处理（图5A）。该控件接收无拮抗介质（蓝色曲线）。在应用激动剂系列之前，添加了拮抗剂，即最终400μL的200μL被移除。激动剂（组胺）是在串行加剂模式1之后添加的，如上面的例子中所述。对拮抗剂模式的实验来说，在实验的整个过程中保持拮抗剂浓度是恒定的。因此，添加到油井的所有激动剂溶液还必须包含预定义的拮抗剂浓度（在本例中为 0.75 μM），而对照管保持无拮抗剂浓度。在串行给给方案内，与诱导细胞反应所需的较高激动剂浓度相对应的阻抗"延迟"增加，从而明显产生对抗效应。在剂量-反应关系中，拮抗剂的作用表示为曲线的右移，对应于 EC50中的增加，前提是拮抗剂是相对于激动剂的竞争性配体（图 5B）。EC50被确定为 （0.92 × 0.05） μM，在没有拮抗剂的情况下，在它的存在下 （14.7 ± 0.6） μM。
图 1：串行激动剂添加模式。（A） 说明浓度计算的原理图.通过将浓度 cy和体积 Vy的激动剂溶液添加到具有 Vx和激动剂浓度 cx的井中，体积增加到 Vx_y，浓度增加到 cx_y。（B） 串行激动剂添加的两种不同的模式。模式 1：每次加法时，井V_y的总体积都会增加。模式2：在添加下一个剂量之前，再次去除每个浓度步骤中添加的体积，从而保持油井总体积不变。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：8井格式典型实验的结果。（A） 在直径为 250 μm 的圆形工作电极上生长的汇体 U-373 MG 细胞层，阻抗变化的时间过程为 12 kHz。在8口井中的7口中，连续添加组胺。每个步骤（模式1）按顺序加载一口井（灰色曲线），除了最后一步添加100 μM组胺作为正对照外。（B） 剂量-响应关系由每个浓度步骤后相对于七个单独井的基线的最大阻抗变化而生成。（C） 从七口单井生成的阻抗变化的平均时间过程（均值 = SD），如 （A） 所示。（D） 从单个数据集生成的平均剂量-响应关系，如 （B） 所示。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：数据分析模式的适应。（A） 在直径为 250 μm 的圆形工作电极上生长的单波波 U-373 MG 细胞层，在 12 kHz 处的阻抗变化典型时间过程。（B） 每次浓度升高后，从相对于基线的最大阻抗变化产生的实验剂量-反应关系（填充符号）。完整的数据集要么受到拟合程序（黑色和灰色曲线）的影响，要么从定量分析（红色和洋红色曲线）中省略了最后一个数据点（指示受体脱敏和/或内化开始）。所有四个参数在最小平方优化（黑色和红色曲线）期间都进行了调整，或者参数 A1（表示较低的亚数托特）被设置为零（灰色和品红色曲线）。对于两种数据分析模式，EC50值没有显著差异。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：96井格式的典型实验。（A） 在 96 孔电极阵列上生长的汇体 U-373 MG 细胞层在 12 kHz 下测量的阻抗变化时间过程。数据显示了 32 口井的数据。24口井受到一系列增加的组胺浓度的加入，每步之间的平衡时间为15分钟。以红色突出显示的曲线从平均值中排除。八口井（对照）在每个加法点均使用无组胺介质处理。（B） 23个单独井的平均阻抗变化时间过程，以响应组胺序列添加和 8 个控制井，如 （A） 所示。（C） 每次浓度增加后相对于基线的最大阻抗变化（均值 = SD）产生的平均剂量-响应关系。数据具有四参数物流功能。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：拮抗模式的典型实验。（A） 在增加组胺浓度增加时，在直径为250 μm的圆形工作电极上生长的汇体U-373 MG细胞层在12 kHz处的阻抗变化时间过程，无论是否存在组胺受体拮抗剂二苯胺。二苯胺（0.75 μM）或无拮抗剂介质（L15）在激动剂连续分剂开始前20分钟加入。（B） 从 （A） 中数据中数据中每次浓度增加后相对于基线的最大阻抗变化生成的剂量-响应关系。0.75 μM 二苯基胺的存在使EC50从（0.92 ± 0.05）μM增加到（14.7 ± 0.6）μM。请点击此处查看此图的较大版本。
| 解决 方案# | cx+y （μM） | cx （μM） | Vx （μL） | Vx+y （μL） | Vy （μL） | cy （μM） |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 230 | 30 | 0.08 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 230 | 260 | 30 | 0.79 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 260 | 290 | 30 | 2.03 |
| 4 | 1 | 0.3 | 290 | 320 | 30 | 7.77 |
| 5 | 3 | 1 | 320 | 350 | 30 | 24.33 |
| 6 | 10 | 3 | 350 | 380 | 30 | 91.67 |
| 7 | 30 | 10 | 380 | 410 | 30 | 283.33 |
| 8 | 100 | 30 | 410 | 440 | 30 | 1056.67 |
表1：在加法模式1下使用8井电极阵列的实验的浓度计算方案。
| 解决 方案# | cy （μM） | Vy （μL） | 使从 | c （μM） | 稀释因子 | 使总 V （μl） | 使用 （μl） | 添加 V （μl） |
| 1 | 0.08 | 30 | 3 | 2.03 | 26.52 | 600 | 22.6 | 577.4 |
| 2 | 0.79 | 30 | 4 | 7.77 | 9.83 | 600 | 61 | 539 |
| 3 | 2.03 | 30 | 5 | 24.33 | 11.97 | 600 | 50.1 | 549.9 |
| 4 | 7.77 | 30 | 6 | 91.67 | 11.8 | 600 | 50.8 | 549.2 |
| 5 | 24.33 | 30 | 7 | 283.33 | 11.64 | 600 | 51.5 | 548.5 |
| 6 | 91.67 | 30 | 8 | 1056.67 | 11.53 | 600 | 52.1 | 547.9 |
| 7 | 283.33 | 30 | 8 | 1056.67 | 3.73 | 600 | 160.9 | 439.1 |
| 8 | 1056.67 | 30 | 10 mM 库存 | 10000 | 9.46 | 800 | 84.5 | 715.5 |
表2：在加法模式1下使用8井电极阵列进行实验的移位方案。
| 解决 方案# | cx+y （μM） | cx （μM） | Vx （μL） | Vx+y （μL） | Vy （μL） | cy （μM） |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 400 | 200 | 0.02 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 200 | 400 | 200 | 0.19 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 200 | 400 | 200 | 0.5 |
| 4 | 1 | 0.3 | 200 | 400 | 200 | 1.7 |
| 5 | 3 | 1 | 200 | 400 | 200 | 5 |
| 6 | 10 | 3 | 200 | 400 | 200 | 17 |
| 7 | 30 | 10 | 200 | 400 | 200 | 50 |
| 8 | 100 | 30 | 200 | 400 | 200 | 170 |
表3：在加法模式2下使用8井电极阵列的实验的浓度计算方案。
| 解决 方案# | cy （μM） | Vy （μL） | 使从 | c （μM） | 稀释因子 | 使总 V （μl） | 使用 （μl） | 添加 V （μl） |
| 1 | 0.02 | 200 | 3 | 0.5 | 25 | 1000 | 40 | 960 |
| 2 | 0.19 | 200 | 4 | 1.7 | 8.95 | 1000 | 111.8 | 888.2 |
| 3 | 0.5 | 200 | 5 | 5 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 4 | 1.7 | 200 | 6 | 17 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 5 | 5 | 200 | 7 | 50 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 6 | 17 | 200 | 8 | 170 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 7 | 50 | 200 | 8 | 170 | 3.4 | 1000 | 294.1 | 705.9 |
| 8 | 170 | 200 | 200 μM 库存 | 200 | 1.18 | 1300 | 1105 | 195 |
表4：在加法模式2下使用8井电极阵列进行实验的移位方案。
| 嗯 | EC50 | 最大E （=A2） | A1 | n |
| （ΜM） | （kΩ） | （Ω） | ||
| 1 | 0.9 × 0.1 | 1680 × 70 | 150 × 80 | 1.9 × 0.5 |
| 2 | 0.7 × 0.2 | 1770 × 90 | 200 ×140 | 1.3 × 0.4 |
| 3 | 0.6 × 0.2 | 1700 × 100 | 60 × 250 | 1.1 × 0.5 |
| 4 | 0.6 × 0.2 | 2000 × 100 | 140 × 180 | 1.3 × 0.4 |
| 5 | 0.9 × 0.1 | 1810 × 60 | 160 × 80 | 1.4 × 0.3 |
| 6 | 0.8 × 0.1 | 1950 × 70 | 200 × 110 | 1.3 × 0.3 |
| 7 | 0.6 × 0.3 | 1700 × 200 | 260 × 250 | 1.6 × 1.0 |
| 1 – 7 | 0.7 × 0.2 | 1900 × 100 | 100 × 100 | 1.1 × 0.2 |
表5：从应用于典型剂量反应数据的四个参数逻辑拟合中获得的结果。用于分析的剂量-反应数据如图2所示。全浓度范围应用于对单个井1至7的分析（图2B）和从1至7口井获得的平均数据（图2D）。在最小平方优化期间，物流函数的参数均未固定。拟合结果四舍五入为错误的十年，除非该值小于误差。
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Discussion
该协议描述了一种无标签阻抗测量方法，以确定在无电激动剂诱导的GPCR活化或存在同一受体的特定拮抗剂时的剂量-反应关系。该方法的概念证明在最近出版的第12号出版物中提出。据我们所知，这是第一个研究描述使用体外单细胞层建立激动剂介导的GPCR活化的全剂量反应曲线。该方法不可避免地需要使用无标签细胞监测方法，并且不适用于端点检测。
该协议已在U-373 MG细胞的例子中得到了证明，该细胞内源表达人体组胺1受体（hHR1），在不断记录细胞阻抗时，其内源性激动剂组胺的浓度增加而刺激。为了证明该协议对拮抗剂研究的适用性，在存在一种恒定浓度的二苯胺（hH1R的竞争性拮抗剂）的情况下重复了这些实验。除了此处显示的示例外，还成功地用于研究其他 H1R 激动剂（例如，UR-KUM53011、单步进给剂）和拮抗剂（例如，Mepyramine）12。此外，该协议还应用于其他细胞系和受体，例如CHO-D2R表达多巴胺D2受体（D2R）或BAEC表达β2-肾上腺素受体（±2AR）12，表明它提出了非常有效的剂量反应数据的一般方案。虽然U373-MG和BAEC细胞在内源水平上表达各自的受体H1R和β2AR，但CHO-D2R是重组细胞模型的一个例子。总之，串行协议一般适用于具有内源性或异位性GPCR表达的细胞类型，具有不同耦合类型Gq（例如，H1R）、Gs（例如，±2AR）、Gi（例如D2R）以及不同配体类型（拮抗剂/拮抗剂）的GPCR。在上述所有细胞/受体类型中，阻抗随激动剂浓度的增加而增加。然而，一些细胞通过阻抗减少对GPCR激活做出反应。我们测试了一个此类情况（HaCaT/组胺）的协议，并发现浓度依赖性逐步降低，支持一种普遍适用的方法的概念，该方法也与反向阻抗变化兼容。提出了阻抗数据的详细时间过程，表明给定受体的G蛋白耦合类型。即使这个概念是有吸引力的，我们的数据池不支持一个普遍适用的规则，将阻抗时间曲线与给定GPCR6的G蛋白耦合相关联。
串行加法可适应不同类型的电极布局和多井格式。它适用于片上灌注系统，与许多基于标签的方法（通常需要一个单元层才能测试一个浓度）不同，这是一个显著的优势。因此，串行剂量方案可能为更复杂的生物模型（如芯片上的器官甚至片上的人工方法）中的剂量反应研究铺平道路。阻抗测量检测细胞对受体活化的集成、远向反应，最终诱导细胞形态变化。这种相当笼统和不具体但无偏不倚的读出是其广泛适用性的基础，不仅限于GPCRs，但也可能适用于其他类别的细胞表面受体、细胞质受体，甚至细胞内蛋白作为靶点。
对于分步激动剂添加协议来说，在电极上处理融合的细胞层至关重要，因为稀疏培养物会干扰灵敏度、可重现性和数据解释。即使在对流细胞单层中，成功监测受体活化的另一个先决条件是沿信号转导级联的细胞形状发生变化。如果研究中的细胞在实验中不改变其形态，则基于阻抗的读出是盲目的，不会报告受体活性的任何变化。为了正确布局串行添加协议，建议在传统的一井一浓度模式下进行初始预测试，以大致确定激动剂的浓度范围和后续激动剂添加之间的时间间隔。应定制激动剂连续剂量之间的时间间隔，以便系统在下一个剂量之前采用新的平衡，增加更高的剂量。因此，该方法对于触发细胞非常快速且仅瞬态响应的受体或可能需要数小时才能完成的非常缓慢的响应的受体可能用处较小。后一种情况将增加实验的总时间，并要求并行添加协议来缩短实验时间。在上面的例子中，实验的总运行时间是2.5~3.5小时，这取决于浓度（8或10）的数量和潜在的对拮抗剂的预孵化。在传统的平行激动剂加法模式下，同样的实验对于相同的细胞受体模型只需要± 1 h，但吞吐量要小得多。串行方法的一个明显优点是，需要测试全剂量-反应关系的浓度数量不受可用井数的限制。如果需要更高的激动剂浓度，实验很容易扩展和完成，无需任何额外的细胞培养工作。应谨慎进行抗激剂添加本身，因为某些细胞对剪切应力敏感，并且仅仅因为液体处理施加的机械刺激而做出相当大的阻抗变化。细胞甚至可能从电极上脱落。然而，这个问题并非基于阻抗的细胞监测所独有，但也适用于其他技术。对于敏感细胞添加模式 1，由于细胞上的机械负荷降低，建议使用 1。然而，这种模式在添加过程中液体体积较低，这增加了不完全混合的风险，因为不建议进行密集搅拌以避免非特异性细胞反应。
加法模式 1 与井中总体积的逐步增加一起，而模式 2 保持总体积不变，因为按顺序删除等量的解。这些只是两种极端策略，可能适用于特殊细胞类型、多孔格式或电极布局。对于 U373-MG/H1R 型号，与传统的并行加法模式相比，串行加法模式在 EC50和 EMax值方面观察到细微差异（串行、 N = 30： EC50： （0.8 + 0.3） μM， EMax： （1.9 + 0.2） kΩ; 平行， N = 15： EC50： （0.5 + 0.2） μM， EMax： （1.3 × 0.3） kΩ）， 而其他细胞/受体模型没有显示任何差异.EC50和 EMax值的变化可能源于受体脱敏，当受体暴露于激动剂更长时间时，更有可能发生这种脱敏。脱敏影响将在很大程度上取决于受体和被研究的配体。对串行和平行激动剂添加的详细分析能否为研究受体脱敏提供一种新的方法，仍有待澄清。
我们建议使用传统的平行模式激动剂添加执行控制实验，以测试剂量-响应曲线中的潜在变化。进一步的控制措施应包括仅以适当剂量处理中等/溶剂的样品，以分解由于溶剂负载或介质添加时的机械应力造成的任何影响。如果配体的库存溶液以介质以外的其他溶剂（例如DMSO、乙醇）制备，这一点就显得尤为重要。在调查不同配体的影响时，应包括标准激动剂作为参考。
未来的方向应该包括自动液体处理单元，这可能允许完全自动化的给给或滴定。在灌注系统中应用串行加法模式，对于在芯片上和片上进行器官实验，以及在液体剪切应力下进行的实验具有巨大潜力。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢芭芭拉·戈里克尼克和娜贾·辛特瑞特在细胞培养和实验解决方案的制备方面提供帮助。作者感谢研究培训小组1910年"选择性GPCR配体药物化学"的财政支持，由德国研究基金会（DFG）资助，赠款号为222125149。JAS特别感谢巴伐利亚性别平等方案提供的奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | |
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 - 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 - 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) | \ |
References
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