Summary
Denne protokol viser real-time registrering af fuld dosis-respons relationer for agonist-induceret GPCR aktivering fra en enkelt celle lag dyrket på en enkelt mikroelektrode ved hjælp af label-fri impedans målinger. Den nye doseringsordning øger gennemløb betydeligt uden tab i tidsløsning.
Abstract
Label-fri impedans-baserede analyser er i stigende grad bruges til ikke-invasivt undersøgelse ligand-induceret GPCR aktivering i cellekultur eksperimenter. Tilgangen giver celleovervågning i realtid med en enhedsafhængig tidsopløsning ned til flere snese millisekunder, og den er meget automatiseret. Men når antallet af prøver bliver høje (f.eks. dosisresponsundersøgelser for forskellige ligander), kan omkostningerne for engangselektrodearrays samt den tilgængelige tidsopløsning for sekventielle brønd-by-well-optagelser blive begrænsende. Derfor præsenterer vi her en seriel agonist tilføjelse protokol, som har potentiale til at øge produktionen af label-fri GPCR assays. Ved hjælp af den serielle agonist tilføjelse protokol, en GPCR agonist er tilføjet sekventielle i stigende koncentrationer til en enkelt celle lag, mens løbende overvågning af prøvens impedans (agonist mode). Med denne serielle tilgang er det nu muligt at etablere en fuld dosisresponskurve for en GPCR-agonist fra blot et enkelt cellelag. Den seriel agonist tilføjelse protokol gælder for forskellige GPCR kobling typer, Gq Gi / 0 eller Gs og det er kompatibel med rekombinant og endogenudtryk niveauer af receptoren under undersøgelsen. Receptor blokering af GPCR antagonister kan vurderes samt (antagonist mode).
Introduction
Denne rapport indeholder en detaljeret beskrivelse af en seriel tilføjelse protokol udviklet til kvantificering af ligand-induceret G protein-koblet receptor (GPCR) aktivering i tilhængere spirende dyrkede celler ved label-fri impedans målinger. G protein-koblede receptorer (GPCRs) er involveret i et væld af fysiologiske funktioner og sygdomme hos mennesker1. På grund af dette og deres gode tilgængelighed på celleoverfladen er GPCR'er et af de vigtigste narkotikamål. Denne vurdering afspejles i et anslået antal ~700 godkendte lægemidler rettet mod GPCR,svarende til en andel på ~35 % på alle markedsførte lægemidler2.
Udviklingen af nye lægemidler omfatter to centrale processer: i) identifikation og funktionel karakterisering af biologiske målmolekyler og ii) opdagelsen af nye blystoffer og deres udvikling i administrative lægemidler. I begge processer er der behov for effektive metoder til kvantitativt at evaluere lægemiddelmålinteraktioner og den efterfølgende biologiske downstream-respons. Forskellige stadier i den prækliniske lægemiddeludviklingsproces gør brug af forskellige analysemetoder lige fra biomolekylære interaktionsundersøgelser mellem lægemiddel- og mål, over funktionelle undersøgelser af celler i kultur, til forsøg med punktafgifter på organmateriale eller hele dyr. Både fysiologisk betydning og biologisk kompleksitet stige fra førstnævnte til sidstnævnte3. Selv om det er det overordnede mål at minimere dyreforsøg, farmakologiske undersøgelser ved hjælp af isolerede organer fra laboratoriedyr eller endda hele dyr anses for at være uundgåelige til omfattende karakterisere nye lægemiddelkandidater. Med hensyn til analytisk udlæsning giver organfarmakologiundersøgelser en distalt, integrativ "holistisk" funktionel respons af højeste fysiologiske relevans. En ulempe ved sådanne forsøg er , at de ikke er forenelige med høj gennemløbsscreening af tekniske såvel som etiske årsager og i vid udstrækning er blevet erstattet af undersøgelser baseret på in vitrocellekultur4.
Metoder til at kvantificere GPCR aktivering i cellekulturer omfatter forskellige etiket-baserede kemiske analyser, som specifikt påvise sekunder budbringere, fosforylering tilstand nedstrøms signalering proteiner, transskriptionelle aktivering via visse transskription faktorer eller ligand-induceret intracellulære receptor handel4,5. En ulempe ved sådanne etiketbaserede analyser er nødvendigheden af at mærke cellerne med potentielt skadelige farvestoffer eller radioaktive markører. Dette kræver ofte at køre analysen som en slutpunkt-bestemmelse for en eksponeringstid, der skal specificeres a priori. Brug af etiketbaserede endepunktsanalyser lider under denne meget begrænsede og forudindtagede timing af forsøget og risikoen for, at kemiske etiketter og sonder kan forstyrre den almindelige cellefysiologi – potentielt ubemærket af eksperimentatoren.
I de seneste år, label-fri analyser til overvågning GPCR aktivering er opstået, ligesom impedans-baserede teknikker eller optiske metoder, der anvender resonant waveguide riste5,6. Mærkning af cellerne er eksperimentelt ikke påkrævet med disse tilgange. Da disse fysiske udlæsninger opererer på lav amplitude signaler, sådanne metoder betragtes som ikke-invasive, de giver mulighed for kontinuerlig celleovervågning potentielt i realtid, og observationstiden er kun begrænset af cellekulturen ikke af udlæsningen. Svarende til udlæsninger fra hele organer, label-fri tilgange ofte rapport om holistiskcellereaktioner, langt nedstrøms for receptor aktivering, når integration langs hele signalnetværket fører til tidsafhængige, men snarere uspecifikke ændringer i celle morfologi eller masse omfordeling. Mens impedansbaserede analyser måler den dielektriske signatur af ændringer i celleform7,8, er målinger ved hjælp af resonantbølgeføringsriste følsomme over for ændringer i brydningsindeks ved cellesubstratgrænsefladen som følge af dynamisk masseomfordeling (DMR)9. Den integrativkarakter gør labelfri metoder ekstremt følsomme over for receptormedierede hændelser uanset typen(e) af G-protein (Gq, Gi/0, Gs,G12/13) eller β-arrestin involveret i receptorens signaleringkaskade 6 og velegnet til receptorens endogene ekspressionsniveauer.
I en standard label-fri impedans-baserede analyse cellerne er konsekvent dyrket i multi-well plader med coplanar guld-film elektroder deponeret på bunden af hver brønd10. Disse elektrode arrays er forbundet til en impedans analysator og celle reaktioner på en eksperimentel stimulus registreres fra individuelle brønde ved tidsløst impedans aflæsninger. I en typisk GPCR analyse en ligand er tilføjet i individuelt forskellige koncentrationer til hver enkelt brønd. De ligand-inducerede ændringer i impedanstidskurset analyseres derefter med hensyn til karakteristiske kurvefunktioner såsom maksimal signalændring, område under kurven, signalændring inden for et givet tidsinterval eller hældning af kurven på et bestemt tidspunkt for at kvantificere ligandens styrke og virkning11.
Omkostningerne ved elektrodearrays kan begrænse anvendelsen af denne teknik i høj gennemløbscreening (HTS) kampagner. Med et stigende antal prøver, der skal følges parallelt, stiger antallet af individuelle målinger desuden og reducerer dermed den tilgængelige tidsopløsning for hver brønd gradvist - selv for state of the art multichannel-optagelser. Under sådanne forhold kan hurtige og forbigående cellereaktioner slippe ud af målingen. Hertil kommer, at den konventionelle en brønd - en koncentration tilgang pålægger en betydelig tid og omkostningsfaktor på perfunderede organ-on-chip eller body-on-chip udvikling med hensyn til deres egnethed i ligand-GPCR interaktion analyse.
Derfor udviklede vi en trinvis doseringsprotokol, der gør det muligt at registrere fuld dosisresponskurver for ligand-induceret GPCR-aktivering i dyrkede cellemonolag ved løbende at overvåge impedansen for en enkelt brønd, mens den agonistiske koncentration øges trinvist. Den seriet agonist tilføjelse protokol øger gennemløb pr godt fra en koncentration til 10 eller flere koncentrationer, som vist på det nuværende eksempel på humane U-373 MG celler, som endogent udtrykke histamin 1 receptor (H1R). Metoden har således potentiale til at forbedre gennemløbet betydeligt i analyser af etiketfri dosisrespons, mens tidsopløsningen bevares på det instrumentale maksimum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellesåning på elektrode arrays
BEMÆRK: Udvælgelse af elektrodelayout er en afvejning mellem følsomhed og antallet af undersøgte celler. Jo mindre elektroden er, jo mere følsom er målingen, men jo mindre er antallet af undersøgte celler. For celler, der viser stærke impedansudsving over tid under baseline betingelser, større eller interdigiterede elektroder er at foretrække.
- Forvarm alle løsninger, der er nødvendige for standardcellegangs- og såning i et 37 °C vandbad. For analyser med menneskelige U-373 MG celler det tager: fosfat buffered saltvand (PBS) uden calcium og magnesium, 0,05% (w / v) trypsin, celle kultur medium (Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) suppleret med 5% (v / v) føtale kalv serum (FCS), 2 mM L-glutamin og 100 μg/mL penicillin / stretocin).
- Skyl cellelaget i bestanden kultur dyrket på bunden af konventionelle celle kultur kolber eller retter med PBS to gange.
- Pbs fjernes, tilsæt trypsinopløsningen (1 ml i 25 cm2)og lad cellerne inkubere ved 37 °C i 5 min. (gælder for U-373 MG-celler).
- Kontrol for fuldstændig løsrivelse af cellerne fra bunden af vækstsubstratet ved mikroskopi.
- Stop trypsin reaktion, så snart cellerne er helt løsrevet ved at tilføje 9 ml celle kultur medium pr 1 ml trypsin til celle suspension. Skyl forsigtigt de resterende celler fra bunden af cellekulturens underlag ved at pipettere suspensionen over underlaget.
- Celleaffjedring opsamles med en pipette, og overfør den til et centrifugationsrør (15 ml eller 50 ml rør).
- Spin ned cellerne ved centrifugering ved 110 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern forsigtigt supernatanten, og sæt cellepelletet i kulturmedium igen, før cellerne tælles (f.eks. ved hjælp af et hemacytometer til fasekontrastmikroskoper og manuel optælling).
- Juster celleaffjedringen til den ønskede celletæthed. Ved forsøg med U-373 MG-celler skal der anvendes 100 000 celler/cm2 til at dyrke et flydende cellelag inden for 48 timer. Dette svarer til en celletæthed på 200 000 celler/ml for 8-brønds elektrodearrays med et vækstareal på ~0,8 cm2 og et godt volumen på 400 μL.
BEMÆRK: For reproducerbare GPCR aktiveringsforsøg, celler bør dyrkes til flydende monolag på elektrode arrays. For at sikre korrekt receptorudtryk på celleoverfladen skal cellerne ses mindst 36 timer, før forsøget udføres. Test forskellige celletætheder for cellesåning er ofte meningsfuldt at identificere de bedste eksperimentelle betingelser. - Tilsæt celleaffjedring til brøndene i elektrodearrayet og lad sælgerne slå sig ned ved stuetemperatur i 10 – 15 min for at sikre ensartet fordeling af celler i bunden af brøndene.
- Vækst celler i mindst 36 timer i en standardcellekulturkuvøse med 5% CO2 (afhængig af medium type) ved 37 °C og befugtet atmosfære. Skift cellekulturmedium 24 timer før eksperimentet.
- På dagen for forsøget skal cellelagene på elektrodearrays undersøges ved (fasekontrast) mikroskopi for at sikre fuldstændig dækning af elektroder med celler.
2. Ligevægt af celler i serumfrit medium
- Prævarm serumfrit medium, i denne undersøgelse: Leibovitz's L15 medium.
- Fjern cellekulturmedium fra celler, der dyrkes på elektrodearrays, og erstatte med forvarmet serumfrit medium. Brug 200 μL til 8-brønds-elektrodearrays og 150 μL til 96-brønds elektrodearrays.
- Cellerne skal jævnisere saeje i serumfrit medium ved 37 °C i mindst 2 timer. Ækvilibreringstiden afhænger i høj grad af celletypen. For eksempel, U-373 MG celler har brug for 2 h, CHO celler har brug for 4 timer, BAEC kan kræve natten ligevægt i L-15 medium.
BEMÆRK: L-15 medium er CO2 uafhængig og kræver en CO2-friatmosfære. For ligevægt i L-15 indstiller rugemaskinen til 0 % CO2. Ligevægt kan overvåges ved impedansaflæsninger, hvilket vi anbefaler at gøre for de første eksperimenter.
3. Overvågning af celleligevægt med impedansaflæsninger
- Placer elektrodearrayet i forbindelsesarrayholderen på impedansanalysatoren.
- Sørg for korrekt lav impedanskontakt mellem elektroder og impedansanalysator. Denne kontrol er individuelt forskellig for forskellige instrumenter.
BEMÆRK: Hvis instrumentet ikke kan oprette forbindelse til elektroderne, skal du åbne kontaktklemmen igen, justere elektrodearrayet for korrekt placering inde i holderen og prøve igen. - Vælg elektrodetype og/eller flerbrøndformat fra softwarens brugergrænseflade.
- Konfigurer måleparametrene. Der er forskellige muligheder.
BEMÆRK: For at vælge den mest følsomme frekvens for ac henviser vi til litteratur- og instrumentmanualerne, da det afhænger af elektrodelayout og celletype under studiet. Typisk er sensorfrekvensen inden for rækkevidde af 4 kHz – 50 kHz. Her blev U-373 MG celler dyrket på cirkulære arbejdselektroder med en diameter på 250 μm, og de blev overvåget med en frekvens på 12 kHz.- Hvis der findes indstillinger for dataindsamling af enkelt- og flere frekvensdata, skal du vælge enkeltfrekvenstilstanden for at sikre maksimal tidsopløsning. Målingen udføres med denne ene frekvens. For de mest udbredte instrumenter er der en række forudindstillede frekvenser langs det tilgængelige frekvensvindue.
- Hvis antallet af undersøgte brønde er lavt, eller tidsopløsningen ikke er kritisk, skal du vælge flere frekvensoptagelser i stedet. Impedance aflæsninger på et bestemt antal frekvenser vil blive registreret for hver brønd til senere dybdegående analyse.
BEMÆRK: Tidsopløsningen falder med stigende antal registrerede frekvenser pr. brønd og et stigende antal brønde. Mulighederne for valg af frekvens- og dataanskaffelsestilstand varierer afhængigt af instrumenttype og version.
- Start erhvervelse af tidskursusdata.
- Følg cellelagets impedans (mindst 2 timer), indtil impedansen er stabiliseret. I mellemtiden skal du forberede de agonistiske løsninger.
- Når cellelagene har nået et stabilt impedansniveau, fortsætter enten (i) den serielagonistiske tilføjelse inden for samme eksperiment eller (ii) opsiger dataindsamlingen og starter et nyt datasæt til overvågning af aktivering af agonistinduceret receptor.
4. Udarbejdelse af agonistløsninger til forsøg i agonisttilstand
- Koncentrationen af agonistopløsninger beregnes efter behov for hvert trin i seriedosering i henhold til ligning (1). n varierer fra 1 til det samlede antal serietillæg i. x angiver koncentration og volumen i brønden ved trin n. y angiver koncentration og volumen af "opløsning-til-være-tilsætning" i trin n.
BEMÆRK: Overvej antallet af replikater, og beregn den samlede mængde "løsning-til-være-tilsat" for hvert koncentrationstrin. Resultaterne af en typisk beregning findes i tabel 1-4. Det tager en generel idé om det agonistkoncentrationsområde, der skal undersøges, da området definerer koncentrationer og antal portioner, der skal administreres under serietilsætning. Ved hjælp af serieagonist tilføjelse protokol agonist koncentration en stigning trinvis. Derfor skal mængden af agonist allerede i brønden, når den næste dosis tilsættes, tages i betragtning. Når antallet af agonistmolekyler, der allerede findes i brønden, er nx = cx ∙Vx (med den aktuelle koncentration cx og volumen Vx) og antallet af molekyler i brønden efter den næste tilsætning er nx+y, bestemmes antallet af molekyler, der skal tilsættes ny, af koncentrationen cy og volumen Vy af opløsningen, der skal anvendes på brønden (ny = cy ∙ V). Efter tilsætning af en del af agonist er den nye mængde agonistmolekyler i brønden: cx+y ∙ Vx+y = cx ∙ Vx + cy ∙ Vy. Denne beregning gælder for hvert efterfølgende trin. På grund af den indbyrdes afhængighed af pinedrist koncentration i brønden og mængden af agonist i de portioner, der skal tilføjes med hvert trin, er det vigtigt at definere de endelige koncentrationer efter hvert trin på forhånd.
Tilstand 1: Mængden i brønden vil stige med hvert trin som væske tilsættes løbende.
Brug Vx1 = 200 μL og Vy1 .... Vyi = 30 μL ved hjælp af denne tilstand og et 8-brøndsformat.
Tilstand 2: Lydstyrken i brønden er konstant, da den diskenhed, der tilføjes med hvert trin, fjernes lige før den efterfølgende tilføjelse.
Brug Vx1 = 150 μL og Vy1 .... Vyi = 75 μL ved hjælp af denne tilstand og et 96-brøndformat.
- Udskriv databladet med den samlede mængde pr. koncentration og detaljerede instruktioner til pipettering.
- Forbered alle løsninger i det nødvendige beløb. Lav alle agonistopløsninger i det samme serumfrie medium som de anvendes til ligevægt af cellerne.
FORSIGTIG: Histamindihydrochlorid anses for farligved OSHA Hazard Communication Standard 2012 (29 CFR 1910.1200). Histamin forårsager hudirritation, alvorlig øjenirritation, kan forårsage en allergisk hudreaktion, allergi, astmasymptomer eller åndedrætsbesvær ved indånding og kan forårsage irritation af luftvejene. Overvej sikkerhedsdatabladet.
BEMÆRK: Gør agonistløsninger så friske som muligt. Stabiliteten af agonister i opløsning kan variere betydeligt. Opløsningerne opbevares ved 4 °C eller derunder, indtil de anvendes i forsøget. For nogle molekyler yderligere stabiliserende tilsætningsstoffer, ligesom BSA ved brug peptid-baserede eller lipid-baserede molekyler, kan overvejes for at forhindre adsorption til væggene i brønde og rør. - Hvis du udfører eksperimentet i 96-brøndsformat, overføres løsninger til en konventionel 96-brøndsplade (ingen elektroder) og bruger en kanalpipet på 8- (eller 12) til hurtig væskeoverførsel til elektrodearrayet.
5. Forberedelse af agonistløsninger til forsøg i antagonisttilstand
BEMÆRK: Klargør antagonistopløsningen/-opløsningen/koncentrationen, der skal anvendes hele vejen igennem. Volumen og koncentration af antagonistopløsning afhænger af tilstanden af agonist tilsætning (1 eller 2). Eksempler på forsøg i 8-brønds eller 96-brøndsformat i billedtilstand 2: (A) 8-brøndsformat (Vx1 = 200 μL, VAntagonist = 200 μL); B) 96-brøndsformat (Vx1 = 150 μL, VAntagonist = 75 μL).
- Koncentrationen af hver agonistopløsning, der er nødvendig for hvert trin i seriedoseringen, som beskrevet i trin 4.1.
- Lav alle agonistopløsninger i samme serumfrie medium som anvendes til ligevægt af cellerne, og tilsættes antagonisten ved samme endelige koncentration som planlagt for de respektive brønde i forsøget.
BEMÆRK: I dette tilfælde fremstilles histaminbestandens opløsning (10 mM) i L-15-mediet. Når agonister opløses i andre opløsningsmidler (f.eks. dimethylsulfoxid (DMSO), bør der medtages en opløsningsmiddelkontrol for at tage højde for den stigende opløsningsmiddelbelastning ved hvert trin tilsætning.
6. Udførelse af seriel tilføjelse protokol i agonist mode
- Start dataindsamling som beskrevet i trin 3.1 - 3.5.
- Varm agonistopløsningerne før brug ved at placere dem i rugemaskinen ca. 10 - 15 minutter før tilsætning.
BEMÆRK: Ved brug af termolabilstoffer bør opløsningerne ikke opbevares ved 37 °C for længe. Hvis forvarmning i 10 - 15 min anses for kritisk, bringe løsninger til 37 °C kort før tilsætning i et vandbad. - Kør den agonist seriel dosering afhængig af den valgte tilføjelsetilstand. Følgende tilstand 1 øges den samlede volumen i brønden med hver tilsætning af den næste dosis. I tilstand 2 fjernes det samme volumen, som tilføjes med hvert trin, også igen, lige før du tilføjer den næste højere dosis.
BEMÆRK: Den tid, der er nødvendig for at afkøle cellelaget i mellem to efterfølgende agonistdoser, afhænger af cellernes responstid. Et indledende eksperiment i paralleltilstand (en brønd – en koncentration) afslører (i) celleresponstider for forskellige agonistiske koncentrationer og (ii) den mest følsomme kurveparameter (f.eks. impedans maksimum, impedans efter tid x).
A: Mode 1 / 8-brønd format
- Der tilsættes 30 μL af den første opløsning med den laveste koncentration af agonist til de celler, der blev jævnet med 200 μL serumfrit medium.
- Lad cellerne reagere og equilibere i den foruddefinerede periode (f.eks. 15 min. ).
- Der tilsættes 30 μL af den anden opløsning med den næste højere koncentration.
- Gentag trin 6.3.1-6.3.3 med den tredje, fjerde osv.
BEMÆRK: Hvis du arbejder med 10 koncentrationstrin, vil det resultere i en samlet volumen på 500 μL i slutningen af forsøget, hvilket ligger lige under den maksimalt gældende volumen af disse brønde på ~ 550 μL.
B: Mode 2 / 96-brøndformat
BEMÆRK: Pause dataindsamling under hver væskehåndtering trin (addition / fjernelse) via impedansinstrumentets software, når du kører eksperimenter i 96-brønd format. Den mere omfattende væskehåndtering kan forstyrre dataindsamlingen. Brug en flerkanals pipette.
- Sæt dataindsamlingen på pause.
- Tilsæt 75 μL af den første opløsning med den laveste koncentration af agonist til de celler, der blev jævnet med 150 μL serumfrit medium.
- Genoptag dataindsamling.
- Lad cellerne reagere og equilibere i den foruddefinerede periode (f.eks. 15 min. ).
- Ca. 1 – 2 min før den almindelige ligevægtstid slutter, skal du sætte målingen på pause og fjerne 75 μL fra hver brønd.
BEMÆRK: Det tidspunkt, hvor opløsningen skal fjernes, afhænger af antallet af brønde, der overvåges parallelt, og rørhastigheden. Den tid, der er nødvendig for at fjerne opløsningerne, bør ikke overstige tiden mellem de efterfølgende trin. - Tilsæt 75 μL af den anden opløsning med den næste højere koncentration, og målingen genoptages.
- Gentag trin 6.3.8-6.3.10 med den tredje, fjerde osv.
7. Udførelse af seriel tilføjelse protokol i antagonist mode
- Start målingen som beskrevet i trin 3.1 – 3.5.
- Under ligevægt af cellelagene forberedes antagonistopløsning (f.eks. 200 μL 1,5 μM diphenhydraminhydrochlorid i L15-medium).
FORSIGTIG: Diphenhydraminhydrochlorid har potentielle akutte sundhedsmæssige virkninger. Det er skadeligt ved indtagelse eller indånding, kan forårsage øjen- og hudirritation. Det kan forårsage luftvejs- og fordøjelseskanalen irritation. Overvej sikkerhedsdatabladet. - Forvarm antagonist- og agonistopløsningerne ved at placere dem i rugemaskinen ca. 10 - 15 minutter før tilføjelse til cellekulturerne (jf. 6.2). Hvis antagonist-fri brønde er inkluderet i analysen så godt, også pre-varm serum-fri medium.
- Tilføj antagonist opløsning til de udpegede brønde. Lad cellerne equilibrate med antagonist i 15 - 20 min. Hvis antagonist-fri brønde er inkluderet, tilføje den samme mængde serum-fri medium til disse brønde.
- Ifølge antagonist tilføjelse i mode 2, fjerne opløsning fra brøndene
(A) 8-brøndsformat (200 μL)
B) 96-brøndsformat (75 μL) - Kør den agonist tilføjelse sekvens som beskrevet i trin 6.3.
8. Dataeksport og -analyse
- Eksporter data ved hjælp af impedansinstrumentets software for at konvertere alle registrerede data fra proprietære dataformater (f.eks. csv). Dette trin giver mulighed for datareorganisering og præsentation med andre softwarepakker.
- Indlæs csv-formaterede data til videnskabelige dataanalysesoftware.
- Normaliser impedansværdier ved at trække impedansen for det sidste datapunkt før den første tilføjelse af agonistopløsning og ved at indstille tidspunktet for tilsætning til t = 0. Plot tid løbet af normaliseret impedans.
- Plot de enkelte tidskurser og identificere maksima i impedans efter hver tilføjelse trin. Opret et dataark med disse værdier.
- Afbilde værdierne for maksimal (eller minimum, hvis relevant) impedans ændringer som en funktion af agonist koncentration. Dette kan gøres for individuelle brønde eller for gennemsnit (gennemsnitlige ± SD).
- Brug en datatilpasningsrutine til at bestemme halvmaksimale effektive koncentrationer (EC50) og maksimal respons (EMax) ved hjælp af den fire parameterlogistikmodel (ligning 2):
BEMÆRK: c angiver agonistkoncentrationen, A1 er minimum, og A2 er den maksimale asymptote af den sigmoidal dosisresponskurve (A2 = EMax). EF50 er koncentrationen ved kurvens bøjningspunkt, og n svarer til Bakkehældningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En typisk ordning for forberedelse af de forskellige agonistløsninger vises til et eksperiment med 8-brønds elektrodearrays med histamin som agonist i tabel 1-4. Tabel 1 og tabel 2 viser mængder og koncentrationer for et eksperiment ved hjælp af tilsætningstilstand 1 (jf. figur 1), mens tabel 3 og tabel 4 viser mængder og koncentrationer til et forsøg efter tilsætningstilstand 2 (jf. figur 1). Data er beregnet ved hjælp af ligning (1).
Et repræsentativt eksperiment er vist i figur 2 for nålelag af U-373 MG-celler, som endogent udtrykker histamin 1-receptoren, der dyrkes på et 8-brønds elektrodearray med en fungerende elektrode med en fungerende elektrode med en diameter på 250 μm ved hjælp af histamin som agonist. Målingen blev udført med en enkelt frekvens på 12 kHz. Tilsætning af kontionskoncentrationsserien blev udført efter tilstand 1. I det valgte eksperiment blev 10 opløsninger med stigende histaminkoncentration (fremstillet i henhold til trin 4) tilføjet sekventialt hver 15 min. Seriedoseringsordningen blev anvendt på syv af otte brønde. I et godt agonist-frit medium (L-15) blev tilføjet sekventialt som en negativ kontrol i ni af ti trin. Den sidste tilføjelse til denne kontrol var en histaminopløsning, der gav en endelig koncentration på 100 μM histamin i brønden. Data er afbildet med dataanalysesoftware og vises som impedansændring Δ| Z| 12 kHz / kΩ langs eksperimentet, med impedansændringen og tidspunktet for den første tilføjelse er sat til nul. Den indledende ækvilibreringstid i forsøgsbufferen på 2 timer vises ikke i dette område. Tidspunkterne for agonist tilføjelse er angivet med pile.
Ændringen i impedans en plan for baseline efter hvert koncentrationstrin blev udvundet fra kurverne ved hjælp af en datamarkør. På trin uden klart maksimum blev det sidste datapunkt før den næste tilføjelse brugt til analyse. Impedans ændringer Δ| Z| 12 kHz blev afbildet som en funktion af histaminkoncentrationen (cx+y) (figur 2B, symboler). Overførselsfunktionen for en fireparameterlogistikmodel (jf. trin 8.6) blev monteret på forsøgsdatapunkterne fra syv brønde(figur 2B, linjer). De tilpassede resultater vises i tabel 5. Figur 2C og figur 2D viser resultatet af gennemsnit af dataene i figur 2A og figur 2B, der viser gennemsnit ± SD for syv brønde. Gennemsnitlige tidsforløbsdata er sammenfattet i figur 2C, mens den gennemsnitlige dosisresponskurve findes i figur 2D.
I forholdet mellem dosis og respons som vist i figur 2B,Dblev monteringsproceduren anvendt på hele koncentrationsområdet, der returnerede EC50 = (0,86 ± 0,13) μM. Impedansresponsen øges monotont med stigende histaminkoncentration med undtagelse af de sidste to koncentrationstrin (30 μM, 100 μM endelig koncentration). Dette svar er formentlig forklares ved downregulation af histamin receptor, desensibilisering eller over-stimulation af cellerne (se diskussion). For at tage højde for denne virkning er analyseområdet blevet reduceret, som vist for et enkelt serielt doseringseksperiment (figur 3; godt 1), der er udvalgt blandt de data, der er vist i figur 2. Desuden er det velbegrundet at indstille den nedre asymptote (A1) til nul under mindst kvadratisk optimering, forudsat at der ikke er nogen impedansændring som reaktion på 0 μM histamin. Anvendelsen af denne treparameteroptimering giver en EF50 (0,75 ± 0,12) μM (jf., figur 3B). Det blev konstateret, at EF50-værdierne var ufølsomme for en af dataanalysetilstandene og ikke var væsentligt forskellige.
Typiske resultater for et 96-brøndpladeeksperiment er sammenfattet i figur 4. U-373 MG celler blev dyrket på 96-brønd elektrode arrays som beskrevet ovenfor. 32 brønde blev inkluderet i målingen. 8 brønde tjente som agonist-fri kontrol, udsat for medium kun. 24 brønde blev udsat for en række stigende histaminkoncentrationer beregnet og forberedt til tilsætningsmåde 2. Tidsforløbet for impedansændring vises for alle 32 individuelle brønde i figur 4A. En af kurverne (fremhævet med rødt) viser et usædvanligt tidsforløb og blev udelukket fra yderligere analyse. Derfor blev data fra 23 brønde i gennemsnit og afbildet som tidsforløb med gennemsnitlig eimpedansændring (gennemsnitlig ± SD) i figur 4B. Hver enkelt kurve blev analyseret som beskrevet ovenfor for forholdet mellem dosis og respons. Datapoint blev i gennemsnit og afbildet som funktion af den endelige histaminkoncentration (figur 4C). Dosisresponsdata blev analyseret ved hjælp af den fire parameterlogistikmodel, som returnerede en gennemsnitlig EF50-værdi på (1,0 ± 0,3) μM.
Et typisk resultat for den serielagonistiske tilføjelsesprotokol i antagonisttilstand vises i figur 5. Her blev en brønd forbehandlet med 0,75 μM af histaminreceptoren antagonist diphenhydramin (rød kurve) 20 min, før den første histamin blev tilføjet (figur 5A). Kontrolelementet fik antagonistfrit medium (blå kurve). Antagonisten blev tilføjet efter tilstand 2, hvilket betyder, at 200 μL af de endelig 400 μL blev fjernet, før agonistserien blev anvendt. Agonist (histamin) blev tilføjet efter seriedoseringstilstand 1 som beskrevet i eksemplerne ovenfor. Det er vigtigt for eksperimenter i antagonisttilstand, at antagonistkoncentrationen holdes konstant i hele forsøgets løb. Derfor skal alle agonistopløsninger, der tilsættes brønden, også indeholde den foruddefinerede antagonistkoncentration (i dette tilfælde 0,75 μM), mens kontrollen forbliver antagonistfri. En antagonistisk effekt viser sig ved en "forsinket" stigning i impedans inden for den serielle doseringsordning svarende til højere agonistiske koncentrationer, der er nødvendige for at fremkalde et cellerespons. I forholdet mellem dosis og respons udtrykkes virkningen af antagonisten som et højreskift i kurverne, hvilket svarer til en stigning i EF50,forudsat at antagonisten er en konkurrencedygtig ligand i forhold til agonist (figur 5B). EF50 blev bestemt til (0,92 ± 0,05) μM uden antagonist og (14,7 ± 0,6) μM i dens tilstedeværelse.
Figur 1: Serieagonist tilføjelsetilstande. A) Skemamatisk illustrerer koncentrationsberegninger. Ved at tilsætte agonistopløsning af koncentration cy og volumen Vy til en brønd med volumen Vx og agonistkoncentration cx, øges volumenet til Vx+y, og koncentrationen øges til cx+y. (B) To forskellige tilstande for serieagonist tilføjelse. Tilstand 1: Den samlede volumen i brønden Vx+y stiger med hver tilføjelse. Tilstand 2: Den mængde, der tilsættes ved hvert koncentrationstrin, fjernes igen, før den næste dosis tilsættes, hvilket holder det samlede volumen i brønden konstant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Resultater af et typisk eksperiment i 8-brøndsformat. (A) Tidsforløb for impedansskift ved 12 kHz for flydende U-373 MG cellelag dyrket på cirkulære arbejdselektroder med en diameter på 250 μm. I syv af otte brønde seriel tilføjelse af histamin blev anvendt. En brønd (grå kurve) blev sekventialt fyldt med histaminfri buffer ved hvert trin (tilstand 1), bortset fra det sidste trin, hvor 100 μM histamin blev tilføjet som en positiv kontrol. (B) Forholdet mellem dosis og respons, der er frembragt ved den maksimale impedansændring i forhold til basislinjen for syv individuelle brønde efter hvert koncentrationstrin. (C) Gennemsnitligt tidsforløb for impedansændring (gennemsnitlig ± SD) fra syv individuelle brønde som vist i (A). (D) Gennemsnitlige dosis-respons relationer genereret fra individuelle datasæt som vist i (B). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Tilpasning af dataanalysetilstande. (A) Typisk tidsforløb for impedansskift ved 12 kHz for et enkelt flydende U-373 MG cellelag dyrket på cirkulære arbejdselektroder med en diameter på 250 μm. (B) Eksperimentel dosis-respons forhold (fyldte symboler) genereret fra den maksimale impedans ændring i forhold til baseline efter hver koncentration stigning. Enten blev det fulde datasæt underkastet monteringsproceduren (sort og grå kurve) eller det sidste datapunkt - der angiver indtræden af receptordesibilisering og/eller internalisering - udeladt fra kvantitativ analyse (rød og magentakurve). Alle fire parametre blev justeret under mindst kvadratisk optimering (sort og rød kurve) eller parameteren A1, der repræsenterer den nederste asymptote, blev indstillet og fastgjort til nul (grå og magenta kurve). EF50-værdierne var ikke væsentligt forskellige for de to dataanalysetilstande. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Typisk eksperiment i 96-brøndsformat. (A) Tidsforløb for impedansskift målt ved 12 kHz for flydende U-373 MG cellelag dyrket på en 96-brønd elektrode array. Data vises for 32 brønde. 24 brønde blev udsat for en række stigende histaminkoncentrationer tilsat med en ækvilibreringstid på 15 minutter mellem hvert trin. Kurven fremhævet med rødt blev udelukket fra gennemsnit. Otte brønde (kontrol) blev behandlet med histamin-fri medium på hvert tidspunkt, hvor tilsætning. (B) Tidsforløbet af gennemsnitlige impedansændring for 23 individuelle brønde som reaktion på histaminserie tilsætning og otte kontrolbrønde som vist i (A). (C) Gennemsnitlig dosis-respons forhold genereret fra den maksimale impedans ændring i forhold til baseline efter hver koncentrationsstigning (gennemsnitlig ± SD). Dataene var udstyret med en fireparameterlogistikfunktion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Typisk eksperiment i antagonisttilstand. (A) Tidsforløb for impedansskift ved 12 kHz for flydende U-373 MG cellelag dyrket på cirkulære arbejdselektroder med en diameter på 250 μm ved tilsætning af stigende koncentrationer af histamin med eller uden tilstedeværelse af histaminreceptor antagonist diphenhydramin. Diphenhydramin (0,75 μM) eller antagonistfrit medium (L15) blev tilføjet 20 minutter, før den agonistiske seriedosering startede. (B) Forholdet mellem dosis og respons, der er fremkommet ved den maksimale impedansændring i forhold til basislinjen efter hver koncentrationsstigning fra data vist i punkt A. Tilstedeværelsen af 0,75 μM Diphenhydramin øgede EC50 fra (0,92 ± 0,05) μM til (14,7 ± 0,6) μM. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Løsning # | cx+y (μM) | cx (μM) | Vx (μL) | Vx+y (μL) | Vy (μL) | cy (μM) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 230 | 30 | 0.08 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 230 | 260 | 30 | 0.79 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 260 | 290 | 30 | 2.03 |
| 4 | 1 | 0.3 | 290 | 320 | 30 | 7.77 |
| 5 | 3 | 1 | 320 | 350 | 30 | 24.33 |
| 6 | 10 | 3 | 350 | 380 | 30 | 91.67 |
| 7 | 30 | 10 | 380 | 410 | 30 | 283.33 |
| 8 | 100 | 30 | 410 | 440 | 30 | 1056.67 |
Tabel 1: Koncentrationsberegningsskema for forsøg med 8-brønds elektrodearrays efter tilsætningstilstand 1.
| Løsning # | cy (μM) | Vy (μL) | gøre fra | c (μM) | fortyndingsfaktor | gøre alt V (μl) | anvendelse (μl) | tilsættes V (μl) |
| 1 | 0.08 | 30 | 3 | 2.03 | 26.52 | 600 | 22.6 | 577.4 |
| 2 | 0.79 | 30 | 4 | 7.77 | 9.83 | 600 | 61 | 539 |
| 3 | 2.03 | 30 | 5 | 24.33 | 11.97 | 600 | 50.1 | 549.9 |
| 4 | 7.77 | 30 | 6 | 91.67 | 11.8 | 600 | 50.8 | 549.2 |
| 5 | 24.33 | 30 | 7 | 283.33 | 11.64 | 600 | 51.5 | 548.5 |
| 6 | 91.67 | 30 | 8 | 1056.67 | 11.53 | 600 | 52.1 | 547.9 |
| 7 | 283.33 | 30 | 8 | 1056.67 | 3.73 | 600 | 160.9 | 439.1 |
| 8 | 1056.67 | 30 | 10 mM Lager | 10000 | 9.46 | 800 | 84.5 | 715.5 |
Tabel 2: Pipetting-skema for forsøg med 8-brønds elektrodearrays efter tilføjelsestilstand 1.
| Løsning # | cx+y (μM) | cx (μM) | Vx (μL) | Vx+y (μL) | Vy (μL) | cy (μM) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 400 | 200 | 0.02 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 200 | 400 | 200 | 0.19 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 200 | 400 | 200 | 0.5 |
| 4 | 1 | 0.3 | 200 | 400 | 200 | 1.7 |
| 5 | 3 | 1 | 200 | 400 | 200 | 5 |
| 6 | 10 | 3 | 200 | 400 | 200 | 17 |
| 7 | 30 | 10 | 200 | 400 | 200 | 50 |
| 8 | 100 | 30 | 200 | 400 | 200 | 170 |
Tabel 3: Koncentrationsberegningsskema for forsøg med 8-brønds elektrodearrays efter tilsætningstilstand 2.
| Løsning # | cy (μM) | Vy (μL) | gøre fra | c (μM) | fortyndingsfaktor | gøre alt V (μl) | anvendelse (μl) | tilsættes V (μl) |
| 1 | 0.02 | 200 | 3 | 0.5 | 25 | 1000 | 40 | 960 |
| 2 | 0.19 | 200 | 4 | 1.7 | 8.95 | 1000 | 111.8 | 888.2 |
| 3 | 0.5 | 200 | 5 | 5 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 4 | 1.7 | 200 | 6 | 17 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 5 | 5 | 200 | 7 | 50 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 6 | 17 | 200 | 8 | 170 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 7 | 50 | 200 | 8 | 170 | 3.4 | 1000 | 294.1 | 705.9 |
| 8 | 170 | 200 | 200 μM Lager | 200 | 1.18 | 1300 | 1105 | 195 |
Tabel 4: Pipetting-skema for forsøg med 8-brønds elektrodearrays efter tilføjelsestilstand 2.
| Godt | EF50 | Emaks (=A2) | A1 | N |
| (μM) | (kΩ) | (Ω) | ||
| 1 | 0,9 ± 0,1 | 1680 ± 70 | 150 ± 80 | 1,9 ± 0,5 |
| 2 | 0,7 ± 0,2 | 1770 ± 90 | 200 ±140 | 1,3 ± 0,4 |
| 3 | 0,6 ± 0,2 | 1700 ± 100 | 60 ± 250 | 1,1 ± 0,5 |
| 4 | 0,6 ± 0,2 | 2000 ± 100 | 140 ± 180 | 1,3 ± 0,4 |
| 5 | 0,9 ± 0,1 | 1810 ± 60 | 160 ± 80 | 1,4 ± 0,3 |
| 6 | 0,8 ± 0,1 | 1950 ± 70 | 200 ± 110 | 1,3 ± 0,3 |
| 7 | 0,6 ± 0,3 | 1700 ± 200 | 260 ± 250 | 1,6 ± 1,0 |
| 1 – 7 | 0,7 ± 0,2 | 1900 ± 100 | 100 ± 100 | 1,1 ± 0,2 |
Tabel 5: Resultater fra fire parameterlogistikpasser, der anvendes på typiske dosisresponsdata. De dosis-responsdata, der anvendes til analyse, er fremlagt i figur 2. Det fulde koncentrationsområde blev anvendt til analyse for de enkelte brønde en til syv(figur 2B) og for de gennemsnitlige data fra brønde 1 til 7 (figur 2D). Ingen af parametrene for logistikfunktionen blev fastsat under mindst kvadratisk optimering. Fit resultater blev afrundet til årti af fejlen, undtagen hvis værdien var mindre end fejlen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en metode til etiketfri impedansmålinger for at bestemme forholdet mellem dosis og respons for agonist-induceret GPCR-aktivering i fravær eller tilstedeværelse af specifikke antagonister for den samme receptor. Beviset for denne metode blev fremlagt i en nylig publikation12. Så vidt vi ved, er det den første undersøgelse, der beskriver etableringen af en fuld dosis-respons kurve af agonist-medieret GPCR aktivering ved hjælp af en enkelt celle lag in vitro. Tilgangen kræver uundgåeligt brug af mærkningsfri celleovervågningsmetoder og vil ikke kunne anvendes på endepunktsanalyser.
Protokollen er blevet påvist på eksemplet med U-373 MG celler, som endogent udtrykke den menneskelige histamin 1 receptor (hHR1), der stimuleres med en række stigende koncentrationer af sin endogene agonist histamin, mens impedans af cellerne er løbende registreres. For at påvise, at protokollen er anvendelighed til antagonistundersøgelser, blev forsøgene gentaget i nærvær af en konstant koncentration af diphenhydramin, en konkurrencedygtig antagonist til hH1R. Impedance optagelser er også blevet brugt med succes til at studere andre H1R agonists (f.eks UR-KUM53011, individuelle og trinvis dosering) og antagonister (f.eks Mepyramin)12 ud over de eksempler, der vises her. Desuden er protokollen også blevet anvendt på andre cellelinjer og receptorer, f.eks. Mens U373-MG- og BAEC-celler udtrykker de respektive receptorer H1R og ß2AR ved endogene niveauer, er CHO-D2R et eksempel på en rekombinant cellemodel. Samlet set gælder serieprotokollen generelt for celletyper med endogene eller ektopiske GPCR-udtryk, GPCR'er med forskellige koblingstyper Gq (f.eks. H1R), Gs (f.eks. ß2AR), Gi (f.eks. D2R) samt forskellige ligandtyper (agonist/antagonist). I alle de celle/receptortyper, der er nævnt ovenfor, stiger impedansen med stigende pinenoistkoncentration. Nogle celler reagerer dog på GPCR-aktivering ved et impedansfald. Vi testede protokollen for et sådant tilfælde (HaCaT/histamin) og fandt også et koncentrationsafhængigt trinvist fald, der støttede begrebet en generelt anvendelig tilgang, der også er forenelig med ændringer i omvendt impedans. Det er blevet foreslået, at det detaljerede tidsforløb for impedansdata angiver typen af G-proteinkobling af en given receptor. Selvom konceptet er attraktivt, understøtter puljen af vores data ikke en generelt gældende regel, der korrelerer impedanstidsprofilen med G-proteinkobling af en given GPCR6.
Den serielle tilføjelse protokol kan tilpasses til forskellige typer af elektrode layouts og multi-well formater. Det gælder for on-chip perfusion systemer, hvilket er en betydelig fordel i forhold til mange etiket-baserede tilgange, der ofte kræver et cellelag for en koncentration, der skal testes. Derfor kan den serielle doseringsordning bane vejen for dosis-respons undersøgelser i mere komplekse biologiske modeller som organ-on-a chip eller endda menneske-på-en-chip tilgange. Impedansmålinger registrerer en integreret, distalt respons af cellerne på receptoraktivering, der i sidste ende inducerer cellemorfologiændringer. Denne ret generelle og uspecifikke, men også upartiske udlæsning er grundlaget for dens brede anvendelighed, der ikke er begrænset til GPCRs, men kan også arbejde for andre klasser af celleoverfladereceptorer, cytoplasmatiske receptorer eller endda intracellulære proteiner som mål.
Det er afgørende for den trinvise agonist tilføjelse protokol til at arbejde med flydende celle lag på elektroderne, som sparsomme kulturer vil forstyrre følsomhed, reproducerbarhed og data fortolkning. En yderligere forudsætning for vellykket overvågning af receptoraktivering selv i flydende cellemonolag er en ændring i celleform langs signaltransduktionskaskade. Hvis de undersøgte celler ikke ændrer deres morfologi langs eksperimentet, er impedansbaserede udlæsninger blinde og vil ikke rapportere om nogen ændring i receptoraktivitet. For korrekt layout den serielle tilføjelse protokol, indledende pre-test i konventionelle one-well-one-concentration mode anbefales at bestemme koncentrationsområdet af agonist groft og tidsintervallet mellem efterfølgende agonist tilføjelser. Tidsintervaller ne mellem fortløbende doser af agonistbør skræddersys således, at systemet indfører en ny ligevægt inden næste, højere dosis tilsættes. Derfor kan metoden være mindre nyttig for receptorer, der udløser en meget hurtig og kun forbigående reaktion af cellerne eller en meget langsom respons, der kan tage timer at fuldføre. Sidstnævnte situation vil øge den samlede tid af eksperimentet og opfordre til parallel tilføjelse protokoller til at afkorte på lab tid. I de eksempler, der blev præsenteret ovenfor, var forsøgets samlede kørselstid 2,5 – 3,5 timer, afhængigt af antallet af koncentrationer (8 eller 10) og en potentiel præinkubation med antagonist. Det samme eksperiment i konventionel parallel agonist tilføjelse mode ville kun tage ~ 1 time for den samme celle-receptor model, men med meget mindre gennemløb. En klar fordel ved den serielle tilgang er, at antallet af koncentrationer, der skal testes for en fuld dosis-respons forhold er ikke begrænset af antallet af tilgængelige brønde. Hvis der er behov for højere agonistkoncentrationer, udvides eksperimentet let og afsluttes uden yderligere cellekulturarbejde. Agonist tilføjelse selv bør udføres omhyggeligt, da nogle celler er følsomme over for forskydning stress og reagere med betydelige impedans ændringer simpelthen på grund af mekanisk stimulation pålagt af væskehåndtering. Cellerne kan endda komme ud af elektroden. Dette problem er imidlertid ikke enestående for impedansbaseret celleovervågning, men gælder også for andre teknikker. For følsomme celler anbefales tilsætningstilstand 1 på grund af reduceret mekanisk belastning på cellerne. Denne tilstand fungerer dog med lavere væskemængder under tilsætning, hvilket øger risikoen for ufuldstændig blanding, da intensiv omrøring ikke anbefales for at undgå uspecifikke cellereaktioner.
Additionstilstand 1 går sammen med en trinvis forøgelse af den samlede volumen i brønden, mens tilstand 2 holder den samlede volumen konstant, da lige store mængder opløsning sekventialt fjernes. Disse er blot de to ekstreme strategier og kan tilpasses til specielle celletyper, multi-well formater eller elektrode layouts på nogen mellemliggende måde. For U373-MG/H1R-modellen er der observeret mindre forskelle i EF50- og EMax-værdierne for den serielle tilsætningsmåde sammenlignet med den konventionelle paralleltilføjelsestilstand (seriel, N = 30: EC50: (0,8 ± 0,3) μM, EMax: (1,9 ± 0,2) kΩ; parallel, N = 15: EC50: (0,5 ± 0,2) μM, EMax: (1,3 ± 0,3) kΩ), mens andre celle-/receptormodeller ikke viste nogen forskelle. Ændringer i EF50- og EMax-værdier kan stamme fra receptordesensibilisering, som er mere tilbøjelige til at forekomme, når receptorerne udsættes for agonist i længere tid. Desensibiliseringsindflydelsen vil i høj grad afhænge af receptoren og liganden, der undersøges. Det er endnu uvist, om en detaljeret analyse af seriel og parallel agonist tilføjelse kan give et nyt middel til at studere receptor desensibilisering.
Vi anbefaler, at du udfører et kontroleksperiment med konventionel paralleltilstandsagonist for at teste for potentielle ændringer i dosisresponskurver. Yderligere kontroller bør omfatte en prøve, der kun behandles med medium/opløsningsmiddel i passende doser for at optrævle eventuelle virkninger som følge af opløsningsmiddelbelastning eller mekanisk stress ved medium tilsætning. Dette bliver særlig vigtigt, hvis ligandens lageropløsning fremstilles i andre opløsningsmidler end medium (f.eks. Ved undersøgelsen af effekten af forskellige ligander bør en standardagonist medtages som reference.
Fremtidige anvisninger bør omfatte automatiske væskehåndteringsenheder, som kan give mulighed for fuldstændig automatiseret dosering eller titrering. Anvendelse af seriel tilsætningstilstand i perfusionssystemer rummer et stort potentiale for lab-on-a-chip og orgel-on a-chip tilgange, samt for eksperimenter udført under flydende forskydning stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Barbara Goricnick og Nadja Hinterreiter for deres hjælp med celledyrkning og forberedelse af eksperimentelle løsninger. Forfatterne anerkender taknemmeligt økonomisk støtte fra Research Training Group 1910 "Medicinsk kemi selektivgpcr ligands" finansieret af Den Tyske Forskningsfond (DFG) under tilskudnummer 222125149. JAS er især taknemmelig for et stipendium ydet af den bayerske ligestilling program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | |
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 - 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 - 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) | \ |
References
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs. Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).
- Kaitin, K. I. Deconstructing the drug development process: The new face of innovation. Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).
- Kenakin, T. P. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).
- Scott, C. W., Peters, M. F. Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening. Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophysical Journal. 91, 16 (2006).
- Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).
- Lieb, S., et al. Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor. Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).
- Stolwijk, J. A., et al. Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol. Integrative Biology. 11, 10 (2019).
