Summary
Dit protocol toont real-time registratie van volledige dosis-respons relaties voor agonist-geïnduceerde GPCR activering van een eencellige laag geteeld op een enkele micro-elektrode met behulp van label-vrije impedantie metingen. De nieuwe dosing regeling verhoogt aanzienlijk doorvoer zonder verlies in de tijd resolutie.
Abstract
Label-vrije impedantie-gebaseerde testen worden steeds vaker gebruikt om niet-invasief bestuderen ligand-geïnduceerde GPCR activering in celcultuur experimenten. De aanpak biedt real-time celbewaking met een apparaatafhankelijke tijdsresolutie tot enkele tientallen milliseconden en is sterk geautomatiseerd. Wanneer de steekproefaantallen echter hoog worden (bijvoorbeeld dosisresponsstudies voor verschillende liganden), kunnen de kosten voor de beschikbare elektrodearrays en de beschikbare tijdsresolutie voor sequentiële well-by-well-opnames beperkend worden. Daarom presenteren we hier een seriële agonist toevoeging protocol dat het potentieel heeft om de output van label-vrije GPCR testen aanzienlijk te verhogen. Met behulp van de seriële agonist toevoeging protocol, een GPCR agonist wordt achtereenvolgens toegevoegd in toenemende concentraties tot een enkele cel laag, terwijl voortdurend toezicht op impedantie van het monster (agonist modus). Met deze seriële aanpak is het nu mogelijk om een volledige dosis-responscurve vast te stellen voor een GPCR-agonist uit slechts één enkele cellaag. Het seriële agonist toevoegingsprotocol is van toepassing op verschillende GPCR-koppelingstypen, Gq Gi/0 of Gs en is compatibel met recombinante en endogene expressieniveaus van de onderzochte receptor. Receptor blokkeren door GPCR antagonisten is ook te beoordelen (antagonist-modus).
Introduction
Dit rapport presenteert een gedetailleerde beschrijving van een seriële toevoeging protocol ontwikkeld voor de kwantificering van ligand-geïnduceerde G eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) activering in aanhangende cellen door label-vrije impedantie metingen. G eiwitgekoppelde receptoren (GPCRs) zijn betrokken bij een veelheid van fysiologische functies en menselijke ziekten1. Vanwege deze en hun goede toegankelijkheid aan het celoppervlak, GPCRs zijn een van de belangrijkste drug doelen. Deze beoordeling wordt weerspiegeld in een geschat aantal ~ 700 goedgekeurde geneesmiddelen gericht op GPCRs, gelijk aan een ~ 35% aandeel op alle op de markt gebrachte drugs2.
De ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen omvat twee centrale processen: i) de identificatie en functionele karakterisering van biologische doelmoleculen, en (ii) de ontdekking van nieuwe loodstoffen en hun ontwikkeling tot administrable drugs. In beide processen zijn efficiënte methoden nodig om interacties met drugsengerichtheid en de daaropvolgende biologische downstreamrespons kwantitatief te evalueren. Verschillende stadia van het preklinische geneesmiddelenontwikkelingsproces maken gebruik van verschillende analysemethoden, variërend van biomoleculaire interactiestudies tussen medicijn en doel, over functionele studies over cellen in de cultuur, tot experimenten op uitgesneden orgaanmateriaal of hele dieren. Beide fysiologische betekenis en biologische complexiteit nemen toe van de eerste naar de laatste3. Hoewel het het algemene doel is om dierproeven te minimaliseren, worden farmacologische studies met behulp van geïsoleerde organen van proefdieren of zelfs hele dieren onvermijdelijk geacht om nieuwe kandidaat-geneesmiddelen volledig te karakteriseren. In termen van analytische uitlezing, orgaan farmacologie studies bieden een distale, integratieve "holistische" functionele respons van de hoogste fysiologische relevantie. Een nadeel van dergelijke experimenten is dat zij om zowel technische als ethische redenen niet verenigbaar zijn met een hoge doorvoerscreening en grotendeels zijn vervangen door studies op basis van in vitro celcultuur4.
Methoden om gpcr-activering in celculturen te kwantificeren, omvatten verschillende op etiketten gebaseerde chemische tests, die specifiek tweede boodschappers detecteren, fosforylatietoestand van downstream-signaaleiwitten, transcriptieactivering via bepaalde transcriptiefactoren of ligand-geïnduceerde intracellulaire receptorhandel4,5. Een nadeel van dergelijke op etiketten gebaseerde tests is de noodzaak om de cellen te etiketteren met mogelijk schadelijke kleurstoffen of radioactieve markers. Dit vereist vaak het uitvoeren van de test als een eindpunt-bepaling voor een blootstelling stijd die moet worden opgegeven a priori. Met behulp van label-gebaseerde eindpunt testen lijdt aan deze zeer beperkte en bevooroordeelde timing van het experiment en het risico dat chemische etiketten en sondes kunnen interfereren met de reguliere celfysiologie - potentieel onopgemerkt door de experimentator.
In de afgelopen jaren zijn labelvrije tests voor het monitoren van GPCR-activatie naar voren gekomen, zoals impedantiegebaseerde technieken of optische methoden die resonante waveguide roosters toepassen5,6. Etikettering van de cellen is experimenteel niet nodig met deze benaderingen. Aangezien deze fysieke uitlezingen werken op lage amplitude signalen, dergelijke methoden worden beschouwd als niet-invasief, ze zorgen voor continue cel monitoring potentieel in real time en de observatie tijd wordt alleen beperkt door de celcultuur niet door de uitlezing. Vergelijkbaar met uitlezingen van hele organen, label-vrije benaderingen vaak verslag over holistische celreacties, ver stroomafwaarts van receptor activering wanneer de integratie langs het hele signaleringsnetwerk leidt tot tijd-afhankelijke, maar eerder onspecifieke veranderingen in celmorfologie of massa herverdeling. Overwegende dat op impedantie gebaseerde tests de diëlektrische signatuur van veranderingen in celvorm7,8meten , metingen met behulp van resonerende golfgeleidingsroosters gevoelig zijn voor veranderingen in de brekingsindex op de celsubstraatinterface als gevolg van dynamische massaherverdeling (DMR)9. Het integrerende karakter maakt labelvrije methoden uiterst gevoelig voor receptorgemedieerde gebeurtenissen, ongeacht het type(en) van G-eiwit (Gq, Gi/0, Gs, G12/13) of β-arrestine die betrokken zijn bij de signaleringcascade6 en goed geschikt voor eneexpressieniveaus van de receptor.
In een standaard label-vrije impedantie-gebaseerde test de cellen zijn adherently geteeld in multi-well platen met coplanar goud-film elektroden afgezet op de bodem van elke put10. Deze elektrodearrays zijn verbonden met een impedantieanalyzer en de celreacties op een experimentele stimulus worden geregistreerd vanuit individuele putten door door de tijd opgeloste impedantiemetingen. In een typische GPCR-test wordt een ligand toegevoegd in individueel verschillende concentraties aan elk individu goed. De ligand-geïnduceerde veranderingen in de impedantie tijdcursus worden vervolgens geanalyseerd met betrekking tot karakteristieke curvekenmerken zoals maximale signaalverandering, gebied onder de curve, signaalverandering binnen een bepaald tijdsinterval of helling van de curve op een bepaald tijdspunt, om de potentie en werkzaamheid van de ligand te kwantificeren11.
De kosten van de elektrodearrays kunnen de toepassing van deze techniek beperken in HTS-campagnes (high throughput screening). Bovendien neemt het aantal afzonderlijke metingen toe en vermindert daarmee geleidelijk de beschikbare tijdsresolutie voor elke put - zelfs voor state-of-the-art meerkanaalsopnamen. Onder dergelijke omstandigheden kunnen snelle en voorbijgaande celreacties aan de meting ontsnappen. Bovendien, de conventionele een goed - een concentratie benadering legt een aanzienlijke tijd en kostenfactor op perfused organ-on-chip of body-on-chip ontwikkelingen met betrekking tot hun geschiktheid in ligand-GPCR interactie analyse.
Om deze reden ontwikkelden we een stapsgewijs doseringsprotocol dat het registreren van volledige dosisresponscurven van ligand-geïnduceerde GPCR-activering in gekweekte celmonolagen mogelijk maakt door de impedantie van één enkele put continu te monitoren, terwijl de agonistconcentratie stapsgewijs wordt verhoogd. Het seriële agonist toevoegingsprotocol verhoogt de doorvoer per put aanzienlijk van één concentratie naar 10 of meer concentraties, zoals blijkt uit het huidige voorbeeld van menselijke U-373 MG-cellen, die de histamine 1-receptor (H1R) endoopeerig uitdrukken. Zo heeft de methode het potentieel om de doorvoer in labelvrije dosisresponsstudies aanzienlijk te verbeteren, terwijl de tijdsresolutie op het instrumentele maximum wordt gehandhaafd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celzaaien op elektrodearrays
OPMERKING: Selectie van elektrode lay-out is een afweging tussen gevoeligheid en het aantal cellen in studie. Hoe kleiner de elektrode, hoe gevoeliger is de meting, maar hoe kleiner het aantal cellen dat wordt onderzocht. Voor cellen die in de loop van de tijd sterke impedantieschommelingen vertonen onder basisomstandigheden, hebben grotere of onderling gedigitaliseerde elektroden de voorkeur.
- Verwarm alle oplossingen die nodig zijn voor standaard celpasseren en zaaien in een waterbad van 37 °C. Voor tests met menselijke U-373 MG cellen duurt het: fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium en magnesium, 0,05% (w/v) trypsine, celkweekmedium (Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) aangevuld met 5% (v/v) foetale kalfsserum (FCS), 2 mM L-glutamine en 100 μg/mL penicilline/streptomycine).
- Spoel de cellaag van de voorraadcultuur geteeld op de bodem van conventionele celcultuur kolven of gerechten met PBS tweemaal.
- Verwijder de PBS, voeg de trypsineoplossing (1 mL voor 25 cm2)toe en laat de cellen 5 min bij 37 °C uitbroeden (geldt voor U-373 MG-cellen).
- Controle voor volledige onthechting van de cellen van de bodem van het groeisubstraat door microscopie.
- Stop de trypsine reactie zodra de cellen volledig zijn losgemaakt door 9 mL celkweekmedium per 1 mL trypsine toe te voegen aan de celvering. Spoel de resterende cellen voorzichtig van de bodem van het celkweeksubstraat door de suspensie over het substraat te beluchten.
- Verzamel de celvering met een pipet en breng deze over naar een centrifugeeringsbuis (15 mL of 50 mL buis).
- Draai de cellen door centrifugeren op 110 x g voor 10 min bij kamertemperatuur.
- Verwijder voorzichtig de supernatant en breveer de celpellet grondig opnieuw op in kweekmedium voordat u de cellen telt (bijvoorbeeld door een hemacytometer te gebruiken voor fasecontrastmicroscopen en handmatig tellen).
- Pas de celvering aan op de gewenste celdichtheid. Gebruik voor experimenten met U-373 MG-cellen 100 000 cellen/cm2 om een confluente cellaag binnen 48 uur te laten groeien. Dit vertaalt zich in een celdichtheid van 200 000 cellen/mL voor 8-well elektrodearrays met een groeigebied van ~0,8 cm2 en een putvolume van 400 μL.
OPMERKING: Voor reproduceerbare GPCR-activeringsexperimenten moeten cellen worden gekweekt tot confluente monolagen op de elektrodearrays. Om een goede receptorexpressie op het celoppervlak te garanderen, moeten cellen ten minste 36 uur worden ingezaaid voordat het experiment wordt uitgevoerd. Het testen van verschillende celdichtheden voor celzaaien is vaak zinvol om de beste experimentele omstandigheden te identificeren. - Voeg de celvering toe aan de putten van de elektrodearray en laat de verkopen 10 – 15 min op kamertemperatuur neerstrijken om een homogene verdeling van cellen op de bodem van de putten te garanderen.
- Kweek cellen gedurende ten minste 36 uur in een standaard celkweekincubator met 5% CO2 (afhankelijk van het gemiddelde type) bij 37 °C en bevochtigde atmosfeer. Verander celkweek medium 24 uur voorafgaand aan het experiment.
- Inspecteer op de dag van het experiment de cellagen op de elektrodearrays door (fasecontrast) microscopie om volledige dekking van elektroden met cellen te garanderen.
2. Evenwicht van cellen in serumvrij medium
- Verwarm serumvrij medium, in deze studie: Leibovitz's L15 medium.
- Verwijder celkweekmedium uit cellen die op elektrodearrays worden gekweekt en vervang door voorverwarmde serumvrije medium. Gebruik 200 μL voor elektrodearrays met 8 putten en 150 μL voor 96-well-elektrodearrays.
- Laat de cellen ten minste 2 uur in serumvrij medium bij 37 °C equilibrate. De evenwichtstijd hangt sterk af van het celtype. U-373 MG-cellen hebben bijvoorbeeld 2 uur nodig, CHO-cellen hebben 4 uur nodig, BAEC kan 's nachts equilibratie in Het L-15 medium vereisen.
LET OP: Het L-15 medium is CO2-onafhankelijk en vereist een CO2-vrijeatmosfeer. Voor de equilibratie in L-15 wordt de incubator op 0 % CO2ingesteld . Equilibratie kan worden gecontroleerd door impedantie metingen, die we aanbevelen om te doen voor de eerste experimenten.
3. Monitoring celequilibratie met impedantiemetingen
- Plaats de elektrodearray in de verbindingsarrayhouder van de impedantieanalyzer.
- Zorg voor een goede lage impedantie contact tussen elektroden en impedantie analyzer. Deze controle is individueel verschillend voor verschillende instrumenten.
OPMERKING: Als het instrument geen verbinding maakt met de elektroden, opent u de contactklem opnieuw, stelt u de elektrodearray voor op de juiste positionering in de houder en probeert u het opnieuw. - Selecteer elektrodetype en/of multi-well formaat uit de gebruikersinterface van de software.
- Stel de meetparameters in. Er zijn verschillende opties beschikbaar.
OPMERKING: Om de meest gevoelige AC-frequentie te selecteren, verwijzen we naar de literatuur- en instrumenthandleidingen, omdat deze afhankelijk zijn van de lay-out van elektrode en het celtype dat wordt bestudeerd. Meestal is de sensorfrequentie in het bereik van 4 kHz – 50 kHz. Hier werden U-373 MG-cellen gekweekt op cirkelvormige werkende elektroden met een diameter van 250 μm en ze werden gecontroleerd met een AC-frequentie van 12 kHz.- Als er modi voor het verkrijgen van gegevens met één en meerdere frequenties beschikbaar zijn, selecteert u de modus met één frequentie om maximale tijdsresolutie te garanderen. De meting wordt uitgevoerd op deze enkele frequentie. Voor de meest verspreide instrumenten is er een aantal vooraf ingestelde frequenties langs het beschikbare frequentievenster.
- Als het aantal onderzochte putten laag is of de tijdresolutie niet van cruciaal belang is, selecteert u in plaats daarvan meerdere frequentie-opnamen. Impedantiemetingen op een bepaald aantal frequenties worden voor elke put geregistreerd voor latere diepgaande analyses.
OPMERKING: De tijdresolutie neemt af met een toenemend aantal frequenties die per put worden geregistreerd en het toenemende aantal putten. De opties voor de selectie van de frequentie- en gegevensverwervingsmodus variëren per instrumenttype en versie.
- Start met het verkrijgen van tijdcursusgegevens.
- Volg de cellaag impedantie (ten minste 2 uur) totdat de impedantie is gestabiliseerd. Bereid ondertussen de agonistoplossingen voor.
- Wanneer de cellagen een stabiel impedantieniveau hebben bereikt, gaat u (i) naar de toevoeging van de seriële agonist binnen hetzelfde experiment of (ii) de gegevensverwerving te beëindigen en start u een nieuwe gegevensset voor het monitoren van agonist-geïnduceerde receptoractivering.
4. Voorbereiding van agonist oplossingen voor experimenten in agonist modus
- Bereken de concentratie van agonist oplossingen als dat nodig is voor elke stap van seriële doseren volgens vergelijking (1). n varieert van 1 tot het totale aantal seriële toevoegingen i. x duidt op concentratie en volume in de put bij stap n. y duidt op concentratie en volume van de "toe te voegen oplossing" in stap n.
OPMERKING: Houd rekening met het aantal replica's en bereken het totale volume van "oplossing-toe te voegen" voor elke concentratiestap. De resultaten van een typische berekening worden gegeven in tabellen 1-4. Er is een algemeen idee nodig over het agonistconcentratiebereik dat moet worden bestudeerd, aangezien het bereik de concentraties en het aantal porties definieert dat moet worden toegediend tijdens de seriële toevoeging. Met behulp van de seriële agonist toevoeging protocol de agonist concentratie wordt stapsgewijs verhoogd. Daarom moet rekening worden gehouden met de hoeveelheid agonist die al in de put zit wanneer de volgende dosis wordt toegevoegd. Wanneer het aantal agonistmoleculen dat al in de put aanwezig is nx = cx ∙Vx (met de huidige concentratie cx x en volume Vx)en het aantal moleculen in de put na de volgende toevoeging nx+yis, wordt het aantal moleculen dat moet worden toegevoegd ny bepaald door de concentratie cy en volume Vy van de oplossing die op de put moet worden toegepast (ny = cy ∙ Vy). Na het toevoegen van een deel van agonist, de nieuwe hoeveelheid agonist moleculen in de put is: cx +y ∙ Vx+y = cx ∙ Vx + cy ∙ Vy. Deze berekening geldt voor elke volgende stap. Vanwege de onderlinge afhankelijkheid van agonist concentratie in de put en de hoeveelheid agonist in de porties worden toegevoegd met elke stap, is het belangrijk om de uiteindelijke concentraties te definiëren na elke stap van tevoren.
Modus 1: Het volume in de put zal toenemen met elke stap als vloeistof continu wordt toegevoegd.
Gebruik deze modus en een 8-put formaat, gebruik Vx1 = 200 μL en Vy1 .... Vyi = 30 μL.
Modus 2: Het volume in de put is constant als het volume toegevoegd bij elke stap wordt verwijderd net voor de daaropvolgende toevoeging.
Gebruik deze modus en een 96-well formaat, gebruik Vx1 = 150 μL en Vy1 .... Vyi = 75 μL.
- Druk het gegevensblad af met het totale volume per concentratie en gedetailleerde instructies voor pipet.
- Bereid alle oplossingen in het vereiste bedrag voor. Maak alle agonist oplossingen in hetzelfde serumvrije medium als gebruikt voor de equilibratie van de cellen.
LET OP: Histamine dihydrochloride wordt beschouwd als gevaarlijk door de OSHA Hazard Communication Standard 2012 (29 CFR 1910.1200). Histamine veroorzaakt huidirritatie, ernstige oogirritatie, kan leiden tot een allergische huidreactie, allergie, astma symptomen of ademhalingsproblemen bij inademing en kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Houd rekening met het veiligheidsinformatieblad.
LET OP: Maak agonist oplossingen zo vers mogelijk. De stabiliteit van agonisten in oplossing kan aanzienlijk variëren. Bewaar oplossingen op 4 °C of lager tot gebruik in het experiment. Voor sommige moleculen kunnen extra stabiliserende additieven, zoals BSA bij het gebruik van op peptiden of lipide gebaseerde moleculen, worden overwogen om adsorptie aan de wanden van putten en buizen te voorkomen. - Als u het experiment uitvoert in een 96-well-formaat, brengt u oplossingen over naar een conventionele 96-putplaat (geen elektroden) en gebruikt u een 8- (of 12-) kanaalleiding voor snelle vloeistofoverdracht naar de elektrodearray.
5. Voorbereiding van agonist oplossingen voor experiment in antagonist modus
LET OP: Bereid de antagonistoplossing(en) voor met de concentratie die overal moet worden toegepast. Volume en concentratie van antagonistoplossing zijn afhankelijk van de wijze van toevoeging van agonist (1 of 2). Voorbeelden voor experimenten in 8-well of 96-well formaat in toevoeging modus 2: (A) 8-well formaat (Vx1 = 200 μL, VAntagonist = 200 μL); (B) 96-well formaat (Vx1 = 150 μL, VAntagonist = 75 μL).
- Bereken de concentratie van elke agonist oplossing die nodig is voor elke stap van serie doseren zoals beschreven in stap 4.1.
- Maak alle agonist oplossingen in hetzelfde serum-vrije medium als gebruikt voor de equilibratie van de cellen en voeg de antagonist op dezelfde uiteindelijke concentratie als gepland voor de respectieve putten in het experiment.
LET OP: In dit geval wordt de histamine stock oplossing (10 mM) bereid in L-15 medium. Wanneer agonisten worden opgelost in andere oplosmiddelen (bijvoorbeeld dimethylsulfoxoïde (DMSO), ethanol), moet een oplosmiddelcontrole worden opgenomen om rekening te houden met de toenemende oplosmiddelbelasting bij elke stap van toevoeging.
6. Het uitvoeren van het seriële toevoegingsprotocol in agonist-modus
- Start gegevensverwerving zoals beschreven in de stappen 3.1 – 3.5.
- Verwarm de agonist oplossingen voor gebruik voor door ze ongeveer 10 – 15 minuten voor optetellen in de couveuse te plaatsen.
OPMERKING: Bij het gebruik van thermo-labile stoffen mogen de oplossingen niet te lang bij 37 °C worden bewaard. Als vooropwarming voor 10 – 15 minuten als kritiek wordt beschouwd, brengt u kort voor toevoeging in een waterbad oplossingen tot 37 °C. - Voer de agonist seriële dosing uit die afhankelijk is van de geselecteerde toevoegingsmodus. Volgende modus 1 neemt het totale volume in de put toe met elke toevoeging van de volgende dosis. In modus 2 wordt hetzelfde volume dat bij elke stap wordt toegevoegd ook weer verwijderd vlak voordat de volgende hogere dosis wordt toegevoegd.
OPMERKING: Tijd die nodig is voor de equilibratie van de cellaag tussen twee daaropvolgende agonist doses is afhankelijk van de reactietijd van de cellen. Een eerste experiment in parallelle modus (één put – één concentratie) onthult (i) celresponstijden voor verschillende agonistconcentraties en (ii) de meest gevoelige curveparameter (bijvoorbeeld impedantie maximum, impedantie na verloop van tijd x).
A: Mode 1 / 8-well formaat
- Voeg 30 μL van de eerste oplossing met de laagste concentratie agonist toe aan de cellen die in 200 μL serumvrij medium zijn geëquilibreerd.
- Laat de cellen reageren en equilibrate voor de vooraf gedefinieerde periode van tijd (bijvoorbeeld 15 min).
- Voeg 30 μL van de tweede oplossing toe met de volgende hogere concentratie.
- Herhaal stap 6.3.1-6.3.3 met de derde, vierde, enzovoort, agonist oplossing.
OPMERKING: Werken met 10 concentratiestappen zal resulteren in een totaal volume van 500 μL aan het einde van het experiment, dat net onder het maximaal toepasselijke volume van deze putten van ~ 550 μL ligt.
B: Mode 2 / 96-well formaat
OPMERKING: Pauzeer het verzamelen van gegevens tijdens elke liquid handling stap (optellen/verwijderen) via de software van het impedantie-instrument bij het uitvoeren van experimenten in 96-well formaat. De meer uitgebreide vloeistofafhandeling kan de gegevensverwerving verstoren. Gebruik een meerkanaals pipet.
- Het verkrijgen van gegevens onderbreken.
- Voeg 75 μL van de eerste oplossing met de laagste concentratie agonist toe aan de cellen die zijn geëquilibreerd in 150 μL serumvrij medium.
- Hervat het verzamelen van gegevens.
- Laat de cellen reageren en equilibrate voor de vooraf gedefinieerde periode van tijd (bijvoorbeeld 15 min).
- Ongeveer 1 – 2 minuten voordat de reguliere evenwichtstijd eindigt, pauzeer de meting en verwijder 75 μL uit elke put.
OPMERKING: Het tijdstip waarop de oplossing moet worden verwijderd, is afhankelijk van het aantal evenhoge putten en de pipettersnelheid. Tijd die nodig is voor het verwijderen van de oplossingen mag niet hoger zijn dan de tijd tussen de volgende stappen. - Voeg 75 μL van de tweede oplossing toe met de volgende hogere concentratie en hervat de meting.
- Herhaal stap 6.3.8-6.3.10 met de derde, vierde, enzovoort, agonist oplossing.
7. Het uitvoeren van het seriële bijtellingsprotocol in de antagonistmodus
- Start de meting zoals beschreven in de stappen 3.1 – 3.5.
- Bereid tijdens de equilibratie van de cellagen een antagonistoplossing voor (bijvoorbeeld 200 μL van 1,5 μM difenhydraminehydrochloride in L15-medium).
LET OP: Difenhydramine hydrochloride heeft potentiële acute gezondheidseffecten. Het is schadelijk bij inslikken of ingeademd, kan oog- en huidirritatie veroorzaken. Het kan irritatie van de luchtwegen en het spijsverteringskanaal veroorzaken. Houd rekening met het veiligheidsinformatieblad. - Verwarm de antagonist- en agonistoplossingen voor door ze ongeveer 10 – 15 minuten in de couveuse te plaatsen voordat ze de celculturen versterken (zie 6.2). Als antagonistvrije putten ook in de test zijn opgenomen, ook pre-warm serumvrij medium.
- Voeg de antagonistoplossing toe aan de aangewezen putten. Laat de cellen 15 – 20 min met antagonist equilibrate. Als antagonistvrije putten zijn opgenomen, voeg dan hetzelfde volume serumvrij medium toe aan deze putten.
- Volgens antagonist toevoeging in modus 2,verwijder oplossing uit de putten
(A) 8-well formaat (200 μL)
(B) 96-well formaat (75 μL) - Voer de agonist toevoeging sing volgorde zoals beschreven in stap 6.3.
8. Uitvoer en analyse van gegevens
- Exporteer gegevens met behulp van de software van het impedantie-instrument om alle geregistreerde gegevens van eigen gegevens om te zetten in gemeenschappelijke gegevensformaten (bijvoorbeeld csv). Deze stap maakt het mogelijk voor gegevens reorganisatie en presentatie met andere software pakketten.
- Laad de csv-geformatteerde gegevens naar wetenschappelijke data-analysesoftware.
- Normaliseer impedantiewaarden door de impedantie van het laatste gegevenspunt af te trekken vóór de eerste toevoeging van agonist-oplossing en door de tijd van toevoeging aan t = 0 in te stellen. Plot de tijdsloop van genormaliseerde impedantie.
- Plot de individuele tijdcursussen en identificeer de maxima in impedantie na elke toevoegingstap. Stel een gegevensblad samen met deze waarden.
- Plot de waarden van maximale (of minimum, indien van toepassing) impedantie veranderingen als een functie van agonist concentratie. Dit kan worden gedaan voor individuele putten of voor de gemiddelden (gemiddelde ± SD).
- Gebruik een gegevensmontageroutine om de halfmaximale effectieve concentraties (EC50)en maximale respons (EMax)te bepalen met behulp van het logistieke model met vier parameters (vergelijking 2):
OPMERKING: c geeft de agonistconcentratie aan, A1 is het minimum en A2 is het maximale asymptoat van de sigmoïdale dosisresponscurve (A2 = EMax). EC50 is de concentratie op het buigpunt van de curve, en n komt overeen met de helling van de heuvel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een typisch schema voor de voorbereiding van de verschillende agonist oplossingen wordt getoond voor een experiment met behulp van 8-goed elektrode arrays met histamine als agonist in tabellen 1-4. Tabel 1 en tabel 2 bevatten volumes en concentraties voor een experiment met toevoegingsmodus 1 (zie figuur 1),terwijl tabel 3 en tabel 4 volumes en concentraties presenteren voor een experiment naar aanleiding van toevoegingsmodus 2 (zie figuur 1). Gegevens zijn berekend met behulp van vergelijking (1).
Een representatief experiment wordt getoond in figuur 2 voor confluente lagen U-373 MG-cellen, die endogene uitdrukken van de histamine 1 receptor, geteeld op een 8-goed elektrode array met een werkende elektrode van 250 μm diameter met behulp van histamine als agonist. De meting werd uitgevoerd op één frequentie van 12 kHz. Toevoeging van de agonist concentratie serie werd uitgevoerd na modus 1. In het geselecteerde experiment werden 10 oplossingen met toenemende histamineconcentratie (voorbereid volgens stap 4) achtereenvolgens elke 15 min toegevoegd (figuur 2A). De seriële doserregeling werd toegepast op zeven van de acht putten. In een goed agonist-vrij medium (L-15) werd achtereenvolgens toegevoegd als een negatieve controle in negen van de tien stappen. De laatste toevoeging aan deze controle was een histamine oplossing die een definitieve concentratie van 100 μM histamine in de put. Gegevens zijn uitgezet met data-analyse software en wordt getoond als impedantie verandering Δ| Z| 12 kHz / kΩ langs het experiment, met de impedantie verandering en het tijdspunt van de eerste toevoeging wordt ingesteld op nul. De initiële evenwichtstijd in de experimentele buffer van 2 uur wordt niet weergegeven in dit perceel. De tijdpunten van agonist toevoeging worden aangegeven door pijlen.
De verandering in impedantie ten opzichte van de basislijn na elke concentratiestap werd uit de curven gehaald met behulp van een gegevenscursor. Bij stappen zonder duidelijk maximum werd het laatste gegevenspunt voor de volgende toevoeging gebruikt voor analyse. Impedantie verandert Δ| Z| 12 kHz werden uitgezet als functie van histamineconcentratie (cx+y) (figuur 2B, symbolen). De overdrachtsfunctie van een logistiek model met vier parameters (zie stap 8.6) werd gemonteerd op de experimentele gegevenspunten uit zeven putten(figuur 2B, lijnen). De pasvormresultaten worden weergegeven in tabel 5. Figuur 2C en figuur 2D tonen het resultaat van het gemiddelde van de gegevens in figuur 2A en figuur 2B, met gemiddelde ± SD voor zeven putten. De gemiddelde tijdscursusgegevens worden samengevat in figuur 2C, terwijl de gemiddelde dosisresponscurve wordt opgegeven in figuur 2D.
In dosisresponsrelaties, zoals aangegeven in figuur 2B,D,werd de montageprocedure toegepast op het gehele concentratiebereik dat EC50 = (0,86 ± 0,13) μM terugbracht. De impedantierespons neemt monotoon toe met een toenemende histamineconcentratie, met uitzondering van de laatste twee concentratiestappen (30 μM, 100 μM eindconcentratie). Deze reactie wordt vermoedelijk verklaard door downregulatie van de histamine receptor, desensibilisatie of over-stimulatie van de cellen (zie discussie). Om rekening te houden met dit effect is het gegevensbereik voor analyse verminderd, zoals blijkt uit één enkel seriële doserexperiment (figuur 3; goed 1) dat is geselecteerd op de gegevens in figuur 2. Bovendien is het instellen van de onderste asymptote (A1) op nul tijdens de minste vierkante optimalisatie ervan uitgaande dat er geen impedantie verandering in reactie op 0 μM histamine is goed gerechtvaardigd. Toepassing van deze drie parameter optimalisatie biedt een EC50 van (0,75 ± 0,12) μM (cf., figuur 3B). DeEG 50-waarden bleken ongevoelig te zijn voor een van de gegevensanalysemodi en waren niet significant verschillend.
Typische resultaten voor een 96-well plate experiment worden samengevat in figuur 4. U-373 MG cellen werden geteeld op 96-well elektrode arrays zoals hierboven beschreven. 32 putten werden opgenomen in de meting. 8 putten dienden als agonist-vrije controles, blootgesteld aan medium alleen. 24 putten werden onderworpen aan een reeks van toenemende histamine concentraties berekend en voorbereid op toevoeging modus 2. De tijdskoers van impedantieverandering wordt weergegeven voor alle 32 afzonderlijke putten in figuur 4A. Een van de curven (rood gemarkeerd) toont een ongebruikelijke tijdscursus en werd uitgesloten van verdere analyse. Bijgevolg werden gegevens van 23 putten gemiddeld en uitgezet als tijdsverloop van gemiddelde impedantieverandering (gemiddelde ± SD) in figuur 4B. Elke individuele curve werd geanalyseerd zoals hierboven beschreven voor de dosis-respons relatie. Gegevenspunten werden gemiddeld en uitgezet als functie van de uiteindelijke histamineconcentratie (figuur 4C). Dosisresponsgegevens werden geanalyseerd aan de hand van het vier parameter logistieke model, dat een gemiddelde EC50-waarde van (1,0 ± 0,3) μM terugbracht.
Een typisch resultaat voor het seriële agonist toevoegingsprotocol in antagonistmodus wordt weergegeven in figuur 5. Hier werd een put vooraf behandeld met 0,75 μM van de histamine receptor antagonist difenhydramine (rode curve) 20 minuten voordat de eerste histamine werd toegevoegd (Figuur 5A). De controle ontving antagonist-vrij middel (blauwe kromme). De antagonist werd toegevoegd na modus 2, wat betekent dat 200 μL van de uiteindelijk 400 μL werden verwijderd voordat de agonist serie werd toegepast. De agonist (histamine) werd toegevoegd na seriële dosermodus 1 zoals beschreven in de bovenstaande voorbeelden. Het is belangrijk voor experimenten in antagonistmodus dat de antagonistconcentratie gedurende de gehele tijd van het experiment constant wordt gehouden. Daarom moeten alle agonist oplossingen toegevoegd aan de put ook de vooraf gedefinieerde antagonistconcentratie (in dit geval 0,75 μM) bevatten, terwijl de controle antagonistvrij blijft. Een antagonistisch effect wordt duidelijk door een "vertraagde" toename van impedantie binnen de seriële doserregeling die overeenkomt met hogere agonistconcentraties die nodig zijn om een celrespons te induceren. In de dosis-responsrelatie wordt het effect van de antagonist uitgedrukt als een rechtse verschuiving van de krommen, die overeenkomt met een toename van EC50, mits de antagonist een concurrerende ligand ten opzichte van de agonist is (figuur 5B). De EC50 werd bepaald tot (0,92 ± 0,05) μM bij afwezigheid van de antagonist en (14,7 ± 0,6) μM in aanwezigheid.
Figuur 1: Seriële agonist toevoeging modi. (A) Schematische illustratie van concentratieberekeningen. Door toevoeging van agonist oplossing van concentratie cy en volume Vy aan een put met volume Vx en agonist concentratie cx, het volume toeneemt tot V x+ y en de concentratie toeneemt tot c x+ y. (B) Twee verschillende modi voor seriële agonist toevoeging. Modus 1: Het totale volume in de put Vx+y neemt met elke toevoeging toe. Modus 2: Het volume dat bij elke concentratiestap wordt toegevoegd, wordt opnieuw verwijderd voordat de volgende dosis wordt toegevoegd, waardoor het totale volume in de put constant blijft. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Resultaten van een typisch experiment in 8-well formaat. (A) Tijdsverloop van impedantie verandering op 12 kHz voor confluent U-373 MG cellagen geteeld op cirkelvormige werkende elektroden met een diameter van 250 μm. In zeven van de acht putten werd serietoevoeging van histamine toegepast. Een put (grijze curve) werd achtereenvolgens geladen met histamine-vrije buffer bij elke stap (modus 1), met uitzondering van de laatste stap toen 100 μM histamine werden toegevoegd als een positieve controle. (B) Dosisresponsrelaties die voortvloeien uit de maximale impedantieverandering ten opzichte van de basislijn voor zeven afzonderlijke putten na elke concentratiestap. (C) Gemiddelde tijdskoers van impedantieverandering (gemiddelde ± SD) gegenereerd uit zeven afzonderlijke putten zoals weergegeven in (A). (D) Gemiddelde dosisresponsrelaties die worden gegenereerd uit afzonderlijke gegevenssets zoals aangegeven in (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Aanpassing van de gegevensanalysemodi. (A) Typische tijdscursus van impedantie verandering op 12 kHz voor een enkele confluent U-373 MG cellaag geteeld op cirkelvormige werkende elektroden met een diameter van 250 μm. (B) Experimentele dosis-respons relatie (gevulde symbolen) gegenereerd uit de maximale impedantie verandering ten opzichte van baseline na elke concentratie te verhogen. Ofwel werd de volledige gegevensset onderworpen aan de montageprocedure (zwarte en grijze curve) of het laatste gegevenspunt - wat wijst op het begin van receptordesensibilisatie en/of internalisatie - weggelaten uit kwantitatieve analyse (rode en magentacurve). Alle vier de parameters werden aangepast tijdens de minste vierkante optimalisatie (zwarte en rode curve) of de parameter A1, die de lagere asymptote, werd ingesteld en vastgesteld op nul (grijs en magenta curve). DeEC 50-waarden waren niet significant verschillend voor de twee gegevensanalysemodi. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Typisch experiment in 96-well formaat. (A) Tijdscursus van impedantie verandering gemeten op 12 kHz voor confluent U-373 MG cellagen geteeld op een 96-goed elektrode array. Gegevens worden weergegeven voor 32 putten. 24 putten werden onderworpen aan een reeks van toenemende histamine concentraties toegevoegd met een evenwichtstijd van 15 min tussen elke stap. De in het rood gemarkeerde curve is uitgesloten van gemiddelding. Acht putten (controle) werden behandeld met histamine-vrij middel op elk tijdpunt van toevoeging. (B) Tijd verloop van de gemiddelde impedantie verandering voor 23 individuele putten in reactie op histamine seriële toevoeging en acht controle putten zoals weergegeven in (A). (C) Gemiddelde dosis-responsrelatie gegenereerd door de maximale impedantieverandering ten opzichte van de basislijn na elke concentratieverhoging (gemiddelde ± SD). De gegevens werden uitgerust met een logistieke functie van vier parameters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Typisch experiment in antagonistmodus. (A) Tijdsverloop van impedantie verandering op 12 kHz voor confluent U-373 MG cellagen geteeld op cirkelvormige werkelektroden met een diameter van 250 μm na toevoeging van toenemende concentraties histamine met of zonder aanwezigheid van histamine receptor antagonist difenmine. Diphenhydramine (0,75 μM) of antagonistvrij medium (L15) werden 20 minuten toegevoegd voordat de agonist seriële dosering begon. (B) Dosisresponsrelaties die voortvloeien uit de maximale impedantieverandering ten opzichte van de basislijn na elke concentratietoename ten opzichte van de onder A vermelde gegevens. De aanwezigheid van 0,75 μM Difenhydramine verhoogde de EC50 van (0,92 ± 0,05) μM naar (14,7 ± 0,6) μM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Oplossing # | cx+y (μM) | cx (μM) | Vx (μL) | Vx+y (μL) | Vy (μL) | cy (μM) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 230 | 30 | 0.08 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 230 | 260 | 30 | 0.79 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 260 | 290 | 30 | 2.03 |
| 4 | 1 | 0.3 | 290 | 320 | 30 | 7.77 |
| 5 | 3 | 1 | 320 | 350 | 30 | 24.33 |
| 6 | 10 | 3 | 350 | 380 | 30 | 91.67 |
| 7 | 30 | 10 | 380 | 410 | 30 | 283.33 |
| 8 | 100 | 30 | 410 | 440 | 30 | 1056.67 |
Tabel 1: Concentratieberekeningsschema voor experimenten met 8-well elektrodearrays naar toevoegingsmodus 1.
| Oplossing # | cy (μM) | Vy (μL) | maken van | c (μM) | verdunningsfactor | maken van het totaal V (μl) | gebruik (μl) | V toevoegen (μl) |
| 1 | 0.08 | 30 | 3 | 2.03 | 26.52 | 600 | 22.6 | 577.4 |
| 2 | 0.79 | 30 | 4 | 7.77 | 9.83 | 600 | 61 | 539 |
| 3 | 2.03 | 30 | 5 | 24.33 | 11.97 | 600 | 50.1 | 549.9 |
| 4 | 7.77 | 30 | 6 | 91.67 | 11.8 | 600 | 50.8 | 549.2 |
| 5 | 24.33 | 30 | 7 | 283.33 | 11.64 | 600 | 51.5 | 548.5 |
| 6 | 91.67 | 30 | 8 | 1056.67 | 11.53 | 600 | 52.1 | 547.9 |
| 7 | 283.33 | 30 | 8 | 1056.67 | 3.73 | 600 | 160.9 | 439.1 |
| 8 | 1056.67 | 30 | 10 mM voorraad | 10000 | 9.46 | 800 | 84.5 | 715.5 |
Tabel 2: Pipetterschema voor experimenten met 8-well elektrodearrays naar toevoegingsmodus 1.
| Oplossing # | cx+y (μM) | cx (μM) | Vx (μL) | Vx+y (μL) | Vy (μL) | cy (μM) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 400 | 200 | 0.02 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 200 | 400 | 200 | 0.19 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 200 | 400 | 200 | 0.5 |
| 4 | 1 | 0.3 | 200 | 400 | 200 | 1.7 |
| 5 | 3 | 1 | 200 | 400 | 200 | 5 |
| 6 | 10 | 3 | 200 | 400 | 200 | 17 |
| 7 | 30 | 10 | 200 | 400 | 200 | 50 |
| 8 | 100 | 30 | 200 | 400 | 200 | 170 |
Tabel 3: Concentratieberekeningsschema voor experimenten met 8-well elektrodearrays naar toevoegingsmodus 2.
| Oplossing # | cy (μM) | Vy (μL) | maken van | c (μM) | verdunningsfactor | maken van het totaal V (μl) | gebruik (μl) | V toevoegen (μl) |
| 1 | 0.02 | 200 | 3 | 0.5 | 25 | 1000 | 40 | 960 |
| 2 | 0.19 | 200 | 4 | 1.7 | 8.95 | 1000 | 111.8 | 888.2 |
| 3 | 0.5 | 200 | 5 | 5 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 4 | 1.7 | 200 | 6 | 17 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 5 | 5 | 200 | 7 | 50 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 6 | 17 | 200 | 8 | 170 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 7 | 50 | 200 | 8 | 170 | 3.4 | 1000 | 294.1 | 705.9 |
| 8 | 170 | 200 | 200 μM Voorraad | 200 | 1.18 | 1300 | 1105 | 195 |
Tabel 4: Pipetterschema voor experimenten met 8-well elektrodearrays naar toevoegingsmodus 2.
| Goed | EG50 | Emax (=A2) | A1 | N |
| (μM) | (kΩ) | (Ω) | ||
| 1 | 0,9 ± 0,1 | 1680 ± 70 | 150 ± 80 | 1,9 ± 0,5 |
| 2 | 0,7 ± 0,2 | 1770 ± 90 | 200 ±140 | 1,3 ± 0,4 |
| 3 | 0,6 ± 0,2 | 1700 ± 100 | 60 ± 250 | 1,1 ± 0,5 |
| 4 | 0,6 ± 0,2 | 2000 ± 100 | 140 ± 180 | 1,3 ± 0,4 |
| 5 | 0,9 ± 0,1 | 1810 ± 60 | 160 ± 80 | 1,4 ± 0,3 |
| 6 | 0,8 ± 0,1 | 1950 ± 70 | 200 ± 110 | 1,3 ± 0,3 |
| 7 | 0,6 ± 0,3 | 1700 ± 200 | 260 ± 250 | 1,6 ± 1,0 |
| 1 – 7 | 0,7 ± 0,2 | 1900 ± 100 | 100 ± 100 | 1,1 ± 0,2 |
Tabel 5: Resultaten verkregen uit vier parameter logistieke aanvallen toegepast op typische dosis-respons gegevens. De dosisresponsgegevens die voor analyse worden gebruikt, worden weergegeven in figuur 2. Het volledige concentratiebereik werd toegepast op analyse voor de afzonderlijke putten een tot en met zeven (figuur 2B) en voor de gemiddelde gegevens verkregen uit putten één tot zeven (figuur 2D). Geen van de parameters van de logistieke functie werd vastgesteld tijdens de minste vierkante optimalisatie. De fitresultaten zijn afgerond op het decennium van de fout, behalve als de waarde kleiner was dan de fout.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een methode voor labelvrije impedantiemetingen om de dosisresponsrelatie van agonist-geïnduceerde GPCR-activering te bepalen bij afwezigheid of aanwezigheid van specifieke antagonisten voor dezelfde receptor. Het proof of concept van deze methode werd gepresenteerd in een recente publicatie12. Voor zover wij weten is het de eerste studie die de oprichting beschrijft van een volledige dosisresponscurve van agonist-gemedieerde GPCR-activering met behulp van een eencellige laag in vitro. De aanpak vereist onvermijdelijk het gebruik van labelvrije benaderingen voor celbewaking en is niet van toepassing op endpoint-tests.
Het protocol is aangetoond op het voorbeeld van U-373 MG cellen, die endoopously uitdrukken van de menselijke histamine 1 receptor (hHR1) die wordt gestimuleerd met een reeks van toenemende concentraties van zijn endogene agonist histamine, terwijl de impedantie van de cellen continu wordt geregistreerd. Om de toepasbaarheid van het protocol op antagoniststudies aan te tonen, werden de experimenten herhaald in aanwezigheid van één constante concentratie difenhydramine, een concurrerende antagonist tegen de hH1R. Impedantie-opnames zijn ook met succes gebruikt om andere H1R-agonisten (bijvoorbeeld UR-KUM53011, individuele en stapsgewijze dosering) en antagonisten (bijvoorbeeld Mepyramine)12 te bestuderen, naast de hier getoonde voorbeelden. Bovendien is het protocol ook toegepast op andere cellijnen en receptoren, bijvoorbeeld CHO-D2R die de dopamine D2-receptor (D2R) of BAEC uitdrukt en de ß2-adrenerge receptor (ß2AR)12 uitdrukt, wat aangeeft dat het een algemeen schema presenteert voor een zeer efficiënte generatie dosisresponsgegevens. Terwijl U373-MG en BAEC cellen de respectieve receptoren H1R en ß2AR uitdrukken op endogene niveaus, is de CHO-D2R een voorbeeld voor een recombinant celmodel. Samen is het seriële protocol in het algemeen van toepassing op celtypen met endogene of ectopische GPCR-expressie, GPCRs met verschillende koppelingstypen Gq (bijvoorbeeld H1R), Gs (bijvoorbeeld ß2AR), Gi (bijvoorbeeld D2R) en verschillende ligandtypes (agonist/antagonist). In al die hierboven genoemde cel/receptortypes neemt de impedantie toe met toenemende agonistconcentratie. Sommige cellen reageren echter op GPCR-activering door een impedantieafname. We testten het protocol voor een dergelijk geval (HaCaT / histamine) en vond ook een concentratie-afhankelijke stepwise daling, ter ondersteuning van het begrip van een algemeen toepasbare aanpak die ook compatibel is met omgekeerde impedantie veranderingen. Er is voorgesteld dat de gedetailleerde tijdsloop van impedantiegegevens het type G-eiwitkoppeling van een bepaalde receptor aangeeft. Hoewel het concept aantrekkelijk is, ondersteunt de pool van onze gegevens geen algemeen toepasbare regel die het impedantietijdprofiel correleert met G-eiwitkoppeling van een bepaalde GPCR6.
Het seriële toevoegingsprotocol is aanpasbaar aan verschillende soorten elektrodelay-outs en multi-well formaten. Het is van toepassing op perfusiesystemen op de chip, wat een aanzienlijk voordeel is ten opzichte van veel op etiketten gebaseerde benaderingen die vaak één cellaag vereisen om één concentratie te testen. Bijgevolg kan de seriële doseringsregeling de weg vrijmaken voor dosisresponsstudies in complexere biologische modellen zoals organ-on-a-chip of zelfs human-on-a-chip benaderingen. Impedantie metingen detecteren een geïntegreerde, distale reactie van de cellen op receptor activering die uiteindelijk cel morfologie veranderingen induceert. Deze nogal algemene en onspecifieke, maar ook onbevooroordeelde uitlezing is de basis voor zijn brede toepasbaarheid die niet beperkt is tot GPCRs, maar ook kan werken voor andere klassen van celoppervlaktereceptoren, cytoplasmatische receptoren of zelfs intracellulaire eiwitten als doelen.
Het is van cruciaal belang voor de stapsgewijze agonist toevoeging protocol om te werken met confluent cellagen op de elektroden, als schaarse culturen zal interfereren met gevoeligheid, reproduceerbaarheid en gegevens interpretatie. Een extra voorwaarde voor succesvolle monitoring van receptoractivering, zelfs in confluentcell monolayers is een verandering in celvorm langs de signaaltransductiecascade. Als de onderzochte cellen hun morfologie niet veranderen tijdens het experiment, zijn impedantie-gebaseerde uitlezingen blind en zullen ze geen verslag uitbrengen over enige verandering in receptoractiviteit. Om het seriële toevoegingsprotocol goed te kunnen uitzetten, wordt de eerste pre-test in conventionele een-goed-een-concentratiemodus aanbevolen om het concentratiebereik van de agonist ruwweg en het tijdsinterval tussen latere agonisttoevoegingen te bepalen. Tijdsintervallen tussen sequentiële doses van de agonist moeten zodanig worden afgestemd dat het systeem een nieuw evenwicht aanneemt voordat de volgende, hogere dosis wordt toegevoegd. Dienovereenkomstig kan de methode minder nuttig zijn voor receptoren die leiden tot een zeer snelle en enige voorbijgaande reactie van de cellen of een zeer trage reactie die uren kan duren om te voltooien. De laatste situatie zou de totale tijd van het experiment verhogen en vragen om parallelle toevoegingprotocollen om de labtijd te verkorten. In de bovenstaande voorbeelden was de totale looptijd van het experiment 2,5 – 3,5 uur, afhankelijk van het aantal concentraties (8 of 10) en een mogelijke pre-incubatie met antagonist. Hetzelfde experiment in conventionele parallelle agonist toevoeging modus zou alleen ~ 1 uur voor dezelfde cel-receptor model, maar met veel kleinere doorvoer. Een duidelijk voordeel van de seriële benadering is dat het aantal concentraties dat moet worden getest op een volledige dosis-responsrelatie niet wordt beperkt door het aantal beschikbare putten. Als hogere agonistconcentraties nodig zijn, wordt het experiment gemakkelijk uitgebreid en voltooid zonder extra celkweekwerk. Agonist toevoeging zelf moet zorgvuldig worden uitgevoerd, omdat sommige cellen gevoelig zijn voor schuifstress en reageren met aanzienlijke impedantie veranderingen gewoon als gevolg van mechanische stimulatie opgelegd door vloeistofbehandeling. De cellen kunnen zelfs van de elektrode komen. Dit probleem is echter niet uniek voor impedantie gebaseerde celmonitoring, maar geldt ook voor andere technieken. Voor gevoelige cellen wordt optellingsmodus 1 aanbevolen vanwege een verminderde mechanische belasting van de cellen. Deze modus werkt echter met lagere vloeistofvolumes tijdens toevoeging, wat het risico op onvolledige vermenging verhoogt, omdat intensieve agitatie niet wordt aanbevolen om niet-specifieke celreacties te voorkomen.
Toevoegingmodus 1 gaat samen met een stapsgewijze toename van het totale volume in de put, terwijl modus 2 het totale volume constant houdt, omdat gelijke hoeveelheden oplossing achtereenvolgens worden verwijderd. Dit zijn slechts de twee extreme strategieën en kunnen worden aangepast voor speciale celtypes, multi-well formaten of elektrode lay-outs in een tussentijdse manier. In het geval van het U373-MG/H1R-model zijn kleine verschillen in EC50- en EMax-waarden waargenomen voor de seriële toevoegingsmodus in vergelijking met de conventionele parallelle toevoegingsmodus (seriële, N = 30: EC50: (0,8 ± 0,3) μM, EMax: (1,9 ± 0,2) kΩ; parallel, N = 15: EC50: (0,5 ± 0,2) μM, EMax: (1,3 ± 0,3) kΩ), terwijl andere cel-/receptormodellen geen verschillen lieten zien. Verschuivingen in EC50- en EMax-waarden kunnen afkomstig zijn van receptordesensibilisatie die eerder optreedt wanneer de receptoren langer aan de agonist worden blootgesteld. De desensibilisatie invloed zal sterk afhangen van de receptor en de ligand onder studie. Het valt nog te verduidelijken of een gedetailleerde analyse van seriële en parallelle agonist toevoeging een nieuwe manier kan bieden om receptordesensibilisatie te bestuderen.
We raden aan om een besturingsexperiment uit te voeren met conventionele parallelle modus agonist toevoeging om te testen op mogelijke verschuivingen in dosisresponscurven. Verdere controles moeten een monster omvatten dat alleen met medium/solvent in de juiste doses is behandeld om eventuele effecten als gevolg van oplosmiddelbelasting of mechanische belasting bij middelgrote toevoeging te ontrafelen. Dit wordt vooral belangrijk als de voorraadoplossing van de ligand wordt bereid in andere oplosmiddelen dan medium (bijvoorbeeld DMSO, ethanol). Bij het onderzoeken van het effect van verschillende liganden moet een standaard agonist als referentie worden opgenomen.
Toekomstige aanwijzingen moeten betrekking hebben op automatische vloeistofhandling-eenheden, die het mogelijk kunnen maken voor volledig geautomatiseerde dosering of titratie. Het toepassen van de seriële toevoegingsmodus in perfusiesystemen biedt een groot potentieel voor lab-on-a-chip- en organ-on a-chip benaderingen, evenals voor experimenten uitgevoerd onder vloeistofafschuifstress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Barbara Goricnick en Nadja Hinterreiter voor hun hulp bij het kweken van cellen en het voorbereiden van experimentele oplossingen. De auteurs erkennen dankbaar financiële steun van de Research Training Group 1910 "Medicinale chemie van selectieve GPCR ligands" gefinancierd door de Duitse Research Foundation (DFG) onder subsidienummer 222125149. JAS is vooral dankbaar voor een beurs toegekend door de Beierse Gender Equality Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | |
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 - 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 - 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) | \ |
References
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs. Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).
- Kaitin, K. I. Deconstructing the drug development process: The new face of innovation. Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).
- Kenakin, T. P. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).
- Scott, C. W., Peters, M. F. Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening. Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophysical Journal. 91, 16 (2006).
- Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).
- Lieb, S., et al. Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor. Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).
- Stolwijk, J. A., et al. Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol. Integrative Biology. 11, 10 (2019).
