Summary
Dieses Protokoll zeigt die Echtzeitaufzeichnung von volldosierten Reaktionsbeziehungen für die agonistisch-induzierte GPCR-Aktivierung von einer einzelnen Zellschicht, die auf einer einzelnen Mikroelektrode mit etikettenfreien Impedanzmessungen angebaut wird. Das neue Dosierschema erhöht den Durchsatz deutlich, ohne dass die Zeitauflösung verloren geht.
Abstract
Etikettenfreie Impedanz-basierte Assays werden zunehmend zur nicht-invasiven Untersuchung der ligaandinduzierten GPCR-Aktivierung in Zellkulturexperimenten eingesetzt. Der Ansatz bietet Echtzeit-Zellüberwachung mit einer geräteabhängigen Zeitauflösung bis zu mehreren Dutzend Millisekunden und ist hochautomatisiert. Wenn jedoch die Probenzahlen hoch werden (z. B. Dosis-Wirkungs-Studien für verschiedene Liganden), können die Kosten für die Einweg-Elektroden-Arrays sowie die verfügbare Zeitauflösung für sequenzielle Well-by-Well-Aufnahmen begrenzt werden. Daher stellen wir hier ein serielles Agonisten-Zusatzprotokoll vor, das das Potenzial hat, die Leistung von etikettenfreien GPCR-Assays deutlich zu erhöhen. Mit Hilfe des seriellen Agonisten-Additionsprotokolls wird ein GPCR-Agonist sequenziell bei der Erhöhung der Konzentrationen zu einer einzelnen Zellschicht hinzugefügt, während die Impedanz der Probe kontinuierlich überwacht wird (Agonistenmodus). Mit diesem seriellen Ansatz ist es nun möglich, eine vollständige Dosis-Wirkungs-Kurve für einen GPCR-Agonisten aus nur einer einzigen Zellschicht zu etablieren. Das serielle Agonisten-Zusatzprotokoll ist auf verschiedene GPCR-Kopplungstypen, Gq Gi/0 oder Gs, anwendbar und mit rekombinanten und endogene Expressionsniveaus des untersuchten Rezeptors kompatibel. Die Rezeptorblockierung durch GPCR-Antagonisten ist ebenfalls bewertbar (Antagonistenmodus).
Introduction
Dieser Bericht enthält eine detaillierte Beschreibung eines seriellen Additionsprotokolls, das zur Quantifizierung der Liganden-induzierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoraktivierung (GPCR) in anhaftend angebauten Zellen durch etikettenfreie Impedanzmessungen entwickelt wurde. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind an einer Vielzahl physiologischer Funktionen und menschlicher Krankheiten beteiligt1. Aufgrund dieser und ihrer guten Zugänglichkeit an der Zelloberfläche sind GPCRs eines der wichtigsten Wirkstoffziele. Diese Bewertung spiegelt sich in einer geschätzten Zahl von 700 zugelassenen Arzneimitteln wider, die auf DIE GPCR abzielen, was einem Anteil von 35 % an allen vermarkteten Arzneimitteln entspricht2.
Die Entwicklung neuer Medikamente umfasst zwei zentrale Prozesse: (i) die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung biologischer Zielmoleküle und (ii) die Entdeckung neuer Bleisubstanzen und deren Entwicklung zu administrierbaren Arzneimitteln. In beiden Prozessen sind effiziente Methoden erforderlich, um Wirkstoff-Ziel-Wechselwirkungen und die anschließende biologische nachgeschaltete Reaktion quantitativ zu bewerten. Verschiedene Stadien des präklinischen Arzneimittelentwicklungsprozesses nutzen verschiedene Analysemethoden, die von biomolekularen Interaktionsstudien zwischen Medikament und Ziel, über funktionelle Studien an Zellen in der Kultur bis hin zu Experimenten an ausgeschnittenem Organmaterial oder ganzen Tieren reichen. Sowohl die physiologische Bedeutung als auch die biologische Komplexität nehmen von ersterer bis zu letzterer3zu. Obwohl es das übergeordnete Ziel ist, Tierversuche zu minimieren, werden pharmakologische Studien mit isolierten Organen von Labortieren oder sogar ganzen Tieren als unvermeidlich angesehen, um neue Wirkstoffkandidaten umfassend zu charakterisieren. In analytischer Auslesung bieten Organpharmakologiestudien eine distale, integrative "ganzheitliche" funktionelle Reaktion von höchster physiologischer Relevanz. Ein Nachteil solcher Experimente ist, dass sie aus technischen und ethischen Gründen nicht mit einem Hochdurchsatz-Screening kompatibel sind und weitgehend durch Studien auf der Grundlage der In-vitro-Zellkultur4 ersetzt wurden.
Methoden zur Quantifizierung der GPCR-Aktivierung in Zellkulturen umfassen verschiedene etikettenbasierte chemische Assays, die speziell zweite Botenstoffe, Phosphorylierungszustand von nachgeschalteten Signalproteinen, Transkriptionsaktivierung über bestimmte Transkriptionsfaktoren oder Liganden-induzierten intrazellulären Rezeptorenhandel4,5. Ein Nachteil solcher etikettenbasierter Assays ist die Notwendigkeit, die Zellen mit potenziell schädlichen Farbstoffen oder radioaktiven Markern zu kennzeichnen. Dies erfordert häufig das Ausführen des Assays als Endpunktbestimmung für eine Expositionszeit, die a prioriangegeben werden muss. Die Verwendung von etikettenbasierten Endpunkt-Assays leidet unter diesem sehr begrenzten und voreingenommenen Timing des Experiments und dem Risiko, dass chemische Etiketten und Sonden die reguläre Zellphysiologie stören – möglicherweise unbemerkt vom Experimentator.
In den letzten Jahren sind etikettenfreie Assays zur Überwachung der GPCR-Aktivierung entstanden, wie Impedanz-basierte Techniken oder optische Methoden mit resonanten Wellenleitergittern5,6. Die Kennzeichnung der Zellen ist bei diesen Ansätzen experimentell nicht erforderlich. Da diese physikalischen Auslesungen mit Signalen mit geringer Amplitude betrieben werden, gelten solche Methoden als nicht-invasiv, sie ermöglichen eine kontinuierliche Zellüberwachung potenziell in Echtzeit und die Beobachtungszeit wird nur durch die Zellkultur und nicht durch das Auslesen begrenzt. Ähnlich wie aus ganzen Organen berichten labelfreie Ansätze häufig über ganzheitliche Zellreaktionen, weit nach der Rezeptoraktivierung, wenn die Integration entlang des gesamten Signalnetzes zu zeitabhängigen, aber eher unspezifischen Veränderungen in der Zellmorphologie oder Massenumverteilung führt. Während impedanzbasierte Assays die dielektrische Signatur von Veränderungen in der Zellform7,8messen, sind Messungen mit resonanzförmigen Wellenleitergittern empfindlich gegenüber Veränderungen des Brechungsindexes an der Zellsubstratschnittstelle, die sich aus der dynamischen Massenumverteilung (DMR)9ergeben. Der integrative Charakter macht etikettenfreie Methoden extrem empfindlich gegenüber Rezeptor-vermittelten Ereignissen, unabhängig von der Art(n) des G-Proteins (Gq, Gi/0, Gs, G12/13) oder '-arrestin, die an der Signalkaskade6 beteiligt sind und sich gut für endogene Expressionsniveaus des Rezeptors eignen.
In einem standardlabelfreien Impedanz-basierten Assay werden die Zellen in Multi-Well-Platten mit koplanaren Goldfilmelektroden, die auf der Unterseite jedes Brunnens abgelagertsind, 10anwachsen. Diese Elektroden-Arrays sind mit einem Impedanzanalysator verbunden und die Zellreaktionen auf einen experimentellen Reiz werden aus einzelnen Brunnen durch zeitaufgelöste Impedanzmessungen aufgezeichnet. In einem typischen GPCR-Test wird jedem einzelnen Brunnen ein Ligand in individuell unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt. Die Liganden-induzierten Veränderungen im Impedanz-Zeitverlauf werden dann in Bezug auf Merkmalskurvenmerkmale wie maximale Signaländerung, Fläche unter der Kurve, Signaländerung innerhalb eines bestimmten Zeitintervalls oder Steigung der Kurve zu einem bestimmten Zeitpunkt analysiert, um die Wirksamkeit und Wirksamkeit des Liganden zu quantifizieren11.
Die Kosten für die Elektroden-Arrays können die Anwendung dieser Technik in HTS-Kampagnen (High Throughput Screening) einschränken. Darüber hinaus steigt die Anzahl der Einzelmessungen mit zunehmender Anzahl parallel zu befolgender Proben und reduziert damit die verfügbare Zeitauflösung für jeden Brunnen schrittweise - auch bei modernsten Mehrkanalaufnahmen. Unter solchen Bedingungen können schnelle und vorübergehende Zellreaktionen der Messung entgehen. Darüber hinaus setzt der konventionelle Brunnen – ein Konzentrationsansatz einen signifikanten Zeit- und Kostenfaktor für durchfundierte Organ-on-Chip- oder Body-on-Chip-Entwicklungen in Bezug auf ihre Eignung in der Liganden-GPCR-Interaktionsanalyse.
Aus diesem Grund haben wir ein stufenweises Dosierungsprotokoll entwickelt, das die Aufzeichnung von Volldosis-Wirkungskurven der Liganden-induzierten GPCR-Aktivierung in kultivierten Zellmonolayern ermöglicht, indem die Impedanz eines einzelnen Brunnens kontinuierlich überwacht wird, während die Agonistenkonzentration schrittweise erhöht wird. Das serielle Agonistenadditionsprotokoll erhöht den Durchsatz pro Brunnen signifikant von einer Konzentration auf 10 oder mehr Konzentrationen, wie am aktuellen Beispiel menschlicher U-373-MG-Zellen gezeigt wird, die den Histamin-1-Rezeptor (H1R) endogen ausdrücken. Somit hat die Methode das Potenzial, den Durchsatz in etikettenfreien Dosis-Wirkungs-Studien deutlich zu verbessern, während die Zeitauflösung am instrumentellen Maximum beibehalten wird.
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Protocol
1. Zellaussaat auf Elektroden-Arrays
HINWEIS: Die Auswahl des Elektrodenlayouts ist ein Kompromiss zwischen Empfindlichkeit und Anzahl der untersuchten Zellen. Je kleiner die Elektrode, desto empfindlicher ist die Messung, aber je kleiner die Anzahl der untersuchten Zellen ist. Bei Zellen, die unter Basisbedingungen starke Impedanzschwankungen im Zeitverlauf aufweisen, sind größere oder interdigitierte Elektroden vorzuziehen.
- Vorwärmung aller Lösungen für Standard-Zellpassaging und -saatierung in einem 37 °C-Wasserbad. Für Assays mit menschlichen U-373 MG-Zellen braucht es: Phosphat gepufferte Saline (PBS) ohne Calcium und Magnesium, 0,05% (w/v) Trypsin, Zellkulturmedium (Eagle es Minimum Essential Medium (EMEM) ergänzt mit 5% (v/v) fetalem Kalbsserum (FCS), 2 mM L-Glutamin und 100 g/mL Penicillin/Strepcin.
- Spülen Sie die Zellschicht der Bestandskultur, die auf dem Boden herkömmlicher Zellkulturkolben oder Gerichte mit PBS zweimal angebaut wird.
- Entfernen Sie die PBS, fügen Sie die Trypsin-Lösung (1 ml für 25 cm2) und lassen Sie die Zellen bei 37 °C für 5 min brüten (gilt für U-373 MG-Zellen).
- Kontrolle zur vollständigen Ablösung der Zellen vom Boden des Wachstumssubstrats durch Mikroskopie.
- Stoppen Sie die Trypsin-Reaktion, sobald die Zellen vollständig getrennt sind, indem sie der Zellsuspension 9 ml Zellkulturmedium pro 1 ml Trypsin hinzufügen. Spülen Sie die verbleibenden Zellen vorsichtig vom Boden des Zellkultursubstrats ab, indem Sie die Suspension über das Substrat pfeifen.
- Sammeln Sie die Zellsuspension mit einer Pipette und übertragen Sie sie in ein Zentrifugationsrohr (15 ml oder 50 ml Rohr).
- Drehen Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 110 x g für 10 min bei Raumtemperatur nach unten.
- Entfernen Sie den Überstand sorgfältig und setzen Sie das Zellpellet im Kulturmedium gründlich wieder auf, bevor Sie die Zellen zählen (z. B. durch Verwendung eines Hemacytometers für Phasenkontrastmikroskope und manuelles Zählen).
- Passen Sie die Zellsuspension an die gewünschte Zelldichte an. Für Experimente mit U-373 MG-Zellen verwenden Sie 100 000 Zellen/cm2, um eine konfluente Zellschicht innerhalb von 48 h zu züchten. Dies entspricht einer Zelldichte von 200 000 Zellen/ml für 8-Well-Elektroden-Arrays mit einer Wachstumsfläche von 0,8cm2 und einem Wellvolumen von 400 l.
HINWEIS: Für reproduzierbare GPCR-Aktivierungsexperimente sollten Zellen zu konfluenten Monolayern auf den Elektrodenarrays angebaut werden. Um eine korrekte Rezeptorexpression auf der Zelloberfläche zu gewährleisten, sollten Zellen vor dem Experiment mindestens 36 h gesät werden. Das Testen unterschiedlicher Zelldichten für die Zellaussaat ist oft sinnvoll, um die besten experimentellen Bedingungen zu identifizieren. - Fügen Sie die Zellsuspension in die Brunnen des Elektroden-Arrays und lassen Sie die Verkäufe bei Raumtemperatur für 10 – 15 min absetzen, um eine homogene Verteilung der Zellen auf dem Boden der Brunnen zu gewährleisten.
- Wachsen Sie Zellen für mindestens 36 h in einem Standard-Zellkultur-Inkubator mit 5%CO2 (abhängig vom mittleren Typ) bei 37 °C und befeuchteter Atmosphäre. Ändern Sie das Zellkulturmedium 24 h vor dem Experiment.
- Am Tag des Experiments werden die Zellschichten auf den Elektrodenarrays durch (Phasenkontrast-)Mikroskopie untersucht, um eine vollständige Abdeckung von Elektroden mit Zellen zu gewährleisten.
2. Gleichgewichtierung von Zellen in serumfreiem Medium
- Vorwarmes serumfreies Medium, in dieser Studie: Leibovitz es L15 medium.
- Entfernen Sie das Zellkulturmedium aus Zellen, die auf Elektrodenarrays angebaut werden, und ersetzen Sie sie durch vorgewärmtes serumfreies Medium. Verwenden Sie 200 l für Elektroden-Arrays im 8-Well-Format und 150 l für 96-Well-Elektroden-Arrays.
- Lassen Sie die Zellen in serumfreiem Medium bei 37 °C für mindestens 2 h ausdemieren. Die Ausgleichszeit hängt stark vom Zelltyp ab. Zum Beispiel benötigen U-373 MG-Zellen 2 h, CHO-Zellen 4 h, BAEC kann eine Übernacht-Äquilibration in L-15 Medium erfordern.
HINWEIS: L-15 Medium istCO2-unabhängig und erfordert eineCO2-freieAtmosphäre. Für den Ausgleich in L-15 stellen Sie den Inkubator auf 0 %CO2. Die Gleichgewichtszeit kann durch Impedanzmessungen überwacht werden, was wir für die ersten Experimente empfehlen.
3. Überwachung der Zelläquilibration mit Impedanzwerten
- Legen Sie das Elektrodenarray in den Anschluss-Array-Halter des Impedanzanalysators.
- Stellen Sie einen korrekten Kontakt mit niedriger Impedanz zwischen Elektroden und Impedanzanalysator sicher. Diese Prüfung unterscheidet sich individuell für verschiedene Instrumente.
HINWEIS: Wenn das Gerät keine Verbindung zu den Elektroden herstellt, öffnen Sie die Kontaktklemme erneut, stellen Sie das Elektrodenarray für die richtige Positionierung im Halter wieder ein und wiederholen Sie es erneut. - Wählen Sie Elektrodentyp und/oder Multi-Well-Format aus der Benutzeroberfläche der Software.
- Richten Sie die Messparameter ein. Es stehen verschiedene Optionen zur Verfügung.
HINWEIS: Um die empfindlichste Wechselfrequenz auszuwählen, beziehen wir uns auf die Literatur und die Instrumentenhandbücher, da dies vom Elektrodenlayout und dem zu untersuchenden Zelltyp abhängt. Typischerweise liegt die Erfassungsfrequenz im Bereich von 4 kHz – 50 kHz. Hier wurden U-373 MG-Zellen auf kreisförmigen Arbeitselektroden mit einem Durchmesser von 250 m angebaut und mit einer Wechselfrequenz von 12 kHz überwacht.- Wenn Einzel- und Mehrfachfrequenzdatenerfassungsmodi verfügbar sind, wählen Sie den Einzelfrequenzmodus aus, um eine maximale Zeitauflösung zu gewährleisten. Die Messung wird mit dieser einzigen Frequenz durchgeführt. Für die am weitesten verbreiteten Instrumente gibt es eine Reihe von voreingestellten Frequenzen entlang des verfügbaren Frequenzfensters.
- Wenn die Anzahl der untersuchten Brunnen gering ist oder die Zeitauflösung nicht entscheidend ist, wählen Sie stattdessen mehrere Frequenzaufzeichnungen aus. Impedanzmessungen an einer bestimmten Anzahl von Frequenzen werden für jeden Brunnen für eine spätere eingehende Analyse aufgezeichnet.
HINWEIS: Die Zeitauflösung nimmt mit zunehmender Anzahl von Frequenzen, die pro Brunnen aufgezeichnet werden, und zunehmender Anzahl von Brunnen ab. Die Optionen für die Auswahl der Frequenz- und Datenerfassungsmodus variieren je nach Gerätetyp und -version.
- Beginnen Sie mit der Erfassung von Zeitkursdaten.
- Folgen Sie der Zellschichtimpedanz (mindestens 2 h), bis sich die Impedanz stabilisiert hat. In der Zwischenzeit bereiten Sie die agonistischen Lösungen vor.
- Wenn die Zellschichten ein stabiles Impedanzniveau erreicht haben, gehen Sie entweder (i) mit der seriellen Agonistenaddition innerhalb desselben Experiments fort oder (ii) die Datenerfassung beenden und einen neuen Datensatz zur Überwachung der agonistisch-induzierten Rezeptoraktivierung starten.
4. Vorbereitung von agonistischen Lösungen für Experimente im Agonistenmodus
- Berechnen Sie die Konzentration von agonistischen Lösungen nach Bedarf für jeden Schritt der seriellen Dosierung nach Gleichung (1). n reicht von 1 bis zur Gesamtzahl der seriellen Zusätze i. x bezeichnet Konzentration und Volumen im Brunnen bei Schritt n. y bezeichnet Konzentration und Volumen der "zu zu ergänzenden Lösung" in Schritt n.
HINWEIS: Berücksichtigen Sie die Anzahl der Replikationen und berechnen Sie das Gesamtvolumen der "zu zu zu addierenden Lösung" für jeden Konzentrationsschritt. Die Ergebnisse einer typischen Berechnung sind in den Tabellen 1-4aufgeführt. Es bedarf einer allgemeinen Vorstellung über den agonistischen Konzentrationsbereich, der untersucht werden muss, da der Bereich die Konzentrationen und die Anzahl der Portionen definiert, die während der seriellen Addition verabreicht werden sollen. Mit Dem seriellen agonistischen Additionsprotokoll wird die Agonistenkonzentration schrittweise erhöht. Daher muss die Menge an Agonisten bereits im Brunnen berücksichtigt werden, wenn die nächste Dosis hinzugefügt wird. Wenn die Anzahl der agonistischen Moleküle, die bereits im Brunnen vorhanden sind, nx = cx x x (mit der aktuellen Konzentration cx und Volumen Vx) und die Anzahl der Moleküle im Brunnen nach der nächsten Zugabe nx+ybeträgt, wird die Anzahl der zuzugesetzten Moleküle ny durch die Konzentration cy und das Volumen V y der auf den Brunnen anzuwendenden Lösung bestimmt (ny = cy ). Nach dem Hinzufügen eines Teils des Agonisten, ist die neue Menge an AgonistenMolekülen im Brunnen: cx+y , Vx+y = cx x , Vx + cy . Diese Berechnung gilt für jeden nachfolgenden Schritt. Aufgrund der Interdependenz der agonistischen Konzentration im Brunnen und der Menge an Agonisten in den Teilen, die bei jedem Schritt hinzugefügt werden sollen, ist es wichtig, die endgültigen Konzentrationen nach jedem Schritt im Voraus zu definieren.
Modus 1: Das Volumen im Brunnen wird mit jedem Schritt zunehmen, da Flüssigkeit kontinuierlich zugegeben wird.
Verwenden Sie diesen Modus und ein 8-Well-Format, verwenden Sie Vx1 = 200 l und Vy1 .... Vyi = 30 l.
Modus 2: Das Volume im Brunnen ist konstant, da das mit jedem Schritt hinzugefügte Volume kurz vor dem nachfolgenden Hinzufügen entfernt wird.
Verwenden Sie diesen Modus und ein 96-Well-Format, verwenden Sie Vx1 = 150 l und Vy1 .... Vyi = 75 .
- Drucken Sie das Datenblatt mit dem Gesamtvolumen pro Konzentration und detaillierten Anweisungen zum Pipetieren.
- Bereiten Sie alle Lösungen in der erforderlichen Menge vor. Machen Sie alle agonistischen Lösungen in demselben serumfreien Medium, wie sie für die Gleichdimierung der Zellen verwendet werden.
VORSICHT: Histamindihydrochlorid wird durch den OSHA Hazard Communication Standard 2012 (29 CFR 1910.1200) als gefährlich eingestuft. Histamin verursacht Hautreizungen, schwere Augenreizungen, kann eine allergische Hautreaktion, Allergie, Asthmasymptome oder Atembeschwerden verursachen, wenn es eingeatmet wird und Atemwegsreizungen verursachen kann. Bitte beachten Sie das Sicherheitsdatenblatt.
HINWEIS: Machen Sie agonistische Lösungen so frisch wie möglich. Die Stabilität der Agonisten in lösungsweise kann erheblich variieren. Lagern Sie Lösungen bei 4 °C oder darunter, bis sie im Experiment verwendet werden. Für einige Moleküle können zusätzliche stabilisierende Additive, wie BSA bei der Verwendung von Peptid-basierten oder Lipid-basierten Molekülen, in Betracht gezogen werden, um Adsorption an den Wänden von Brunnen und Röhren zu verhindern. - Wenn Sie das Experiment im 96-Well-Format durchführen, übertragen Sie Lösungen auf eine herkömmliche 96-Well-Platte (keine Elektroden) und verwenden Sie eine 8- (oder 12-) Kanalpipette für eine schnelle Flüssigkeitsübertragung in das Elektroden-Array.
5. Vorbereitung von agonistischen Experimentierlösungen im Antagonistenmodus
HINWEIS: Bereiten Sie die Antagonistenlösung(n) mit der Konzentration vor, die durchgängig aufgebracht werden soll. Volumen und Konzentration der Antagonistenlösung hängen von der Art der agonistischen Addition ab (1 oder 2). Beispiele für Experimente im 8-Well- oder 96-Well-Format zusätzlich Modus 2: (A) 8-Well-Format (Vx1 = 200 l, VAntagonist = 200 l); (B) 96-Well-Format (Vx1 = 150 l, VAntagonist = 75 x L).
- Berechnen Sie die Konzentration jeder Agonistenlösung, die für jeden Schritt der seriellen Bejegung benötigt wird, wie in Schritt 4.1 beschrieben.
- Machen Sie alle agonistischen Lösungen in demselben serumfreien Medium, wie sie zur Gleichdrüse der Zellen verwendet werden, und fügen Sie den Antagonisten bei der gleichen Endkonzentration hinzu, wie für die jeweiligen Brunnen im Experiment geplant.
HINWEIS: In diesem Fall wird die Histamin-Lagerlösung (10 mM) in L-15 Medium hergestellt. Wenn Agonisten in anderen Lösungsmitteln (z.B. Dimethylsulfoxid (DMSO), Ethanol) gelöst werden, sollte eine Lösungsmittelkontrolle einbezogen werden, um die steigende Lösungsmittellast bei jedem Zusatzschritt zu berücksichtigen.
6. Ausführen des seriellen Additionsprotokolls im Agonistenmodus
- Starten Sie die Datenerfassung, wie in den Schritten 3.1 – 3.5 beschrieben.
- Die Agonistenlösungen vor dem Gebrauch vorwärmen, indem Sie sie vor der Zugabe ca. 10 – 15 min im Inkubator platzieren.
HINWEIS: Bei verwendung thermolabiler Substanzen sollten die Lösungen nicht zu lange bei 37 °C gehalten werden. Wenn die Vorerwärmung für 10 – 15 min als kritisch angesehen wird, bringen Sie Lösungen kurz vor dem Zusatz in einem Wasserbad auf 37 °C. - Führen Sie die agonistische serielle Dosing abhängig vom ausgewählten Additionsmodus aus. Nach Modus 1 erhöht sich das Gesamtvolumen im Brunnen mit jeder Zugabe der nächsten Dosis. Im Modus 2 wird das gleiche Volumen, das mit jedem Schritt hinzugefügt wird, auch kurz vor dem Hinzufügen der nächsthöheren Dosis wieder entfernt.
HINWEIS: Die Zeit, die für den Ausgleich der Zellschicht zwischen zwei nachfolgenden Agonistendosen benötigt wird, hängt von der Reaktionszeit der Zellen ab. Ein erstes Experiment im Parallelmodus (ein Brunnen – eine Konzentration) zeigt (i) Zellreaktionszeiten für verschiedene agonistische Konzentrationen und (ii) den empfindlichsten Kurvenparameter (z.B. Impedanzmaximum, Impedanz nach Zeit x).
A: Modus 1 / 8-Well-Format
- Fügen Sie den Zellen, die in 200 l serumfreiem Medium ausgeglichen wurden, 30 l der ersten Lösung mit der niedrigsten Konzentration von Agonisten hinzu.
- Lassen Sie die Zellen für den vordefinierten Zeitraum (z. B. 15 min) reagieren und ausdemieren.
- Fügen Sie 30 l der zweiten Lösung mit der nächsthöheren Konzentration hinzu.
- Wiederholen Sie die Schritte 6.3.1-6.3.3 mit der dritten, vierten und so weiter agonistischen Lösung.
ANMERKUNG: Die Arbeit mit 10 Konzentrationsschritten führt am Ende des Experiments zu einem Gesamtvolumen von 500 l, was knapp unter dem maximal anwendbaren Volumen dieser Brunnen von 550 l liegt.
B: Modus 2 / 96-Well-Format
HINWEIS: Anhalten Sie die Datenerfassung während jedes Flüssigkeitsbehandlungsschritts (Addition/Entfernung) über die Software des Impedanzinstruments, wenn Experimente im 96-Well-Format ausgeführt werden. Die aufwendigere Handhabung von Flüssigkeiten kann die Datenerfassung beeinträchtigen. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette.
- Unterbrechen Sie die Datenerfassung.
- Fügen Sie den Zellen, die in 150 l serumfreiem Medium ausgeglichen wurden, 75 l der ersten Lösung mit der niedrigsten Konzentration von Agonisten hinzu.
- Setzen Sie die Datenerfassung fort.
- Lassen Sie die Zellen für den vordefinierten Zeitraum (z. B. 15 min) reagieren und ausdemieren.
- Etwa 1 – 2 min, bevor die reguläre Ausgleichszeit endet, halten Sie die Messung an und entfernen Sie 75 l aus jedem Brunnen.
HINWEIS: Der Zeitpunkt, zu dem die Lösung entfernt werden soll, hängt von der Anzahl der parallel überwachten Bohrungen und der Pipettiergeschwindigkeit ab. Die für die Entfernung der Lösungen benötigte Zeit sollte die Zeit zwischen den nachfolgenden Schritten nicht überschreiten. - Fügen Sie 75 l der zweiten Lösung mit der nächsthöheren Konzentration hinzu und nehmen Sie die Messung wieder auf.
- Wiederholen Sie die Schritte 6.3.8-6.3.10 mit der dritten, vierten und so weiter agonistischen Lösung.
7. Ausführen des seriellen Additionsprotokolls im Antagonistenmodus
- Starten Sie die Messung wie in den Schritten 3.1 – 3.5 beschrieben.
- Während der Gleichgewichtsbehandlung der Zellschichten eine Antagonistenlösung (z. B. 200 L von 1,5 M Diphenhydraminhydrochlorid in L15-Medium) vorbereiten.
VORSICHT: Diphenhydraminhydrochlorid hat potenzielle akute gesundheitliche Auswirkungen. Es ist schädlich, wenn geschluckt oder eingeatmet, kann Augen- und Hautreizungen verursachen. Es kann Zufall von Reizungen des Atmungs- und Verdauungstraktes verursachen. Bitte beachten Sie das Sicherheitsdatenblatt. - Die antagonistischen und agonistischen Lösungen vorwärmen, indem man sie ca. 10 – 15 min im Inkubator platziert, bevor sie zusätzlich zu den Zellkulturen (vgl. 6.2) vorgewässt werden. Wenn auch antagonistischfreie Brunnen in den Test einbezogen sind, auch vorwarmes serumfreies Medium.
- Fügen Sie die Antagonistenlösung zu den dafür vorgesehenen Brunnen hinzu. Lassen Sie die Zellen mit Antagonisten für 15 – 20 min aussetzen. Wenn antagonistischfreie Brunnen enthalten sind, fügen Sie das gleiche Volumen serumfreies Medium zu diesen Brunnen hinzu.
- Nach Antagonistenzusatz in Modus 2,entfernen Sie die Lösung aus den Brunnen
(A) 8-Well-Format (200 l)
(B) 96-Well-Format (75 l) - Führen Sie die agonistische Additionssequenz wie in Schritt 6.3 beschrieben aus.
8. Datenexport und -analyse
- Exportieren Sie Daten mit der Software des Impedanzinstruments, um alle aufgezeichneten Daten von proprietären in gängige Datenformate (z.B. csv) umzuwandeln. Dieser Schritt ermöglicht die Neuorganisation und Darstellung der Daten mit anderen Softwarepaketen.
- Laden Sie die csv-formatierten Daten in eine wissenschaftliche Datenanalysesoftware.
- Normalisieren Sie Impedanzwerte, indem Sie die Impedanz des letzten Datenpunkts vor der ersten Zugabe der Agonistenlösung subtrahieren und die Zeit des Hinzufügens auf t = 0 festlegen. Zeichnen Sie den Zeitverlauf der normalisierten Impedanz.
- Zeichnen Sie die einzelnen Zeitkurse und identifizieren Sie die Maxima in Impedanz nach jedem Additionsschritt. Erstellen Sie ein Datenblatt mit diesen Werten.
- Plotten Sie die Werte der maximalen (oder minimalen, falls zutreffend) Impedanzänderungen als Funktion der agonistischen Konzentration. Dies kann für einzelne Brunnen oder für die Mittelwerte (Mittelwert SD) erfolgen.
- Verwenden Sie eine Datenanpassungsroutine, um halbmaximale effektive Konzentrationen (EC50) und maximale Reaktionsgeschwindigkeit (EMax) mithilfe des vier Parameter-Logistikmodells (Gleichung 2) zu bestimmen:
ANMERKUNG: c gibt die Agonistenkonzentration an, A1 ist das Minimum und A2 ist das maximale Asymptote der sigmoidalen Dosis-Wirkungs-Kurve (A2 = EMax). EC50 ist die Konzentration am Biegepunkt der Kurve und n entspricht der Hügelneigung.
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Representative Results
Ein typisches Schema zur Vorbereitung der verschiedenen agonistischen Lösungen wird für ein Experiment mit 8-Well-Elektroden-Arrays mit Histamin als Agonist in den Tabellen 1-4gezeigt. Tabelle 1 und Tabelle 2 zeigen Volumen und Konzentrationen für ein Experiment mit Additionsmodus 1 (vgl. Abbildung 1), während Tabelle 3 und Tabelle 4 Volumen und Konzentrationen für ein Experiment nach Additionsmodus 2 darstellen (vgl. Abbildung 1). Die Daten wurden mit Gleichung (1) berechnet.
Ein repräsentatives Experiment ist in Abbildung 2 für konfluente Schichten von U-373 MG-Zellen dargestellt, die endogen den Histamin-1-Rezeptor ausdrücken, der auf einem 8-Well-Elektroden-Array mit einer Arbeitselektrode von 250 m Durchmesser mit Histamin als Agonist angebaut wird. Die Messung wurde mit einer Einzelfrequenz von 12 kHz durchgeführt. Die Addition der agonistischen Konzentrationsserie wurde nach Modus 1durchgeführt. Im ausgewählten Experiment wurden alle 15 min 10 Lösungen mit steigender Histaminkonzentration (vorbereitet nach Schritt 4) sequenziell zugesetzt (Abbildung 2A). Das serielle Dosiersystem wurde auf sieben von acht Brunnen angewendet. In einem gut agonistisch-freien Medium (L-15) wurde sequenziell als Negativkontrolle in neun von zehn Schritten hinzugefügt. Die letzte Ergänzung zu dieser Kontrolle war eine Histaminlösung, die eine Endkonzentration von 100 M Histamin im Brunnen lieferte. Die Daten wurden mit datenanalysesoftware geplottet und werden als Impedanzänderung angezeigt. Z| 12 kHz / k' entlang des Experiments, wobei die Impedanzänderung und der Zeitpunkt der ersten Addition auf Null gesetzt werden. Die anfängliche Ausgleichszeit im versuchsweise puffer von 2 h wird in diesem Diagramm nicht angezeigt. Die Zeitpunkte der agonistischen Addition werden durch Pfeile angezeigt.
Die Änderung der Impedanz relativ zur Basislinie nach jedem Konzentrationsschritt wurde mit einem Datencursor aus den Kurven extrahiert. Bei Schritten ohne klares Maximum wurde der letzte Datenpunkt vor dem nächsten Zusatz für die Analyse verwendet. Impedanzändert sich | Z| 12 kHz wurden als Funktion der Histaminkonzentration (cx+y)(Abbildung 2B, Symbole) dargestellt. Die Übertragungsfunktion eines Vierparameter-Logistikmodells (vgl. Schritt 8.6) wurde an die experimentellen Datenpunkte aus sieben Brunnen angepasst(Abbildung 2B,Linien). Die Anpassungsergebnisse sind in Tabelle 5dargestellt. Abbildung 2C und Abbildung 2D zeigen das Ergebnis der Mittelung der Daten in Abbildung 2A und Abbildung 2B, die den Mittelwert SD für sieben Brunnen darstellen. Die durchschnittlichen Zeitverlaufsdaten sind in Abbildung 2Czusammengefasst, während die durchschnittliche Dosis-Wirkungs-Kurve in Abbildung 2Dangegeben ist.
In Dosis-Wirkungs-Beziehungen, wie in Abbildung 2B,Ddargestellt, wurde das Anpassungsverfahren auf den gesamten Konzentrationsbereich angewendet, der EC50 = (0,86 x 0,13) M zurückgibt. Die Impedanzreaktion erhöht sich monoton mit steigender Histaminkonzentration, mit Ausnahme der letzten beiden Konzentrationsschritte (30 M, 100 m Endkonzentration). Diese Reaktion erklärt sich vermutlich durch Downregulation des Histaminrezeptors, Desensibilisierung oder Überstimulation der Zellen (siehe Diskussion). Um diesen Effekt zu berücksichtigen, wurde der Datenbereich für die Analyse reduziert, wie für ein einziges serielles Dosierexperiment(Abbildung 3;gut 1) gezeigt, das aus den in Abbildung 2dargestellten Daten ausgewählt wurde. Darüber hinaus ist es gut gerechtfertigt, das untere Asymptot (A1) bei der geringsten quadratischen Optimierung auf Null zu setzen, wenn keine Impedanzänderung als Reaktion auf 0 'M Histamin angenommen wird. Die Anwendung dieser drei Parameteroptimierung bietet eine EC50 von (0,75 x 0,12) M (vgl. Abbildung 3B). Es wurde festgestellt, dass dieEG-50-Werte für beide Datenanalysemodi unempfindlich waren und sich nicht wesentlich unterschieden.
Typische Ergebnisse für ein 96-Well-Plattenexperiment sind in Abbildung 4zusammengefasst. U-373 MG-Zellen wurden wie oben beschrieben auf 96-Well-Elektroden-Arrays angebaut. 32 Brunnen wurden in die Messung einbezogen. 8 Brunnen dienten als agonistische Kontrollen, die nur dem Medium ausgesetzt waren. 24 Brunnen wurden einer Reihe von zunehmenden Histaminkonzentrationen unterzogen, die für den Additionsmodus 2 berechnet und vorbereitet wurden. Der Zeitverlauf der Impedanzänderung wird für alle 32 Einzelbrunnen in Abbildung 4Adargestellt. Eine der Kurven (rot hervorgehoben) zeigt einen ungewöhnlichen Zeitverlauf und wurde von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Dementsprechend wurden die Daten aus 23 Brunnen in Abbildung 4Bgemittelt und als Zeitverlauf der durchschnittlichen Impedanzänderung (Mittelwert SD) dargestellt. Jede einzelne Kurve wurde wie oben beschrieben für die Dosis-Wirkungs-Beziehung analysiert. Die Datenpunkte wurden gemittelt und in Abhängigkeit von der endgültigen Histaminkonzentration dargestellt (Abbildung 4C). Die Dosis-Wirkungs-Daten wurden mit Hilfe des vier Parameter-Logistikmodells analysiert, das einen durchschnittlichenEC-50-Wert von (1,0 x 0,3) m zurückgab.
Ein typisches Ergebnis für das serielle Agonistenadditionsprotokoll im Antagonistenmodus ist in Abbildung 5dargestellt. Hier wurde ein Brunnen mit 0,75 M des Histaminrezeptor-Antagonisten Diphenhydramin (rote Kurve) 20 min vorbehandelt, bevor das erste Histamin hinzugefügt wurde (Abbildung 5A). Die Steuerung erhielt antagonistisch freies Medium (blaue Kurve). Der Antagonist wurde nach Modus 2hinzugefügt, was bedeutet, dass 200 l der letzten 400 l entfernt wurden, bevor die Agonistenserie angewendet wurde. Der Agonist (Histamin) wurde nach dem seriellen Dosiermodus 1 hinzugefügt, wie in den obigen Beispielen beschrieben. Für Experimente im Antagonistenmodus ist es wichtig, dass die Antagonistenkonzentration während des gesamten Verlaufs des Experiments konstant gehalten wird. Dementsprechend müssen alle agonistischen Lösungen, die dem Brunnen hinzugefügt werden, auch die vordefinierte Antagonistenkonzentration (in diesem Fall 0,75 m) enthalten, während die Kontrolle antagonistisch bleibt. Eine antagonistische Wirkung wird durch eine "verzögerte" Erhöhung der Impedanz innerhalb des seriellen Dosierschemas sichtbar, die höheren agonistischen Konzentrationen entspricht, die erforderlich sind, um eine Zellreaktion zu induzieren. In der Dosis-Wirkungs-Beziehung wird die Wirkung des Antagonisten als eine Rechtsverschiebung der Kurven ausgedrückt, was einer Erhöhung der EC50entspricht, vorausgesetzt, der Antagonist ist ein kompetitiver Liganden im Verhältnis zum Agonisten (Abbildung 5B). Die EC50 wurde ohne den Antagonisten auf (0,92 x 0,05) m und in ihrer Anwesenheit auf (14,7 x 0,6) m bestimmt.
Abbildung 1: Serielle Agonisten-Additionsmodi. (A) Schematische Darstellung von Konzentrationsberechnungen. Durch Zugabe von agonistischer Konzentrationslösung cy und Volumen Vy zu einem Brunnen mit Volumen Vx und Agonistenkonzentration cxerhöht sich das Volumen auf Vx+y und die Konzentration steigt auf cx+y. (B) Zwei verschiedene Modi für serielle Agonisten Addition. Modus 1: Das Gesamtvolumen im Brunnen Vx+y erhöht sich mit jeder Zugabe. Modus 2: Das bei jedem Konzentrationsschritt hinzugefügte Volumen wird erneut entfernt, bevor die nächste Dosis hinzugefügt wird, wodurch das Gesamtvolumen im Brunnen konstant bleibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Ergebnisse eines typischen Experiments im 8-Well-Format. (A) Zeitverlauf der Impedanzänderung bei 12 kHz für konfluente U-373 MG-Zellschichten, die auf kreisförmigen Arbeitselektroden mit einem Durchmesser von 250 m angebaut werden. In sieben von acht Brunnen wurde die serielle Zugabe von Histamin angewendet. Ein Brunnen (graue Kurve) wurde sequenziell mit einem histaminfreien Puffer bei jedem Schritt (Modus 1) geladen, mit Ausnahme des letzten Schritts, als 100 -M Histamin als Positivkontrolle hinzugefügt wurden. (B) Dosis-Wirkungs-Beziehungen, die aus der maximalen Impedanzänderung relativ zur Ausgangsbasis für sieben einzelne Brunnen nach jedem Konzentrationsschritt generiert werden. (C) Durchschnittlicher Zeitverlauf der Impedanzänderung (Mittelwert SD), erzeugt aus sieben einzelnen Brunnen (A). (D) Durchschnittliche Dosis-Wirkungs-Beziehungen, die aus einzelnen Datensätzen generiertwurden,wie in B dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Anpassung der Datenanalysemodi. (A) Typischer Zeitverlauf der Impedanzänderung bei 12 kHz für eine einzelne konfluente U-373 MG-Zellschicht, die auf kreisförmigen Arbeitselektroden mit einem Durchmesser von 250 m angebaut wird. (B) Experimentelle Dosis-Wirkungs-Beziehung (gefüllte Symbole), die aus der maximalen Impedanzänderung relativ zur Ausgangsbasis nach jeder Konzentrationserhöhung generiert wurde. Entweder wurde der vollständige Datensatz dem Anpassungsverfahren unterzogen (schwarze und graue Kurve) oder der letzte Datenpunkt - der den Beginn der Rezeptorensilage und/oder Internalisierung angibt - wurde bei der quantitativen Analyse (rote und Magentakurve) weggelassen. Alle vier Parameter wurden während der geringsten quadratischen Optimierung (schwarze und rote Kurve) angepasst oder der Parameter A1, der den unteren Asymptoten darstellt, wurde eingestellt und auf Null (graue und magentafarbene Kurve) festgelegt. DieEG-50-Werte unterschieden sich für die beiden Datenanalysemodi nicht wesentlich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Typisches Experiment im 96-Well-Format. (A) Zeitverlauf der Impedanzänderung gemessen bei 12 kHz für konfluente U-373 MG-Zellschichten, die auf einem 96-Well-Elektroden-Array angebaut werden. Die Daten werden für 32 Brunnen angezeigt. 24 Brunnen wurden einer Reihe von zunehmenden Histaminkonzentrationen unterzogen, die mit einer Ausgleichszeit von 15 min zwischen jedem Schritt hinzugefügt wurden. Die rot markierte Kurve wurde von der Mittelung ausgeschlossen. Acht Brunnen (Kontrolle) wurden mit histaminfreiem Medium zu jedem Zeitpunkt der Zugabe behandelt. (B) Zeitverlauf der durchschnittlichen Impedanzänderung für 23 einzelne Brunnen als Reaktion auf Histamin-Serienaddition und acht Steuerbrunnen, wie in (A) dargestellt. (C) Durchschnittliche Dosis-Wirkungs-Beziehung, die aus der maximalen Impedanzänderung relativ zur Ausgangsbasis nach jeder Konzentrationserhöhung entsteht (mittleres Verhältnis sD). Die Daten wurden mit einer vier Parameter-Logistikfunktion ausgestattet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Typisches Experiment im Antagonistenmodus. (A) Zeitverlauf der Impedanzänderung bei 12 kHz für konfluente U-373 MG-Zellschichten, die auf kreisförmigen Arbeitselektroden mit einem Durchmesser von 250 m bei Zugabe zunehmender Histaminkonzentrationen mit oder ohne Vorhandensein von Histaminrezeptor-Antagonistendiphenhydramin angebaut werden. Diphenhydramin (0,75 m) oder antagonistenfreies Medium (L15) wurden 20 min hinzugefügt, bevor die agonistische serielle Dosing begann. (B) Dosis-Antwort-Beziehungen, die aus der maximalen Impedanzänderung relativ zur Basislinie nach jeder Konzentrationserhöhung aus den in (A) dargestellten Daten generiert werden. Das Vorhandensein von 0,75 m Diphenhydramin erhöhte die EC50 von (0,92 x 0,05) auf (14,7 x 0,6) M. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Lösung # | cx+y (M) | cx (M) | Vx (L) | Vx+y (L) | Vy (L) | cy (M) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 230 | 30 | 0.08 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 230 | 260 | 30 | 0.79 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 260 | 290 | 30 | 2.03 |
| 4 | 1 | 0.3 | 290 | 320 | 30 | 7.77 |
| 5 | 3 | 1 | 320 | 350 | 30 | 24.33 |
| 6 | 10 | 3 | 350 | 380 | 30 | 91.67 |
| 7 | 30 | 10 | 380 | 410 | 30 | 283.33 |
| 8 | 100 | 30 | 410 | 440 | 30 | 1056.67 |
Tabelle 1: Konzentrationsberechnungsschema für Experimente mit 8-Well-Elektroden-Arrays nach Additionsmodus 1.
| Lösung # | cy (M) | Vy (L) | machen aus | c (M) | Verdünnungsfaktor | gesamt V machen (l) | Verwendung (l) | Hinzufügen von V (l) |
| 1 | 0.08 | 30 | 3 | 2.03 | 26.52 | 600 | 22.6 | 577.4 |
| 2 | 0.79 | 30 | 4 | 7.77 | 9.83 | 600 | 61 | 539 |
| 3 | 2.03 | 30 | 5 | 24.33 | 11.97 | 600 | 50.1 | 549.9 |
| 4 | 7.77 | 30 | 6 | 91.67 | 11.8 | 600 | 50.8 | 549.2 |
| 5 | 24.33 | 30 | 7 | 283.33 | 11.64 | 600 | 51.5 | 548.5 |
| 6 | 91.67 | 30 | 8 | 1056.67 | 11.53 | 600 | 52.1 | 547.9 |
| 7 | 283.33 | 30 | 8 | 1056.67 | 3.73 | 600 | 160.9 | 439.1 |
| 8 | 1056.67 | 30 | 10 mM Lager | 10000 | 9.46 | 800 | 84.5 | 715.5 |
Tabelle 2: Pipettierschema für Experimente mit 8-Well-Elektroden-Arrays nach Additionsmodus 1.
| Lösung # | cx+y (M) | cx (M) | Vx (L) | Vx+y (L) | Vy (L) | cy (M) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 400 | 200 | 0.02 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 200 | 400 | 200 | 0.19 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 200 | 400 | 200 | 0.5 |
| 4 | 1 | 0.3 | 200 | 400 | 200 | 1.7 |
| 5 | 3 | 1 | 200 | 400 | 200 | 5 |
| 6 | 10 | 3 | 200 | 400 | 200 | 17 |
| 7 | 30 | 10 | 200 | 400 | 200 | 50 |
| 8 | 100 | 30 | 200 | 400 | 200 | 170 |
Tabelle 3: Konzentrationsberechnungsschema für Experimente mit 8-Well-Elektroden-Arrays nach Additionsmodus 2.
| Lösung # | cy (M) | Vy (L) | machen aus | c (M) | Verdünnungsfaktor | gesamt V machen (l) | Verwendung (l) | Hinzufügen von V (l) |
| 1 | 0.02 | 200 | 3 | 0.5 | 25 | 1000 | 40 | 960 |
| 2 | 0.19 | 200 | 4 | 1.7 | 8.95 | 1000 | 111.8 | 888.2 |
| 3 | 0.5 | 200 | 5 | 5 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 4 | 1.7 | 200 | 6 | 17 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 5 | 5 | 200 | 7 | 50 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 6 | 17 | 200 | 8 | 170 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 7 | 50 | 200 | 8 | 170 | 3.4 | 1000 | 294.1 | 705.9 |
| 8 | 170 | 200 | 200 M Lagerbestand | 200 | 1.18 | 1300 | 1105 | 195 |
Tabelle 4: Pipettierschema für Experimente mit 8-Well-Elektroden-Arrays nach Additionsmodus 2.
| Gut | EC50 | Emax (=A2) | A1 | N |
| (M) | (k)) | () | ||
| 1 | 0,9 x 0,1 | 1680 bei 70 | 150 x 80 | 1,9 x 0,5 |
| 2 | 0,7 x 0,2 | 1770 bei 90 | 200 €140 | 1,3 x 0,4 |
| 3 | 0,6 x 0,2 | 1700 bei 100 | 60 x 250 | 1,1 bis 0,5 |
| 4 | 0,6 x 0,2 | 2000 bei 100 | 140 x 180 | 1,3 x 0,4 |
| 5 | 0,9 x 0,1 | 1810 bei 60 | 160 x 80 | 1,4 x 0,3 |
| 6 | 0,8 x 0,1 | 1950 bei 70 | 200 x 110 | 1,3 x 0,3 |
| 7 | 0,6 x 0,3 | 1700 x 200 | 260 x 250 | 1,6 x 1,0 |
| 1 – 7 | 0,7 x 0,2 | 1900 bei 100 | 100 x 100 | 1,1 bis 0,2 |
Tabelle 5: Ergebnisse aus vier logistischen Parameteranpassungen, die auf typische Dosis-Wirkungs-Daten angewendet werden. Die für die Analyse verwendeten Dosis-Wirkungs-Daten sind in Abbildung 2dargestellt. Der volle Konzentrationsbereich wurde auf die Analyse der einzelnen Brunnen eins bis sieben (Abbildung 2B) und für die durchschnittlichen Daten aus den Brunnen eins bis sieben angewandt (Abbildung 2D). Keiner der Parameter der logistischen Funktion wurde bei der geringsten quadratischen Optimierung festgelegt. Die Anpassungsergebnisse wurden auf das Jahrzehnt des Fehlers gerundet, es sei denn, der Wert war kleiner als der Fehler.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren für etikettenfreie Impedanzmessungen, um die Dosis-Wirkungs-Beziehung der agonistisch-induzierten GPCR-Aktivierung in Abwesenheit oder das Vorhandensein spezifischer Antagonisten für denselben Rezeptor zu bestimmen. Der Konzeptbeweis dieser Methode wurde kürzlich in einer Veröffentlichungvorgestellt 12. Unserer Kenntnis nach ist es die erste Studie, die die Etablierung einer vollständigen Dosis-Wirkungs-Kurve der agonistisch vermittelten GPCR-Aktivierung mit einer einzigen Zellschicht in vitro beschreibt. Dieser Ansatz erfordert unweigerlich die Verwendung von etikettenfreien Zellüberwachungsansätzen und wird nicht auf Endpunkt-Assays anwendbar sein.
Das Protokoll wurde am Beispiel von U-373 MG-Zellen demonstriert, die endogen den menschlichen Histamin-1-Rezeptor (hHR1) ausdrücken, der mit einer Reihe zunehmender Konzentrationen seines endogenen agonistischen Histamins stimuliert wird, während die Impedanz der Zellen kontinuierlich aufgezeichnet wird. Um die Anwendbarkeit des Protokolls auf Antagonistenstudien nachzuweisen, wurden die Experimente in Gegenwart einer konstanten Konzentration von Diphenhydramin, einem Wettbewerbsantagonisten gegenüber dem hH1R, wiederholt. Impedanzaufnahmen wurden auch erfolgreich eingesetzt, um neben den hier gezeigten Beispielen auch andere H1R-Agonisten (z.B. UR-KUM53011, individuelle und stufenweise Dosierung) und Antagonisten (z.B. Mepyramin)12 zu untersuchen. Darüber hinaus wurde das Protokoll auch auf andere Zelllinien und Rezeptoren angewendet, z. B. CHO-D2R, der den Dopamin-D2-Rezeptor (D2R) oder BAEC ausdrückt, der den ß 2-adrenergen Rezeptor (ß2AR)12 ausdrückt, was darauf hindeutet, dass es ein allgemeines Schema für eine sehr effiziente Generierung von Dosis-Wirkungs-Daten darstellt. Während U373-MG- und BAEC-Zellen die jeweiligen Rezeptoren H1R und ß2AR auf endogenen Niveaus ausdrücken, ist der CHO-D2R ein Beispiel für ein rekombinantes Zellmodell. Zusammengenommen ist das serielle Protokoll allgemein für Zelltypen mit endogener oder ektopischer GPCR-Expression, GPCRs mit verschiedenen Kopplungstypen Gq (z.B. H1R), Gs (z.B. ß2AR), Gi (z.B. D2R) sowie verschiedene Ligandentypen (Agonist/Antagonist) anwendbar. Bei allen oben genannten Zell-/Rezeptortypen erhöht sich die Impedanz mit zunehmender Agonistenkonzentration. Einige Zellen reagieren jedoch auf die GPCR-Aktivierung durch eine Impedanzabnahme. Wir testeten das Protokoll für einen solchen Fall (HaCaT/Histamin) und fanden auch eine konzentrationsabhängige stufenweise Abnahme, die den Begriff eines allgemein anwendbaren Ansatzes unterstützt, der auch mit inversen Impedanzänderungen kompatibel ist. Es wurde vorgeschlagen, dass der detaillierte Zeitverlauf der Impedanzdaten die Art der G-Protein-Kopplung eines bestimmten Rezeptors angibt. Auch wenn das Konzept attraktiv ist, unterstützt der Pool unserer Daten keine allgemeingültige Regel, die das Impedanzzeitprofil mit der G-Protein-Kopplung eines bestimmten GPCR6korreliert.
Das serielle Additionsprotokoll ist an verschiedene Arten von Elektrodenlayouts und Multi-Well-Formaten anpassbar. Es gilt für On-Chip-Perfusionssysteme, was ein wesentlicher Vorteil gegenüber vielen etikettenbasierten Ansätzen ist, die oft eine Zellschicht erfordern, damit eine Konzentration getestet werden kann. Dementsprechend kann das serielle Dosierungsschema den Weg für Dosis-Wirkungs-Studien in komplexeren biologischen Modellen wie Organ-on-a-Chip oder sogar Human-on-a-Chip-Ansätzen ebnen. Impedanzmessungen erkennen eine integrierte, distale Reaktion der Zellen auf die Rezeptoraktivierung, die letztlich Zellmorphologieveränderungen induziert. Diese eher allgemeine und unspezifische, aber auch unvoreingenommene Auslesung ist die Grundlage für ihre breite Anwendbarkeit, die nicht auf GPCRs beschränkt ist, sondern auch für andere Klassen von Zelloberflächenrezeptoren, zytoplasmatischen Rezeptoren oder sogar intrazellulären Proteinen als Ziele wirken könnte.
Es ist entscheidend, dass das stufenweise agonistische Additionsprotokoll mit konfluenten Zellschichten an den Elektroden arbeitet, da spärliche Kulturen die Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Dateninterpretation beeinträchtigen. Eine weitere Voraussetzung für eine erfolgreiche Überwachung der Rezeptoraktivierung auch in konfluenten Zellmonolayern ist eine Veränderung der Zellform entlang der Signaltransduktionskaskade. Wenn die untersuchten Zellen ihre Morphologie entlang des Experiments nicht ändern, sind impedanzbasierte Auslesungen blind und berichten nicht über eine Veränderung der Rezeptoraktivität. Um das serielle Additionsprotokoll richtig zu gestalten, wird eine erste Vorprüfung im herkömmlichen One-Well-One-Konzentrationsmodus empfohlen, um den Konzentrationsbereich des Agonisten grob und das Zeitintervall zwischen nachfolgenden Agonistenzusätzen zu bestimmen. Die Zeitintervalle zwischen den sequenziellen Dosen des Agonisten sollten so angepasst werden, dass das System ein neues Gleichgewicht annimmt, bevor die nächste, höhere Dosis hinzugefügt wird. Dementsprechend kann die Methode weniger nützlich für Rezeptoren sein, die eine sehr schnelle und nur vorübergehende Reaktion der Zellen auslösen oder eine sehr langsame Reaktion, die Stunden dauern kann. Die letztgenannte Situation würde die Gesamtzeit des Experiments erhöhen und parallele Additionsprotokolle erfordern, um die Laborzeit zu verkürzen. In den oben vorgestellten Beispielen betrug die Gesamtlaufzeit des Experiments 2,5 – 3,5 h, abhängig von der Anzahl der Konzentrationen (8 oder 10) und einer möglichen Vorinkubation mit Antagonisten. Das gleiche Experiment im konventionellen parallelen agonistischen Additionsmodus würde nur 1 h für das gleiche Zell-Rezeptor-Modell, aber mit viel kleinerem Durchsatz dauern. Ein klarer Vorteil des seriellen Ansatzes besteht darin, dass die Anzahl der Konzentrationen, die auf eine vollständige Dosis-Wirkungs-Beziehung getestet werden müssen, nicht durch die Anzahl der verfügbaren Brunnen begrenzt wird. Wenn höhere agonistische Konzentrationen benötigt werden, wird das Experiment leicht erweitert und ohne zusätzliche Zellkulturarbeit abgeschlossen. AgonistEnzusatz selbst sollten sorgfältig durchgeführt werden, da einige Zellen empfindlich auf Scherspannung reagieren und mit erheblichen Impedanzänderungen reagieren, einfach aufgrund der mechanischen Stimulation, die durch Flüssigkeitshandhabung auferlegt wird. Die Zellen könnten sogar von der Elektrode kommen. Dieses Problem ist jedoch nicht nur auf die Impedanz-basierte Zellüberwachung, sondern gilt auch für andere Techniken. Für empfindliche Zellen wird der Additionsmodus 1 aufgrund der reduzierten mechanischen Belastung der Zellen empfohlen. Dieser Modus arbeitet jedoch mit geringeren Flüssigkeitsvolumina während der Zugabe, was das Risiko einer unvollständigen Vermischung erhöht, da intensives Rühren nicht empfohlen wird, um unspezifische Zellreaktionen zu vermeiden.
Additionsmodus 1 geht mit einer schrittweisen Erhöhung des Gesamtvolumens im Brunnen einher, während Modus 2 das Gesamtvolumen konstant hält, da gleiche Mengen an Lösung sequenziell entfernt werden. Dies sind nur die beiden extremen Strategien und können für spezielle Zelltypen, Multi-Well-Formate oder Elektroden-Layouts in jeder Zwischenform angepasst werden. Beim Modell U373-MG/H1R wurden leichte Unterschiede in den EC50- undE-Max-Werten im seriellen Additionsmodus im Vergleich zum herkömmlichen parallelen Additionsmodus (seriell, N = 30: EC50: (0,8 x 0,3) M, EMax:(1,9 x 0,2) k; parallel, N = 15: EC50: (0,5 x 0,2) M, EMax:(1,3 x 0,3) k), während andere Zell-/Rezeptormodelle keine Unterschiede aufzeigten. Verschiebungen in EC50 und EMax Werte könnten von Rezeptor-Desensibilisierung, die eher auftreten, wenn die Rezeptoren dem Agonisten für längere Zeit ausgesetzt sind. Der Desensibilisierungseinfluss hängt stark vom untersuchten Rezeptor und Liganden ab. Es bleibt zu klären, ob eine detaillierte Analyse der seriellen und parallelen agonistischen Zugabe ein neues Mittel zur Untersuchung der Rezeptordesensibilisierung bieten kann.
Wir empfehlen, ein Kontrollexperiment mit konventioneller Parallelmodus-Agonistenzugabe durchzuführen, um mögliche Verschiebungen in Dosis-Wirkungs-Kurven zu testen. Weitere Kontrollen sollten eine Probe umfassen, die nur mit Medium/Lösungsmittel in geeigneten Dosen behandelt wird, um etwaige Auswirkungen aufgrund von Lösungsmittelbelastung oder mechanischer Beanspruchung bei mittlerer Zugabe zu entwirren. Dies wird besonders wichtig, wenn die Lagerlösung des Ligandens in anderen Lösungsmitteln als Medium (z.B. DMSO, Ethanol) hergestellt wird. Bei der Untersuchung der Wirkung verschiedener Liganden sollte ein Standard-Agonist als Referenz aufgenommen werden.
Zukünftige Richtungen sollten automatische Flüssigkeitshandhabungseinheiten umfassen, die eine vollständig automatisierte Dosierung oder Titration ermöglichen könnten. Die Anwendung des seriellen Additionsmodus in Perfusionssystemen birgt ein großes Potenzial für Lab-on-a-Chip- und Organ-on-A-Chip-Ansätze sowie für Experimente, die unter flüssiger Scherspannung durchgeführt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Barbara Goricnick und Nadja Hinterreiter für ihre Hilfe bei der Zellkultivierung und der Vorbereitung experimenteller Lösungen. Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung durch das von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) geförderte Graduiertenkolleg 1910 "Medizinische Chemie selektiver GPCR-Liganden" unter der Fördernummer 222125149. Besonders dankbar ist JAS für ein Stipendium des Bayerischen Gleichstellungsprogramms.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | |
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 - 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 - 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) | \ |
References
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs. Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).
- Kaitin, K. I. Deconstructing the drug development process: The new face of innovation. Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).
- Kenakin, T. P. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).
- Scott, C. W., Peters, M. F. Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening. Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophysical Journal. 91, 16 (2006).
- Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).
- Lieb, S., et al. Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor. Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).
- Stolwijk, J. A., et al. Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol. Integrative Biology. 11, 10 (2019).
