Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

פרוטוקול מינון סטפנסקי עבור תפוקה מוגברת ב-GPCR-מבוסס-תוויות חינם

Published: February 21, 2020 doi: 10.3791/60686
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1,4
1Institute of Analytical Chemistry, Chemo- and Biosensors, University of Regensburg, 2Institute of Pharmacy, University of Regensburg, 3Department of Chemistry and Pharmacy, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nuernberg, 4Fraunhofer Research Institution for Microsystems and Solid State Technologies EMFT

Summary

פרוטוקול זה מדגים הקלטה בזמן אמת של יחסים מינון-תגובה מלאה עבור agonist-המושרה GPCR הפעלה משכבת תא אחת גדל על מיקרואלקטרודה אחת באמצעות תווית ללא מדידות עכבה. ערכת המינון החדשה מגדילה באופן משמעותי את התפוקה ללא הפסד ברזולוציית הזמן.

Abstract

מבוסס על תווית חינם מבוססי בחני משמשים יותר ויותר לפני באופן פולשני ליגולי מחקר המושרה gpcr בניסויים בתרבות התא. הגישה מספקת ניטור התא בזמן אמת עם רזולוציית הזמן תלויי התקן עד כמה עשרות אלפיות הראשונה והוא אוטומטי מאוד. עם זאת, כאשר מספרים לדוגמה לקבל גבוה (כגון, מחקרים מינון עבור ליגניות שונות), את העלות של מערכי האלקטרודה החד, כמו גם את רזולוציית הזמן הזמין עבור הקלטות היטב-by-היטב עשוי להיות מגביל. לכן, אנו כאן הצגת פרוטוקול אגוניסט טורי התוספת אשר יש את הפוטנציאל להגדיל באופן משמעותי את הפלט של gpcr-התווית חינם. באמצעות פרוטוקול התוספת הטורית אגוניסט, אגוניסט gpcr נוסף ברצף בריכוזים גוברת לשכבת תא אחת ברציפות ניטור העכבה של המדגם (מצב אגוניסט). עם גישה טורית זו, כעת ניתן ליצור עקומת מינון מלא של תגובה עבור אגוניסט gpcr מתוך שכבת תא אחת בלבד. פרוטוקול התוספת הטורית של האגוניסט חל על סוגי צימוד מסוג GPCR שונים, Gq g/0 או g והוא תואם לרמות ביטוי רקומביננטי ואנדוגני של הקולטן תחת המחקר. חסימת הקולטן על ידי האנטוניסטים GPCR הוא הניתן גם (מצב היריב).

Introduction

דו ח זה מציג תיאור מפורט של פרוטוקול התוספת הטורית שפותחה עבור כימות החלבון המושרה G-חלבונים בשילוב קולטן (GPCR) הפעלה בתאים מגודלים על ידי תווית ללא מדידות עכבה. מצמידים בחלבון G (GPCRs) מעורבים בהמון תפקודים פיזיולוגיים ומחלות אנושיות1. בגלל זה והנגישות הטובה שלהם במשטח התאים, GPCRs הן אחת ממטרות הסמים החשובות ביותר. הערכה זו משתקפת במספר מוערך של ~ 700 תרופות שאושרו על-ידי GPCRs, שוות ערך ל-~ 35% שיתוף בכל התרופות המשווקים2.

התפתחות התרופות החדשות כוללת שני תהליכים מרכזיים: (i) האפיון ההזדהות והפונקציונלי של מולקולות היעד הביולוגי ו-(ii) גילוי של חומרי הובלה חדשים והתפתחותם לתרופות בניהול. בשני התהליכים, נדרשות שיטות יעילות כדי להעריך את האינטראקציות של מטרות הסמים ואת תגובת המטה הביולוגית הבאה. בשלבים שונים של תהליך פיתוח תרופות טרום-קליני לעשות שימוש בשיטות ניתוח שונות החל ממחקרים ביוקולריות האינטראקציה בין התרופה והיעד, על פני מחקרים פונקציונליים על תאים בתרבות, לניסויים על חומר האיבר המגורש או בעלי חיים שלמים. הן, המשמעות הפיזיולוגית והמורכבות הביולוגית, מגדילות מהראשון ל-3האחרון. למרות שזו המטרה הכוללת למזער ניסויים בבעלי חיים, מחקרים פרמקולוגיים המשתמשים באברים מבודדים מבעלי חיים מעבדתיים או אפילו בעלי חיים שלמים נחשבים בלתי נמנעים למאפיינים מקיפים של מועמדים חדשים לסמים. במונחים של הבדיקה האנליטית, לימודי האיברים הפרמקולוגיה מספקים תגובה פונקציונלית מההוליסטית ואינטגרטיבית של הרלוונטיות הפיזיולוגית הגבוהה ביותר. חיסרון של ניסויים כאלה הוא שהם לא תואמים הקרנת תפוקה גבוהה עבור טכני, כמו גם סיבות אתיות כבר הוחלף ברובו על ידי מחקרים המבוססים על התרבות תא מבחנה4.

שיטות כדי לכמת gpcr הפעלה בתרבויות תאים כוללים שונים מבוססי תוויות כימיים assays, אשר במפורש לזהות שליחים השני, המדינה זרחון במורד החלבונים איתות, הפעלת הפעלה דרך גורמים שעתוק מסוימים או ליגקין המושרה סחר הקולטן תאיים4,5. החיסרון של התווית המבוססת על תוויות הוא הצורך לתייג את התאים עם צבעים שעלולים להזיק או סמנים רדיואקטיביים. זה דורש לעיתים קרובות להפעיל את התשובה כקביעת נקודת קצה-הגדרה לזמן חשיפה שיש לציין א פריורי. שימוש בנקודת קצה מבוססת תווית סובל מתזמון מאוד מצומצם ומוטה של הניסוי והסיכון שתוויות כימיות והבדיקות עלולות לשבש את הפיזיולוגיה של התא הרגיל – שעלולים להבחין בידי הניסוי.

בשנים האחרונות, לייבל ללא תווית עבור ניטור gpcr הפעלה התפתחה, כמו מבוססי עכבה טכניקות או שיטות אופטיות החלת מדריך גלהתהודההדרכה 5,6. התוויות של התאים הינם ניסויים שאינם נדרשים בגישות אלה. כמו אלה הקריאות הפיזיות לפעול על אותות משרעת נמוכה, שיטות כאלה נחשבות לא פולשנית, הם מאפשרים ניטור תאים רציף פוטנציאלי בזמן אמת וזמן התצפית מוגבל רק על ידי תרבות התא לא על ידי הבדיקה. בדומה לקריאות מאיברים שלמים, גישות ללא תווית בדרך כלל לדווח על תגובות התא הוליסטי , במורד הזרם של הפעלת הקולטן כאשר אינטגרציה לאורך כל רשת איתות מוביל לשינויים תלויי זמן אך לא ספציפיים במבנה התא או הפצה המוניים. בעוד מבוסס עכבה מבוססת למדוד את החתימה מדידות של שינויים בצורה תא7,8, מדידות באמצעות מדריך גל התהודה המדורגים רגישים לשינויים במדד השבירה בממשק התא-מצע הנובע מפצה דינמית המסה (dmr)9. התו האינטגרטיבי הופך שיטות ללא תוויות רגישות מאוד לאירועים בתיווך הקולטן ללא קשר לסוג (s) של G חלבון (Gq, gi/0, gs, g12/13) או β-מעורב בדירוג איתות6 ומתאים היטב לרמות ביטוי אנדוגני של הקולטן.

בתוך שיטת העכבה הסטנדרטית ללא תווית, התאים גדלים בגדול בצלחות מרובות-היטב עם אלקטרודות לסרט זהב ישור שהופקדו בתחתית כל באר10. אלה מערכי אלקטרודה מחוברים מנתח עכבה ואת התגובות התאים לגירוי ניסיוני נרשמים מבארות בודדות על ידי קריאות העכבה שנפתרו זמן. ב שיטת GPCR טיפוסית ליגונה מתווסף ריכוזים שונים בנפרד לכל אדם היטב. השינויים המושרה בקורס לאחר העכבה מנותח לאחר מכן ביחס לתכונות עקומות אופייני כגון שינוי האות המקסימלי, שטח תחת עיקול, שינוי האות בתוך מרווח זמן נתון או מדרון של עקומת בנקודת זמן מוגדר, על מנת לכמת את העוצמה של ligand יעילות11.

עלות מערכי האלקטרודה עשויה להגביל את היישום של טכניקה זו בקמפיינים של הקרנת תפוקה גבוהה (hts). יתר על כן, עם מספר גדל והולך של דגימות להיות במקביל, המספר של מדידות בודדות עולה ובכך מפחית את רזולוציית הזמן הזמין עבור כל היטב בהדרגה-אפילו עבור הקלטות רב ערוצי האמנות. תחת תנאים כאלה מהיר התגובות התא ארעי עשוי לברוח מדידה. בנוסף, המקובל אחד היתרונות – גישה ריכוז אחת מטיל משמעות משמעותית הזמן והעלות על מעשה הגוף על שבב או על שבבים התפתחויות על שבב ביחס להתאמה שלהם בניתוח האינטראקציה LIGAND-gpcr.

מסיבה זו, פיתחנו פרוטוקול מינון חורג המאפשר הקלטה של מינון מלאה-תגובה עקומות של הפעלה GPCR המושרה של ליגיום בתוך מונאולאיירס תא תרבותי על ידי ברציפות ניטור עכבה של באר אחת בעוד ריכוז אגוניסט הוא מוגבר צעד. פרוטוקול התוספת של האגוניסט הטורי מגביר באופן משמעותי את התפוקה לכל היותר מריכוז אחד ועד 10 ריכוזים או יותר, כפי שמוצג בדוגמה הנוכחית של התאים האנושיים U-373 MG, אשר מבטאים באופן מובהק את הקולטן להיסטמין 1 (H1R). לפיכך, לשיטה יש פוטנציאל לשפר באופן משמעותי את התפוקה במחקרים של מינון ללא תווית, בעוד שרזולוציית הזמן נשמרת במקסימום האינסטרומנטלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שזריעת תאים במערכים אלקטרודה

הערה: בחירת פריסת האלקטרודה היא החלפה בין רגישות לבין מספר התאים בלמידה. ככל שאלקטרודה קטנה יותר, המדידה רגישה יותר, אך קטנה יותר היא מספר התאים הנמצאים במחקר. עבור תאים המראים תנודות עכבה חזקות לאורך זמן בתנאים בסיסיים, מעדיפים אלקטרודות גדולות או מקבילות.

  1. מחמם מראש את כל הפתרונות הדרושים לפסיית התא הסטנדרטי ולזריעה באמבט מים ב37 ° c. עבור בחני אומר עם האדם U-373 MG תאים שלוקח: מלוחים מואגור פוספט (PBS) ללא סידן ומגנזיום, 0.05% (w/v) טריפסין, מדיום תרבות התא (מדיום מינימלי של הנשר (emem) שיושלם עם 5% (v/v) סרום עגל עוברי (fcs), 2 מ"מ L-גלוטמין ו 100 μg/mL פניצילין/סטרפטומיצין).
  2. שטפו את שכבת התאים של תרבות המניה שגדלה בחלק התחתון של מבחנות או מנות של תרבות התא המקובלת עם ה-PBS פעמיים.
  3. הסר את ה-PBS, להוסיף את הפתרון טריפסין (1 mL עבור 25 ס מ2) ולתת את התאים לדגירה ב 37 ° צ' עבור 5 דקות (חל על U-373 התאים MG).
  4. בקרה לניתוק מלא של התאים מהחלק התחתון של המצע הגדילה על ידי מיקרוסקופ.
  5. הפסיקו את תגובת טריפסין ברגע שהתאים מנותקים לחלוטין על-ידי הוספת 9 מ ל של תרבות התא בינונית ל -1 מ ל טריפסין להשעיה של התא. לשטוף בזהירות את התאים הנותרים מהחלק התחתון של המצע תרבות התא על ידי ליטוף את ההשעיה על המצע.
  6. לאסוף את ההשעיה התא עם פיפטה ולהעביר אותו צינור צנטריפוגה (15 mL או 50 mL שפופרת).
  7. ספין את התאים על ידי צנטריפוגה ב 110 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. הסר בזהירות את הסופרנטנט והשהה מחדש ביסודיות את הגלולה בתוך התרבות הבינונית לפני ספירת התאים (לדוגמה, על-ידי שימוש ב-hemacytometer עבור מיקרוסקופים בניגוד לפאזה וספירה ידנית).
  9. כוונן את השעיית התא לצפיפות התא הרצויה. לניסויים עם תאים U-373 MG, השתמש 100 000 תאים/cm2 כדי לגדול שכבת התא confluent בתוך 48 h. זה מתורגם לצפיפות התא של 200 000 תאים/mL עבור 8-היטב מערכי אלקטרודה עם אזור צמיחה של ~ 0.8 ס מ2 ו נפח טוב של 400 μl.
    הערה: עבור ניסויים ההפעלה GPCR הפעלה, התאים צריכים להיות מגודלים כדי שוטפת monolayers על מערכי האלקטרודה. כדי להבטיח ביטוי הקולטן הנכון על משטח התא, התאים צריכים להיות הנזרע לפחות 36 h לפני ביצוע הניסוי. בדיקת צפיפויות תאים שונות לזריעת תאים משמעותית לעתים קרובות כדי לזהות את התנאים הניסיוניים הטובים ביותר.
  10. הוסף את התא הבולם לבארות של מערך האלקטרודה ולתת להסדיר להתיישב בטמפרטורת החדר עבור 10 – 15 דקות כדי להבטיח התפלגות הומוגנית של תאים בתחתית הבארות.
  11. הגדל תאים לפחות 36 h בחממה סטנדרטית לתרבות התא עם 5% CO2 (תלוי בסוג בינוני) ב 37 ° c ו לחות האווירה. שנה את תרבות התא בינונית 24 שעות לפני הניסוי.
  12. ביום הניסוי, לבדוק את שכבות התא על מערכי האלקטרודות על ידי (ניגודיות הפאזה) מיקרוסקופ כדי להבטיח כיסוי מלא של אלקטרודות עם תאים.

2. השפה הבינונית-ללא שימוש בתאים

  1. טרום חם סרום-בינוני, במחקר זה: L15 של ליבוביץ ' s בינונית.
  2. הסרת מדיום תרבות התא מתאים שגדלו על מערכי אלקטרודה ומחליפים במדיום ללא התחממות מראש. השתמש ב-200 μL עבור 8-היטב מערכי האלקטרודה, ו 150 μL עבור 96-היטב מערכים אלקטרודה.
  3. תנו לתאים להיות בתווך ללא סרום ב-37 ° c לפחות 2 שעות. זמן השיווציה תלוי בסוג התא. לדוגמה, התאים U-373 MG צריכים 2 h, התאים צ'ו צריך 4 h, BAEC עשוי לדרוש לילה בשפה בינונית L-15.
    הערה: L-15 בינוני הוא CO2 עצמאי ומחייב שיתוף2-אווירה חינם. עבור שיווציה ב-L-15 להגדיר את החממה 0% CO2. השפה יכולה להיות מנוטרת על ידי קריאות עכבה, אשר אנו ממליצים לעשות עבור הניסויים הראשונים.

3. ניטור תא מדידה עם קריאות עכבה

  1. מניחים את מערך האלקטרודות לתוך המחזיק מערך המחבר של מנתח העכבה.
  2. ודא הקשר הנכון העכבה נמוכה בין אלקטרודות מנתח עכבה. בדיקה זו שונה באופן אינדיבידואלי עבור מכשירים שונים.
    הערה: אם המכשיר אינו מצליח ליצור קשר עם האלקטרודות, פתח שוב את מהדק איש הקשר, הכנס את מערך האלקטרודות למיקום הנכון בתוך המחזיק ונסה שוב.
  3. בחר סוג אלקטרודה ו/או תבנית מרובת היטב מממשק המשתמש של התוכנה.
  4. הגדר את פרמטרי המדידה. אפשרויות שונות זמינות.
    הערה: כדי לבחור את תדירות ה-AC הרגישה ביותר, אנו מתייחסים לספרות ולמדריכים כלים כפי שהוא תלוי בפריסת האלקטרודה וסוג התא תחת לימוד. בדרך כלל, תדירות החישה היא בטווח של 4 kHz – 50 kHz. כאן, U-373 התאים MG גדלו על אלקטרודות עבודה מעגלית של 250 יקרומטר קוטר והם היו מנוטרים בתדר AC של 12 kHz.
    1. אם קיימים מצבי רכישה של נתונים יחידים ומרובים בתדר מרובה, בחר במצב התדר הבודד כדי להבטיח את רזולוציית הזמן המירבית. המדידה תתבצע בתדר אחד זה. לכלי הפריסה הנפוצים ביותר, יש מספר תדרים מוכנים מראש לאורך חלון התדר הזמין.
    2. אם מספר הבארות הנמצאות במחקר נמוך או ברזולוציה של זמן אינו קריטי, בחר במקום זאת הקלטות בתדר מרובות. קריאות עכבה במספר מוגדר של תדרים יירשמו עבור כל טוב לניתוח מאוחר יותר מעמיק.
      הערה: רזולוציית הזמן פוחתת עם מספר הולך וגובר של תדרים שנרשמו למספר הבארות והולך וגדל. האפשרויות עבור תדירות ובחירת מצב רכישת נתונים משתנות עם סוג מכשיר וגירסה.
  5. התחל לרכוש נתוני קורס זמן.
  6. בצע את העכבה שכבת התא (לפחות 2 h) עד שהעכבה התייצב. בינתיים, הכינו את הפתרונות האגוניסט.
  7. כאשר שכבות התא הגיעו לרמת עכבה יציבה, או (אני) להמשיך לתוספת אגוניסט סדרתי בתוך ניסוי זהה או (ii) לסיים את רכישת נתונים ולהתחיל ערכת נתונים חדשה עבור ניטור הפעלת הקולטן אגוניסט.

4. הכנת פתרונות אגוניסט לניסויים במצב אגוניסט

  1. חישוב הריכוז של פתרונות אגוניסט לפי הצורך עבור כל שלב של מינון טורי לפי משוואה (1). n טווחים מ-1 עד למספר הכולל של תוספות טוריות i. x מציין ריכוז ונפח בבאר בשלב n. y מציין ריכוז ונפח של "פתרון-להיות-מוסף" בשלב n.

Equation 1

הערה: שקול את מספר השכפל וחשב את הנפח הכולל של "פתרון-להוספה" עבור כל שלב ריכוז. תוצאות חישוב אופייני ניתנות בטבלאות 1-4. זה לוקח רעיון כללי על טווח ריכוז אגוניסט ללמוד כמו הטווח מגדיר את ריכוזי ומספר חלקים להינתן במהלך התוספת הטורית. באמצעות פרוטוקול התוספת אגוניסט סדרתי הריכוז אגוניסט הוא מוגבר חורג. לכן, כמות אגוניסט כבר בבאר כאשר המינון הבא נוסף צריך להילקח בחשבון. כאשר מספר מולקולות אגוניסט כבר נוכח הבאר הוא nx = cx ∙ Vx (עם הריכוז הנוכחי cx ו-volume vx) ואת מספר המולקולות בבאר אחרי התוספת הבאה היא nx + y, מספר המולקולות שיש להוסיף ny נקבעת על ידי הריכוז cy ונפח Vy של הפתרון כדי להיות מיושם על הבאר (ny = cy ∙ Vy). לאחר הוספת חלק אגוניסט, כמות חדשה של מולקולות אגוניסט בבאר היא: cx + y ∙ vx + y = cx ∙ vx + cy ∙ Vy. חישוב זה חל על כל שלב שאחריו. בגלל התלות ההדדית של ריכוז אגוניסט בבאר וכמות אגוניסט בחלקים להתווסף עם כל שלב, חשוב להגדיר ריכוזים סופיים לאחר כל צעד מראש.

מצב 1: הכרך בבאר יגדל עם כל שלב כנוזל הוא הוסיף ברציפות.
באמצעות מצב זה ופורמט 8-היטב, השתמש Vx1 = 200 μl ו-vy1. .. vyi = 30 μl.

מצב 2: עוצמת הקול בבאר היא קבועה כמו אמצעי האחסון שנוסף עם כל צעד מוסר ממש לפני התוספת הבאה.
באמצעות מצב זה ופורמט 96-היטב, השתמש Vx1 = 150 μl ו-vy1. .. vyi = 75 μl.

  1. הדפס את גליון הנתונים עם אמצעי האחסון הכולל לריכוז והוראות מפורטות לליטוף.
  2. הכן את כל הפתרונות בסכום הנדרש. הפוך את כל הפתרונות האגוניסט באותו מדיום ללא סרום, המשמש לequiציה של התאים.
    התראה: היסטמין דיהידרוטסטוסטרון נחשב מסוכן על-ידי מ2012 התקשורת המסוכנת הסטנדרטית (29 CFR 1910.1200). היסטמין גורם לגירוי בעור, גירוי בעיניים חמורות, עלול לגרום לתגובת עור אלרגית, אלרגיה, תסמיני אסטמה או קשיי נשימה אם לשאוף ועלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה. . בבקשה, שקול את גליון הנתונים הבטיחותי
    הערה: הפוך פתרונות אגוניסט טריים ככל האפשר. יציבות האגוניסטים בתמיסה עשויה להשתנות במידה ניכרת. לאחסן פתרונות ב -4 ° c או למטה עד לשימוש בניסוי. עבור מולקולות מסוימות תוספים ייצוב נוספים, כמו bsa בעת שימוש במולקולות מבוססות פפטיד או מבוססי השומנים, עשויים להיחשב כדי למנוע ספיחה לקירות של בארות וצינורות.
  3. אם ביצוע הניסוי ב 96-היטב בפורמט, העברת פתרונות לצלחת 96 רגיל-באר (אין אלקטרודות) ולהשתמש 8-(או 12-) ערוץ pipet עבור העברה נוזלית מהירה למערך האלקטרודה.

5. הכנת פתרונות אגוניסט לניסוי במצב היריב

הערה: הכינו את פתרון היריב בריכוז לאורך כל הדרך. נפח וריכוז של פתרון היריב תלוי במצב של תוספת אגוניסט (1 או 2). דוגמאות לניסויים ב 8-טוב או 96-פורמט טוב בנוסף במצב 2: (A) 8-היטב פורמט (Vx1 = 200 μl, Vהיריב = 200 μl); (ב) 96-ובכן פורמט (Vx1 = 150 μl, vהיריב = 75 μl).

  1. חישוב הריכוז של כל הפתרונות אגוניסט הדרושים עבור כל שלב של מינון סדרתי כמתואר בשלב 4.1.
  2. הפוך את כל הפתרונות האגוניסט באותו מדיום נטול-סרום, המשמש לequiציה של התאים והוסף את היריב באותו ריכוז סופי כמתוכנן לבארות המתאימות בניסוי.
    הערה: במקרה זה פתרון מניות היסטמין (10 מ"מ) מוכן בינוני L-15. כאשר אגוניסטים מומס ממיסים אחרים (למשל, diמתיל sulfoxid (DMSO), אתנול) בקרת ממס יש לכלול לחשבון עבור עומס הממס גדל עם כל שלב של תוספת.

6. ביצוע פרוטוקול התוספת הטורית במצב אגוניסט

  1. התחל את רכישת הנתונים כמתואר בשלבים 3.1 – 3.5.
  2. לחמם את הפתרונות האגוניסט לפני השימוש על ידי הצבת אותם בחממה בערך 10 – 15 דקות לפני התוספת.
    הערה: בעת שימוש בחומרים תרמו-לאבתיים, אין לשמור על הפתרונות ב-37 ° c במשך זמן רב מדי. אם התחממות מראש במשך 10 – 15 דקות נחשבת לקריטית, הביאו פתרונות ל-37 ° c זמן קצר לפני הוספת אמבט מים.
  3. הפעל את המינון הטורי האגוניסט התלוי במצב החיבור הנבחר. לאחר מצב 1 את הנפח הכולל בבאר מגדיל עם כל תוספת של המינון הבא. במצב 2 אותו אמצעי האחסון אשר נוסף עם כל שלב מוסר שוב רק לפני הוספת המינון הגבוה הבא.
    הערה: הזמן הדרוש לשפה של שכבת התא בין שתי מנות אגוניסט עוקבות תלויה בזמן התגובה של התאים. הניסוי הראשוני במצב מקביל (אחד טוב-ריכוז אחד) חושף (i) התגובה התאים עבור ריכוזי אגוניסט שונים ו (ii) פרמטר העקומה הרגיש ביותר (למשל, עכבה מקסימום, עכבה אחרי זמן x).

A: מצב 1/8-פורמט טוב

  1. הוסף 30 μL של הפתרון הראשון עם הריכוז הנמוך ביותר של אגוניסט לתאים שהיו מסובטים ב 200 μL של מדיום ללא סרום.
  2. תן לתאים להגיב ולקצר את פרק הזמן המוגדר מראש (לדוגמה, 15 דקות).
  3. הוסף 30 μL של הפתרון השני עם הריכוז הגבוה הבא.
  4. חזור על הצעדים 6.3.1-6.3.3 עם השלישי, הרביעי, וכן הלאה, פתרון אגוניסט.
    הערה: עבודה עם 10 צעדי ריכוז תגרום נפח כולל של 500 μL בסוף הניסוי, אשר נמצא ממש מתחת לנפח הישים המקסימלי של בארות אלה של ~ 550 μL.

ב: מצב 2/96-פורמט טוב

הערה: השהה את רכישת הנתונים במהלך כל שלב טיפול בנוזלים (בתוספת/הסרה) באמצעות תוכנת מכשיר העכבה בעת הפעלת ניסויים ב-96-בפורמט טוב. הטיפול הנוזלי המשוכלל יותר עלול לשבש את רכישת הנתונים. השתמש בפיפטה רב ערוצית.

  1. השהה את רכישת הנתונים.
  2. הוסף 75 μL של הפתרון הראשון עם הריכוז הנמוך ביותר של אגוניסט לתאים שהיו מסובטים ב 150 μL של מדיום ללא סרום.
  3. . לחדש את רכישת הנתונים
  4. תן לתאים להגיב ולקצר את פרק הזמן המוגדר מראש (לדוגמה, 15 דקות).
  5. בערך 1 – 2 דקות לפני הזמן הרגיל המקביל מסתיים, להשהות את המדידה ולהסיר את 75 μL מכל באר.
    הערה: נקודת הזמן שבה יש להסיר את הפתרון תלויה במספר הבארות המנוטרות במקביל ובמהירות הבזק. הזמן הדרוש להסרת הפתרונות לא יעלה על הזמן שבין השלבים הבאים.
  6. הוסף 75 μL של הפתרון השני עם הריכוז הגבוה הבא וחדש את המדידה.
  7. חזור על הצעדים 6.3.8-6.3.10 עם השלישי, הרביעי, וכן הלאה, פתרון אגוניסט.

7. ביצוע פרוטוקול התוספת הטורית במצב היריב

  1. הפעל את המדידה כמתואר בשלבים 3.1 – 3.5.
  2. במהלך הרובד של שכבות התא, להכין פתרון היריב (למשל, 200 μL של 1.5 μM הידרוכלוריד מכרה L15 בינוני).
    התראה: הידרוכלוריד בדיפנהידרלי יש פוטנציאל להשפעות רפואיות חדות. הוא מזיק אם בלע או שאפה, עלול לגרום לגירוי בעין ובעור. זה עלול לגרום לגירוי במערכת הנשימה ובדרכי העיכול. . בבקשה, שקול את גליון הנתונים הבטיחותי
  3. טרום לחמם את היריב ואת פתרונות אגוניסט על ידי הצבת אותם בחממה על 10 – 15 דקות לפני בנוסף לתרבויות התא (cf. 6.2). אם בארות ללא יריב כלולים גם בתוך השימוש, וגם במדיום ללא סרום חם.
  4. הוסיפו את פתרון היריב לבארות המיועדות. תנו לתאים להיות מוקצב עם היריב במשך 15 – 20 דקות. אם הם בארות ללא יריב כלולים, להוסיף את אותו נפח של מדיום ללא סרום לבארות אלה.
  5. על פי תוספת היריב במצב 2, להסיר את הפתרון מן הבארות
    (A) 8-היטב פורמט (200 μL)
    (ב) 96-פורמט טוב (75 μL)
  6. הפעל את רצף התוספת אגוניסט כמתואר בשלב 6.3.

8. יצוא וניתוח נתונים

  1. ייצוא נתונים באמצעות תוכנת מכשיר העכבה כדי להמיר את כל הנתונים המוקלטת מקנייני לתוך תבניות נתונים נפוצות (לדוגמה, csv). שלב זה מאפשר ארגון מחדש של נתונים ומצגת עם חבילות תוכנה אחרות.
  2. טען את הנתונים בתבנית csv לתוכנה לניתוח נתונים מדעיים.
  3. לנרמל את ערכי העכבה על ידי חיסור העכבה של נקודת הנתונים האחרונה לפני התוספת הראשונה של הפתרון אגוניסט ועל ידי הגדרת הזמן של נוסף ל-t = 0. מתווה את מסלול הזמן של עכבה מנורמלת.
  4. להתוות את קורסי הזמן הבודדים ולזהות את מקסימה בעכבה אחרי כל שלב בתוספת. חבר גליון נתונים עם ערכים אלה.
  5. להתוות את הערכים של מקסימום (או מינימום, אם ישים) העכבה שינויים כפונקציה של ריכוז אגוניסט. זה יכול להיעשות עבור בארות בודדות או עבור ממוצעים (ממוצע ± SD).
  6. השתמש בשגרת התאמת נתונים כדי לקבוע ריכוזים יעילים של חצי מקסימאלי (EC50) ומענה מרבי (EMax) באמצעות ארבעת המודלים הלוגיסטיים של הפרמטרים (משוואה 2):

Equation 2

הערה: c מציין את הריכוז האגוניסט ,1 הוא המינימום ו-2 הוא אסימפטוטה המרבי של עקומת המינון הסיגמואידית-תגובה (A2 = EMax). EC50 הוא הריכוז בנקודת פיתול של העקומה, ו n מקביל למדרון היל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ערכה טיפוסית להכנת פתרונות אגוניסט שונים מוצג לניסוי באמצעות 8-היטב מערכי אלקטרודה עם היסטמין כמו אגוניסט בטבלאות 1-4. טבלה 1 ו- table 2 להציג כרכים וריכוזים עבור ניסוי באמצעות מצב חיבור 1 (cf., איור 1), בעוד טבלה 3 וטבלה 4 להציג אמצעי אחסון וריכוזים עבור ניסוי לאחר מצב התוספת 2 (cf., איור 1). נתונים חושבו באמצעות משוואה (1).

ניסוי מייצג מוצג באיור 2 עבור שכבות confluent של U-373 התאים MG, אשר מבטאים באופן מסחרר את הקולטן היסטמין 1, גדל על מערך 8-היטב אלקטרודה עם אלקטרודה עובד של 250 יקרומטר קוטר באמצעות היסטמין כמו אגוניסט. המדידה בוצעה בתדר אחד של 12 kHz. תוספת של סדרת הריכוז אגוניסט בוצעה לאחר מצב 1. בניסוי שנבחר 10 פתרונות עם הגדלת ריכוז היסטמין (מוכן על פי שלב 4) נוספו ברציפות כל 15 דקות (איור 2א). ערכת המינון הטורית הוחלה על שבע מתוך שמונה בארות. במדיום אחד ללא הרבה אגוניסט (L-15) נוספה ברציפות כפקד שלילי בתשעה מתוך עשרה שלבים. התוספת האחרונה לפקד זה היה פתרון היסטמין מתן ריכוז סופי של 100 μM היסטמין בבאר. נתונים כבר הותווה עם תוכנה ניתוח נתונים מוצג כמו עכבה שינוי Δ | ז ' | 12 kHz /kΩ לאורך הניסוי, עם שינוי עכבה ואת נקודת הזמן של התוספת הראשונה שנקבע לאפס. זמן ההחלקה הראשונית במאגר הניסיוני של 2 שעות אינו מוצג בעלילה זו. נקודות הזמן של תוספת אגוניסט מסומנים על ידי חיצים.

השינוי העכבה ביחס לתוכנית הבסיסית לאחר כל צעד הריכוז חולצו מן עקומות באמצעות סמן נתונים. בשלבים ללא מקסימום ברור, נקודת הנתונים האחרונה לפני שנעשה שימוש בתוספת הבאה לניתוח. שינויי עכבה Δ | ז ' | 12 kHz הותוו כפונקציה של היסטמין ריכוז (cx + y) (איור 2B, סימנים). פונקציית ההעברה של מודל לוגיסטי של ארבעה פרמטרים (cf. step 8.6) הותאמה לנקודות המידע הנסיוניות משבע בארות (איור 2ב', קווים). תוצאות ההתאמה מוצגות בטבלה 5. איור 2ג ואיור 2ד להראות את התוצאה של ממוצע הנתונים באיור 2A ו- איור 2ב, הצגת ממוצע ± SD עבור שבע בארות. נתוני קורס הזמן הממוצעים מסוכמים באיור 2C, בעוד שעקומת המינון הממוצעת לתגובה מסופקת באיור 2ד.

בקשרי מינון-תגובה כפי שמוצג באיור 2B, D, הליך ההתאמה הוחל על טווח הריכוז כולו חוזר EC50 = (0.86 ± 0.13) μm. תגובת העכבה עולה ונוטוני עם הגדלת ריכוז היסטמין למעט שני צעדי הריכוז האחרונים (30 μM, 100 μM ריכוז סופי). תגובה זו מוסבר ככל הנראה על ידי downregulation של קולטן היסטמין, הפחתת רגישות או גירוי יתר של התאים (ראה דיון). כדי להסביר אפקט זה, טווח הנתונים לניתוח הופחת, כפי שמוצג עבור ניסוי מינון טורי אחד (איור 3; טוב 1) נבחר מהנתונים המוצגים באיור 2. יתר על כן, הגדרת אסימפטוטה נמוך (A1) לאפס במהלך אופטימיזציה לפחות מרובע בהנחה לא שינוי עכבה בתגובה 0 μm היסטמין הוא מוצדק היטב. החלת מיטוב זה שלושה פרמטרים מספק EC50 של (0.75 ± 0.12) μm (cf., איור 3ב). ערכי EC50 נמצאו חסרי רגישות עבור אחד ממצבי ניתוח הנתונים ולא היו שונים באופן משמעותי.

תוצאות טיפוסיות עבור ניסוי צלחת 96-ובכן מסוכמים באיור 4. U-373 התאים MG גדלו על 96-היטב מערכי האלקטרודה כמתואר לעיל. 32 בארות נכללו במדידה. 8 בארות שימשו כהגאים ללא אגוניסט, חשופים למדיום בלבד. 24 בארות היו נתון לסדרה של הגדלת ריכוזי היסטמין מחושב ומוכן למצב נוסף 2. מהלך הזמן של שינוי עכבה מוצג עבור כל 32 בארות בודדות באיור 4א. אחת העקומות (המסומנת באדום) מראה קורס זמן בלתי רגיל ולא נכלל בניתוח נוסף. בהתאם לכך, נתונים מ -23 בארות היו ממוצעים ומותווים כמהלך הזמן של שינוי העכבה הממוצעת (ממוצע ± SD) באיור 4ב. כל עיקול בודד נותח כמתואר לעיל לקשר המינון-תגובה. נקודות הנתונים היו ממוצעים והותוו כפונקציה של הריכוז הסופי היסטמין (איור 4ג). נתונים מינון-תגובה נותחו באמצעות ארבעה מודל לוגיסטי פרמטר, אשר החזיר EC50 ממוצע ערך של (1.0 ± 0.3) μm.

תוצאה אופיינית עבור פרוטוקול הוספת האגוניסט הטורי במצב היריב מוצג באיור 5. כאן, אחד היטב היה מטופל מראש עם 0.75 μm של מההיסטמין היריב של היסטמין דיפנהידרמין (עקום אדום) 20 דקות לפני ההיסטמין הראשון התווסף (איור 5א). הפקד קיבל בינונית ללא יריב (עיקול כחול). היריב התווסף לאחר מצב 2, כלומר 200 μl של לבסוף 400 μl הוסרו לפני הסדרה אגוניסט הוחל. ה אגוניסט (היסטמין) התווסף לאחר מינון טורי במצב 1 כפי שמתואר בדוגמאות לעיל. חשוב לניסויים במצב היריב שריכוז היריב נשמר באופן קבוע במהלך כל הזמן של הניסוי. בהתאם לכך, כל הפתרונות אגוניסט שנוספו הבאר חייב גם להכיל את הריכוז מוגדר מראש היריב (במקרה זה, 0.75 μM), בעוד הפקד נשאר ללא יריב. השפעה עוינת הופך להיות ברור על ידי הגברת "מתעכב" של עכבה בתוך הערכה מינון סדרתי המתאים ריכוזי אגוניסט גבוה יותר הדרושים כדי לגרום לתגובת התא. בקשר המינון-תגובה ההשפעה של היריב מתבטא כמשמרת הימניים של עקומות, אשר מתאים לעלייה ב-EC50, בתנאי היריב הוא ליגולי תחרותי ביחס אגוניסט (איור 5ב). EC50 היה נחוש (0.92 ± 0.05) μm בהעדר היריב ו (14.7 ± 0.6) μm בנוכחותו.

Figure 1
איור 1: מצבי התוספת האגוניסט הטורית. (א) סכמטי הממחישות חישובי ריכוז. על ידי הוספת הפתרון האגוניסט של ריכוז cy ונפח vy לבאר עם נפח vx ו-אגוניסט ריכוז cx, נפח עולה ל-vx + y והריכוז עולה cx + y. (ב) שני מצבים שונים עבור תוספת אגוניסט טורית. מצב 1: הנפח הכולל בבאר Vx + y גדל עם כל חיבור. מצב 2: אמצעי האחסון שנוסף בכל שלב הריכוז מוסר שוב לפני המינון הבא נוסף, אשר שומר על הנפח הכולל בקבוע היטב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תוצאות של ניסוי אופייני בפורמט 8-היטב. (A) מסלול הזמן של שינוי עכבה ב 12 kHz עבור confluent U-373 שכבות התא MG גדל על אלקטרודות עבודה מעגלית של 250 יקרומטר קוטר. בשבעה מתוך שמונה בארות התוספת הסדרתית של היסטמין הוחל. אחד טוב (עקומת אפור) היה טעון ברציפות עם מאגר ללא היסטמין בכל שלב (מצב 1), למעט השלב האחרון כאשר 100 μM היסטמין נוספו כפקד חיובי. (ב) קשרים במינון-תגובה שנוצרו מתוך שינוי העכבה המקסימלי ביחס לקו הבסיס עבור שבעה בארות נפרדות לאחר כל שלב הריכוז. (ג) קורס הזמן הממוצע של שינוי עכבה (ממוצע± SD) שנוצר משבע בארות בודדות כפי שמוצג ב (א). (ד) קשרים ממוצעים עם תגובת מינון שנוצרו מערכות נתונים בודדות כמוצג ב (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הסתגלות של מצבי ניתוח נתונים. (A) מסלול הזמן האופייני של שינוי עכבה ב 12 kHz עבור שכבת יחיד confluent U-373 מג הגדל על אלקטרודות עבודה מעגלית של 250 יקרומטר קוטר. (ב) מערכת היחסים הניסיונית לתגובת מינון (סימנים מלאים) שנוצרה משינוי העכבה המקסימלי יחסית לתוכנית בסיסית לאחר הגדלת הריכוז. כל ערכת הנתונים המלאה הייתה נתונה להליך ההתאמה (עקומת שחור ואפור) או נקודת הנתונים האחרונה-המציינת את התחלתה של הפחתת רגישות לקולטן ו/או הפנמה-הושמט מניתוח כמותי (עקום אדום ומגנטה). כל ארבעת הפרמטרים הותאמו במהלך אופטימיזציה לפחות מרובעת (עקומת שחור ואדום) או את הפרמטר A1, המייצג את האסימפטוטה התחתונה, נקבע ותוקן לאפס (עיקול אפור ומגנטה). ערכי EC50 לא היו שונים באופן משמעותי עבור שני מצבי ניתוח הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הניסוי האופייני ב 96-פורמט היטב. (A) מסלול הזמן של שינוי עכבה נמדד על 12 kHz עבור Confluent U-373 שכבות תא MG הגדלים על מערך האלקטרודה 96-טוב. נתונים מוצגים עבור 32 בארות. 24 בארות היו חשופים סדרה של הגדלת ריכוזי היסטמין נוסף עם זמן שיווציה של 15 דקות בין כל צעד. העיקול המסומן באדום לא נכלל בממוצע. שמונה בארות (שליטה) טופלו עם היסטמין ללא מדיום בכל פעם בנוסף. (ב) מסלול הזמן של שינוי העכבה הממוצע עבור 23 בארות בודדות בתגובה לתוספת ההיסטמין הטורית ושמונה בארות שליטה כפי שמוצג ב (א). (ג) קשר ממוצע מינון-תגובה שנוצר מן השינוי עכבה מקסימלית יחסית לתוכנית הבסיסית לאחר הגדלת ריכוז (ממוצע ± SD). הנתונים הותאמו לפונקציה לוגיסטית בעלת ארבעה פרמטרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניסוי אופייני במצב היריב. (A) מסלול הזמן של שינוי עכבה ב 12 kHz עבור confluent U-373 שכבות תא MG גדל על אלקטרודות עבודה מעגלית של 250 יקרומטר קוטר על התוספת של ריכוזים הגוברת של היסטמין עם או בלי נוכחות של היסטמין קולטן האנטי diphenhydramine. Diphenhydramine (0.75 μM) או בינונית ללא מורא (L15) נוספו 20 דקות לפני מינון טורי אגוניסט החלה. (ב) קשרי מינון-תגובה שנוצרו משינוי העכבה המקסימלי יחסית לתוכנית הבסיסית לאחר הגדלת הריכוז מהנתונים המוצגים ב (א). נוכחות של 0.75 μM Diפניההידרמינה גדל EC50 מ (0.92 ± 0.05) μm ל (14.7 ± 0.6) Μm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.

פתרון # cx + y (μm) cx (μm) Vx (μl) Vx + y (μl) Vy (μl) cy (μm)
1 0.01 0 200 230 30 0.08
2 0.1 0.01 230 260 30 0.79
3 0.3 0.1 260 290 30 2.03
4 1 0.3 290 320 30 7.77
מיכל 5 3 1 320 350 30 24.33
6 10 3 350 380 30 91.67
7 30 10 380 410 30 283.33
8 100 30 410 440 30 1056.67

טבלה 1: ערכת חישוב ריכוז עבור ניסויים באמצעות 8-היטב מערכי אלקטרודה לאחר מצב החיבור 1.

פתרון # cy (μm) Vy (μl) להכין מ c (μM) גורם דילול הפוך סה כ V (μl) השתמש (μl) הוסף V (μl)
1 0.08 30 3 2.03 26.52 600 22.6 577.4
2 0.79 30 4 7.77 9.83 600 61 539
3 2.03 30 מיכל 5 24.33 11.97 600 50.1 549.9
4 7.77 30 6 91.67 11.8 600 50.8 549.2
מיכל 5 24.33 30 7 283.33 11.64 600 51.5 548.5
6 91.67 30 8 1056.67 11.53 600 52.1 547.9
7 283.33 30 8 1056.67 3.73 600 160.9 439.1
8 1056.67 30 מניות 10 מ"מ 10000 9.46 800 84.5 715.5

שולחן 2: ליטוף לניסויים באמצעות מערכי האלקטרודה 8-היטב לאחר מצב חיבור 1.

פתרון # cx + y (μm) cx (μm) Vx (μl) Vx + y (μl) Vy (μl) cy (μm)
1 0.01 0 200 400 200 0.02
2 0.1 0.01 200 400 200 0.19
3 0.3 0.1 200 400 200 0.5
4 1 0.3 200 400 200 1.7
מיכל 5 3 1 200 400 200 מיכל 5
6 10 3 200 400 200 17
7 30 10 200 400 200 50
8 100 30 200 400 200 170

שולחן 3: ערכת חישוב ריכוז עבור ניסויים באמצעות 8-היטב מערכי אלקטרודה בעקבות מצב התוספת 2.

פתרון # cy (μm) Vy (μl) להכין מ c (μM) גורם דילול הפוך סה כ V (μl) השתמש (μl) הוסף V (μl)
1 0.02 200 3 0.5 25 1000 40 960
2 0.19 200 4 1.7 8.95 1000 111.8 888.2
3 0.5 200 מיכל 5 מיכל 5 10 1000 100 900
4 1.7 200 6 17 10 1000 100 900
מיכל 5 מיכל 5 200 7 50 10 1000 100 900
6 17 200 8 170 10 1000 100 900
7 50 200 8 170 3.4 1000 294.1 705.9
8 170 200 200 מניות μM 200 1.18 1300 1105 195

שולחן 4: ליטוף לניסויים באמצעות מערכי האלקטרודה של 8-היטב בעקבות מצב חיבור 2.

ובכן EC50 Eמקסימום (= A2) מיכלא n
יקרומטר (kΩ) Ω
1 0.9 ± 0.1 1680 ± 70 150 ± 80 1.9 ± 0.5
2 0.7 ± 0.2 1770 ± 90 200 ± 140 1.3 ± 0.4
3 0.6 ± 0.2 1700 ± 100 60 ± 250 1.1 ± 0.5
4 0.6 ± 0.2 2000 ± 100 140 ± 180 1.3 ± 0.4
מיכל 5 0.9 ± 0.1 1810 ± 60 160 ± 80 1.4 ± 0.3
6 0.8 ± 0.1 1950 ± 70 200 ± 110 1.3 ± 0.3
7 0.6 ± 0.3 1700 ± 200 260 ± 250 1.6 ± 1.0
1 – 7 0.7 ± 0.2 1900 ± 100 100 ± 100 1.1 ± 0.2

טבלה 5: תוצאות שהתקבלו מארבעה מתאים לוגיסטיים פרמטרים החלים על נתונים טיפוסיים של תגובת מינון. נתוני תגובת המינון המשמשים לניתוח מוצגים באיור 2. טווח הריכוז המלא הוחל על ניתוח עבור הבארות הבודדות אחד עד שבעה (איור 2ב) ועבור הנתונים הממוצעים שהתקבלו מבארות אחד עד שבעה (איור 2ד). אף אחד מהפרמטרים של הפונקציה הלוגיסטית לא תוקן במהלך האופטימיזציה לפחות מרובעת. תוצאות ההתאמה מעוגלות לעשור של השגיאה, אלא אם הערך היה קטן יותר מהשגיאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור מדידות עכבה ללא תווית כדי לקבוע את הקשר המינון-תגובה של agonist המושרה הפעלת GPCR בהעדר או נוכחות של יריבים ספציפיים לאותו קולטן. הוכחת המושג של שיטה זו הוצגה בפרסום האחרון12. לידיעתנו שלנו הוא המחקר הראשון המתאר את הקמתה של עקומת מינון מלא-תגובה של אגוניסט-בתיווך GPCR הפעלה באמצעות שכבת תא אחת בתוך מבחנה. הגישה באופן בלתי נמנע דורשת שימוש בגישות לניטור תאים ללא תוויות ולא יחולו על מספר נקודות קצה.

הפרוטוקול הוכח על הדוגמה של U-373 בתאי MG, אשר מבטא באופן שוטף את האדם היסטמין 1 קולטן (hHR1) כי הוא מגורה עם סדרה של ריכוזים גוברת של אגוניסט אנדוגניים שלה בעוד העכבה של התאים הוא הקליט ברציפות. כדי להדגים את תחולתה של הפרוטוקול ללימודי היריב, חזרו הניסויים בנוכחותם של ריכוז מתמשך אחד של דיפניההידרשלי, יריב תחרותי לhH1R. הקלטות עכבה יש גם בשימוש בהצלחה כדי ללמוד H1R אגוניסטים אחרים (למשל, UR-KUM53011, בודדים ומינון החורגים) ו האנטוניסטים (למשל, משלי)12 בנוסף לדוגמאות המוצגות כאן. יתר על כן, הפרוטוקול הוחל על קווי תאים אחרים וקולטנים כמו גם, למשל CHO-D2R להביע את הקולטן דופמין D2 (D2R) או BAEC המבטא את הקולטן ביותר2-אדרררגיות (בדיוק2AR)12 המציין כי הוא מציג ערכה כללית עבור הדור היעיל ביותר של מינון-תגובה נתונים. בעוד U373-MG ו BAEC תאים לבטא את הקולטנים המתאימים H1R ו2AR ברמות אנדודוגני, CHO-D2R הוא דוגמה למודל תא רקומביננטי. שצולמו יחד, הפרוטוקול הטורי הוא בכלל ישים על סוגי תאים עם ביטוי משני או GPCR, GPCRs עם סוגי צימוד שונים Gq (למשל, H1R), gs (למשל, יש2AR), gi (למשל, D2R) כמו גם ליגונים וסוגי שונות (אגוניסט/יריב). בכל אלה מסוג תא/קולטן שהוזכרו לעיל, העכבה עולה עם ריכוז אגוניסט גדל. עם זאת, תאים מסוימים מגיבים להפעלת GPCR באמצעות צמצום עכבה. בדקנו את הפרוטוקול עבור מקרה כזה (האג/היסטמין) ומצא גם ירידה מתונה תלוי בריכוז, לתמוך ברעיון של גישה ישימה בדרך כלל, כי הוא גם תואם לשינויי עכבה הופכי. זה הוצע כי הזמן המפורט מפורט של נתוני עכבה מציין את סוג של G-חלבון צימוד של קולטן נתון. למרות המושג הוא אטרקטיבי, הבריכה של הנתונים שלנו אינו תומך כלל החלים בדרך כלל כי המתאים את פרופיל זמן העכבה של G-חלבון צימוד של GPCR נתון6.

פרוטוקול התוספת הטורית הוא הסתגלות לסוגים שונים של פריסות אלקטרודה ותבניות מרובות-היטב. הוא חל על מערכות זלוף על שבב, שהוא יתרון משמעותי על גישות רבות מבוססות תוויות, כי לעתים קרובות דורשים שכבת תא אחת עבור ריכוז אחד להיבדק. בהתאם לכך, סכימת המינון הטורית עשויה לסלול את הדרך למחקרים בעלי מינון במודלים ביולוגיים מורכבים יותר, כגון העוגב-on-שבב או אפילו הגישות של אדם-על-שבב. מדידות עכבה לזהות משולבת, התגובה המרוחק של התאים כדי הפעלת קולטן כי בסופו של דבר גורם מורפולוגיה התאים שינויים. זה מאוד כללי ולא ספציפי אך גם משוחדת הוא הבסיס עבור ישימות רחב שלה כי הוא לא מוגבל GPCRs אבל יכול גם לעבוד עבור מחלקות אחרות של קולטני פני שטח התא, קולטנים cytoplasmic או אפילו חלבונים תאיים כמטרות.

זה קריטי עבור פרוטוקול התוספת האגוניסט החורג לעבוד עם שכבות התאים באמצעות שוטפת על האלקטרודות, כמו תרבויות דליל יפריעו רגישות, התוכסות ופרשנות הנתונים. תנאי מוקדם נוסף לניטור מוצלחת של הפעלת הקולטן גם מונואולאיירס התא הקונאואני הוא שינוי בצורת התא לאורך האותות התמרה האות. אם התאים הנמצאים במחקר אינם משנים את המבנה שלהם לאורך הניסוי, הקריאות מבוססות העכבה עיוורות ולא ידווחו על כל שינוי בפעילות הקולטן. כדי לפרוס כראוי את פרוטוקול התוספת הטורית, בדיקה ראשונית מראש במצב מקובל אחד-היטב-ריכוז אחד מומלץ לקבוע את טווח הריכוז של אגוניסט בערך את מרווח הזמן בין תוספות אגוניסט עוקבות. מרווחי זמן בין מינונים רציפים של אגוניסט צריך להיות מותאם כך המערכת מאמצת שיווי משקל חדש לפני הבא, מינון גבוה יותר מתווסף. בהתאם לכך, השיטה עשויה להיות פחות שימושית עבור קולטנים המפעילים תגובה ארעית מהירה ובלבד של התאים או תגובה איטית מאוד שעשויה להימשך שעות עד להשלמת הפעולה. המצב האחרון יגביר את הזמן הכולל של הניסוי ויקרא לפרוטוקולי ההוספה המקבילים לקצר בזמן המעבדה. בדוגמאות שהוצגו לעיל, זמן הריצה הכולל של הניסוי היה 2.5-3.5 h, בהתאם למספר הריכוזים (8 או 10) ולטרום דגירה פוטנציאלית עם היריב. באותו ניסוי במצב נוסף המקובלת המקביל אגוניסט לקחת רק ~ 1 h עבור אותו מודל קולטן התא אבל עם תפוקה הרבה יותר קטן. יתרון ברור של הגישה הטורית הוא שמספר הריכוזים שצריך להיבדק עבור יחסי מינון מלאים של תגובה אינו מוגבל על-ידי מספר הבארות הזמינות. אם יש צורך בריכוזים אגוניסט גבוהים יותר, הניסוי מורחב בקלות ומסתיים ללא כל עבודה נוספת בתרבות התא. בנוסף האגוניסט עצמו צריך להתבצע בקפידה, כמו תאים מסוימים רגישים לחץ הטיה ולהגיב עם שינויי עכבה ניכרת פשוט בשל גירוי מכני המוטל על ידי טיפול נוזלי. התאים עלולים אפילו. לרדת מאלקטרודה בעיה זו היא, עם זאת, לא ייחודי ניטור תא מבוסס עכבה אבל חל על טכניקות אחרות גם. עבור מצב החיבור של תאים רגישים 1 מומלץ בשל עומס מכני מופחת על התאים. עם זאת, מצב זה פועל עם כרכים נוזליים נמוכים יותר במהלך הוספת הסיכון לערבוב לא שלם מאז עצבנות אינטנסיבית אינה מומלצת כדי להימנע מתגובות תאים לא ספציפיות.

בנוסף מצב 1 הולך יחד עם גידול מתמשך של הנפח הכולל בבאר בעוד מצב 2 שומר על קבוע העוצמה הכולל מאז כמויות שוות של פתרון מוסרים ברציפות. אלה הן רק שתי אסטרטגיות קיצוניות וניתן להתאים עבור סוגי תאים מיוחדים, מרובי היטב פורמטים או האלקטרודה פריסות בכל דרך ביניים. במקרה של U373-MG/H1R מודל הבדלים קלים בערכים EC50 ו-EMax נצפו עבור מצב התוספת הטורית בהשוואה למצב החיבור המקביל המקובל (סדרתי, N = 30: EC50: (0.8 ± 0.3) μm, EMax: (1.9 ± 0.2) kΩ; מקבילי, N = 15: EC50: (0.5 ± 0.2) μm, emax: (1.3 ± 0.3) kΩ), בעוד שדגמי תא/קולטן אחרים לא הראו הבדלים. שינויים ב-EC50 ו-Eמקסימום ערכים יכול לנבוע הפחתת רגישות הקולטן כי הוא צפוי יותר להתרחש כאשר קולטני נחשפים אגוניסט במשך פעמים ארוכות יותר. השפעת הפחתת הרגישות תהיה תלויה בתוקף בקולטן ובלמידה. זה נשאר להבהיר אם ניתוח מפורט של תוספת אגוניסט סדרתי ומקבילי עשוי לספק אמצעים חדשים כדי לחקור את הפחתת הרגישות של הקולטן.

אנו ממליצים לבצע ניסוי בקרה עם התוספת המקובלת מקבילים במצב מקבילי כדי לבדוק עבור המשמרות הפוטנציאליות עקומות המינון התגובה. שולטת נוספת צריך לכלול מדגם שטופלו רק עם בינוני/ממס במינון המתאים כדי לפענח את כל ההשפעות עקב עומס ממס או לחץ מכני על תוספת בינונית. זה הופך להיות חשוב במיוחד אם הפתרון של המניה של ליגנד מוכן ממיסים אחרים מאשר בינוני (למשל, dmso, אתנול). כאשר חוקרים את ההשפעה של ליגניות שונות האגוניסט סטנדרטי צריך להיכלל כהפניה.

כיוונים עתידיים צריך לערב נוזלים אוטומטי הטיפול ביחידות, אשר עשוי לאפשר מינון אוטומטי לחלוטין או titration. החלת מצב התוספת הטורית במערכות זלוף מחזיקה פוטנציאל גדול עבור המעבדה-על-שבב וגישות העוגב-על-ידי שבב, כמו גם עבור ניסויים שבוצעו תחת המתח להטות נוזלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים לברברה Goricnick ו-Nadja Hinterreiter על עזרתם בהכנת תאים והכנת פתרונות ניסיוניים. המחברים מכירים בהכרת תודה את התמיכה הפיננסית של קבוצת ההדרכה למחקר 1910 "כימיה מרפא של בררני GPCR ליגנדס" הממומן על ידי קרן המחקר הגרמני (DFG) תחת מספר 222125149. JAS מודה במיוחד על מלגה שניתנה על ידי תוכנית השוויון המגדרית הבווארית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bürker counting chamber Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) 640210
cell culture flasks 25 cm2 Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) 690175
Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) \
Centrifuge (Heraeus 1S-R) Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) \
Diphenhydramine hydrochloride Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) D3630
Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) D5671
Impedance Instrument (ECIS Zθ) Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) \
8-well electrode Arrays (8W1E PET) Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) \ PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)
96-well electrode arrays (96W1E+ PET) Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) \ PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area
Fetal calf serum (FCS) Biochrom (Berlin, Germany) S0615
Histamine dihydrochloride Carl Roth (Karlsruhe, Germany) 4017.1
Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) 51022515 class II safety cabinet
Leibovitz' L-15 medium Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) 21083-027
L-glutamine Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) G7513
Micropipette large (100 - 1000 µL) Brandt (Wertheim, Germany) 704780
Micropipette large (20 - 200 µL) Brandt (Wertheim, Germany) 704778
Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) Nikon (Düsseldorf, Germany)
Penicillin/streptomycin Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) P0781
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) D8537
Pipette, serological Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) 607 180
Pipettor (accu-jet pro) Brandt (Wertheim, Germany) 26300
Trypsin Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) T4174 in PBS with 1 mM EDTA
Tube, 15 mL Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) 188 271
Tube, 50 mL Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) 210 261
U-373 MG cells ATCC (Rockville, MD, USA) ATCC HTB-17
water bath (TW21) Julabo (Seelbach, Germany) \

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
  2. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs. Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).
  3. Kaitin, K. I. Deconstructing the drug development process: The new face of innovation. Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).
  4. Kenakin, T. P. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).
  5. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).
  6. Scott, C. W., Peters, M. F. Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening. Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).
  7. Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).
  8. Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
  9. Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophysical Journal. 91, 16 (2006).
  10. Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).
  11. Lieb, S., et al. Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor. Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).
  12. Stolwijk, J. A., et al. Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol. Integrative Biology. 11, 10 (2019).

Tags

ביוכימיה סוגיה 156 G-חלבון מצמידים קולטן (GPCR) עכבה ללא תווית המבוססת על תא מערכת יחסים של תגובת ריכוז אגוניסט יריב היסטמין
פרוטוקול מינון סטפנסקי עבור תפוקה מוגברת ב-GPCR-מבוסס-תוויות חינם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stolwijk, J. A., Mildner, A. K.,… More

Stolwijk, J. A., Mildner, A. K., Kade, C., Skiba, M., Bernhardt, G., Buschauer, A., Huebner, H., Gmeiner, P., Wegener, J. Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays. J. Vis. Exp. (156), e60686, doi:10.3791/60686 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter