Summary
Questo protocollo dimostra la registrazione in tempo reale delle relazioni dose-risposta completa per l'attivazione GPCR indotta da agonisti da un singolo strato di cellule coltivato su un singolo microelettrodo utilizzando misurazioni di impeditto senza etichetta. Il nuovo schema di dosso aumenta significativamente la velocità effettiva senza perdita di risoluzione del tempo.
Abstract
I saggi basati su impedimenti senza etichetta sono sempre più utilizzati per studiare in modo non invasivo l'attivazione di GPCR indotta dal ligando negli esperimenti di coltura cellulare. L'approccio fornisce il monitoraggio delle celle in tempo reale con una risoluzione temporale dipendente dal dispositivo fino a diverse decine di millisecondi ed è altamente automatizzato. Tuttavia, quando i numeri di esempio diventano elevati (ad esempio, studi di risposta alla dose per vari ligandi diversi), il costo per gli array di elettrodi usa e getta e la risoluzione del tempo disponibile per le registrazioni sequenziali bene-bene possono diventare limitanti. Pertanto, noi qui presentiamo un protocollo di addizione agonista seriale che ha il potenziale per aumentare significativamente la produzione di saggi GPCR senza etichette. Utilizzando il protocollo di aggiunta agonista seriale, un agonista GPCR viene aggiunto in sequenza nell'aumentare le concentrazioni a un singolo strato di cellule, monitorando continuamente l'impedimento del campione (modalità agonista). Con questo approccio seriale, è ora possibile stabilire una curva completa dose-risposta per un agonista GPCR da un solo strato di cella singola. Il protocollo di addizione agonista seriale è applicabile a diversi tipi di accoppiamento GPCR, Gq Gi/0 o Gs ed è compatibile con i livelli di espressione ricombinanti ed endogeni del recettore in fase di studio. Anche il blocco del recettore da parte degli antagonisti del GPCR è valutabile (modalità antagonista).
Introduction
Questo rapporto presenta una descrizione dettagliata di un protocollo di addizione seriale sviluppato per la quantificazione dell'attivazione del recettore accoppiato con proteina G (GPCR) indotta dal ligando (GPCR) nelle cellule coltivate con aderenza mediante misurazioni di impedimento senza etichette. I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono coinvolti in una moltitudine di funzioni fisiologiche e malattie umane1. A causa di questo e della loro buona accessibilità sulla superficie cellulare, i GPCR sono uno dei più importanti bersagli farmacologici. Questa valutazione si riflette in un numero stimato di 700 dollari di farmaci approvati destinati ai GPCR, pari a una quota del 35% su tutti i farmaci commercializzati2.
Lo sviluppo di nuovi farmaci comprende due processi centrali: (i) l'identificazione e la caratterizzazione funzionale delle molecole bersaglio biologiche e (ii) la scoperta di nuove sostanze di piombo e il loro sviluppo in farmaci amministrativi. In entrambi i processi, sono necessari metodi efficienti per valutare quantitativamente le interazioni farmaco-bersaglio e la successiva risposta biologica a valle. Diverse fasi del processo di sviluppo di farmaci preclinici fanno uso di diversi metodi di analisi che vanno da studi di interazione biomolecolare tra farmaco e bersaglio, su studi funzionali sulle cellule in coltura, a esperimenti su materiale di organi ascisi o animali interi. Entrambi, il significato fisiologico e la complessità biologica aumentano dal primo al secondo3. Sebbene sia l'obiettivo generale di ridurre al minimo gli esperimenti sugli animali, gli studi farmacologici che utilizzano organi isolati di animali da laboratorio o persino animali interi sono considerati inevitabili per caratterizzare in modo completo nuovi farmaci candidati. In termini di lettura analitica, gli studi di farmacologia degli organi forniscono una risposta funzionale "olistica" dissintesa e integrativa di massima rilevanza fisiologica. Uno svantaggio di tali esperimenti è che non sono compatibili con lo screening ad alta produttività per motivi tecnici ed etici e sono stati in gran parte sostituiti da studi basati sulla coltura delle cellule in vitro4.
I metodi per quantificare l'attivazione di GPCR nelle colture cellulari includono diversi saggi chimici basati su etichette, che rilevano specificamente i secondi messaggeri, lo stato di fosforolalazione delle proteine di segnalazione a valle, l'attivazione trascrizionale tramite determinati fattori di trascrizione o il traffico di recettori intracellulari indotti dal ligando4,5. Uno degli inconvenienti di tali analisi basate su etichette è la necessità di etichettare le cellule con coloranti potenzialmente dannosi o marcatori radioattivi. Ciò richiede spesso l'esecuzione dell'espressione come endpoint-determinazione per un tempo di esposizione che deve essere specificato a priori. L'utilizzo di analisi endpoint basate su etichette soffre di questa tempistica molto limitata e di parte dell'esperimento e del rischio che etichette chimiche e sonde possano interferire con la fisiologia cellulare regolare – potenzialmente inosservata dallo sperimentatore.
Negli ultimi anni sono emersi saggi senza etichette per il monitoraggio dell'attivazione di GPCR, come tecniche basate su impedimento o metodi ottici che applicano griglie di guida d'onda risonanti5,6. L'etichettatura delle cellule non è richiesta sperimentalmente con questi approcci. Poiché queste letture fisiche operano su segnali a bassa ampiezza, tali metodi sono considerati non invasivi, consentono un monitoraggio continuo delle cellule potenzialmente in tempo reale e il tempo di osservazione è limitato solo dalla coltura cellulare non dalla lettura. Simile alle letture da organi interi, gli approcci senza etichetta segnalano comunemente risposte olistiche cellulari, a valle dell'attivazione del recettore quando l'integrazione lungo l'intera rete di segnalazione porta a cambiamenti dipendenti dal tempo ma piuttosto non specifici nella morfologia cellulare o nella ridistribuzione di massa. Mentre i saggi basati su impedimenti misurano la firma dielettrica delle variazioni della forma cellulare7,8, le misurazioni utilizzando griglie di guida d'onda risonanti sono sensibili ai cambiamenti nell'indice di rifrazione nell'interfaccia cellulare-substrate derivanti dalla ridistribuzione dinamica della massa (DMR)9. Il carattere integrativo rende i metodi privi di etichetta estremamente sensibili agli eventi mediati dal recettore indipendentemente dal tipo(s) di proteina G (Gq, Gi/0, Gs, G12/13) o z-arrestin coinvolti nella cascata di segnalazione6 e adatti per i livelli di espressione endogeni del recettore.
In un saggio standard senza etichetta basato su impedance le cellule sono coltivate aderentemente in piastre multi-bene con elettrodi coplanari a pellicola d'oro depositati sul fondo di ogni pozzo10. Questi array di elettrodi sono collegati a un analizzatore di impedimenti e le risposte cellulari a uno stimolo sperimentale sono registrate da singoli pozzi da letture di impedimenti risolti nel tempo. In un tipico saggio GPCR un ligando viene aggiunto in concentrazioni singolarmente diverse ad ogni singolo pozzo. Le variazioni indotte dal ligando nel corso del tempo impedibile vengono quindi analizzate rispetto alle caratteristiche della curva come il cambio massimo del segnale, l'area sotto la curva, la variazione del segnale entro un determinato intervallo di tempo o pendenza della curva in un determinato punto temporale, al fine di quantificare la potenza e l'efficacia del ligando11.
Il costo degli array di elettrodi può limitare l'applicazione di questa tecnica nelle campagne di screening ad alta produttività (HTS). Inoltre, con un numero crescente di campioni da seguire in parallelo, il numero di singole misurazioni aumenta e quindi riduce gradualmente la risoluzione del tempo disponibile per ogni pozzo , anche per le registrazioni multicanale all'avanguardia. In tali condizioni le risposte cellulari rapide e transitorie possono sfuggire alla misurazione. Inoltre, quello convenzionale bene – un approccio di concentrazione impone un fattore di tempo e di costo significativo sugli sviluppi perfusi organo su chip o corpo su chip per quanto riguarda la loro idoneità nell'analisi dell'interazione ligand-GPCR.
Per questo motivo, abbiamo sviluppato un protocollo di dosaggio stepwise che consente la registrazione di curve di risposta alla dose completa dell'attivazione GPCR indotta dal ligando in monostrati cellulari coltivati monitorando continuamente l'impedimento di un singolo pozzo mentre la concentrazione agonista aumenta di passo. Il protocollo di addizione agonista seriale aumenta significativamente la produttività per bene da una concentrazione a 10 o più concentrazioni, come mostrato nell'attuale esempio di cellule umane U-373 MG, che endogenamente esprimono il recettore dell'istamina 1 (H1R). Pertanto, il metodo ha il potenziale per migliorare significativamente la produttività negli studi di risposta alla dose senza etichette, mentre la risoluzione del tempo viene mantenuta al massimo strumentale.
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Protocol
1. Semina cellulare su array di elettrodi
NOTA: La selezione del layout degli elettrodi è un compromesso tra sensibilità e numero di cellule in studio. Più piccolo è l'elettrodo, più sensibile è la misura, ma minore è il numero di cellule in fase di studio. Per le cellule che mostrano forti fluttuazioni di impeditto nel tempo in condizioni di base, sono preferibili elettrodi più grandi o interdigitati.
- Preriscaldare tutte le soluzioni necessarie per il passaggio e il semina di cellule standard in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi. Per i saggi con cellule umane U-373 MG che prende: fosfato tamponato salina (PBS) senza calcio e magnesio, 0.05% (w/v) trypsin, mezzo di coltura cellulare (EMEM minimo dell'Aquila) integrato con il 5% (v/v) siero di vitello fetale (FCS), 2 mM L-glutamina e 100 g/mL penicillina/streptomicina).
- Sciacquare lo strato cellulare della coltura stock coltivata sul fondo dei flaconi di coltura cellulare convenzionali o piatti con PBS due volte.
- Rimuovere il PBS, aggiungere la soluzione di orpsina (1 mL per 25 cm2) e lasciare che le cellule si incubano a 37 gradi centigradi per 5 min (si applica alle cellule U-373 MG).
- Controllo per il distacco completo delle cellule dal fondo del substrato di crescita mediante microscopia.
- Interrompere la reazione di trypsin non appena le cellule sono completamente staccate aggiungendo 9 mL di mezzo di coltura cellulare per 1 mL di trypsin alla sospensione cellulare. Risciacquare con attenzione le cellule rimanenti dal fondo del substrato di coltura cellulare digitando la sospensione sopra il substrato.
- Raccogliere la sospensione cellulare con una pipetta e trasferirla in un tubo di centrifugazione (15 mL o 50 mL).
- Abbassare le cellule con la centrifugazione a 110 x g per 10 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere con attenzione il supernatante e ri-sospendere accuratamente il pellet cellulare nel mezzo di coltura prima di contare le cellule (ad esempio utilizzando un emacytometro per microscopi a contrasto di fase e conteggio manuale).
- Regolare la sospensione cellulare in base alla densità di cella desiderata. Per esperimenti con cellule U-373 MG, utilizzare 100 000 cellule/cm2 per far crescere uno strato di cellule confluenti entro 48 h. Questo si traduce in una densità di cellule di 200 000 celle/mL per array di elettrodi a 8 pozze con un'area di crescita di 0,8 cm2 e un volume di pozzo di 400 .L.
NOTA: per gli esperimenti di attivazione GPCR riproducibili, le cellule dovrebbero essere coltivate a monostrati confluenti sugli array di elettrodi. Per garantire la corretta espressione del recettore sulla superficie cellulare, le cellule devono essere semiate almeno 36 h prima di eseguire l'esperimento. Testare diverse densità cellulari per la semina cellulare è spesso significativo per identificare le migliori condizioni sperimentali. - Aggiungere la sospensione cellulare ai pozze dell'array di elettrodi e lasciare che le vendite si stabilizzino a temperatura ambiente per 10 – 15 min al fine di garantire la distribuzione omogenea delle cellule sul fondo dei pozzi.
- Coltivare cellule per almeno 36 h in un'incubatrice di coltura cellulare standard con 5% di CO2 (a seconda del tipo medio) a 37 gradi centigradi e atmosfera umidificata. Modificare il mezzo di coltura cellulare 24 h prima dell'esperimento.
- Il giorno dell'esperimento, ispezionare gli strati cellulari sugli array di elettrodi mediante microscopia (contrasto di fase) per garantire una copertura completa degli elettrodi con le cellule.
2. Equilibration di cellule in mezzo senza siero
- Mezzo preriscaldato privo di siero, in questo studio: mezzo L15 di Leibovitz.
- Rimuovere il mezzo di coltura cellulare dalle cellule coltivate su array di elettrodi e sostituirlo con un mezzo preriscaldato privo di siero. Utilizzare 200 l per le serie di elettrodi di formato 8-well e 150 L per array di elettrodi 96-well.
- Lasciare che le cellule eclichino in mezzo senza siero a 37 gradi centigradi per almeno 2 h. Il tempo di acquisione dipende fortemente dal tipo di cellula. Ad esempio, le cellule U-373 MG hanno bisogno di 2 h, le cellule CHO hanno bisogno di 4 h, BAEC può richiedere l'equilibratione durante la notte nel mezzo L-15.
NOTA: il supporto L-15 è indipendente da CO2 e richiede un'atmosfera senzaCO2. Per l'equilibratore in L-15 impostare l'incubatrice a 0 % CO2. L'equilibratore può essere monitorato da letture impediti, che si consiglia di fare per i primi esperimenti.
3. Monitoraggio dell'equilibratione cellulare con letture impediti
- Posizionare l'array di elettrodi nel supporto dell'array di collegamento dell'analizzatore di impedimenti.
- Assicurare un corretto contatto a basso impedibile tra elettrodi e analizzatore di impedimenti. Questo controllo è individualmente diverso per diversi strumenti.
NOTA: Se lo strumento non riesce a effettuare il collegamento agli elettrodi, aprire nuovamente il morsetto a contatto, riadattare l'array di elettrodi per il corretto posizionamento all'interno del supporto e riprovare. - Selezionare il tipo di elettrodo e/o il formato multi-bene dall'interfaccia utente del software.
- Impostare i parametri di misurazione. Sono disponibili diverse opzioni.
NOTA: Per selezionare la frequenza AC più sensibile, ci riferiamo alla letteratura e manuali di strumenti in quanto dipende dal layout dell'elettrodo e dal tipo di cella in studio. In genere, la frequenza di rilevamento è compresa tra 4 kHz – 50 kHz. Qui, le cellule U-373 MG sono state coltivate su elettrodi circolari di 250 m di diametro e sono state monitorate ad una frequenza AC di 12 kHz.- Se sono disponibili modalità di acquisizione dati a frequenza singola e a più frequenze, selezionare la modalità a frequenza singola per garantire la massima risoluzione del tempo. La misurazione verrà eseguita a questa singola frequenza. Per gli strumenti più diffusi, c'è una serie di frequenze preimpostate lungo la finestra di frequenza disponibile.
- Se il numero di pozzi in fase di studio è basso o la risoluzione del tempo non è critica, selezionare invece più registrazioni di frequenza. Le letture impennti a un determinato numero di frequenze saranno registrate per ogni pozzo per una successiva analisi approfondita.
NOTA: la risoluzione temporale diminuisce con un numero crescente di frequenze registrate per pozzo e un numero crescente di pozzetti. Le opzioni per la selezione della modalità di acquisizione della frequenza e dei dati variano in base al tipo e alla versione dello strumento.
- Avviare l'acquisizione dei dati del corso di tempo.
- Seguire lo strato cellulare impedire (almeno 2 h) fino a quando l'impedito si è stabilizzato. Nel frattempo, preparate le soluzioni agoniste.
- Quando gli strati cellulari hanno raggiunto un livello di impedimento stabile, (i) procedere all'aggiunta agonista seriale all'interno dello stesso esperimento o (ii) terminare l'acquisizione dei dati e avviare un nuovo set di dati per il monitoraggio dell'attivazione del recettore indotta dall'agonista.
4. Preparazione di soluzioni agoniste per esperimenti in modalità agonista
- Calcolare la concentrazione di soluzioni agoniste secondo necessità per ogni fase del dosing seriale in base all'equazione (1). n varia da 1 al numero totale di aggiunte seriali i. x denota concentrazione e volume nel pozzo al passo n. y denota concentrazione e volume della "soluzione da aggiungere" nel passaggio n.
NOTA: considerare il numero di repliche e calcolare il volume totale di "soluzione da aggiungere" per ogni fase di concentrazione. I risultati di un calcolo tipico sono riportati nelle tabelle 1-4. Ci vuole un'idea generale circa la gamma di concentrazione agonista per essere studiato come la gamma definisce le concentrazioni e il numero di porzioni da somministrare durante l'addizione seriale. Utilizzando il protocollo di addizione agonista seriale la concentrazione agonista è aumentata passo avanti. Pertanto, la quantità di agonista già nel pozzo quando viene aggiunta la dose successiva deve essere presa in considerazione. Quando il numero di molecole agoniste presenti già nel pozzo è nx cx xV x (con la concentrazione corrente cx x e volume Vx) e il numero di molecole nel pozzo dopo la prossima aggiunta è nx-y, il numero di molecole da aggiungere ny è determinato dalla concentrazione cy e dal volume Vy della soluzione da applicare al pozzo (ny - cy yy). Dopo aver aggiunto una porzione di agonista, la nuova quantità di molecole agoniste nel pozzo è: cx Questo calcolo si applica per ogni passaggio successivo. A causa dell'interdipendenza della concentrazione agonista nel pozzo e della quantità di agonista nelle porzioni da aggiungere ad ogni passo, è importante definire le concentrazioni finali dopo ogni passo in anticipo.
Modalità 1: Il volume nel pozzo aumenterà ad ogni passo come liquido viene continuamente aggiunto.
Utilizzando questa modalità e un formato a 8 bengeti, utilizzare Vx1 , 200 L e Vy1 .... Vyi , 30 L.
Modalità 2: Il volume nel pozzo è costante in quanto il volume aggiunto con ogni passaggio viene rimosso appena prima dell'aggiunta successiva.
Utilizzando questa modalità e un formato di 96 pozze, utilizzare Vx1 , 150 L e Vy1 .... Vyi , 75 L.
- Stampare la scheda dati con il volume totale per concentrazione e istruzioni dettagliate per la pipettatura.
- Preparare tutte le soluzioni nella quantità richiesta. Rendere tutte le soluzioni agoniste nello stesso mezzo senza siero utilizzato per l'equilibratione delle cellule.
AGGIORNAMENTO: Il dihydrochlor di istamina è considerato pericoloso dallo standard di comunicazione di pericolo 2012 OSHA (29 CFR 1910.1200). L'istamina provoca irritazione cutanea, grave irritazione oculare, può causare una reazione allergica della pelle, allergia, sintomi di asma o difficoltà respiratorie se inalato e può causare irritazione respiratoria. Si prega di prendere in considerazione la scheda dati di sicurezza.
NOTA: Rendere le soluzioni agoniste il più fresche possibile. La stabilità degli agonisti in soluzione può variare considerevolmente. Conservare le soluzioni a 4 gradi centigradi o inferiori fino all'utilizzo nell'esperimento. Per alcune molecole ulteriori additivi stabilizzanti, come BSA quando si utilizzano molecole a base di peptidi o lipidi, può essere considerato per prevenire l'assorbemento alle pareti di pozzi e tubi. - Se si esegue l'esperimento in formato 96 pozzetti, trasferire le soluzioni a una piastra convenzionale da 96 pozzetti (senza elettrodi) e utilizzare un tubo di canale 8 (o 12) per un rapido trasferimento di liquidi all'array di elettrodi.
5. Preparazione di soluzioni agonistiche per l'esperimento in modalità antagonista
NOTA: Preparare la soluzione (o le soluzioni antagoniste) con la concentrazione da applicare in tutto. Il volume e la concentrazione della soluzione antagonista dipendono dalla modalità di addizione agonista (1 o 2). Esempi di esperimenti in formato 8-pozzo o 96-pozzi in modalità di addizione 2: (A) formato 8 pozzetto (Vx1 - 200 -L, VAntagonist - 200 -L); (B) Formato 96-pozzo (Vx1 : 150 - L, VAntagonista - 75 L).
- Calcolare la concentrazione di ogni soluzione agonista necessaria per ogni fase del dosamento seriale come descritto nel passaggio 4.1.
- Rendere tutte le soluzioni agoniste nello stesso mezzo senza siero utilizzato per l'equilibratione delle cellule e aggiungere l'antagonista alla stessa concentrazione finale come previsto per i rispettivi pozzi nell'esperimento.
NOTA: In questo caso la soluzione di riserva di istamina (10 mM) viene preparata nel mezzo L-15. Quando gli agonisti sono dissolti in altri solventi (ad esempio, sulfoxid dimetilico (DMSO), deve essere incluso un controllo del solvente per tenere conto dell'aumento del carico di solvente ad ogni fase dell'addizione.
6. Esecuzione del protocollo di addizione seriale in modalità agonista
- Avviare l'acquisizione dei dati come descritto nei passaggi da 3.1 a 3.5.
- Preriscaldare le soluzioni agoniste prima dell'uso mettendole nell'incubatrice circa 10 – 15 min prima dell'aggiunta.
NOTA: Quando si utilizzano sostanze termolabili, le soluzioni non devono essere mantenute a 37 gradi centigradi per troppo tempo. Se il preriscaldamento per 10 – 15 min è considerato critico, portare soluzioni a 37 gradi centigradi poco prima dell'aggiunta in un bagno d'acqua. - Eseguire il dosing seriale agonista a seconda della modalità di aggiunta selezionata. Seguendo la modalità 1 il volume totale nel pozzo aumenta con ogni aggiunta della dose successiva. In modalità 2 lo stesso volume che viene aggiunto con ogni passo viene rimosso di nuovo appena prima di aggiungere la dose successiva più alta.
NOTA: il tempo necessario per l'equilibrato dello strato cellulare tra due dosi agoniste successive dipende dal tempo di risposta delle cellule. Un esperimento iniziale in modalità parallela (un pozzo – una concentrazione) rivela (i) i tempi di risposta cellulare per diverse concentrazioni agoniste e (ii) il parametro della curva più sensibile (ad esempio, impedire il massimo, impedire dopo il tempo x).
A: Formato Mode 1 / 8-well
- Aggiungere 30 l della prima soluzione con la più bassa concentrazione di agonista alle cellule che sono state equilibrate in 200 l di mezzo senza sieri.
- Lascia che le cellule rispondano ed equilichino per il periodo di tempo predefinito (ad es. 15 min).
- Aggiungere 30 -L della seconda soluzione con la successiva concentrazione più alta.
- Ripetere i passaggi 6.3.1-6.3.3 con la terza, la quarta e così via, la soluzione agonista.
NOTA: L'utilizzo di 10 fasi di concentrazione comporterà un volume totale di 500 gradi alla fine dell'esperimento, appena al di sotto del volume massimo applicabile di questi pozze di questi pozzi di 550 dollari.
B: Mode 2 / 96-bene formato
NOTA: Sospendere l'acquisizione dei dati durante ogni fase di movimentazione del liquido (aggiunta/rimozione) tramite il software dello strumento di impedimento durante l'esecuzione di esperimenti in formato 96-well. La gestione più elaborata del liquido può interferire con l'acquisizione dei dati. Utilizzare una pipetta multicanale.
- Sospendere l'acquisizione dei dati.
- Aggiungere 75 l della prima soluzione con la più bassa concentrazione di agonista alle cellule che sono state equilibrate in 150 gradi di mezzo senza sieri.
- Riprendere l'acquisizione dei dati.
- Lascia che le cellule rispondano ed equilichino per il periodo di tempo predefinito (ad es. 15 min).
- Circa 1 – 2 min prima del normale tempo di equilibratore, mettere in pausa la misura e rimuovere 75 l da ogni pozzo.
NOTA: il punto temporale in cui la soluzione deve essere rimossa dipende dal numero di pozzi monitorati in parallelo e dalla velocità di tubazione. Il tempo necessario per la rimozione delle soluzioni non deve superare il tempo tra i passaggi successivi. - Aggiungere 75 l della seconda soluzione con la successiva concentrazione più alta e riprendere la misurazione.
- Ripetere i passaggi 6.3.8-6.3.10 con la terza, la quarta e così via, la soluzione agonista.
7. Esecuzione del protocollo di addizione seriale in modalità antagonista
- Avviare la misurazione come descritto nei passaggi da 3.1 a 3.5.
- Durante l'equilibratura degli strati cellulari, preparare la soluzione antagonista (ad esempio, 200 -L di 1,5 M di cloridrato di phenhydramina nel mezzo L15).
AVVISO: L'idrocloruro difenidrina ha potenziali effetti acuti sulla salute. È dannoso se ingerita o inalata, può causare irritazione agli occhi e alla pelle. Può causare irritazione del tratto respiratorio e digestivo. Si prega di prendere in considerazione la scheda dati di sicurezza. - Preriscaldare le soluzioni antagoniste e agonistamettendole mettendole nell'incubatrice circa 10 – 15 min prima dell'aggiunta alle colture cellulari (cfr 6.2). Se nell'antagonista sono inclusi anche pozzi privi di antagoni, anche i mezzi preriscaldati senza siero.
- Aggiungere la soluzione antagonista ai pozzi designati. Lasciate che le cellule eclichiamo con antagonista per 15 –20 min. Se sono inclusi pozzi senza antagoni, aggiungere lo stesso volume di mezzo senza siero a questi pozzi.
- Secondo l'aggiunta di antagonista in modalità 2, rimuovere la soluzione dai pozzi
(A) Formato a 8 pozzetto (200 -L)
(B) Formato 96 pozzi (75 l) - Eseguire la sequenza di addizione agonista come descritto nel passaggio 6.3.
8. Esportazione e analisi dei dati
- Esportare i dati utilizzando il software dello strumento di impeditto al fine di convertire tutti i dati registrati da proprietari in formati di dati comuni (ad esempio, csv). Questo passaggio consente la riorganizzazione dei dati e la presentazione con altri pacchetti software.
- Caricare i dati in formato csv nel software di analisi scientifica dei dati.
- Normalizzare i valori impediti sottraendo l'impedimento dell'ultimo punto dati prima della prima aggiunta di soluzione agonista e impostando l'ora di addizione su t - 0. Tracciare il corso temporale dell'impedimento normalizzato.
- Tracciare i singoli corsi temporali e identificare il massimo in impedendo dopo ogni fase di addizione. Comporre un foglio dati con questi valori.
- Tracciare i valori del massimo (o minimo, se applicabile) impedendo i cambiamenti in funzione della concentrazione agonista. Questo può essere fatto per singoli pozzi o per le medie (media - SD).
- Utilizzare una routine di adattamento dei dati per determinare le concentrazioni effettive a metà massima (EC50) e la risposta massima (EMax) utilizzando il modello logistico a quattro parametri (equazione 2):
NOTA: c indica la concentrazione agonista, A1 è il minimo e A2 è l'asintote massimo della curva sigmoidaldose-risposta (A2 e EMax). EC50 è la concentrazione nel punto di inflessione della curva, e n corrisponde al pendio collinare.
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Representative Results
Uno schema tipico per la preparazione delle varie soluzioni agonista è mostrato per un esperimento utilizzando 8-well array di elettrodi con istamina come agonista nelle tabelle 1-4. La tabella 1 e la tabella 2 presentano i volumi e le concentrazioni per un esperimento che utilizza la modalità di addizione 1 (cfr., figura 1), mentre la tabella 3 e la tabella 4 presentano volumi e concentrazioni per un esperimento successivo alla modalità di addizione 2 (cf., figura 1). I dati sono stati calcolati utilizzando l'equazione (1).
Un esperimento rappresentativo è illustrato nella Figura 2 per gli strati confluenti delle cellule U-373 MG, che endogenamente esprimono il recettore 1 dell'istamina, coltivato su una matrice di elettrodi a 8 pozze con un elettrodo funzionante di 250 m di diametro utilizzando l'istamina come agonista. La misurazione è stata eseguita a una singola frequenza di 12 kHz. L'aggiunta della serie di concentrazione agonista è stata eseguita seguendo la modalità 1. Nell'esperimento selezionato sono state aggiunte in sequenza ogni 15 min(Figura 2A)sono state aggiunte in sequenza 10 soluzioni con aumento della concentrazione di istamina (preparata secondo il punto 4). Lo schema di dosso seriale è stato applicato a sette degli otto pozzi. In un mezzo ben senza agonista (L-15) è stato aggiunto in sequenza come un controllo negativo in nove di dieci passi. L'ultima aggiunta a questo controllo è stata una soluzione di istamina che fornisce una concentrazione finale di 100 m di istamina nel pozzo. I dati sono stati tracciati con un software di analisi dei dati e vengono visualizzati come impedimento del cambiamento N. di controllo lungo l'esperimento, con l'impedinza e il punto temporale della prima aggiunta impostato su zero. Il tempo di equilibratore iniziale nel buffer sperimentale di 2 h non è mostrato in questo grafico. I punti temporali dell'addizione agonista sono indicati da frecce.
La modifica dell'impedimento rispetto alla linea di base dopo ogni fase di concentrazione è stata estratta dalle curve utilizzando un cursore dati. In passaggi senza un massimo chiaro, l'ultimo punto dati prima dell'aggiunta successiva è stato utilizzato per l'analisi. Impenitta cambiamenti - N. di controllo 12 kHz sono stati tracciati in funzione della concentrazione di istamina (cx-y) (Figura 2B, simboli). La funzione di trasferimento di un modello logistico a quattro parametri (cfr. passaggio 8.6) è stata adattata ai punti dati sperimentali di sette pozze(Figura 2B, linee). I risultati dell'adattamento sono riportati nella tabella 5. Figura 2C e Figura 2D mostrano il risultato della media dei dati in Figura 2A e Figura 2B, presentando media SD per sette pozzi. I dati del corso di tempo medio sono riepilogati nella Figura 2C, mentre la curva media dose-risposta è fornita nella Figura 2D.
Nelle relazioni dose-risposta, come illustrato nella figura 2B,D, la procedura di adattamento è stata applicata all'intero intervallo di concentrazione che restituisce EC50 , (0,86 x 0,13) , m. La risposta impedibile aumenta monotonamente con l'aumentare della concentrazione di istamina, ad eccezione degli ultimi due passi di concentrazione (30 M, 100 M di concentrazione finale). Questa risposta è presumibilmente spiegata dalla downregolazione del recettore dell'istamina, desensibilizzazione o sovrastimolazione delle cellule (vedi discussione). Per tenere conto di questo effetto, l'intervallo di dati per l'analisi è stato ridotto, come mostrato per un singolo esperimento di dosing seriale(Figura 3; ben 1) selezionato tra i dati illustrati Figura 2. Inoltre, l'impostazione dell'asintono inferiore (A1) su zero durante l'ottimizzazione del quadrato, supponendo che nessun cambiamento di impedanza in risposta a 0 isfetamiale M è ben giustificato. L'applicazione di questa ottimizzazione a tre parametri fornisce unEC 50 di (0,75 x 0,12) - M (cf., Figura 3B). I valori di EC50 sono risultati insensibili per una delle modalità di analisi dei dati e non erano significativamente diversi.
Risultati tipici per un esperimento di piastra 96-well sono riepilogati in Figura 4. Le cellule U-373 MG sono state coltivate su array di elettrodi a 96 pozzi, come descritto sopra. 32 pozzi sono stati inclusi nella misurazione. 8 pozzi serviti come controlli senza agonista, esposti solo a medie. 24 pozzi sono stati sottoposti a una serie di crescenti concentrazioni di istamina calcolate e preparate per la modalità di addizione 2. Il corso di tempo di impementazione cambiamento è mostrato per tutti i 32 pozzi individuali in Figura 4A. Una delle curve (evidenziate in rosso) mostra un percorso temporale insolito ed è stata esclusa da ulteriori analisi. Di conseguenza, i dati provenienti da 23 pozzi sono stati mediati e tracciati come corso temporale di variazione media impedibile (media - SD) in Figura 4B. Ogni singola curva è stata analizzata come descritto sopra per la relazione dose-risposta. I punti dati sono stati mediati e tracciati in funzione della concentrazione finale di istamina(Figura 4C). I dati sulla risposta alla dose sono stati analizzati mediante il modello logistico a quattro parametri, che ha restituito un valore medio di EC50 pari a (1,0 x 0,3) .
Un risultato tipico per il protocollo di addizione agonista seriale in modalità antagonista è illustrato nella Figura 5. Qui, un pozzo è stato pre-trattato con 0,75 M dell'antagonista del recettore dell'istamina (curva rossa) 20 min prima dell'aggiunta del primo istamina (Figura 5A). Il controllo ha ricevuto un mezzo senza antagonista (curva blu). L'antagonista è stato aggiunto in base alla modalità 2, il che significa che 200 L degli infine 400 L sono stati rimossi prima dell'applicazione della serie agonista. L'agonista (istamina) è stato aggiunto seguendo la modalità di dosing seriale 1 come descritto negli esempi precedenti. È importante per gli esperimenti in modalità antagonista che la concentrazione antagonista sia mantenuta costante per tutto il corso dell'esperimento. Di conseguenza, tutte le soluzioni agoniste aggiunte al pozzo devono contenere anche la concentrazione di antagonipredefiniti predefinita (in questo caso, 0,75 m), mentre il controllo rimane privo di antagoni. Un effetto antagonistico diventa evidente da un aumento "ritardato" di impedimento all'interno dello schema di dosaggio seriale corrispondente a concentrazioni agonistiche più elevate necessarie per indurre una risposta cellulare. Nel rapporto dose-risposta l'effetto dell'antagonista è espresso come spostamento verso destra delle curve, che corrisponde ad un aumento della CE50, a condizione che l'antagonista sia un ligando competitivo rispetto all'agonista (Figura 5B). L'EC50 era determinato a (0,92 x 0,05) m in assenza dell'antagonista e (14,7 x 0,6) m in sua presenza.
Figura 1: Modalità di addizione agonista seriale. (A) Schematico che illustra i calcoli della concentrazione. Aggiungendo soluzione agonista di concentrazione cy e volume Vy ad un pozzo con volume Vx e concentrazione agonista cx, il volume aumenta a Vx , e la concentrazione aumenta a c x. (B) Due diverse modalità per l'addizione agonista seriale. Modalità 1: Il volume totale nel pozzo Vx-y aumenta ad ogni aggiunta. Modalità 2: Il volume aggiunto ad ogni fase di concentrazione viene rimosso di nuovo prima dell'aggiunta della dose successiva, che mantiene il volume totale nel pozzo costante. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati di un esperimento tipico in formato a 8 pozze. (A) Corso temporale di impedibile a 12 kHz per strati cellulari confluenti U-373 MG coltivati su elettrodi circolari di 250 m di diametro. In sette degli otto pozzi è stata applicata l'aggiunta seriale di istamina. Un pozzo (curva grigia) è stato caricato in sequenza con buffer senza istamina ad ogni passo (modalità 1), ad eccezione dell'ultimo passaggio in cui sono stati aggiunti 100 zermi (curva) come controllo positivo. (B) Relazioni dose-risposta generate dal massimo cambiamento di impedimento rispetto alla linea di base per sette pozzi individuali dopo ogni fase di concentrazione. (C) Corso medio di tempo di impediva (media : SD) generato da sette singoli pozzi, come mostrato nella (A). (D) Relazioni media dose-risposta generate da singoli set di dati, come mostrato nella (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Adattamento delle modalità di analisi dei dati. (A) Corso tipico del tempo di cambiamento di impedizione a 12 kHz per un singolo strato di cellule confluenti U-373 MG coltivato su elettrodi circolari di 250 m di diametro. (B) Relazione sperimentale dose-risposta (simboli riempiti) generata dalla variazione massima dell'impedimento rispetto al basale dopo ogni aumento della concentrazione. L'insieme completo dei dati è stato sottoposto alla procedura di adattamento (curva nera e grigia) o all'ultimo punto dati - che indica l'insorgenza della desensibilità e/o dell'internalizzazione del recettore - è stato omesso dall'analisi quantitativa (curva rossa e magenta). Tutti e quattro i parametri sono stati regolati durante l'ottimizzazione del minimo quadrato (curva nera e rossa) o il parametro A1, che rappresenta l'asintono inferiore, è stato impostato e fissato a zero (curva grigia e magenta). I valori di Ce50 non erano significativamente diversi per le due modalità di analisi dei dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Esperimento tipico in formato 96-well. (A) Corso temporale di impedibile cambiamento misurato a 12 kHz per gli strati cellulari confluenti U-373 MG cresciuti su un array di elettrodi 96-well. I dati sono mostrati per 32 pozze. 24 pozzi sono stati sottoposti a una serie di crescenti concentrazioni di istamina aggiunte con un tempo di equilibratondicazione di 15 min tra ogni passo. La curva evidenziata in rosso è stata esclusa dalla media. Otto pozzi (controllo) sono stati trattati con mezzo privo di istamina ad ogni momento di aggiunta. (B) Il tempo corso di cambiamento medio di impedimento per 23 pozzi individuali in risposta all'addizione seriale di istamina e otto pozzi di controllo, come mostrato nella (A). (C) Relazione media dose-risposta generata dal cambiamento massimo di impedimento rispetto alla linea di base dopo ogni aumento di concentrazione (media SD). I dati sono stati dotati di una funzione logistica a quattro parametri. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Esperimento tipico in modalità antagonista. (A) Il corso temporale di impedimento del cambiamento a 12 kHz per gli strati cellulari confluenti U-373 MG coltivati su elettrodi circolari di 250 m di diametro dopo l'aggiunta di crescenti concentrazioni di istamina con o senza presenza di anfetamina del recettore dell'istamina. Diphenhydramine (0,75 m) o media senza antagonista (L15) sono stati aggiunti 20 minuti prima dell'inizio del dosing seriale agonista. (B) Relazioni dose-risposta generate dalla variazione massima di impedimento rispetto alla linea di base dopo ogni aumento della concentrazione dai dati mostrati in (A). La presenza di 0,75 M Diphenhydramine ha aumentato l'EC50 da (0,92 x 0,05) a (14,7 x 0,6) - Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
| Soluzione # | cx-y (M) | cx (M) | Vx (L) | Vx-y (L) | Vy (L) | cy (M) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 230 | 30 | 0.08 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 230 | 260 | 30 | 0.79 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 260 | 290 | 30 | 2.03 |
| 4 | 1 | 0.3 | 290 | 320 | 30 | 7.77 |
| 5 | 3 | 1 | 320 | 350 | 30 | 24.33 |
| 6 | 10 | 3 | 350 | 380 | 30 | 91.67 |
| 7 | 30 | 10 | 380 | 410 | 30 | 283.33 |
| 8 | 100 | 30 | 410 | 440 | 30 | 1056.67 |
Tabella 1: Schema di calcolo della concentrazione per gli esperimenti che utilizzano array di elettrodi a 8 benre che seguono la modalità di addizione 1.
| Soluzione # | cy (M) | Vy (L) | fare da | c (M) | fattore di diluizione | fare il totale V (l) | l'uso (l) | aggiungere V (l) |
| 1 | 0.08 | 30 | 3 | 2.03 | 26.52 | 600 | 22.6 | 577.4 |
| 2 | 0.79 | 30 | 4 | 7.77 | 9.83 | 600 | 61 | 539 |
| 3 | 2.03 | 30 | 5 | 24.33 | 11.97 | 600 | 50.1 | 549.9 |
| 4 | 7.77 | 30 | 6 | 91.67 | 11.8 | 600 | 50.8 | 549.2 |
| 5 | 24.33 | 30 | 7 | 283.33 | 11.64 | 600 | 51.5 | 548.5 |
| 6 | 91.67 | 30 | 8 | 1056.67 | 11.53 | 600 | 52.1 | 547.9 |
| 7 | 283.33 | 30 | 8 | 1056.67 | 3.73 | 600 | 160.9 | 439.1 |
| 8 | 1056.67 | 30 | 10 mM Magazzino | 10000 | 9.46 | 800 | 84.5 | 715.5 |
Tabella 2: Schema di pipettaggio per esperimenti che utilizzano array di elettrodi a 8 ben in seguito alla modalità di addizione 1.
| Soluzione # | cx-y (M) | cx (M) | Vx (L) | Vx-y (L) | Vy (L) | cy (M) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 400 | 200 | 0.02 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 200 | 400 | 200 | 0.19 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 200 | 400 | 200 | 0.5 |
| 4 | 1 | 0.3 | 200 | 400 | 200 | 1.7 |
| 5 | 3 | 1 | 200 | 400 | 200 | 5 |
| 6 | 10 | 3 | 200 | 400 | 200 | 17 |
| 7 | 30 | 10 | 200 | 400 | 200 | 50 |
| 8 | 100 | 30 | 200 | 400 | 200 | 170 |
Tabella 3: Schema di calcolo della concentrazione per esperimenti che utilizzano array di elettrodi a 8 benre che seguono la modalità di addizione 2.
| Soluzione # | cy (M) | Vy (L) | fare da | c (M) | fattore di diluizione | fare il totale V (l) | l'uso (l) | aggiungere V (l) |
| 1 | 0.02 | 200 | 3 | 0.5 | 25 | 1000 | 40 | 960 |
| 2 | 0.19 | 200 | 4 | 1.7 | 8.95 | 1000 | 111.8 | 888.2 |
| 3 | 0.5 | 200 | 5 | 5 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 4 | 1.7 | 200 | 6 | 17 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 5 | 5 | 200 | 7 | 50 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 6 | 17 | 200 | 8 | 170 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 7 | 50 | 200 | 8 | 170 | 3.4 | 1000 | 294.1 | 705.9 |
| 8 | 170 | 200 | 200 -M Magazzino | 200 | 1.18 | 1300 | 1105 | 195 |
Tabella 4: Schema di pipettaggio per esperimenti che utilizzano array di elettrodi a 8 ben in seguito alla modalità di addizione 2.
| Bene | CE50 (c) | Emax (A2) | A1 | N |
| (M) | (k) | (z) | ||
| 1 | 0,9 - 0,1 | 1680 X 70 | 150 x 80 | 1,9 x 0,5 |
| 2 | 0,7 - 0,2 | 1770 x 90 | 200 X 140 | 1,3 - 0,4 |
| 3 | 0,6 - 0,2 | 1700 x 100 | 60 x 250 | 1,1 x 0,5 |
| 4 | 0,6 - 0,2 | 2000 X 100 | 140 x 180 | 1,3 - 0,4 |
| 5 | 0,9 - 0,1 | 1810 X 60 | 160 x 80 | 1,4 - 0,3 |
| 6 | 0,8 - 0,1 | 1950 - 70 | 200 X 110 | 1,3 - 0,3 |
| 7 | 0,6 x 0,3 | 1700 X 200 | 260 X250 | 1,6 - 1,0 |
| 1 – 7 | 0,7 - 0,2 | 1900 - 100 | 100 x 100 | 1,1 - 0,2 |
Tabella 5: Risultati ottenuti da quattro adattamenti logistici di parametri applicati ai dati tipici di risposta alla dose. I dati di risposta alla dose utilizzati per l'analisi sono presentati nella Figura 2. L'intera gamma di concentrazione è stata applicata all'analisi per i singoli pozzi da uno a sette (Figura 2B) e per i dati medi ottenuti da pozzi da uno a sette (Figura 2D). Nessuno dei parametri della funzione logistica è stato fissato durante l'ottimizzazione del minimo quadrato. I risultati di adattamento sono stati arrotondati al decennio dell'errore, tranne se il valore è inferiore all'errore.
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Discussion
Questo protocollo descrive un metodo per le misurazioni di impeditto senza etichetta per determinare la relazione dose-risposta dell'attivazione GPCR indotta da agonisti in assenza o presenza di antagonisti specifici per lo stesso recettore. La prova di concetto di questo metodo è stata presentata in una recente pubblicazione12. Per quanto ne sappiamo, è il primo studio che descrive l'istituzione di una curva dose-risposta completa di attivazione GPCR mediata da agonisti utilizzando un singolo strato di cellula in vitro. L'approccio richiede inevitabilmente l'uso di approcci di monitoraggio cellulare privi di etichette e non sarà applicabile ai saggi degli endpoint.
Il protocollo è stato dimostrato sull'esempio delle cellule U-373 MG, che endogenamente esprimono il recettore dell'istamina 1 (hHR1) umano che viene stimolato con una serie di crescenti concentrazioni della sua istamina agonista endogena mentre l'impeto delle cellule viene continuamente registrata. Per dimostrare l'applicabilità del protocollo agli studi antagonisti, gli esperimenti sono stati ripetuti in presenza di una costante concentrazione di diphenhydramine, un antagonista competitivo all'hH1R. Le registrazioni di impedite sono state utilizzate con successo anche per studiare altri agonisti H1R (ad esempio, UR-KUM53011, dosing individuale e stepwise) e antagonisti (ad esempio, Mepyramine)12 oltre agli esempi mostrati qui. Inoltre, il protocollo è stato applicato anche ad altre linee cellulari e recettori, ad esempio CHO-D2R esprimendo il recettore D2 della dopamina (D2R) o BAEC che esprime il recettore -adrenergico2(z2AR)12 che indica che presenta uno schema generale per una generazione molto efficiente dei dati di risposta alla dose. Mentre le cellule U373-MG e BAEC esprimono i rispettivi recettori H1R e2AR a livelli endogeni, il CHO-D2R è un esempio per un modello cellulari ricombinante. Nel loro insieme, il protocollo seriale è in generale applicabile ai tipi di cellule con espressione GPCR endogena o ectopica, ai GPCR con diversi tipi di accoppiamento Gq (ad esempio, H1R), Gs (ad esempio, z2AR), Gi (ad esempio, D2R) e diversi tipi di ligando (agonist/antagago). In tutti quei tipi di cellule/recettori di cui sopra, l'impedimento aumenta con l'aumentare della concentrazione agonista. Tuttavia, alcune cellule rispondono all'attivazione di GPCR con una diminuzione impedibile. Abbiamo testato il protocollo per uno di questi casi (HaCaT/histamina) e abbiamo trovato anche una diminuzione graduale dipendente dalla concentrazione, sostenendo la nozione di un approccio generalmente applicabile che è anche compatibile con cambiamenti inversi impediti. È stato proposto che il corso temporale dettagliato dei dati di impedimento indichi il tipo di accoppiamento delle proteine G di un determinato recettore. Anche se il concetto è attraente, il pool dei nostri dati non supporta una regola generalmente applicabile che correla il profilo temporale impedibile all'accoppiamento delle proteine G di un determinato GPCR6.
Il protocollo di addizione seriale è adattabile a diversi tipi di layout di elettrodi e formati multi-pozzi. È applicabile ai sistemi di perfusione su chip, che è un vantaggio significativo rispetto a molti approcci basati su etichette che spesso richiedono uno strato cellulare per una concentrazione da testare. Di conseguenza, lo schema di dosaggio seriale può spianare la strada a studi di risposta alla dose in modelli biologici più complessi come organo su un chip o anche approcci umano su un chip. Le misurazioni impedite rilevano una risposta integrata e distale delle cellule all'attivazione del recettore che alla fine induce cambiamenti di morfologia cellulare. Questa lettura piuttosto generale e non specifica, ma anche imparziale, è la base per la sua ampia applicabilità che non è limitata ai GPCR, ma potrebbe funzionare anche per altre classi di recettori della superficie cellulare, recettori citoplasmici o persino proteine intracellulari come bersagli.
È fondamentale per il protocollo di addizione agonista passo modo passo per lavorare con strati cellulari confluenti sugli elettrodi, in quanto le colture sparse interferiranno con la sensibilità, la riproducibilità e l'interpretazione dei dati. Un ulteriore prerequisito per il monitoraggio riuscito dell'attivazione del recettore anche nei monostrati cellulari confluenti è un cambiamento nella forma delle cellule lungo la cascata di trasduzione del segnale. Se le cellule in studio non cambiano la loro morfologia lungo l'esperimento, le letture basate sulla danza sono cieche e non riferiranno su alcun cambiamento nell'attività dei recettori. Per il layout corretto del protocollo di addizione seriale, si consiglia di eseguire il pre-test iniziale in modalità convenzionale con una concentrazione di un pozzo per determinare approssimativamente l'intervallo di concentrazione dell'agonista e l'intervallo di tempo tra le successive aggiunte agonistiche. Gli intervalli di tempo tra le dosi sequenziali dell'agonista devono essere adattati in modo tale che il sistema adotti un nuovo equilibrio prima della dose successiva, più alta. Di conseguenza, il metodo può essere meno utile per i recettori che innescano una risposta molto rapida e solo transitoria delle cellule o una risposta molto lenta che può richiedere ore per completare. Quest'ultima situazione aumenterebbe il tempo totale dell'esperimento e richiederebbe che i protocolli di addizione paralleli si abbreviinino del tempo di laboratorio. Negli esempi presentati in precedenza, il tempo totale dell'esperimento era di 2,5 – 3,5 h, a seconda del numero di concentrazioni (8 o 10) e di una potenziale pre-incubazione con antagonista. Lo stesso esperimento nella modalità di addizione agonista parallela convenzionale richiederebbe solo 1 h per lo stesso modello di recettore cellulare, ma con una velocità effettiva molto minore. Un chiaro vantaggio dell'approccio seriale è che il numero di concentrazioni che devono essere testate per una relazione dose-risposta completa non è limitato dal numero di pozzi disponibili. Se sono necessarie concentrazioni agoniste più elevate, l'esperimento viene facilmente esteso e completato senza alcun lavoro aggiuntivo di coltura cellulare. L'addizione agonista stessa deve essere effettuata con attenzione, in quanto alcune cellule sono sensibili allo stress da taglio e rispondono con notevoli cambiamenti di impedimento semplicemente a causa della stimolazione meccanica imposta dalla manipolazione del liquido. Le cellule potrebbero anche staccarsi dall'elettrodo. Questo problema, tuttavia, non è unico per ostacolare il monitoraggio cellulare basato su, ma si applica anche ad altre tecniche. Per le cellule sensibili la modalità 1 è consigliata a causa della riduzione del carico meccanico sulle celle. Tuttavia, questa modalità opera con volumi di liquido più bassi durante l'aggiunta che aumenta il rischio di miscelazione incompleta poiché l'agitazione intensiva non è raccomandato per evitare risposte cellulari non specifiche.
La modalità di addizione 1 va di pari passo con un aumento graduale del volume totale nel pozzo, mentre la modalità 2 mantiene costante il volume totale poiché le stesse quantità di soluzione vengono rimosse in sequenza. Queste sono solo le due strategie estreme e potrebbero essere adattate per tipi di cellule speciali, formati multi-pozzo o layout di elettrodi in qualsiasi modo intermedio. Nel caso del modello U373-MG/H1R sono state osservate lievi differenze nei valori EC50 ed EMax per la modalità di addizione seriale rispetto alla modalità di addizione parallela convenzionale (seriale, N : 30: EC50: (0,8 x 0,3) - M, EMax: (1.9 - 0.2) k'; parallelo, N - 15: EC50: (0.5 0.2M, EMax: (1.3 - 0.3) kà), mentre altri modelli di cellule/recettori non hanno mostrato alcuna differenza. I cambiamenti in EC50 ed EMax valori potrebbero derivare dalla desensibilizzazione del recettore che è più probabile che si verifichi quando i recettori sono esposti all'agonista per tempi più lunghi. L'influenza di desensibilizzazione dipenderà fortemente dal recettore e dal ligando in fase di studio. Resta da chiarire se un'analisi dettagliata dell'aggiunta agonista seriale e parallela può fornire un nuovo mezzo per studiare la desensibilizzazione del recettore.
Si consiglia di eseguire un esperimento di controllo con l'aggiunta agonista in modalità parallela convenzionale al fine di testare potenziali cambiamenti nelle curve dose-risposta. Ulteriori controlli dovrebbero includere un campione trattato solo con un mezzo/solvente in dosi appropriate per svelare eventuali effetti dovuti al carico di solvente o allo stress meccanico su aggiunta media. Ciò diventa particolarmente importante se la soluzione di riserva del ligando viene preparata in altri solventi rispetto al mezzo (ad esempio, DMSO, etanolo). Quando si studia l'effetto di diversi ligandi, un agonista standard dovrebbe essere incluso come riferimento.
Le direzioni future dovrebbero riguardare unità di movimentazione automatica dei liquidi, che potrebbero consentire il dosamento o la titolazione completamente automatizzati. L'applicazione della modalità di aggiunta seriale nei sistemi di perfusione ha un grande potenziale per gli approcci lab-on-a-chip e organ-on a-chip, nonché per esperimenti eseguiti sotto stress da taglio liquido.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Barbara Goricnick e Nadja Hinterreiter per il loro aiuto nella coltura cellulare e nella preparazione di soluzioni sperimentali. Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno finanziario del Gruppo di formazione della ricerca 1910 "Chimica medicinale dei ligandi SElettivi di GPCR" finanziato dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) con il numero di sovvenzione 222125149. JAS è particolarmente grato per una borsa di studio concessa dal Programma bavarese per l'uguaglianza di genere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | |
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 - 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 - 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) | \ |
References
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