Summary
이 프로토콜은 라벨이 없는 임피던스 측정을 사용하여 단일 마이크로 전극에서 성장한 단일 세포 층으로부터 작용제 유발 GPCR 활성화에 대한 전체 용량 응답 관계를 실시간으로 기록하는 것을 보여줍니다. 새로운 도징 방식은 시간 해결 의 손실없이 처리량을 크게 증가시킵니다.
Abstract
라벨프리 임피던스 계 세포 계 세포 배양 실험에서 리간드 유도 GPCR 활성화를 비침습적으로 연구하는 데 점점 더 사용되고 있다. 이 접근 방식은 수십 밀리초까지 디바이스 에 의존하는 시간 해상도로 실시간 셀 모니터링을 제공하며 고도로 자동화되어 있습니다. 그러나, 샘플 수치가 높아지면(예를 들어, 다양한 리간드에 대한 투여량-응답 연구), 일회용 전극 어레이에 대한 비용뿐만 아니라 순차적 웰바이웰 레코딩에 대한 가용 시간 분해능이 제한될 수 있다. 따라서, 우리는 여기에서 라벨없는 GPCR 분석의 출력을 현저하게 증가시킬 가능성이 있는 직렬 작용제 추가 프로토콜을 제시합니다. 직렬 작용제 추가 프로토콜을 사용하여 GPCR 주작동근은 샘플의 임피던스(agonist 모드)를 지속적으로 모니터링하면서 단일 세포 층에 농도를 증가시키면서 순차적으로 추가됩니다. 이 직렬 접근법을 통해, 이제 단 하나의 단일 세포 층에서 GPCR 작용제에 대한 전체 투여량 응답 곡선을 확립할 수 있다. 직렬 작용제 첨가 프로토콜은 상이한 GPCR 커플링 유형, Gq Gi/0 또는 Gs에 적용 가능하며, 연구 하에 수용체의 재조합 및 내인성 발현 수준과 호환된다. GPCR 길항제에 의한 수용체 차단은 또한 평가할 수 있다(길항제 모드).
Introduction
본 보고서는 라벨프리 임피던스 측정에 의해 부착적으로 성장한 세포에서 리간드 유도 G 단백질 결합 수용체(GPCR) 활성화의 정량화를 위해 개발된 직렬 첨가 프로토콜에 대한 상세한 설명을 제시한다. G 단백질 결합 수용체(GPCRs)는 다수의 생리적 기능 및 인간 질환에 관여한다1. 이 것 및 세포 표면에 그들의 좋은 접근성 때문에, GPCRs는 가장 중요 한 약물 목표 중 하나입니다. 이 평가는 GPCR을 표적으로 하는 ~700의 승인된 약의 추정수에 반영됩니다, 모든 판매된 약에 ~ 35% 점유율에 해당2.
새로운 약물의 개발은 두 가지 중앙 프로세스로 구성됩니다 : (i) 생물학적 표적 분자의 식별 및 기능적 특성화, (ii) 새로운 납 물질의 발견 및 관리 가능한 약물로의 개발. 두 프로세스 에서, 효율적인 방법은 정량적으로 약물 표적 상호 작용 및 후속 생물학적 다운스트림 반응을 평가하는 데 필요합니다. 전 임상 약물 개발 과정의 다른 단계는 약물과 표적 간의 생체 분자 상호 작용 연구, 배양 세포에 대한 기능적 연구, 절제된 장기 물질 또는 전체 동물에 대한 실험에 이르기까지 다양한 분석 방법을 사용합니다. 둘 다, 생리적 중요성과 생물학적 복잡성은전자에서 후자3로 증가한다. 동물 실험을 최소화하는 것이 전반적인 목표이지만, 실험실 동물 또는 전체 동물의 고립 된 장기를 사용한 약리학 연구는 신약 후보물질의 포괄적 특성화에 불가피한 것으로 간주됩니다. 분석 판독의 관점에서, 장기 약리학 연구는 가장 높은 생리적 관련성의 원위, 통합 "전체론적"기능 적 반응을 제공합니다. 이러한 실험의 단점은 기술적 및 윤리적 이유에 대한 높은 처리량 스크리닝과 호환되지 않으며 체외 세포 배양에 기초한 연구에 의해 대체되었다는 것이다4.
세포 배양에서 GPCR 활성화를 정량화하는 방법은 상이한 라벨 기반 화학 분석을 포함하며, 이는 특히 제2 메신저, 다운스트림 신호 단백질의 인산화 상태, 특정 전사 인자 또는 리간드 유도 세포내 수용체 인신매매를 통한 전사 활성화를검출하는4,5. 이러한 라벨 기반 검사의 단점은 잠재적으로 유해한 염료 또는 방사성 마커로 세포를 라벨하는 필요성입니다. 이는 종종 선행을 지정해야 하는 노출 시간에 대한 엔드포인트 결정으로 분석기를실행해야 합니다. 라벨 기반 종점 분석을 사용 하 여 실험의이 매우 제한 되 고 편향 된 타이밍 및 화학 라벨 및 프로브 일반 세포 생리를 방해할 수 있는 위험에서 고통 – 잠재적으로 실험자에 의해 주목.
최근에는 GPCR 활성화를 모니터링하기 위한 라벨없는 검정법이 등장하고 있으며, 임피던스 기반 기술 또는 공진 도파관격자를적용하는 광학 적 방법 등5,6. 세포의 라벨링은 실험적으로 이러한 접근법에 필요하지 않습니다. 이러한 물리적 판독은 낮은 진폭 신호에서 작동하므로, 이러한 방법은 비침습적으로 간주되며, 잠재적으로 실시간으로 연속 적인 세포 모니터링을 허용하고 관찰 시간은 판독이 아닌 셀 배양에 의해서만 제한된다. 전체 기관에서 판독과 유사, 라벨없는 접근은 일반적으로 전체적인 세포 응답에 보고, 전체 신호 네트워크를 따라 통합 할 때 수용체 활성화의 멀리 하류는 시간 의존하지만 오히려 비특이적 인 변화로 이어질 세포 형태 또는 대량 재분배. 임피던스 계 측정은 세포 형상7,8의변화의 유전체 서명을 측정하는 반면, 공진 도파관 격자를 이용한 측정은 동적 질량 재분배(DMR) 9에서발생하는 세포 기판 계면에서굴절률의 변화에 민감하다. 통합 문자는 G 단백질의 유형 (Gq,Gi/0,Gs, G12/13)또는 β-arrestin 신호 캐스케이드6에 관여하는 수용체 매개 사건에 관계없이 매우 민감하고 수용체의 내인성 발현 수준에 매우 적합한 무첨가 방법을 만든다.
표준 라벨 프리 임피던스 계 분석에서 세포는 각 웰10의바닥에 증착된 코플라나 금막 전극을 가진 다중 웰 플레이트에서 부착적으로 성장한다. 이러한 전극 어레이는 임피던스 분석기와 연결되어 있으며 실험 자극에 대한 셀 응답은 시간 해결된 임피던스 판독값에 의해 개별 우물에서 기록됩니다. 전형적인 GPCR 분석에서 리간드가 각 개인에게 개별적으로 상이한 농도로 잘 첨가된다. 임피던스 시간 코스에서 리간드-유도 변화는 리간드의 효능 및 효능을 정량화하기 위해 최대 신호 변화, 곡선 아래 영역, 지정된 시간 간격 또는 곡선의 기울기 내의 신호 변화와 같은 특성 곡선 특징에 대하여 분석된다(11).
전극 어레이의 비용은 높은 처리량 스크리닝(HTS) 캠페인에서 이 기술의 적용을 제한할 수 있습니다. 더욱이, 병렬로 따라야 할 샘플의 수가 증가함에 따라 개별 측정의 수가 증가하고, 따라서 각 웰에 대한 사용 가능한 시간 분해능을 점차적으로 감소시킵니다 - 심지어 최첨단 멀티 채널 기록의 경우에도 마찬가지입니다. 이러한 조건하에서 빠르고 과도적인 세포 반응은 측정을 피할 수 있다. 또한, 종래의 웰-하나의 집중 접근법은 리간드-GPCR 상호작용 분석에서의 적합성과 관련하여 관전된 오르간 온 칩 또는 바디 온 칩 개발에 상당한 시간과 비용 계수를 부과한다.
이러한 이유로, 우리는 주작동근 농도가 단계적으로 증가하는 동안 단일 웰의 임피던스를 지속적으로 모니터링하여 배양 된 세포 단층에서 리간드 유도 GPCR 활성화의 전체 용량 응답 곡선의 기록을 가능하게하는 단계적 투약 프로토콜을 개발했습니다. 직렬 작용제 첨가 프로토콜은 히스타민 1 수용체(H1R)를 내인성으로 발현하는 인간 U-373 MG 세포의 현재 예에 나타난 바와 같이, 1농도에서 10개 이상의 농도로 웰당 처리량을 크게 증가시킨다. 따라서, 이 방법은 라벨없는 투여 량 응답 연구에서 처리량을 크게 향상시킬 수있는 잠재력을 가지고 있으며, 시간 해상도는 도구 최대값으로 유지됩니다.
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Protocol
1. 전극 어레이의 셀 시딩
참고: 전극 레이아웃 선택은 연구 중인 셀수의 민감도와 수 간의 절충입니다. 전극이 작을수록 측정값이 더 민감하지만 연구 중인 셀 수가 작아지다. 기준 선 조건 하에서 시간이 지남에 따라 강한 임피던스 변동을 보이는 셀의 경우 더 크거나 디지털화된 전극이 바람직합니다.
- 37°C 수조에서 표준 셀 패싱 및 파종에 필요한 모든 용액을 미리 데우면 됩니다. 인간 U-373 MG 세포를 가진 분석의 경우: 칼슘과 마그네슘이 없는 인산완충식염수(PBS), 0.05% (w/v) 트립신, 세포 배양 배지(이글의 최소 필수 배지(EMEM)는 5% (v/v) 태아 송아지 혈청(FCS), 2 mML-글루타민 및 100 μg/mL 페니실린/스트렙토마이신으로 보충되었습니다.
- 종래의 세포 배양 플라스크 또는 접시의 바닥에 자란 스톡 배양의 세포층을 PBS로 2회 헹구는다.
- PBS를 제거하고 트립신 용액 (25 cm2에대한 1 mL)을 추가하고 세포가 37 °C에서 5 분 동안 배양하게하십시오 (U-373 MG 세포에 적용됨).
- 현미경 검사법에 의해 성장 기판의 바닥에서 세포의 완전한 분리에 대한 제어.
- 세포현탁액에 트립신 1mL당 9 mL의 세포 배양 배지를 추가하여 세포가 완전히 분리되는 즉시 트립신 반응을 중단한다. 현탁액을 기판 위에 파이펫팅하여 세포 배양 기판의 바닥에서 남은 세포를 조심스럽게 헹구는다.
- 피펫으로 셀 현탁액을 수집하고 원심 분리 튜브 (15 mL 또는 50 mL 튜브)로 옮긴다.
- 실온에서 10 분 동안 110 x g에서 원심 분리하여 세포를 회전시면 됩니다.
- 조심스럽게 상류를 제거하고 세포를 세기 전에 배양 배지에서 세포 펠릿을 철저히 다시 일시 중단하십시오 (예 : 위상 대비 현미경 및 수동 계수에 대한 혈수측정기를 사용하여).
- 셀 현탁액을 원하는 셀 밀도로 조정합니다. U-373 MG 세포를 사용한 실험의 경우, 100 000세포/cm2를 사용하여 48시간 이내에 동봉된 세포 층을 성장시다. 이것은 ~ 0.8 cm2의 성장 면적과 400 μL의 잘 부피와 8 웰 전극 배열에 대한 200 000 셀 / mL의 세포 밀도로 변환합니다.
참고: 재현 가능한 GPCR 활성화 실험을 위해, 세포는 전극 배열에 결합된 단층으로 성장되어야 합니다. 세포 표면에 적절한 수용체 발현을 보장하기 위해, 세포는 실험을 수행하기 전에 적어도 36 시간 씨를 뿌리고야 한다. 세포 시종에 대한 다른 세포 밀도를 테스트하는 것은 종종 최고의 실험 조건을 식별하는 의미가 있습니다. - 전극 어레이의 우물에 셀 현탁액을 추가하고 웰의 바닥에 셀의 균일 한 분포를 보장하기 위해 10 - 15 분 동안 실온에서 정착 판매하자.
- 37°C및 가습된 분위기에서 5%CO2(배지 유형에 의존)를 가진 표준 세포 배양 인큐베이터에서 적어도 36시간 동안 세포를 성장시켰다. 실험 전에 세포 배양 배지 24h를 변경하였다.
- 실험 당일, 전극 어레이의 세포 층을 (위상 대비) 현미경검사법으로 검사하여 세포로 전극을 완전히 커버합니다.
2. 혈청이없는 배지에서 세포의 평형화
- 이 연구에서 는 미리 따뜻한 세럼이 없는 배지: 라이보비츠의 L15 배지.
- 전극 어레이에서 자란 세포에서 세포 배양 배지를 제거하고 미리 데운 무혈청 배지로 대체하십시오. 8웰 포맷 전극 어레이에는 200 μL, 96웰 전극 어레이에는 150μL을 사용합니다.
- 세포가 적어도 2 시간 동안 37 °C에서 무혈청 배지에서 평형화시키십시오. 평형 시간은 셀 유형에 따라 크게 달라집니다. 예를 들어, U-373 MG 세포는 2h, CHO 세포는 4h, BAEC는 L-15 배지에서 하룻밤 평형을 필요로 할 수 있다.
참고: L-15 배지는CO2독립적이며 CO2-free분위기가 필요합니다. L-15의 평형을 위해 인큐베이터를 0 %CO2로설정합니다. 평형은 임피던스 판독값으로 모니터링할 수 있으며, 첫 번째 실험에서는 이를 수행하는 것이 좋습니다.
3. 임피던스 판독값으로 셀 평형 모니터링
- 전극 어레이를 임피던스 분석기의 연결 어레이 홀더에 넣습니다.
- 전극과 임피던스 분석기 간에 적절한 낮은 임피던스 접촉을 보장합니다. 이 검사는 기기마다 개별적으로 다릅니다.
참고: 기기가 전극에 연결하지 못하면 접점 클램프를 다시 열고 홀더 내부에 적절한 위치를 지정하기 위해 전극 어레이를 다시 조정하고 다시 시도하십시오. - 소프트웨어의 사용자 인터페이스에서 전극 유형 및/또는 다중 웰 형식을 선택합니다.
- 측정 매개 변수를 설정합니다. 다양한 옵션을 사용할 수 있습니다.
참고: 가장 민감한 AC 주파수를 선택하려면 연구 중인 전극 레이아웃 및 셀 유형에 따라 다르므로 문헌 및 계측기 매뉴얼을 참조합니다. 일반적으로 감지 주파수는 4kHz – 50kHz 의 범위에 있습니다. 여기서, U-373 MG 세포는 직경 250 μm의 원형 작동 전극상에서 성장하였고 12 kHz의 AC 주파수에서 모니터링하였다.- 단일 및 다중 주파수 데이터 수집 모드를 사용할 수 있는 경우 단일 주파수 모드를 선택하여 최대 시간 해결을 보장합니다. 측정은 이 단일 주파수에서 수행됩니다. 가장 널리 퍼진 계측기의 경우 사용 가능한 주파수 창을 따라 미리 설정된 주파수가 많이 있습니다.
- 스터디 중인 웰 수가 적거나 시간 해상도가 중요하지 않은 경우 대신 여러 주파수 레코딩을 선택합니다. 지정된 수의 주파수에서 임피던스 판독값이 나중에 심층 분석을 위해 모든 웰에 대해 기록됩니다.
참고: 웰당 기록된 주파수 수가 증가하고 웰 수가 증가함에 따라 시간 해상도가 감소합니다. 주파수 및 데이터 수집 모드 선택 옵션은 계측기 유형 및 버전에 따라 다릅니다.
- 시간 코스 데이터의 수집을 시작합니다.
- 임피던스가 안정화될 때까지 세포층 임피던스(적어도 2시간)를 따릅니다. 그 동안, 주작동근 솔루션을 준비합니다.
- 세포 층이 안정한 임피던스 수준에 도달하면, (i) 동일한 실험 내에서 직렬 작용제 첨가를 진행하거나 (ii) 데이터 수집을 종료하고 작용제 유도 수용체 활성화를 모니터링하기 위한 새로운 데이터 세트를 시작한다.
4. 주작동근 모드에서 실험을위한 주작동제 솔루션 준비
- 수학식 1에 따라 직렬 투약의 각 단계에 필요한 주작동근 용액의 농도를 계산합니다. n 범위는 1에서 총 직렬 첨가 수 i. x는 단계 n. y에서 웰내의 농도 및 부피를 나타내며, 단계 n에서 "용액-첨가될"의 농도 및 부피를 나타낸다.
참고: 복제 수를 고려하고 각 농도 단계에 대한 "솔루션-추가"의 총 볼륨을 계산합니다. 일반적인 계산 결과는 표 1-4에표시됩니다. 상기 범위가 직렬 첨가 동안 투여될 부분의 농도 및 수를 정의함에 따라 연구될 작용제 농도 범위에 대한 일반적인 아이디어가 필요하다. 직렬 작용제 첨가 프로토콜을 사용하여 작용제 농도가 단계적으로 증가한다. 따라서, 다음 투여량이 첨가될 때 이미 웰에 있는 작용제의 양을 고려해야 한다. 웰내에 이미 존재하는 작용제 분자의 수가 nx=c x∙V x(현재 농도 cx 및 부피 Vx)이고다음 첨가 후 웰 내의 분자 수가 nx+y인경우,ny를 첨가할 분자의 수는 웰에 적용될 용액의 농도 cy 및 부피Vy에 의해 결정된다(ny=c y.y). 주 작동 근의 일부를 추가 한 후, 웰에 있는 작용제 분자의 새로운 양은: cx+y ∙ Vx+y = c+V + cy ∙ Vy. 이 계산은 각 후속 단계에 적용됩니다. 각 단계마다 첨가되는 부분의 아고니스트 농도및 아고니스트의 양이 상호 의존하기 때문에, 각 단계 마다 미리 최종 농도를 정의하는 것이 중요하다.
모드 1: 액체가 지속적으로 첨가됨에 따라 우물의 부피가 각 단계마다 증가합니다.
이 모드와 8웰 형식을 사용하여 Vx1 = 200 μL 및 Vy1을 사용합니다....
모드 2: 각 단계에 추가된 볼륨이 후속 추가 직전에 제거됨에 따라 웰의 볼륨은 일정합니다.
이 모드와 96웰 형식을 사용하여 Vx1 = 150 μL 및 Vy1을 사용합니다.... Vyi = 75 μL.
- 농도당 총 부피와 파이펫팅에 대한 자세한 지침으로 데이터 시트를 인쇄합니다.
- 필요한 양으로 모든 솔루션을 준비합니다. 세포의 평형에 사용되는 것과 동일한 혈청이없는 배지에서 모든 작용제 용액을 확인하십시오.
주의: 히스타민 디하이드로클로라이드는 2012년 미국 산업안전보건청(OSHA) 위험 통신 표준(29 CFR 1910.1200)에 의해 유해한 것으로 간주됩니다. 히스타민은 피부 자극, 심각한 눈 자극을 일으키며, 흡입시 알레르기 성 피부 반응, 알레르기, 천식 증상 또는 호흡 곤란을 유발할 수 있으며 호흡 자극을 일으킬 수 있습니다. 안전 데이터 시트를 고려하십시오.
참고: 아고니스트 솔루션을 가능한 한 신선하게 만드십시오. 용액의 작용제의 안정성은 상당히 다를 수 있습니다. 실험에서 사용할 때까지 용액을 4°C 이하로 보관하십시오. 일부 분자에 대 한 추가 안정화 첨가제, 펩 티 드 기반 또는 지질 기반 분자를 사용 하는 경우 BSA 처럼, 우물과 튜브의 벽에 흡착을 방지 하기 위해 간주 될 수 있습니다. - 96웰 형식으로 실험을 수행하는 경우, 용액을 기존의 96웰 플레이트(전극 없음)로 전달하고 8-(또는 12-) 채널 파이펫을 사용하여 전극 어레이로 의 신속한 액체 전달을 수행하였다.
5. 길항제 모드에서 실험을위한 주작동근 솔루션의 준비
참고: 전체에 적용할 농도로 길항제 용액을 준비합니다. 길항제 용액의 부피 와 농도는 작용제 첨가 모드 (1 또는 2)에 따라 달라집니다. 추가 모드에서 8-웰 또는 96 웰 포맷의 실험예:(A) 8웰 포맷(Vx1 = 200 μL, V길항제 = 200μL); (B) 96 웰 포맷 (Vx1 = 150 μL, V길항제 = 75 μL).
- 4.1단계에서 설명한 바와 같이 직렬 투약의 각 단계에 필요한 각 작용제 용액의 농도를 계산합니다.
- 세포의 평형화에 사용되는 것과 동일한 혈청없는 배지에서 모든 작용제 용액을 만들고 실험에서 각각의 웰에 대해 계획된 것과 동일한 최종 농도로 길항제를 추가하십시오.
참고 : 이 경우 히스타민 스톡 솔루션 (10mM)은 L-15 배지로 제조됩니다. 작용제가 다른 용매(예를 들어, 디메틸 설폭시드(DMSO) 에 용매에 용해될 때, 에탄올 은 첨가의 각 단계에서 증가하는 용매 부하를 설명하기 위해 포함되어야 한다.
6. 주작동근 모드에서 직렬 추가 프로토콜 수행
- 3.1 – 3.5 단계에 설명된 대로 데이터 수집을 시작합니다.
- 사용 전에 사용 하기 전에 약 10 - 15 분 전에 인큐베이터에 배치 하 여 주 작동 근 솔루션을 미리 따뜻하게.
참고: 열 연무 물질을 사용할 때, 용액은 37 °C에서 너무 오래 보관해서는 안 됩니다. 10-15분 동안 사전 온난화가 중요한 것으로 간주되는 경우, 수조에 추가하기 직전에 37°C로 용액을 가져오십시오. - 선택한 추가 모드에 따라 주작동근 시리얼 투약을 실행합니다. 다음 모드 1은 다음 투여량의 각 첨가에 따라 웰의 총 부피가 증가한다. 모드 2각 단계와 함께 추가되는 동일한 볼륨도 다음 더 높은 용량을 추가하기 직전에 다시 제거됩니다.
참고: 두 개의 후속 작용제 투여 사이에 세포 층의 평형화에 필요한 시간은 세포의 반응 시간에 따라 달라집니다. 병렬 모드에서의 초기 실험(1웰 – 1농도)은 (i) 다른 작용제 농도에 대한 세포 응답 시간을 밝히고 (ii) 가장 민감한 곡선 파라미터(예: 임피던스 최대, 시간 x 이후 임피던스)를 나타냅니다.
A : 모드 1 / 8 웰 형식
- 혈청이 없는 배지의 200 μL에서 평형화된 세포에 작용제의 가장 낮은 농도로 첫 번째 용액의 30 μL을 첨가하였다.
- 세포가 미리 정의된 기간(예를 들어, 15분)에 반응하고 평형화하도록 한다.
- 다음 농도로 두 번째 용액의 30 μL을 추가합니다.
- 6.3.1-6.3.3 단계를 세 번째, 네 번째 등으로 반복하여 주작동근 용액을 반복합니다.
참고: 10개의 농도 단계로 작업하면 실험이 끝날 때 총 500 μL의 부피가 발생하며, 이는 ~ 550 μL의 이 웰의 최대 적용 가능한 부피 바로 아래에 있습니다.
B : 모드 2 / 96 웰 형식
참고: 96웰 형식으로 실험을 실행할 때 임피던스 계측기의 소프트웨어를 통해 각 액체 처리 단계(추가/제거)에서 데이터 수집을 일시 중지합니다. 보다 정교한 액체 처리는 데이터 수집을 방해할 수 있습니다. 다중 채널 파이펫을 사용합니다.
- 데이터 수집을 일시 중지합니다.
- 혈청이 없는 배지의 150 μL에서 평형화된 세포에 작용제의 가장 낮은 농도를 가진 첫번째 용액의 75 μL을 추가합니다.
- 데이터 수집을 다시 시작합니다.
- 세포가 미리 정의된 기간(예를 들어, 15분)에 반응하고 평형화하도록 한다.
- 일반 평형 시간이 끝나기 약 1 - 2 분 전에 측정을 일시 중지하고 각 우물에서 75 μL을 제거하십시오.
참고: 솔루션을 제거해야 하는 시점은 병렬로 모니터링되는 웰수와 파이펫팅 속도에 따라 달라집니다. 솔루션을 제거하는 데 필요한 시간은 후속 단계 사이의 시간을 초과해서는 안 됩니다. - 다음 농도로 두 번째 용액의 75 μL을 추가하고 측정을 재개합니다.
- 6.3.8-6.3.10 단계를 세 번째, 네 번째 등으로 반복하여 주작동근 용액을 반복합니다.
7. 길항 모드에서 직렬 추가 프로토콜 수행
- 3.1단계 - 3.5단계에 설명된 대로 측정을 시작합니다.
- 세포 층의 평형 동안 길항제 용액을 준비하십시오 (예를 들어, L15 배지에서 1.5 μM 디펜히드라민 염산염의 200 μL).
주의: 디펜히드라민 염산염은 급성 건강에 잠재적인 영향을 미칩니다. 삼키거나 흡입하면 유해하며 눈과 피부 자극을 유발할 수 있습니다. 그것은 호흡기 와 소화 관 자극을 일으킬 수 있습니다. 안전 데이터 시트를 고려하십시오. - 세포 배양에 첨가하기 전에 약 10-15분 전에 배양기체에 배치하여 길항제 및 작용제 용액을 미리 따뜻하게 한다(6.2 참조). 길항제없는 우물도 분석에 포함되어 있는 경우, 또한 미리 따뜻한 혈청이없는 매체.
- 지정된 우물에 길항제 용액을 추가합니다. 세포가 길항제와 15 - 20 분 동안 평형화시키십시오. 길항제가 없는 우물이 포함되어 있다면, 이 우물에 동일한 양의 무혈청 매질을 추가하십시오.
- 모드 2의길항제 추가에 따르면, 우물에서 용액을 제거
(A) 8웰 포맷(200 μL)
(B) 96웰 포맷(75 μL) - 6.3단계에서 설명한 바와 같이 작용제 첨가 서열을 실행한다.
8. 데이터 내보내기 및 분석
- 임피던스 계측기의 소프트웨어를 사용하여 데이터를 내보내 독점에서 기록된 모든 데이터를 공통 데이터 형식(예: csv)으로 변환합니다. 이 단계를 통해 다른 소프트웨어 패키지와 함께 데이터를 재구성하고 프레젠테이션할 수 있습니다.
- csv 형식의 데이터를 과학 데이터 분석 소프트웨어에 로드합니다.
- 주작동근 솔루션을 처음 추가하기 전에 마지막 데이터 요소의 임피던스를 빼고 t = 0에 추가시간을 설정하여 임피던스 값을 정규화합니다. 정규화된 임피던스의 시간 과정을 플로팅합니다.
- 개별 시간 코스를 플로팅하고 각 추가 단계 후에 임피던스에서 최대를 식별합니다. 이러한 값으로 데이터 시트를 작성합니다.
- 주작동근 농도의 함수로 최대값(또는 해당되는 경우 최소) 임피던스 변경 값을 플로팅합니다. 이것은 개별 우물 또는 평균 (평균 ± SD)에 대해 수행 할 수 있습니다.
- 데이터 피팅 루틴을 사용하여 4개의 파라미터 로지스틱 모델(수학식 2)을 사용하여 반최대 유효 농도(EC50)및 최대 응답(EMax)을결정합니다.
참고: c는 작용제 농도를 나타내고,A1은 최소이고 A2는 지그모이드 투여량-반응 곡선의 최대 점근수(A2 = E Max)이다. EC50은 곡선의 변곡점에서의 농도이며, n은 언덕 경사에 해당한다.
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Representative Results
다양한 주작동근 용액을 준비하기 위한 전형적인 계획은 표 1-4에서히스타민과 함께 8웰 전극 어레이를 이용한 실험에 대해 도시된다. 표 1 및 표 2는 추가 모드 1(cf., 도 1)을사용하여 실험에 대한 부피 및 농도를 제시하고, 표 3 및 표 4는 추가 모드 2(참조, 도 1)에따른 실험에 대한 부피 및 농도를 제시한다. 데이터는 방정식 1을 사용하여 계산되었습니다.
대표적인 실험은 히스타민을 아고니제로서 사용하여 직경 250 μm의 작동 전극을 가진 8웰 전극 어레이에서 자란 히스타민 1 수용체를 내생적으로 발현하는 U-373 MG 세포의 동시층에 대해 도 2에 나타났다. 측정은 12 kHz의 단일 주파수에서 수행되었다. 주작동근 농도 계열의 첨가는 모드 1에따라 수행되었다. 선택된 실험에서 10개의 해법은 히스타민 농도를 증가시키고(4단계에 따라 제조됨) 15분마다 순차적으로 첨가하였다(도2A). 직렬 도징 방식은 8개의 우물 중 7개에 적용되었습니다. 1개의 잘 작용제 없는 배지(L-15)에서 10단 중 9단계에서 음의 대조군으로서 순차적으로 첨가하였다. 이 대조군의 마지막 첨가는 웰에서 100 μM 히스타민의 최종 농도를 제공하는 히스타민 용액이었다. 데이터는 데이터 분석 소프트웨어로 플롯되었으며 임피던스 변경 Δ| Z | 실험을 따라 12 kHz/kΩ, 임피던스 변경 및 첫 번째 추가의 시간 포인트가 0으로 설정됨. 2시간의 실험 버퍼에서의 초기 평형 시간은 이 플롯에 도시되지 않는다. 주작동근 추가시간 포인트는 화살표로 표시됩니다.
각 농도 단계 후 기준선을 기준으로 임피던스의 변화는 데이터 커서를 사용하여 곡선으로부터 추출되었다. 명확한 최대치가 없는 단계에서는 다음 추가 이전의 마지막 데이터 포인트가 분석에 사용되었습니다. 임피던스 변경 Δ | Z | 12 kHz는 히스타민 농도(cx+y)의함수로서 플롯되었다(도2B,기호). 4개의 파라미터 로지스틱 모델(8.6단계 참조)의 전달 함수를 7개의 웰로부터의 실험 데이터 포인트에 장착하였다(도2B,라인). 맞춤 결과는 표 5에나와 있습니다. 도 2C 및 도 2D는 도 2A 및 도 2B의데이터를 평균화한 결과를 나타내고, 7개의 웰에 대한 평균 ±SD를 제시한다. 평균 시간 코스 데이터는 그림 2C로요약되어 있는 반면 평균 용량-응답 곡선은 그림 2D에제공됩니다.
도 2B,D에도시된 바와 같이 투여량-반응 관계에서, 피팅 절차는 EC 50=(0.86±0.13) μM을 반환하는 전체 농도 범위에 적용되었다. 임피던스 반응은 마지막 두 농도 단계(30 μM, 100 μM 최종 농도)를 제외하고 히스타민 농도를 증가시키면서 단조롭게 증가한다. 이 반응은 아마도 히스타민 수용체의 하향 조절, 탈감작 또는 세포의 과잉 자극에 의해 설명된다 (토론 참조). 이러한 효과를 설명하기 위해, 도 2에도시된 데이터로부터 선택된 하나의 일련 투약 실험(도3;well 1)에 대해 도시된 바와 같이 분석용 데이터 범위가 감소하였다. 더욱이, 0 μM 히스타민에 대한 반응에서 임피던스 변화가 없다고 가정하는 최소 정사각형 최적화 동안 낮은 점근(A1)을 0으로 설정하는 것은 잘 정당화된다. 이러한 3가지 파라미터 최적화를 적용하면 EC50의 (0.75±0.12) μM(cf., 도 3B)을제공한다. EC50 값은 데이터 분석 모드 중 하나에 대해 민감하지 않은 것으로 나타났으며 크게 다르지 않았습니다.
96웰 플레이트 실험에 대한 일반적인 결과는 도 4에요약되어 있다. U-373 MG 세포는 전술한 바와 같이 96웰 전극 어레이상에서 성장하였다. 32개의 웰이 측정에 포함되었다. 8 개의 우물은 매체에만 노출된 주작동근없는 컨트롤로 사용되었습니다. 24개의 웰은 일련의 히스타민 농도를 계산하고 추가 모드 2에 대해 제조된 증가를 실시하였다. 임피던스 변경 의 시간 과정은 그림 4 A에서모든 32 개의 개별 우물에 대해 표시됩니다. 곡선 중 하나(빨간색으로 강조 표시)는 비정상적인 시간 코스를 보여 주며 추가 분석에서 제외되었습니다. 따라서, 도 4B에서23개의 웰로부터의 데이터를 평균화하고 평균 임피던스 변화(평균 ±SD)의 시간 과정으로서 플롯하였다. 각각의 개별 곡선은 투여량-반응 관계에 대해 전술한 바와 같이 분석되었다. 데이터 포인트는 최종 히스타민 농도의 함수로서 평균화되고 플롯되었다(도4C). 투여량-응답 데이터는 4개의 파라미터 로지스틱 모델을 통해 분석되었고, 이는 평균 EC50 값(1.0±0.3)을 μM으로 반환하였다.
길항제 모드에서 직렬 작용제 추가 프로토콜에 대한 일반적인 결과는 그림 5에나와 있습니다. 여기서, 1개의 웰을 히스타민 수용체 길항제 디펜히드라민(적색 곡선)의 0.75 μM으로 전처리하였고, 제1 히스타민이 첨가되기 20분 전에(도 5A). 컨트롤은 길항제 없는 매체(파란색 곡선)를 받았습니다. 길항제는 모드 2다음에첨가되었으며, 이는 아고니스트 시리즈가 적용되기 전에 최종적으로 400 μL의 200 μL이 제거되었다는 것을 의미한다. 상기 실시예에 기재된 바와 같이 작용제(히스타민)가 연속 투약 모드 1에 따라 첨가되었다. 길항제 모드의 실험은 실험의 전체 시간 과정에 걸쳐 길항제 농도가 일정하게 유지되는 것이 중요합니다. 따라서, 웰에 첨가된 모든 작용제 용액은 또한 미리 정의된 길항제 농도(이 경우, 0.75 μM)를 포함해야 하며, 대조군은 길항제 없이 유지되어야 한다. 길항 효과는 세포 반응을 유도하는 데 필요한 더 높은 작용제 농도에 대응하는 직렬 투약 방식 내에서 임피던스의 "지연된" 증가에 의해 명백해진다. 투여-반응 관계에서 길항제의 효과는 EC50의증가에 상응하는 곡선의 우측 시프트로서 표현되며, 길항제는 작용제에 비해 경쟁적인 리간드(도5B)이다. 상기 EC50은 그 존재에서 길항제 및 (14.7±0.6)의 부재시에 (0.92±0.05) μM으로 결정하였다.
그림 1: 직렬 작용제 추가 모드. (A)농도 계산을 보여주는 회로도. 농도 cy 및 볼륨 Vy의 작용제 용액을 볼륨 Vx 및 주작동근 농도 cx와잘 추가함으로써, 볼륨이 Vx +y로 증가하고 농도가 cx +y로증가합니다. (B)직렬 작용제 추가를위한 두 가지 모드. 모드 1: 웰 Vx+y의 총 볼륨은 추가될 때마다 증가합니다. 모드 2: 각 농도 단계에서 추가된 부피는 다음 투여량이 추가되기 전에 다시 제거되어 총 부피가 일정하게 유지됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 8웰 형식의 일반적인 실험 결과입니다. (A)직경 250 μm의 원형 작동 전극상에서 자란 U-373 MG 세포 층을 위해 12 kHz에서 임피던스 변경의 시간 과정. 히스타민의 8개의 우물 연속 첨가 중 7개가 적용되었다. 1개의 웰(grey curve)은 100 μM 히스타민이 양성 대조군으로 첨가되었을 때마지막 단계를 제외하고, 각 단계(모드 1)에서 히스타민이 없는 완충제와 순차적으로 적재되었다. (b)각 농도 단계 후 7개의 개별 웰에 대한 기준선에 대한 최대 임피던스 변화로부터 생성된 투여량-반응 관계. (C)임피던스 변화(평균 ±SD)의 평균 시간 과정은(A)에도시된 바와 같이 7개의 개별 우물에서 생성된다. (D)(B)에도시된 바와 같이 개별 데이터 세트에서 생성된 평균 용량-응답 관계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 데이터 분석 모드의 적응. (A)직경 250 μm의 원형 작동 전극에서 자란 단일 동시 U-373 MG 전지 층에 대해 12 kHz에서 임피던스 변화의 전형적인 시간 과정. (b)각 농도증가 후 기준선에 대한 최대 임피던스 변화로부터 생성된 실험용량-반응 관계(채워진 심볼). 전체 데이터 세트는 피팅 절차(검정 및 회색 곡선) 또는 수용체 탈감작 및/또는 내재화의 발병을 나타내는 마지막 데이터 포인트를 실시하였고 정량 분석(적색 및 마젠타 곡선)에서 생략되었다. 네 개의 파라미터는 모두 최소 제곱 최적화(검정 및 적색 곡선) 또는 하부 점액을 나타내는 파라미터 A1 동안 조정되었고, 0(회색 및 마젠타 곡선)으로 설정되고 고정되었다. EC50 값은 두 데이터 분석 모드에 대해 크게 다르지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 96웰 형식의 일반적인 실험. (A)96웰 전극 어레이상에서 성장한 U-373 MG 세포층을 위해 12 kHz에서 측정된 임피던스 변화의 시간 과정. 32개의 웰에 대한 데이터가 표시됩니다. 24개의 웰은 각 단계 사이에 15분의 평형 시간으로 추가된 일련의 히스타민 농도를 증가시킴을 겪었다. 빨간색으로 강조 표시된 곡선은 평균에서 제외되었습니다. 8개의 웰(대조군)을 첨가할 때마다 히스타민이 없는 배지로 처리하였다. (B)히스타민 시리얼 첨가 및 8개의 제어웰(A)에대한 응답으로 23개의 개별 웰에 대한 평균 임피던스 변화의 시간 과정. (c)각 농도 증가 후 기준선에 대한 최대 임피던스 변화로부터 생성된 평균 투여량-응답 관계(평균 ±SD). 데이터는 4개의 파라미터 로지스틱 함수를 장착했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 길항제 모드에서의 일반적인 실험. (A)히스타민 수용체 길항제 디펜히드라민의 유무에 관계없이 히스타민의 농도가 증가하면 직경 250 μm의 원형 작동 전극상에서 자란 U-373 MG 세포층에 대해 12 kHz에서 임피던스 변화가 진행된다. 디펜히드라민(0.75 μM) 또는 길항제 없는 배지(L15)를 작용제 연쇄 투약이 시작되기 20분 전에 첨가하였다. (b)(A)에 도시된 데이터로부터 각 농도증가 후 기준선에 대한 최대 임피던스 변화로부터 생성된 투여량-응답 관계. 0.75 μM 디펜히드라민의 존재는 EC50을 (0.92±0.05) μM에서 (14.7±0.6)로 증가시켰습니다.
| 솔루션 # | cx+y(μM) | c x(μM) | V x(μL) | Vx+y(μL) | Vy (μL) | cy (μM) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 230 | 30 | 0.08 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 230 | 260 | 30 | 0.79 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 260 | 290 | 30 | 2.03 |
| 4 | 1 | 0.3 | 290 | 320 | 30 | 7.77 |
| 5 | 3 | 1 | 320 | 350 | 30 | 24.33 |
| 6 | 10 | 3 | 350 | 380 | 30 | 91.67 |
| 7 | 30 | 10 | 380 | 410 | 30 | 283.33 |
| 8 | 100 | 30 | 410 | 440 | 30 | 1056.67 |
표 1: 추가 모드 1 다음에 8웰 전극 어레이를 사용하는 실험에 대한 농도 계산 체계.
| 솔루션 # | cy (μM) | Vy (μL) | 에서 확인 | c (μM) | 희석 계수 | 총 V(μl) 만들기 | 사용(μl) | V(μl) 추가 |
| 1 | 0.08 | 30 | 3 | 2.03 | 26.52 | 600 | 22.6 | 577.4 |
| 2 | 0.79 | 30 | 4 | 7.77 | 9.83 | 600 | 61 | 539 |
| 3 | 2.03 | 30 | 5 | 24.33 | 11.97 | 600 | 50.1 | 549.9 |
| 4 | 7.77 | 30 | 6 | 91.67 | 11.8 | 600 | 50.8 | 549.2 |
| 5 | 24.33 | 30 | 7 | 283.33 | 11.64 | 600 | 51.5 | 548.5 |
| 6 | 91.67 | 30 | 8 | 1056.67 | 11.53 | 600 | 52.1 | 547.9 |
| 7 | 283.33 | 30 | 8 | 1056.67 | 3.73 | 600 | 160.9 | 439.1 |
| 8 | 1056.67 | 30 | 10 mM 주식 | 10000 | 9.46 | 800 | 84.5 | 715.5 |
표 2: 추가 모드 1 에 이어 8웰 전극 어레이를 사용하는 실험을 위한 파이펫팅 방식.
| 솔루션 # | cx+y(μM) | c x(μM) | V x(μL) | Vx+y(μL) | Vy (μL) | cy (μM) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 400 | 200 | 0.02 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 200 | 400 | 200 | 0.19 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 200 | 400 | 200 | 0.5 |
| 4 | 1 | 0.3 | 200 | 400 | 200 | 1.7 |
| 5 | 3 | 1 | 200 | 400 | 200 | 5 |
| 6 | 10 | 3 | 200 | 400 | 200 | 17 |
| 7 | 30 | 10 | 200 | 400 | 200 | 50 |
| 8 | 100 | 30 | 200 | 400 | 200 | 170 |
표 3: 추가 모드 2 에 이어 8웰 전극 어레이를 사용하는 실험에 대한 농도 계산 체계.
| 솔루션 # | cy (μM) | Vy (μL) | 에서 확인 | c (μM) | 희석 계수 | 총 V(μl) 만들기 | 사용(μl) | V(μl) 추가 |
| 1 | 0.02 | 200 | 3 | 0.5 | 25 | 1000 | 40 | 960 |
| 2 | 0.19 | 200 | 4 | 1.7 | 8.95 | 1000 | 111.8 | 888.2 |
| 3 | 0.5 | 200 | 5 | 5 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 4 | 1.7 | 200 | 6 | 17 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 5 | 5 | 200 | 7 | 50 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 6 | 17 | 200 | 8 | 170 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 7 | 50 | 200 | 8 | 170 | 3.4 | 1000 | 294.1 | 705.9 |
| 8 | 170 | 200 | 200 μM 스톡 | 200 | 1.18 | 1300 | 1105 | 195 |
표 4: 추가 모드 2에 이어 8웰 전극 어레이를 사용하는 실험을 위한 파이펫팅 방식.
| 잘 | EC50 | E최대 (= A2) | A1 | N |
| (μM) | (kΩ) | (Ω) | ||
| 1 | 0.9 ± 0.1 | 1680 ± 70 | 150 ± 80 | 1.9 ± 0.5 |
| 2 | 0.7 ± 0.2 | 1770 ± 90 | 200±140 | 1.3 ± 0.4 |
| 3 | 0.6 ± 0.2 | 1700 ± 100 | 60 ± 250 | 1.1 ± 0.5 |
| 4 | 0.6 ± 0.2 | 2000 ± 100 | 140 ± 180 | 1.3 ± 0.4 |
| 5 | 0.9 ± 0.1 | 1810 ± 60 | 160 ± 80 | 1.4 ± 0.3 |
| 6 | 0.8 ± 0.1 | 1950 ± 70 | 200 ± 110 | 1.3 ± 0.3 |
| 7 | 0.6 ± 0.3 | 1700 ± 200 | 260 ± 250 | 1.6 ± 1.0 |
| 1 – 7 | 0.7 ± 0.2 | 1900 ± 100 | 100 ± 100 | 1.1 ± 0.2 |
표 5: 일반적인 용량 응답 데이터에 적용된 네 개의 파라미터 로지스틱 핏에서 얻은 결과입니다. 분석에 사용되는 투여량 응답 데이터는 도 2에제시되어 있다. 전체 농도 범위는 1~7개의 개별 웰에 대한 분석에 적용하였다(도2B)및 웰 1~7로부터 얻어진 평균 데이터에 대해(도2D). 로지스틱 함수의 매개 변수중 어느 것도 최소 제곱 최적화 중에 수정되지 않았습니다. 값이 오류보다 작은 경우를 제외하고 맞춤 결과는 오류의 10년으로 반올림되었습니다.
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Discussion
이 프로토콜은 동일한 수용체에 대한 특정 길항제의 부재 또는 존재 시 작용제-유도 GPCR 활성화의 투여량-반응 관계를 결정하기 위한 무임피던스 측정 방법을 기술한다. 이 방법의 개념 증명은 최근 간행물12에발표되었다. 우리의 지식에 그것은 시험관에서 단일 세포 층을 사용 하 여 주 작동 근 중재 GPCR 활성화의 전체 복용량 응답 곡선의 설립을 설명 하는 첫 번째 연구. 접근은 필연적으로 표지 없는 세포 감시 접근의 사용을 요구하고 종점 실험에 적용되지 않을 것입니다.
이 프로토콜은 U-373 MG 세포의 예에서 입증되었으며, 이는 내생적으로 인간 히스타민 1 수용체(hHR1)를 발현하는데, 이는 세포의 임피던스가 지속적으로 기록되는 동안 그의 내인성 아고니스트 히스타민의 일련의 증가 농도로 자극된다. 길항제 연구에 대한 프로토콜의 적용가능성을 입증하기 위해, 실험은 hH1R에 대한 경쟁적 길항제인 디펜히드라민의 일정한 농도가 있는 상황에서 반복되었다. 임피던스 기록은 또한 여기에 도시된 예 이외에 다른 H1R 작용제(예를 들어, UR-KUM53011,개인 및 단계적 투약) 및 길항제(예를 들어, 메피라민)(12)를 연구하는 데 에도 성공적으로 사용되었다. 더욱이, 프로토콜은 다른 세포주 및 수용체뿐만 아니라, 예를 들어 도파민 D2 수용체(D2R) 또는ß2-아드레날린수용체(ß2AR)를 발현하는BAEC를 발현하는 CHO-D2R뿐만 아니라 매우 효율적인 투여량-반응 데이터를 생성하기 위한 일반적인 계획을 제시한다는 것을 나타낸다. U373-MG 및 BAEC 세포는 내인성 수준에서 각각의 수용체 H1R 및ß2AR을 발현하는 반면, CHO-D2R은 재조합 세포 모델에 대한 예이다. 종합하면, 직렬 프로토콜은 내인성 또는 이소성 GPCR 발현을 가진 세포 유형, 상이한 커플링 유형을 가진 GPCR(예를 들어, H1R), Gs(예를 들어, ß2AR), Gi(예를 들어, D2R) 뿐만 아니라 상이한 리간드 유형(agonist/길항제)에 일반적으로 적용가능하다. 위에서 언급 한 모든 세포 / 수용체 유형에서, 임피던스는 주작동근 농도가 증가함에 따라 증가합니다. 그러나 일부 셀은 임피던스 감소에 의해 GPCR 활성화에 반응합니다. 우리는 그러한 경우 (HaCaT / 히스타민)에 대한 프로토콜을 테스트하고 또한 역 임피던스 변화와 호환되는 일반적으로 적용 가능한 접근 법의 개념을 지원, 농도 의존 단계적 감소를 발견했다. 임피던스 데이터의 상세한 시간 과정은 주어진 수용체의 G-단백질 커플링의 유형을 나타낸다는 것이 제안되었다. 개념이 매력적이더라도, 우리의 데이터 풀은 주어진 GPCR6의G 단백질 커플링에 임피던스 시간 프로파일을 상관시키는 일반적으로 적용 가능한 규칙을 지원하지 않습니다.
직렬 추가 프로토콜은 다양한 유형의 전극 레이아웃 및 다중 웰 형식에 맞게 조정할 수 있습니다. 온칩 관류 시스템에 적용되며, 이는 한 농도를 테스트하기 위해 종종 하나의 세포 층을 필요로 하는 많은 라벨 기반 접근법에 비해 상당한 이점입니다. 따라서, 직렬 투약 방식은 오르간 온 칩 또는 심지어 인간 온 어 칩 접근법과 같은 보다 복잡한 생물학적 모델에서 투여 반응 연구에 대한 길을 열 수 있습니다. 임피던스 측정은 세포 형태 변화를 궁극적으로 유도하는 수용체 활성화에 대한 세포의 통합된 원위 반응을 감지합니다. 이 오히려 일반적이 고 특이 하지만 또한 편견 된 판독 GPCRs에 제한 되지 않습니다 하지만 또한 세포 표면 수용 체의 다른 클래스에 대 한 작동 수 있습니다 광범위 한 적용에 대 한 기초, 세포 질 수용 체 또는 심지어 세포 내 단백질 표적으로.
희소 한 배양이 감도, 재현성 및 데이터 해석을 방해하기 때문에 전극의 결합 된 세포 층과 함께 작동하는 단계적 작용제 추가 프로토콜은 중요합니다. 결합 된 세포 단층에서도 수용체 활성화의 성공적인 모니터링을위한 추가 전제 조건은 신호 전달 캐스케이드를 따라 세포 모양의 변화입니다. 연구 하에 있는 세포가 실험을 따라 그들의 형태를 바꾸지 않는 경우에, 임피던스 기지를 둔 판독은 장님이고 수용체 활동의 어떤 변경든지에 보고하지 않을 것입니다. 직렬 추가 프로토콜을 적절하게 레이아웃하려면 기존의 1-well-one-concentration 모드에서 초기 사전 테스트를 통해 주작동근의 농도 범위와 후속 작용제 추가 사이의 시간 간격을 결정하는 것이 좋습니다. 주작동근의 순차적 투여 사이의 시간 간격은 시스템이 다음 전에 새로운 평형을 채택되도록 맞춤화되어야하며, 더 높은 용량이 추가됩니다. 따라서, 상기 방법은 세포의 매우 빠르고 만 일시적인 반응을 유발하는 수용체또는 완료하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있는 매우 느린 반응을 유발하는 수용체에 덜 유용할 수 있다. 후자의 상황은 실험의 총 시간을 늘리고 병렬 추가 프로토콜을 요청하여 실험실 시간을 단축할 수 있습니다. 상기 예에서, 실험의 총 런타임은 농도(8 또는 10)의 수와 길항제를 가진 잠재적사전 배양에 따라 2.5-3.5시간이었다. 기존의 병렬 작용제 추가 모드에서 동일한 실험은 동일한 세포 수용체 모델에 대해 ~ 1 시간만 걸리지만 처리량이 훨씬 적습니다. 직렬 접근법의 명확한 장점은 전체 투여량-반응 관계에 대해 시험되어야 하는 농도의 수가 이용 가능한 웰의 수에 의해 제한되지 않는다는 것이다. 더 높은 주작동근 농도가 필요한 경우에, 실험은 어떤 추가 세포 배양 일 없이 쉽게 확장되고 완료됩니다. 일부 세포는 전단 스트레스에 민감하고 액체 취급에 의해 부과 된 기계적 자극으로 인해 상당한 임피던스 변화로 반응하기 때문에 아고니스트 첨가 자체는 신중하게 수행되어야합니다. 세포는 심지어 전극에서 나올 수 있습니다. 그러나 이 문제는 임피던스 기반 셀 모니터링에만 국한되지 않고 다른 기술에도 적용됩니다. 민감한 셀의 경우 추가 모드 1은 셀의 기계적 부하가 감소하기 때문에 권장됩니다. 그러나, 이 모드는 집중적인 동요가 비특이적 세포 반응을 피하기 위하여 추천되지 않기 때문에 불완전한 혼합의 리스크를 올리는 추가 도중 더 낮은 액체 부피로 작동합니다.
추가 모드 1은 웰에서 총 부피의 단계적 증가와 함께 진행되는 반면 모드 2는 동일한 양의 용액이 순차적으로 제거되기 때문에 총 부피를 일정하게 유지합니다. 이들은 단지 두 가지 극단적 인 전략이며 특별한 세포 유형, 멀티 웰 포맷 또는 중간 방식으로 전극 레이아웃에 맞게 조정 될 수 있습니다. U373-MG/H1R 모델의 경우 EC50과 EMax 값의 약간의 차이가 종래의 병렬 추가 모드(직렬, N = 30: EC50: (0.8 ±0.3) μM, EMax: (1.9 ±0.2) kΩ; 병렬, N= 15: EC50: (0.5 ±0.2) μM, EMax: (1.3 ±0.3) kΩ, 다른 세포/수용체 모델은 어떠한 차이도 나타내지 않았다. EC50 및 EMax 값의 변화는 수용체가 더 긴 시간 동안 작용제에 노출될 때 발생할 가능성이 더 높은 수용체 둔감에서 유래할 수 있습니다. 둔감화 영향은 연구 하에 수용체 및 리간드에 강하게 의존할 것이다. 직렬 및 병렬 작용제 첨가의 상세한 분석이 수용체 둔감화를 연구하는 새로운 수단을 제공할 수 있는지 여부를 해명하기 위해 남아 있다.
용량-응답 곡선의 잠재적인 변화를 테스트하기 위해 기존의 병렬 모드 작용제 추가를 사용하여 제어 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 추가 제어에는 중간 부전 시 용매 부하 또는 기계적 응력으로 인한 효과를 해명하기 위해 적절한 용량으로 중간/용매로만 처리된 샘플이 포함되어야 합니다. 이는 리간드의 스톡 용액이 배지(예를 들어, DMSO, 에탄올)가 아닌 다른 용매에서 제조되는 경우에 특히 중요하다. 상이한 리간드의 효과를 조사할 때 표준 작용제가 참조로 포함되어야 한다.
향후 방향에는 자동 액체 처리 장치가 포함되어야 하며, 이는 완전히 자동화된 투약 또는 적정을 허용할 수 있습니다. 관류 시스템에 직렬 추가 모드를 적용하면 실험실 온 칩 및 오르간 온 칩 접근법뿐만 아니라 액체 전단 응력 하에서 수행되는 실험에 대한 잠재력이 큽습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 세포 배양 및 실험 용액의 준비에 도움을 주셔서 바바라 고릭크와 나드자 힌터리터에게 감사드립니다. 저자는 감사하게도 연구 훈련 그룹에 의해 재정 지원을 인정 1910 "선택적 GPCR 리간드의 의약 화학" 보조금 번호에 따라 독일 연구 재단에 의해 자금 (DFG) 222125149. JAS는 특히 바이에른 남녀 평등 프로그램에 의해 부여된 장학금에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | |
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 - 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 - 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) | \ |
References
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