Summary
Этот протокол демонстрирует в режиме реального времени запись полной дозы-реакции отношений для агониста индуцированной активации GPCR из одного слоя клеток, выращенных на одном микроэлектроде с использованием без этикетки импеданса измерений. Новая схема дозирования значительно увеличивает пропускную схему без потери во времени разрешения.
Abstract
Без этикетки impedance основе анализы все чаще используются для неинвазивного изучения лиганд-индуцированной активации GPCR в экспериментах клеточной культуры. Этот подход обеспечивает мониторинг клеток в режиме реального времени с разрешением времени, зависящим от устройства, до нескольких десятков миллисекунд, и он полностью автоматизирован. Однако, когда число образцов становится высоким (например, доза-ответ исследований для различных лигандов), стоимость одноразовых электродов массивов, а также доступное разрешение времени для последовательных хорошо хорошо записи могут стать ограниченными. Таким образом, мы представляем серийный протокол дополнения агониста, который имеет потенциал для значительного увеличения выпуска без этикетки GPCR анализов. Используя протокол последовательного добавления агониста, агонист GPCR добавляется последовательно в увеличении концентраций к одноклеточному слою при постоянном мониторинге импеданса образца (агонистовый режим). С помощью этого последовательного подхода теперь можно установить полную кривую реакции дозы для агониста GPCR только из одного слоя клеток. Протокол последовательного агониста применяется к различным типам соединения GPCR, Gq Gi/0 или Gs и совместим с рекомбинантными и эндогенными уровнями экспрессии исследуемого рецептора. Блокирование рецепторов антагонистами GPCR также оценивается (антагонистский режим).
Introduction
В этом отчете представлено подробное описание серийного протокола добавления, разработанного для количественной оценки активации рецептора белка, индуцированного Г-жа (GPCR) в правильно выращенных клетках по измерениям без этикетки импеданса. G белковые рецепторы (GPCRs) участвуют во множестве физиологических функций и заболеваний человека1. Из-за этого и их хорошей доступности на поверхности клетки, GPCRs являются одной из наиболее важных целей наркотиков. Эта оценка находит свое отражение в, по оценкам, число 700 утвержденных препаратов, ориентированных на GPCRs, что эквивалентно 35%-ной доле на всех продаваемых препаратах2.
Разработка новых препаратов включает в себя два центральных процесса: i) идентификацию и функциональную характеристику биологических молекул-мишеней и ii) обнаружение новых свинцовых веществ и их развитие в управляемые препараты. В обоих процессах необходимы эффективные методы количественной оценки взаимодействий с целевыми препаратами и последующего биологического реагирования. Различные этапы доклинического процесса разработки препарата используют различные методы анализа, начиная от исследований биомолекулярного взаимодействия между препаратом и мишенями, по сравнению с функциональными исследованиями клеток в культуре, экспериментами на вырезанном органном материале или целых животных. И физиологическая значимость, и биологическая сложность увеличиваются с первого до последнего3. Хотя это общая цель, чтобы свести к минимуму эксперименты на животных, фармакологические исследования с использованием изолированных органов из лабораторных животных или даже целых животных считаются неизбежными, чтобы всесторонне охарактеризовать новых кандидатов наркотиков. С точки зрения аналитического чтения, орган фармакологии исследования обеспечивают дистальный, интегративный "целостный" функциональный ответ высокой физиологической значимости. Недостатком таких экспериментов является то, что они не совместимы с высокой пропускной способностью скрининга по техническим, а также этические причины и были в значительной степени заменены исследования, основанные на культуре клеток in vitro4.
Методы количественной оценки активации GPCR в клеточных культурах включают различные химические анализы на основе этикеток, которые конкретно обнаруживают вторых посланников, состояние фосфорилирования вниз по течению сигнальных белков, транскрипционную активацию через определенные транскрипционные факторы или торговлю внутриклеточными рецепторами на основе лигандов4,5. Недостатком таких анализов на этикетке является необходимость обозначения клеток потенциально вредными красителями или радиоактивными маркерами. Это часто требует выполнения ассеа в качестве конечного определения для времени экспозиции, которое должно быть определено априори. Использование этикетки на основе конечных анализов страдает от этого очень ограниченное и предвзятое время эксперимента и риск того, что химические этикетки и зонды могут вмешиваться в регулярной физиологии клеток - потенциально незамеченным экспериментатором.
В последние годы появились анализы без этикеток для мониторинга активации GPCR, такие как методы на основе импедеданса или оптические методы, применяющие резонансные волноводы, решетки5,6. Маркировка клеток экспериментально не требуется с этими подходами. Поскольку эти физические считыватели работают на сигналах низкой амплитуды, такие методы считаются неинвазивными, они позволяют осуществлять непрерывный мониторинг клеток потенциально в режиме реального времени, а время наблюдения ограничивается только клеточной культурой, а не считывателем. Подобно считываниям из целых органов, подходы, свободные от этике, обычно сообщают о целостных реакциях клеток, далеко вниз по течению активации рецепторов, когда интеграция по всей сигнальной сети приводит к зависящим от времени, но скорее неспецифическим изменениям в морфологии клеток или перераспределению массы. В то время как impedance основе анализов измерения диэлектрической подписи изменений в форме ячейки7,8, измерения с помощью резонансных волнообразных решеток чувствительны к изменениям в рефракционном индексе на ячейке субстрата интерфейса, вытекающих из динамического перераспределения массы (DMR)9. Интегративный характер делает методы без этикетки чрезвычайно чувствительными к событиям, опосредованным рецепторами, независимо от типа (ы) белка G (Gq,Gi/0, Gs,G12/13) или q-arrestin, участвующих в сигнальном каскаде6 и хорошо подходящих для эндогенных уровней экспрессии рецептора.
В стандартном без этикетке impedance основе анализ клетки adherently выращены в нескольких колодцев с копланарной пленки электродов, отложенных на дне каждого колодца10. Эти электродные массивы соединены с анализатором импеданса, и реакции клеток на экспериментальный стимул регистрируются из отдельных скважин с помощью временных показаний импеданса. В типичном асссе GPCR лиганд добавляется в индивидуально различных концентрациях к каждому отдельному человеку. Лиганд-индуцированные изменения в курсе времени impedance после этого проанализированы по отношению к характерным характеристикам кривой such as максимальная изменение сигнала, зона под кривой, изменение сигнала в пределах, котор дали интервал времени или наклон кривой на затем указанном пункте времени, для того чтобы количественно количественно потенции ligand и эффективности11.
Стоимость электродных массивов может ограничить применение этого метода в кампаниях скрининга высокой пропускной силы (HTS). Кроме того, с увеличением числа образцов, которые должны следовать параллельно, количество индивидуальных измерений увеличивается и тем самым уменьшает разрешение времени для каждого колодца постепенно - даже для современных многоканальных записей. В таких условиях быстрая и переходная реакция клеток может избежать измерения. Кроме того, обычный хорошо - один подход концентрации налагает значительное время и фактор затрат на perfused орган-на-чипе или тело-на-чип события в отношении их пригодности в ligand-GPCR анализа взаимодействия.
По этой причине мы разработали пошаговый протокол дозирования, который позволяет записывать полную кривую реакции на дозу активации гЦКр в культурных клеточных монослойах, постоянно отслеживая препятствие одной скважины, в то время как концентрация агониста увеличивается поэтапно. Протокол последовательного агониста значительно увеличивает пропускную стоимость в скважине от одной концентрации до 10 или более концентраций, как показано на текущем примере клеток U-373 MG человека, которые эндогенно выражают рецептор гистамина 1 (H1R). Таким образом, метод имеет потенциал для значительного улучшения пропускной связи в безэтикетки доза-ответ исследований, в то время как разрешение времени сохраняется на инструментальной максимум.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Посев клеток на электродных массивах
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор макета электрода является компромиссом между чувствительностью и количеством исследуемых ячеек. Чем меньше электрод, тем более чувствительным является измерение, но чем меньше количество исследуемых ячеек. Для клеток, показывающих сильные колебания импеданса с течением времени в базовых условиях, более крупные или межцифровые электроды предпочтительнее.
- Предварительно согреть все растворы, необходимые для стандартного пропуска ячеек и посева в водяной бане 37 градусов по Цельсию. Для анализов с человеческими U-373 МГ клеток он принимает: фосфат буферного сольникового раствора (PBS) без кальция и магния, 0,05% (w/v) трипсин, среда клеточной культуры (Игл Минимальная основная среда (EMEM) дополнена 5% (v/v) сывороткой икроножной мышцы плода (FCS), 2 мМ L-глютамина и 100 мкг/мЛ пенициллин/стрептомицин).
- Промыть клеточный слой фондовой культуры, выращенной на дне обычных фляг или клеточных культур ы с PBS дважды.
- Удалить PBS, добавить раствор трипсина (1 мл на 25 см2) и пусть клетки инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин (применяется к U-373 МГ клеток).
- Контроль для полного отрыва клеток со дна роста субстрата с помощью микроскопии.
- Остановите реакцию трипсина, как только клетки полностью отделены, добавив 9 мл среды клеточной культуры на 1 мл трипсина в клеточную подвеску. Тщательно промыть оставшиеся клетки со дна клеточной культуры субстрата, прокладывая подвеску над подпортом.
- Соберите клеточную подвеску с помощью пипетки и перенесите ее в центробежную трубку (15 мл или 50 мл трубки).
- Спин вниз клетки центрифугации на 110 х г в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Тщательно удалите супернатант и тщательно приостановите клеточной гранулы в культурной среде перед подсчетом клеток (например, с помощью гемаситометра для фазовых контрастных микроскопов и ручного подсчета).
- Отрегулируйте суспензию клетки до нужной плотности клеток. Для экспериментов с u-373 MG клетки, использовать 100 000 клеток / см2 расти сливочного слоя клеток в течение 48 ч. Это приводит к плотности клеток 200 000 ячеек/мл для 8-колодных электродных массивов с областью роста 0,8 см2 и объемом скважины 400 л.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для воспроизводимых экспериментов активации GPCR, клетки должны быть выращены, чтобы совмещеть монослой на электродных массивах. Для обеспечения правильного экспрессии рецепторов на поверхности клетки, клетки должны быть посеяны по крайней мере 36 ч перед выполнением эксперимента. Тестирование различных плотностей клеток для посева клеток часто имеет значение для определения лучших экспериментальных условий. - Добавьте клеточную подвеску к скважинам электродного массива и дайте продавцам осесть при комнатной температуре в течение 10 - 15 минут, чтобы обеспечить однородное распределение клеток на дне скважин.
- Выращивайте клетки не менее 36 ч в стандартном инкубаторе культуры клеток с 5% CO2 (зависит от среднего типа) при 37 градусах Цельсия и увлажненной атмосфере. Изменение культуры клеток среднего 24 ч до эксперимента.
- В день эксперимента осмотрите слои клеток на электродных массивах по микроскопии (фазовой контрастности), чтобы обеспечить полное покрытие электродов клетками.
2. Равновесие клеток в среде, свободной от сыворотки
- Предварительно теплая среда без сыворотки, в этом исследовании: L15 среды Лейбовица.
- Удалить среды клеточной культуры из клеток, выращенных на электродных массивах и заменить предварительно разогретых сыворотки свободной среде. Используйте 200 зл для 8-колодных электродных массивов и 150 л для 96-колодных электродных массивов.
- Пусть клетки уравновесить в сыворотке свободной среде на 37 градусов по Цельсию, по крайней мере 2 ч. Время равновесия сильно зависит от типа ячейки. Например, U-373 MG клетки нужно 2 ч, CHO клетки должны 4 ч, BAEC может потребоваться ночное равновесие в L-15 среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: L-15 среда CO2 независима и требует CO2-свободнойатмосферы. Для уравновешись в L-15 установите инкубатор до 0 % CO2. Равновесие может контролироваться с помощью показаний импеданса, которые мы рекомендуем делать для первых экспериментов.
3. Мониторинг уравновешизм клеток с показаниями импеданса
- Поместите электродный массив в держатель соединительного массива анализатора импеданса.
- Обеспечить надлежащий низкий контакт с импедедантом между электродами и анализатором импедеданса. Эта проверка индивидуально отличается для различных инструментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если прибор не в состоянии сделать подключение к электродам, открыть контактзательный зажим снова, сделать электрод массивдля для правильного позиционирования внутри держателя и повторной попытки. - Выберите тип электрода и/или формат мульти-хорошего из пользовательского интерфейса программного обеспечения.
- Настройка параметров измерения. Доступны различные варианты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы выбрать наиболее чувствительную частоту переменного тока, мы ссылаемся на литературу и руководство по инструментам, поскольку это зависит от макета электрода и исследуемого типа клеток. Как правило, частота зондирования находится в диапазоне 4 кГц - 50 кГц. Здесь клетки U-373 MG выращивались на круглых рабочих электродах диаметром 250 мкм и отслеживались с частотой переменного тока 12 кГц.- Если доступны режимы сбора одно- и нескольких частотных данных, выберите режим единой частоты, чтобы обеспечить максимальное разрешение времени. Измерение будет проводиться на этой одной частоте. Для наиболее широко распространенных инструментов, есть ряд заданных частот вдоль доступного окна частоты.
- Если количество исследуемых скважин низкое или разрешение времени не является критическим, выберите несколько частотных записей. Показания impedance на определенном количестве частот будут записаны для каждого колодца для последующего углубленного анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешение времени уменьшается с увеличением числа частот, зарегистрированных на скважину, и увеличением числа скважин. Варианты выбора режима частоты и сбора данных варьируются в зависимости от типа инструмента и версии.
- Начало получения данных о курсе времени.
- Следуйте за импеданом клеточного слоя (не менее 2 ч) до тех пор, пока импеданс не стабилизируется. В то же время, подготовить агонистовые решения.
- Когда слои клеток достигли стабильного уровня импеданса, либо (i) переходите к последовательному агонисту в рамках того же эксперимента или (ii) прекращают сбор данных и запускают новый набор данных для мониторинга активации рецепторов, вызванных агонистом.
4. Подготовка агонистовых решений для экспериментов в агонистике
- Рассчитайте концентрацию агонистовых растворов по мере необходимости для каждого шага последовательной дозирования в соответствии с уравнением (1). n колеблется от 1 до общего числа серийных дополнений i. x, обозначает концентрацию и объем в скважине на шаг n. y, обозначает концентрацию и объем "решения к быть добавленной" в шаге n.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрим количество репликаций и вычислите общий объем "решения, которые будут добавлены" для каждого шага концентрации. Результаты типичного расчета приведены в таблицах 1-4. Требуется общее представление о агонистике диапазона концентрации, который будет изучен, поскольку диапазон определяет концентрации и количество частей, которые будут вводиться во время последовательного добавления. Используя протокол последовательного дополнения агониста, концентрация агониста увеличивается поэтапно. Таким образом, количество агониста уже в колодце, когда следующая доза добавляется должен быть принят во внимание. Когда количество молекул агониста, уже присутствующих в колодце, составляет nx q c x x x (с текущей концентрацией cx и объемом Vx)и количество молекул в колодце после следующего добавления nx'y, количество молекул, которые будут добавлены ny, определяется концентрацией cy и объемом Vy решения, который будет применяться к хорошо(n y y yy). После добавления порции агониста, новое количество молекул агониста в колодце: c x'y Этот расчет применяется для каждого последующего шага. Из-за взаимозависимости концентрации агониста в скважине и количества агониста в порциях, которые будут добавляться с каждого шага, важно определить окончательные концентрации после каждого шага заранее.
Режим 1: Объем в скважине будет увеличиваться с каждым шагом по мере непрерывного добавления жидкости.
Используя этот режим и 8-колодец формат, используйте Vx1 200 л и Vy1 .... Vyi 30 qL.
Режим 2: Объем в скважине является постоянным, так как объем, добавленный с каждым шагом, удаляется непосредственно перед последующим добавлением.
Используя этот режим и 96-колодский формат, используйте Vx1 и 150 л и Vy1 .... Vyi 75 qL.
- Печать листа данных с общим объемом на концентрацию и подробные инструкции по пайпеттингу.
- Подготовьте все решения в необходимом количестве. Сделайте все агонистовые растворы в той же среде, свободной от сыворотки, что и для уравновешения клеток.
ВНИМАНИЕ: Дигидрохлорид гистамина считается опасным стандартом связи OSHA 2012 (29 CFR 1910.1200). Гистамин вызывает раздражение кожи, серьезное раздражение глаз, может вызвать аллергическую кожную реакцию, аллергию, симптомы астмы или затрудненное дыхание при вдыхании и может вызвать раздражение дыхательных путей. Пожалуйста, рассмотрим лист данных о безопасности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сделать агонист решения как можно более свежими. Стабильность агонистов в растворе может значительно различаться. Храните растворы при 4 градусах цельсия или ниже до использования в эксперименте. Для некоторых молекул могут быть рассмотрены дополнительные стабилизирующие добавки, такие как BSA при использовании молекул на основе пептида или липидов, для предотвращения адсорбции на стенки колодцев и труб. - При выполнении эксперимента в формате 96 скважин перенесите растворы на обычную 96-пуговую пластину (без электродов) и используйте 8- (или 12-) канал пипетку для быстрого перехода жидкости в электродный массив.
5. Подготовка агонистовых решений для эксперимента в режиме антагонист
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте антагонистрешение раствор (ы) с концентрацией, которая будет применяться во всем. Объем и концентрация антагонистского раствора зависят от режима агониста (1 или 2). Примеры для экспериментов в формате 8-ну или 96-ну в дополнительном режиме 2: (A) 8-ну ну колодец формат (Vx1 200 л, VАнтагонист 200 Л); (B) 96-колодец формат (Vx1 150 л, VАнтагонист No 75 qL).
- Рассчитайте концентрацию каждого агониста, необходимого для каждого шага последовательной дозировки, как описано в шаге 4.1.
- Сделайте все агонистовые растворы в той же среде, свободной от сыворотки, используемой для уравновешивания клеток, и добавьте антагониста в той же конечной концентрации, что и планировалось для соответствующих скважин в эксперименте.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае раствор гистамина (10 мМ) готовится в среде L-15. Когда агонисты растворяются в других растворителях (например, диметил сульфоксид (DMSO), этанол) контроль растворителя должен быть включен для учета увеличения нагрузки растворителя с каждым шагом добавления.
6. Выполнение протокола последовательного добавления в агонистике режиме
- Начало сбора данных, описанное в шагах 3.1 - 3.5.
- Предварительно разогреть агонист решения до использования, поместив их в инкубатор около 10 - 15 минут до добавления.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании термо-лабильных веществ, растворы не должны храниться при 37 градусах Цельсия слишком долго. Если предварительное потепление в течение 10 - 15 минут считается критическим, довести решения до 37 градусов по Цельсию незадолго до добавления в водяной бане. - Выполнить агонист серийного дозирования в зависимости от выбранного режима добавления. После режима 1 общий объем в колодце увеличивается с каждым добавлением следующей дозы. В режиме 2 тот же объем, который добавляется с каждым шагом, также удаляется снова перед добавлением следующей более высокой дозы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для уравновешивания клеточного слоя между двумя последующими дозами агониста, зависит от времени отклика клеток. Первоначальный эксперимент в параллельном режиме (одна хорошо - одна концентрация) показывает (i) время отклика клеток для различных концентраций агониста и (ii) наиболее чувствительный параметр кривой (например, максимальный импеданс, импеданс после времени x).
A: Режим 1 / 8-ну хорошо формат
- Добавьте 30 кЛ первого раствора с наименьшей концентрацией агониста к клеткам, которые были уравновешваны в 200 л среды, свободной от сыворотки.
- Пусть клетки реагируют и уравновеш— в течение заранее определенного периода времени (например, 15 мин).
- Добавьте 30 кл второго раствора со следующей более высокой концентрацией.
- Повторите шаги 6.3.1-6.3.3 с третьим, четвертым и так далее, агонистным решением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Работа с 10 шагами концентрации приведет к общему объему 500 qL в конце эксперимента, что чуть ниже максимально применимого объема этих скважин в 550 евро.
B: Режим 2 / 96-ну колодец формат
ПРИМЕЧАНИЕ: Пауза обработки данных во время каждого шага обработки жидкости (дополнение / удаление) с помощью программного обеспечения impedance инструмента при запуске экспериментов в формате 96-ну хорошо. Более сложная обработка жидкости может помешать получению данных. Используйте многоканальный пипетка.
- Приостановить получение данных.
- Добавьте 75 кЛ первого раствора с наименьшей концентрацией агониста к клеткам, которые были уравновешваны в 150 л среды, свободной от сыворотки.
- Возобновить сбор данных.
- Пусть клетки реагируют и уравновеш— в течение заранее определенного периода времени (например, 15 мин).
- Примерно за 1 - 2 мин до окончания регулярного времени равновесия, приостановите измерение и удалите 75 л из каждой скважины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время, в которое решение должно быть удалено, зависит от количества скважин, контролируемых параллельно, и скорости трубации. Время, необходимое для удаления решений, не должно превышать время между последующими шагами. - Добавьте 75 кл второго раствора со следующей более высокой концентрацией и возобновите измерение.
- Повторите шаги 6.3.8-6.3.10 с третьим, четвертым и так далее, агонистным решением.
7. Выполнение протокола серийного добавления в режиме антагониста
- Начало измерения, описанного в шагах 3.1 - 3.5.
- Во время уравновешения клеточных слоев подготовьте антагонист-раствор (например, 200 л из 1,5 мл димедромного гидрохлорида в среде L15).
ВНИМАНИЕ: Димедрол гидрохлорид имеет потенциальные острые последствия для здоровья. Это вредно, если проглотить или вдыхать, может вызвать раздражение глаз и кожи. Это может вызвать раздражение дыхательных путей и пищеварительного тракта. Пожалуйста, рассмотрим лист данных о безопасности. - Предварительно разогреть антагонист и агонист решения, поместив их в инкубатор около 10 - 15 минут до добавления к клеточной культуры (ср. 6.2). Если в ассоциатив включены колодцы без антагониста, то предварительно теплая среда без сыворотки.
- Добавьте антагонистское решение в назначенные скважины. Пусть клетки уравновеш— антагонист от 15 до 20 мин. Если включены скважины, свободные от антагониста, добавьте к этим скважинам тот же объем среды, свободной от сыворотки.
- Согласно антагонист дополнение в режиме 2, удалить решение из скважин
(A) 8-колодец формат (200 Л)
(B) формат 96-ну колодец (75 л) - Выполнить агонист дополнение последовательность, описанную в шаге 6.3.
8. Экспорт и анализ данных
- Экспортные данные с использованием программного обеспечения инструмента impedance для преобразования всех записанных данных из несвободных в общие форматы данных (например, csv). Этот шаг позволяет реорганизовать данные и презентацию с другими пакетами программного обеспечения.
- Загрузите данные csv-форматированных в программное обеспечение для анализа научных данных.
- Нормализовать значения impedance путем вычесть impedance последней точки данных перед первым добавлением агониста разрешения и путем устанавливать время добавления к t q 0. Участок времени курс нормализованного импеданса.
- Участок отдельных курсов времени и определить максиму в impedance после каждого шага добавления. Составьте лист данных с этими значениями.
- Участок значения максимального (или минимального, если применимо) изменения импеданса как функция концентрации агониста. Это может быть сделано для отдельных скважин или для средних (средний sD).
- Используйте режим установки данных для определения полумаксимальных эффективных концентраций (EC50)и максимального ответа (EMax)с помощью четырех параметров логистической модели (уравнение 2):
ПРИМЕЧАНИЕ: c указывает на агонист концентрации, A1 является минимальным и 2 является максимальным asymptote сигмоидальной дозы-ответ кривой (A2 и EМакс). EC50 является концентрацией в точке перегиба кривой, и n соответствует склону холма.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичная схема для подготовки различных агонистовых решений показана для эксперимента с использованием 8-колодных электродных массивов с гистамином в качестве агониста в таблицах 1-4. Таблица 1 и таблица 2 представляют объемы и концентрации для эксперимента с использованием режима добавления 1 (cf., Рисунок 1),в то время как таблица 3 и таблица 4 представляют объемы и концентрации для эксперимента после режима добавления 2 (cf., Рисунок 1). Данные были рассчитаны с помощью уравнения (1).
Репрезентативный эксперимент показан на рисунке 2 для конфлюентных слоев клеток U-373 MG, которые эндогенно выражают рецептор гистамина 1, выращенный на 8-коловидном электродном массиве с рабочим электродом диаметром 250 мкм, используя гистамин в качестве агониста. Измерение проводилось на одной частоте 12 кГц. Добавление серии концентрации агониста было выполнено после режима 1. В выбранном эксперименте 10 растворов с увеличением концентрации гистамина (подготовлено в соответствии с шагом 4) были добавлены последовательно каждые 15 минут(рисунок 2A). Схема последовательного дозирования применялась к семи из восьми скважин. В одну хорошо агонист-свободную среду (L-15) было добавлено последовательно как отрицательный контроль в 9 из 10 шагов. Последним дополнением к этому контролю был раствор гистамина, обеспечивающий окончательную концентрацию 100 мкм гистамина в колодце. Данные были построены с программным обеспечением для анализа данных и показаны как изменение импеданса Вопрос 12 кГц / кЗ вдоль эксперимента, с изменением импеданса и временной точки первого добавления устанавливается к нулю. Начальное время равновесия в экспериментальном буфере 2 ч не показано в этом сюжете. Точки времени агониста указываются стрелками.
Изменение импеданса по отношению к базовому уровню после каждого шага концентрации было извлечено из кривых с помощью курсора данных. На шагах без четкого максимума для анализа использовалась последняя точка данных перед следующим дополнением. Импедас изменяется Вопрос 12 кГц были построены как функция концентрации гистамина (cx'y)(Рисунок 2B, символы). Функция передачи четырех параметров логистической модели (ср. шаг 8.6) была установлена на экспериментальных точках данных из семи скважин(рисунок 2B,линии). Результаты подгонки показаны в таблице 5. На рисунке 2C и рисунке 2D показан результат усреднения данных на рисунке 2A и рисунке 2B,представляя среднее и SD для семи скважин. Данные о среднем времени курса суммируются на рисунке 2C,в то время как средняя кривая доза-ответ приведена на рисунке 2D.
В отношениях доза-реакции, как показано на рисунке 2B,D, процедура установки была применена ко всему диапазону концентрации, возвращающего EC50 (0,86 и 0,13) мКМ. Ответ импедананса увеличивается монотонно с увеличением концентрации гистамина, за исключением последних двух шагов концентрации (30 мкм, 100 мкм конечной концентрации). Этот ответ, предположительно, объясняется downregulation гистаминового рецептора, десенсибилизации или чрезмерной стимуляции клеток (см. обсуждение). Для учета этого эффекта диапазон данных для анализа был сокращен, как показано для одного серийного эксперимента дозирования(рисунок 3;ну 1), выбранный из данных, показанных на рисунке 2. Кроме того, установка нижнего асимптота(A1) к нулю во время наименьшей квадратной оптимизации при условии, что не будет изменений в ответ на 0 МКм гистамина вполне оправдано. Применение этого трех параметров оптимизации обеспечивает EC50 (0,75 и 0,12) ММ (ср., рисунок 3B). Значения EC50 были признаны нечувствительными ни для одного из режимов анализа данных и существенно не отличались.
Типичные результаты для 96-колодца пластины эксперимента суммируются в рисунке 4. U-373 MG клетки были выращены на 96-колодных электродных массивах, как описано выше. В измерение было включено 32 скважины. 8 скважин служили в качестве агониста свободного контроля, подвергаются воздействию только средних. 24 скважины подверглись серии увеличения концентраций гистамина, рассчитанных и подготовленных для добавления режима 2. Временной ход изменения импедеданса показан для всех 32 отдельных скважин на рисунке 4А. Одна из кривых (выделенная красным цветом) показывает необычный временной курс и была исключена из дальнейшего анализа. Соответственно, данные из 23 скважин были усреднены и построены как временной ход изменения среднего импедеданса (средний sD) на рисунке 4B. Каждая индивидуальная кривая была проанализирована, как описано выше для доза-ответ отношения. Точки данных были усреднены и построены как функция окончательной концентрации гистамина(рисунок 4C). Данные о дозах были проанализированы с помощью четырех типовых логистических моделей, которые вернули среднее значение EC50 (1,0 и 0,3) мКм.
Типичный результат для протокола последовательного агониста в режиме антагонист показано на рисунке 5. Здесь, один хорошо был предварительно обработан ы 0,75 мкм антагониста антагониста димедрола гистамина (красная кривая) 20 мин до первого гистамина был добавлен(Рисунок 5A). Контроль получил среду без антагониста (синяя кривая). Антагонист был добавлен после режима 2, что означает, что 200 Зл из, наконец, 400 Зл были удалены до агониста серии был применен. Агонист (гистамин) был добавлен после серийного режима дозирования 1, как описано в приведенных выше примерах. Для экспериментов в режиме антагониста важно, чтобы концентрация антагониста сохраняла постоянную на протяжении всего времени эксперимента. Соответственно, все агонистовые растворы, добавленные в скважину, должны также содержать заранее определенную концентрацию антагониста (в данном случае 0,75 мкм), в то время как контроль остается без антагониста. Антагонистический эффект проявляется в "отложенном" увеличении импеданса в рамках последовательной дозирующей схемы, соответствующей более высоким концентрациям агониста, необходимым для вызвать реакцию клеток. В доза-ответ отношения эффект антагониста выражается как правый сдвиг кривых, что соответствует увеличению еС50, при условии, что антагонист является конкурентоспособной лигандой по отношению к агонисту (Рисунок 5B). EC50 был определен в случае (0,92 и 0,05) мКм в отсутствие антагониста и (14,7 х 0,6) мКм в его присутствии.
Рисунок 1: Серийные режимы добавления агониста. (A) Схема, иллюстрирующая расчеты концентрации. Добавляя агонистный раствор концентрации cy и тома Vy к колодцу с объемом Vx и агониста концентрации cx,объем увеличивается до Vx'y, а концентрация увеличивается доc x.y. (B) Два различных режима для серийного агониста того. Режим 1: Общий объем в скважине Vх-й увеличивается с каждым добавлением. Режим 2: Объем, добавленный на каждом шаге концентрации, удаляется снова до добавления следующей дозы, которая сохраняет общий объем в постоянном скважине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Результаты типичного эксперимента в 8-колодном формате. (A) Время курса импеданса изменения на 12 кГц для слияния U-373 МГ клеточных слоев, выращенных на круглых рабочих электродов 250 мкм диаметром. В семи из восьми скважин было применено серийное добавление гистамина. Один колодец (серая кривая) был последовательно загружен с гистаминовой буфером на каждом шагу (режим 1), за исключением последнего шага, когда 100 мкм гистамин были добавлены в качестве положительного контроля. (B) Доза-ответ отношения, порожденные от максимального изменения импеданса по отношению к базовой для семи отдельных скважин после каждого шага концентрации. (C) Средний временной ход изменения импеданса (средний sD) генерируется из семи отдельных скважин, как показано в (A). (D) Средняя доза-ответ отношения, полученные из отдельных наборов данных, как показано в (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Адаптация режимов анализа данных. (A) Типичный курс времени изменения импеданса на 12 кГц для одного смежного U-373 МГ клеточного слоя, выращенного на круглых рабочих электродов 250 мкм диаметром. (B) Экспериментальные отношения доза-ответ (заполненные символы), порожденные максимальным изменением импеданса относительно базовой линии после каждого увеличения концентрации. Либо полный набор данных был подвергнут процедуре установки (черная и серая кривая), либо последняя точка данных, указывающая на начало десенсибилизации рецепторов и/или интернализации, была исключена из количественного анализа (красная и пурпурная кривая). Все четыре параметра были скорректированы во время наименьшей квадратной оптимизации (черная и красная кривая) или параметр А1, представляющий нижнюю асимптоту, был установлен и зафиксирован до нуля (серая и пурпурная кривая). Значения EC50 существенно не отличались для двух режимов анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Типичный эксперимент в формате 96 скважин. (A) Время курс изменения импеданса измеряется на 12 кГц для слияния U-373 МГ клеточных слоев, выращенных на 96-колодный электрод массива. Данные отображаются по 32 скважинам. 24 скважины были подвергнуты серии увеличения концентрации гистамина добавил с успеваемостью время 15 минут между каждым шагом. Кривая, выделенная красным цветом, была исключена из усреднения. Восемь скважин (контроль) были обработаны с гистамина свободной среды в каждый момент времени того. (B) Время курса среднего изменения импедеданса для 23 отдельных скважин в ответ на гистамин серийного добавления и восемь контрольных скважин, как показано в (A). (C) Средняя доза-ответ отношения, порожденные от максимального изменения импеданса по отношению к базовой линии после каждого увеличения концентрации (средний SD). Данные были оснащены функцией логистики из четырех параметров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Типичный эксперимент в режиме антагонист. (A) Время курса импеданса изменения на 12 кГц для слияния U-373 МГ клеточных слоев, выращенных на круглых рабочих электродов 250 мкм диаметром при добавлении увеличения концентрации гистамина с или без присутствия антагониста диплодопромидного рецептора гистамина. Димедрол (0,75 мкм) или среда без антагонистов (L15) были добавлены за 20 минут до начала агониста серийного дозирования. (B) Отношения дозы-реакции, порожденные максимальным изменением импеданса относительно базового срока после каждого увеличения концентрации от данных, показанных в (A). Наличие димедрола 0,75 мкм увеличило EC50 с (0,92 и 0,05) до (14,7 и 0,6) мКМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более крупную версию этой цифры.
| Решение # | cхюй (мкм) | cx (мкм) | Vx (КЛ) | Vхюй (КЛ) | Vy (КЛ) | cy (мкм) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 230 | 30 | 0.08 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 230 | 260 | 30 | 0.79 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 260 | 290 | 30 | 2.03 |
| 4 | 1 | 0.3 | 290 | 320 | 30 | 7.77 |
| 5 | 3 | 1 | 320 | 350 | 30 | 24.33 |
| 6 | 10 | 3 | 350 | 380 | 30 | 91.67 |
| 7 | 30 | 10 | 380 | 410 | 30 | 283.33 |
| 8 | 100 | 30 | 410 | 440 | 30 | 1056.67 |
Таблица 1: Схема расчета концентрации для экспериментов с использованием 8-колодных электродных массивов после режима добавления 1.
| Решение # | cy (мкм) | Vy (КЛ) | сделать из | c (мм) | коэффициент разбавления | сделать общее количество V (L) | использовать (Зл) | добавить V (Зл) |
| 1 | 0.08 | 30 | 3 | 2.03 | 26.52 | 600 | 22.6 | 577.4 |
| 2 | 0.79 | 30 | 4 | 7.77 | 9.83 | 600 | 61 | 539 |
| 3 | 2.03 | 30 | 5 | 24.33 | 11.97 | 600 | 50.1 | 549.9 |
| 4 | 7.77 | 30 | 6 | 91.67 | 11.8 | 600 | 50.8 | 549.2 |
| 5 | 24.33 | 30 | 7 | 283.33 | 11.64 | 600 | 51.5 | 548.5 |
| 6 | 91.67 | 30 | 8 | 1056.67 | 11.53 | 600 | 52.1 | 547.9 |
| 7 | 283.33 | 30 | 8 | 1056.67 | 3.73 | 600 | 160.9 | 439.1 |
| 8 | 1056.67 | 30 | 10 мМ шток | 10000 | 9.46 | 800 | 84.5 | 715.5 |
Таблица 2: Схема трубопроката для экспериментов с использованием 8-колодных электродных массивов после режима добавления 1.
| Решение # | cхюй (мкм) | cx (мкм) | Vx (КЛ) | Vхюй (КЛ) | Vy (КЛ) | cy (мкм) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 400 | 200 | 0.02 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 200 | 400 | 200 | 0.19 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 200 | 400 | 200 | 0.5 |
| 4 | 1 | 0.3 | 200 | 400 | 200 | 1.7 |
| 5 | 3 | 1 | 200 | 400 | 200 | 5 |
| 6 | 10 | 3 | 200 | 400 | 200 | 17 |
| 7 | 30 | 10 | 200 | 400 | 200 | 50 |
| 8 | 100 | 30 | 200 | 400 | 200 | 170 |
Таблица 3: Схема расчета концентрации для экспериментов с использованием 8-колодных электродных массивов после режима добавления 2.
| Решение # | cy (мкм) | Vy (КЛ) | сделать из | c (мм) | коэффициент разбавления | сделать общее количество V (L) | использовать (Зл) | добавить V (Зл) |
| 1 | 0.02 | 200 | 3 | 0.5 | 25 | 1000 | 40 | 960 |
| 2 | 0.19 | 200 | 4 | 1.7 | 8.95 | 1000 | 111.8 | 888.2 |
| 3 | 0.5 | 200 | 5 | 5 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 4 | 1.7 | 200 | 6 | 17 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 5 | 5 | 200 | 7 | 50 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 6 | 17 | 200 | 8 | 170 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 7 | 50 | 200 | 8 | 170 | 3.4 | 1000 | 294.1 | 705.9 |
| 8 | 170 | 200 | 200 мкм запас | 200 | 1.18 | 1300 | 1105 | 195 |
Таблица 4: Схема трубопроката для экспериментов с использованием 8-колодных электродных массивов после режима добавления 2.
| Хорошо | EC50 | Eмакс (За2) | A1 | N |
| (ММ) | (кЗ) | (В) | ||
| 1 | 0,9 и 0,1 | 1680 г. 70 | 150 и 80 | 1,9 и 0,5 |
| 2 | 0,7 и 0,2 | 1770 г. и 90 | 200 й140 | 1,3 и 0,4 |
| 3 | 0,6 и 0,2 | 1700 и 100 | 60 и 250 | 1,1 и 0,5 |
| 4 | 0,6 и 0,2 | 2000 г. 100 | 140 и 180 | 1,3 и 0,4 |
| 5 | 0,9 и 0,1 | 1810 г. и 60 | 160 и 80 | 1,4 и 0,3 |
| 6 | 0,8 и 0,1 | 1950 г. - 70 | 200 х 110 | 1,3 и 0,3 |
| 7 | 0,6 и 0,3 | 1700 и 200 | 260 х 250 | 1,6 и 1,0 |
| 1 – 7 | 0,7 и 0,2 | 1900 г. и 100 | 100 и 100 | 1,1 и 0,2 |
Таблица 5: Результаты, полученные из четырех параметров логистических припадков применяется к типичным данным доза-ответ. Данные о дозах-ответ, используемые для анализа, представлены на рисунке 2. Полный диапазон концентрации был применен к анализу отдельных скважин от одного до семи(рисунок 2B)и для средних данных, полученных из скважин от одного до семи(рисунок 2D). Ни один из параметров логистической функции не был зафиксирован при наименьшей квадратной оптимизации. Результаты fit были округлены к декаде ошибки, за исключением если значение было более мало чем ошибка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает метод для измерения импеданса без этикетки для определения отношения доза-реакции активации гЦКр в отсутствие или наличии конкретных антагонистов для одного и того же рецептора. Доказательство концепции этого метода было представлено в недавней публикации12. Насколько нам известно, это первое исследование, описывающее создание полной кривой реакции на дозу агонист-опосредованного активации GPCR с использованием одноклеточного слоя in vitro. Этот подход неизбежно требует использования подходов к мониторингу ячеек без маркировки и не будет применим к конечным анализам.
Протокол был продемонстрирован на примере u-373 MG клеток, которые эндогенно выражают рецептор гистамина человека 1 (hHR1), который стимулируется с серией увеличения концентраций его эндогенного агониста гистамина в то время как импеданс клеток непрерывно регистрируется. Чтобы продемонстрировать применимость протокола к антагонистическим исследованиям, эксперименты повторялись при наличии одной постоянной концентрации димедрола, конкурентного антагониста hH1R. Записи impedance также были успешно использованы для изучения других агонистов H1R (например, UR-KUM53011, индивидуальное и пошаговое дозирование) и антагонистов (например, Mepyramine)12 в дополнение к приведенным здесь примерам. Кроме того, протокол был применен и к другим клеточным линиям и рецепторам, например, CHO-D2R, выражающим рецептордопамина D2 (D2R) или BAEC, выражающий 2-адренергический рецептор(No 2AR)12, указывающий на то, что он представляет собой общую схему очень эффективного генерации данных о дозах-реакции. В то время как u373-MG и BAEC клетки выражают соответствующие рецепторы H1R и No2AR на эндогенных уровнях, CHO-D2R является примером для рекомбинантной модели клеток. В совокупности серийный протокол в целом применим к типам клеток с эндогенным или эктопическим выражением GPCR, GPCR с различными типами соединения Gq (например, H1R), Gs (например,No 2AR),G i (например, D2R), а также различными типами лигандов (агонист/анагонист). Во всех этих клеток / рецепторов типов, упомянутых выше, импеданский увеличивается с увеличением концентрации агониста. Тем не менее, некоторые клетки реагируют на активацию GPCR снижением импеданса. Мы протестировали протокол для одного такого случая (HaCaT/гистамина) и обнаружили также концентрационное пошаговое снижение, поддерживая понятие общеприменимого подхода, который также совместим с обратными изменениями импедации. Было предложено, чтобы подробный курс времени данных impedance указывает на тип G-белковой связи данного рецептора. Несмотря на то, что концепция привлекательна, пул наших данных не поддерживает общеприменимое правило, которое коррелирует профиль времени импеданса с G-белковым соединением данного GPCR6.
Протокол последовательного добавления адаптируется к различным типам макетов электродов и многофункциональных форматов. Это применимо к системам перфузии на чипе, что является значительным преимуществом перед многими подходами на основе этикеток, которые часто требуют одного слоя клеток для проверки одной концентрации. Соответственно, система последовательного дозирования может проложить путь к исследованиям в области доз-реакции в более сложных биологических моделях, таких как орган-на-чипе или даже подходы человека-на-чипе. Измерения импеданса обнаруживают интегрированную, дистальную реакцию клеток на активацию рецепторов, которая в конечном итоге вызывает изменения клеточной морфологии. Это довольно общее и неспецифическое, но также беспристрастное считывание является основой для его широкой применимости, которая не ограничивается GPCRs, но может также работать для других классов рецепторов поверхности клетки, цитоплазматических рецепторов или даже внутриклеточных белков в качестве мишеней.
Очень важно для протокола пошагового агониста для работы с сводными слоями клеток на электродах, так как редкие культуры будут мешать чувствительности, воспроизводимости и интерпретации данных. Дополнительным условием успешного мониторинга активации рецепторов даже в сольствуя клеточных монослойах является изменение формы клеток вдоль каскада трансдукции сигнала. Если исследуемые клетки не изменят свою морфологию в ходе эксперимента, считывани на основе импедеданса слепы и не будут сообщать о каких-либо изменениях в активности рецепторов. Для правильного компоновки протокола последовательного добавления рекомендуется провести предварительное тестирование в обычном режиме "одна-одна концентрация" для примерного определения диапазона концентрации агониста и временной интервала между последующими агонистами. Временные интервалы между последовательными дозами агониста должны быть адаптированы таким образом, чтобы система принимает новое равновесие до следующей, более высокой дозы добавляется. Соответственно, метод может быть менее полезным для рецепторов, которые вызывают очень быструю и только преходящую реакцию клеток или очень медленный ответ, который может занять несколько часов, чтобы завершить. Последняя ситуация увеличит общее время проведения эксперимента и потребует параллельных протоколов добавления, чтобы сократить время лабораторных сокращений. В приведенных выше примерах общее время выполнения эксперимента составило 2,5 - 3,5 ч, в зависимости от количества концентраций (8 или 10) и потенциальной прединкубации с антагонистом. Тот же эксперимент в обычном режиме параллельного агониста будет принимать только 1 ч для той же модели клеток-рецепторов, но с гораздо меньшей пропускной их. Явным преимуществом последовательного подхода является то, что количество концентраций, которые необходимо проверить на наличие полной дозы и реакции, не ограничивается количеством имеющихся скважин. Если необходимы более высокие концентрации агониста, эксперимент легко расширяется и завершается без какой-либо дополнительной работы клеточной культуры. Агонист дополнение само по себе должно осуществляться тщательно, так как некоторые клетки чувствительны к сдвига стресса и реагировать со значительными изменениями impedance просто из-за механической стимуляции, введенной жидкой обработки. Клетки могут даже оторваться от электрода. Эта проблема, однако, не является уникальной для импеданса основе мониторинга клеток, но относится и к другим методам, а также. Для чувствительных клеток режим добавления 1 рекомендуется из-за снижения механической нагрузки на клетки. Тем не менее, этот режим работает с более низкими объемами жидкости во время добавления, что повышает риск неполного смешивания, так как интенсивное возбуждение не рекомендуется, чтобы избежать неспецифических реакций клеток.
Режим добавления 1 идет вместе с пошаговое увеличение общего объема в колодце в то время как режим 2 сохраняет общий объем постоянным, так как равное количество раствора последовательно удалены. Это всего лишь две экстремальные стратегии и могут быть адаптированы для специальных типов клеток, форматов с несколькими скважинами или макетов электродов любым промежуточным способом. В случае модели U373-MG/H1R были отмечены небольшие различия в значениях EC50 и EMax для режима последовательного добавления по сравнению с обычным режимом параллельного добавления (серийный, N No 30: EC50: (0,8 х 0,3) мкм, EMax: (1,9 х 0,2) кЗ; параллель, N No 15: EC50: (0,5 и 0,2) ММ, EMax: (1,3 х 0,3) кЗ), в то время как другие модели клеток/рецепторов не показали никаких различий. Сдвиг в значениях EC50 и EMax может возникнуть в ходе десенсибилизации рецепторов, которая с большей вероятностью произойдет, когда рецепторы подвергаются воздействию агониста в течение более длительного времени. Влияние десенсибилизации будет сильно зависеть от рецептора и исследуемого лиганда. Остается выяснить, может ли подробный анализ последовательного и параллельного агониста обеспечить новое средство для изучения десенсибилизации рецепторов.
Мы рекомендуем проводить контрольный эксперимент с обычным параллельным агонистом режима для проверки потенциальных сдвигов в кривых реакции дозы. Дальнейшие меры контроля должны включать образец, обработанный только со средним/растворителем в соответствующих дозах, чтобы распутать любые эффекты из-за нагрузки растворителя или механического напряжения при среднем добавлении. Это становится особенно важным, если запасной раствор лиганда готовится в других растворителях, чем средний (например, DMSO, этанол). При изучении влияния различных лиганд стандартного агониста следует включить в качестве эталона.
Будущие направления должны включать автоматические жидкостные устройства обработки, которые могут позволить полностью автоматизированное дозирование или титрировка. Применение режима последовательного добавления в перфузионных системах обладает большим потенциалом для лабораторных подходов к чипу и органу на чипе, а также для экспериментов, проводимых при стрессе жидкого сдвига.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Барбару Горицник и Надю Хинтеррайтер за помощь в культивированиеклето клеток и подготовку экспериментальных решений. Авторы с благодарностью признают финансовую поддержку исследовательской учебной группы 1910 "Лекарственная химия селективных лигандов GPCR", финансируемой Немецким исследовательским фондом (DFG) под грантом No 222125149. JAS особенно признательна за стипендию, предоставленную Баварской программой гендерного равенства.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | |
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 - 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 - 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) | \ |
References
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs. Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).
- Kaitin, K. I. Deconstructing the drug development process: The new face of innovation. Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).
- Kenakin, T. P. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).
- Scott, C. W., Peters, M. F. Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening. Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophysical Journal. 91, 16 (2006).
- Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).
- Lieb, S., et al. Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor. Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).
- Stolwijk, J. A., et al. Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol. Integrative Biology. 11, 10 (2019).
