Summary
Bu protokol, etiketsiz empedans ölçümleri kullanılarak tek bir mikroelektrot üzerinde yetiştirilen tek bir hücre tabakasından agonist kaynaklı GPCR aktivasyonu için tam doz-yanıt ilişkilerinin gerçek zamanlı kaydını göstermektedir. Yeni dosing şeması, zaman çözümlü zaman kaybı olmadan iş buzunu önemli ölçüde artırır.
Abstract
Etiketsiz empedans bazlı tahliller, hücre kültürü deneylerinde ligand kaynaklı GPCR aktivasyonunu invaziv olmayan olarak incelemek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu yaklaşım, aygıta bağlı zaman çözünürlüğü yle gerçek zamanlı hücre izleme sağlar ve bu durum çok yüksek derecede otomatiktir. Ancak, örnek sayıları nidik aldığında (örneğin, çeşitli ligandlar için doz-yanıt çalışmaları), tek kullanımlık elektrot dizilerinin maliyeti ve sıralı iyi kuyu kayıtları için kullanılabilir zaman çözünürlüğü sınırlayıcı hale gelebilir. Bu nedenle, burada önemli ölçüde etiket içermeyen GPCR tahlilçıktısını artırmak için potansiyele sahip bir seri agonist ek protokolü sıyoruz. Seri agonist ekleme protokolü kullanılarak, bir GPCR agonist sürekli örnek empedans (agonist modu) izlerken tek bir hücre katmanına artan konsantrasyonları artarda eklenir. Bu seri yaklaşım ile, artık sadece tek bir hücre tabakasından bir GPCR agonist için tam doz-yanıt eğrisi kurmak mümkündür. Seri agonist ekleme protokolü farklı GPCR kaplin tipleri, Gq Gi/0 veya Gs için geçerlidir ve çalışma altındaki reseptörün rekombinant ve endojen ekspresyon düzeyleri ile uyumludur. GPCR antagonistleri tarafından reseptör blokesi de değerlendirilebilir (antagonist mod).
Introduction
Bu rapor, bağlı olarak yetiştirilen hücrelerde ligand kaynaklı G protein-çiftreseptör (GPCR) aktivasyonunun etiketsiz empedans ölçümleri ile ölçülmesi için geliştirilmiş seri ek protokolünün ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktadır. G protein-coupled reseptörleri (PcF) fizyolojik fonksiyonlar ve insan hastalıkları1çok sayıda yer almaktadır. Bu ve hücre yüzeyinde ki iyi erişilebilirlik nedeniyle, GPCR en önemli uyuşturucu hedeflerinden biridir. Bu değerlendirme, tüm pazarlanan ilaçlar2~% 35 paya eşdeğer, GPCR hedefleyen ~ 700 onaylı ilaçların tahmini sayısı yansıtılır.
Yeni ilaçların geliştirilmesi iki merkezi süreçten oluşur: (i) biyolojik hedef moleküllerin tanımlanması ve fonksiyonel karakterizasyonu ve (ii) yeni kurşun maddelerin keşfi ve bunların yönetilebilir ilaçlara dönüştürülmesi. Her iki süreçte de, ilaç hedef etkileşimlerini ve sonraki biyolojik aşağı tepkiyi nicel olarak değerlendirmek için etkin yöntemler gereklidir. Klinik öncesi ilaç geliştirme sürecinin farklı aşamalarında, ilaç ve hedef arasındaki biyomoleküler etkileşim çalışmalarından kültürdeki hücreler üzerinde yapılan fonksiyonel çalışmalara, eksise organ materyali veya bütün hayvanlar üzerinde deneylere kadar farklı analiz yöntemlerini kullanmaktadır. Her ikisi de, fizyolojik önemi ve biyolojik karmaşıklığı eski den ikinci3artış . Hayvan deneylerini en aza indirmek genel hedef olsa da, laboratuvar hayvanlarından ve hatta bütün hayvanlardan izole edilmiş organları kullanan farmakolojik çalışmalar, yeni ilaç adaylarını kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için kaçınılmaz kabul edilmektedir. Analitik okuma açısından, organ farmakolojisi çalışmaları en yüksek fizyolojik alaka distal, bütünleştirici "bütünleştirici" fonksiyonel yanıt sağlar. Bu tür deneylerin bir dezavantajı, teknik yanı sıra etik nedenlerle yüksek iş elde tarama ile uyumlu değildir ve büyük ölçüde in vitro hücre kültürü4dayalı çalışmalar ile ikame edilmiştir.
Hücre kültürlerinde GPCR aktivasyonunu ölçmek için kullanılan yöntemler arasında, özellikle ikinci habercileri tespit eden farklı etiket tabanlı kimyasal tahliller, aşağı akım sinyal proteinlerinin fosforilasyon durumu, belirli transkripsiyon faktörleri veya ligand kaynaklı hücre içi reseptör ticareti ile transkripsiyonel aktivasyon4,5sayılabilir. Bu tür etiket tabanlı tahlillerin bir dezavantajı, hücreleri zararlı boyalar veya radyoaktif belirteçlerle etiketleme zorunluluğudur. Bu genellikle bir prioribelirtilmesi gereken bir pozlama süresi için bir bitiş noktası belirleme olarak tayini çalıştırmayı gerektirir. Etiket tabanlı uç nokta testlerinin kullanılması, deneyin bu çok sınırlı ve önyargılı zamanlamasından ve kimyasal etiketlerin ve probların normal hücre fizyolojisini etkileyebilecek riskten muzdaripdir – deneyci tarafından fark edilmeden.
Son yıllarda, GPCR aktivasyon izlemek için etiketsiz tahliller ortaya çıkmıştır, empedans tabanlı teknikler veya rezonans dalga kılavuzu ızgaraları uygulayan optik yöntemler gibi5,6. Bu yaklaşımlarla hücrelerin etiketlenmesi deneysel olarak gerekli değildir. Bu fiziksel okumalar düşük genlikli sinyaller üzerinde çalıştığından, bu tür yöntemler invaziv olmayan olarak kabul edilir, onlar potansiyel olarak gerçek zamanlı olarak sürekli hücre izleme için izin ve gözlem süresi sadece hücre kültürü ile sınırlıdır okuma ile değil. Tüm organlardan gelen okumalara benzer şekilde, etiketsiz yaklaşımlar genellikle bütünsel hücre yanıtları hakkında rapor, tüm sinyal ağı boyunca entegrasyon zamana bağlı ama hücre morfolojisi veya kitle yeniden dağıtımında zamana bağlı olmayan değişikliklere yol açtığında reseptör aktivasyonunun çok aşağısında. Empedans tabanlı tahliller hücre şekli7,8, rezonans dalga kılavuzu ızgaraları kullanarak ölçümler istatiksel imza ölçmek ise dinamik kütle yeniden dağılımı (DMR)9kaynaklanan hücre-substrat arabiriminde kırılma indisi değişikliklere duyarlıdır . İntegratif karakter, G proteininin (Gq, Gi/0, Gs, G12/13)veya β-arrestin in sinyalizasyon basamak6 dahil ve reseptörün endojen ekspresyon düzeyleri için uygun ne olursa olsun reseptör aracılı olaylara son derece duyarlı etiketsiz yöntemler yapar.
Standart etiketsiz empedans tabanlı bir teşbimizde hücreler, her kuyunun10'ununaltına biriken koplanar altın film elektrotlarla çok kuyulu plakalarda yapışkan bir şekilde yetiştirilir. Bu elektrot dizileri bir empedans analizörüne bağlanır ve deneysel bir uyarıcıya hücre tepkileri zaman çözümlü empedans okumaları ile bireysel kuyulardan kaydedilir. Tipik bir GPCR tsay bir ligand her bir eye ayrı ayrı farklı konsantrasyonlarda iyi eklenir. Empedans zaman dilimindeki ligand indüklenen değişiklikler daha sonra maksimum sinyal değişimi, eğrinin altındaki alan, belirli bir zaman aralığında ki sinyal değişimi veya eğrinin eğimi gibi karakteristik eğri özelliklerine göre analiz edilir, ligand'ın gücünü ve etkinliğini ölçmek için11.
Elektrot dizilerinin maliyeti, bu tekniğin yüksek iş yapma tarama (HTS) kampanyalarında uygulanmasını sınırlayabilir. Dahası, paralel olarak takip edilecek örnek sayısının artmasıyla, bireysel ölçümlerin sayısı artar ve böylece her bir kuyu için kullanılabilir zaman çözünürlüğünü kademeli olarak azaltır - en son teknoloji deki çok kanallı kayıtlar için bile. Bu koşullar altında hızlı ve geçici hücre yanıtları ölçümden kaçabilir. Buna ek olarak, konvansiyonel bir iyi - bir konsantrasyon yaklaşımı ligand-GPCR etkileşim analizi onların uygunluk açısından perfüzyon organ-on-chip veya vücut-on-chip gelişmeler önemli bir zaman ve maliyet faktörü empoze.
Bu nedenle, agonist konsantrasyonu kademeli olarak artarken tek bir kuyunun empedansını sürekli izleyerek, kültürlü hücre monokatmanlarında ligand kaynaklı GPCR aktivasyonunun tam doz-yanıt eğrilerinin kaydedilmesini sağlayan adım sallayan bir protokol geliştirdik. Seri agonist ekleme protokolü, histamin 1 reseptörünü (H1R) endojen bir şekilde ifade eden insan U-373 MG hücrelerinin mevcut örneğinde gösterildiği gibi, bir konsantrasyondan 10 veya daha fazla konsantrasyona kadar kuyu başına verimin önemli ölçüde arttırıldığı gibi. Böylece, yöntem önemli ölçüde etiketsiz doz-yanıt çalışmalarda iş bilgililik geliştirmek için potansiyele sahiptir, zaman çözünürlüğü enstrümantal maksimum korunur iken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Elektrot dizileri üzerinde hücre tohumlama
NOT: Elektrot düzeninin seçimi, hassaslık ve çalışıldaki hücre sayısı arasında bir dengedir. Elektrot ne kadar küçükse, ölçüm o kadar hassastır, ancak çalışıldaki hücre sayısı da o kadar küçüktür. Temel koşullar altında zaman içinde güçlü empedans dalgalanmaları gösteren hücreler için, daha büyük veya interdigitated elektrotlar tercih edilir.
- 37 °C'lik bir su banyosunda standart hücre geçişi ve tohumlama için gerekli tüm çözeltiler önceden ısıtın. İnsan U-373 MG hücreleri ile tahliller için alır: kalsiyum ve magnezyum olmadan fosfat tamponlu salin (PBS), %0.05 (w/v) tripsin, hücre kültürü ortamı (Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) %5 (v/v) fetal baldır serumu (FCS), 2 mM L-glutamin ve 100 μg/mL penisilin/streptomisin ile desteklenmiştir.
- Geleneksel hücre kültürü şişelerinin veya PBS'li tabakların altında yetişen stok kültürünün hücre tabakasını iki kez durulayın.
- PBS'yi çıkarın, tripsin çözeltisini ekleyin (25 cm2için 1 mL) ve hücrelerin 37 °C'de 5 dk (U-373 MG hücreleri için geçerlidir) kuluçkaya yatmasına izin verin.
- Mikroskop ile büyüme substrat altından hücrelerin tam ayrılması için kontrol.
- Hücreler tamamen ayrılır ayrılmaz trypsin reaksiyonu durdurun hücre süspansiyonuna 1 mL'lik trypsin başına 9 mL hücre kültürü ortamı ekleyin. Kalan hücreleri hücre kültürünün alt tabakasının altından süspansiyonu substrat üzerine borulayarak dikkatlice durulayın.
- Bir pipet ile hücre süspansiyon toplamak ve bir santrifüj tüpü (15 mL veya 50 mL tüp) aktarın.
- Oda sıcaklığında 10 dk için 110 x g santrifüj ile hücreleri aşağı spin.
- Hücreleri saymadan önce (örneğin faz kontrastmikroskopları ve manuel sayma için bir hemacytometre kullanarak) süpernatant'ı dikkatlice çıkarın ve kültür ortamındaki hücre peletini iyice askıya alın.
- Hücre süspansiyonuna istenilen hücre yoğunluğuna ayarlayın. U-373 MG hücreleri ile deneyler için, 48 saat içinde bir eşzamanlı hücre tabakası büyümek için 100 000 hücre/ cm2 kullanın. Bu~ 0.8 cm2 büyüme alanı ve 400 μL bir kuyu hacmi ile 8-iyi elektrot dizileri için 200 000 hücre / mL hücre yoğunluğu anlamına gelir.
NOT: Tekrarlanabilir GPCR aktivasyon deneyleri için hücreler elektrot dizileri üzerinde enfluent monolayers yetiştirilmelidir. Hücre yüzeyinde uygun reseptör ekspresyonu sağlamak için, hücreler deneyi gerçekleştirmeden önce en az 36 saat tohumlanmalıdır. Hücre tohumlama için farklı hücre yoğunluklarını test etmek genellikle en iyi deneysel koşulları belirlemek için anlamlıdır. - Hücre süspansiyonu elektrot dizisinin kuyularına ekleyin ve kuyuların altındaki hücrelerin homojen dağılımını sağlamak için 10 - 15 dk oda sıcaklığında satAmasına izin verin.
- Standart hücre kültürü kuvözlerinde 37 °C'de %5 CO2 (orta tipe bağlı) ve nemli atmosferde en az 36 saat hücre yetiştirin. Hücre kültürünü denemeden önce 24 saat önce değiştirin.
- Deney günü, elektrot dizileri üzerindeki hücre katmanlarını (faz kontrastı) mikroskobu yla inceleyerek elektrotların hücrelerle tam kapsama alanını sağlayın.
2. Serumsuz ortamda hücrelerin denkliği
- Pre-sıcak serum içermeyen orta, Bu çalışmada: Leibovitz's L15 orta.
- Elektrot dizileri üzerinde yetişen hücrelerden hücre kültürü ortamını çıkarın ve önceden ısıtılmış serumsuz ortamla değiştirin. 8-iyi formatlı elektrot dizileri için 200 μL ve 96 kuyulu elektrot dizileri için 150 l kullanın.
- Hücreler serumsuz ortamda 37 °C'de en az 2 saat eve gelsin. Denge süresi güçlü hücre türüne bağlıdır. Örneğin, U-373 MG hücreleri 2 saat, CHO hücreleri 4 saat, BAEC L-15 ortamda geceleme equilibration gerektirebilir gerekir.
NOT: L-15 orta CO2 bağımsız ve CO2-serbest bir atmosfer gerektirir. L-15'te denge için kuvöz % 0 CO2olarak ayarlayın. Denge empedans okumaları ile izlenebilir, ilk deneyler için yapmanızı öneririz.
3. Empedans okumaları ile hücre dengesinin izlenmesi
- Elektrot dizisini empedans analizörün bağlantı dizisi tutucuya yerleştirin.
- Elektrotlar ve empedans analizörü arasında uygun düşük empedans temasını sağlayın. Bu kontrol farklı enstrümanlar için ayrı ayrı farklıdır.
NOT: Cihaz elektrotlara bağlantı kuramazsa, kontak kıskacını tekrar açın, tutucunun içinde doğru konumlandırma için elektrot dizisini yeniden düzene sokun ve yeniden deneyin. - Yazılımın kullanıcı arabiriminden elektrot türünü ve/veya çok iyi biçimini seçin.
- Ölçüm parametrelerini ayarlayın. Farklı seçenekler mevcuttur.
NOT: En hassas AC frekansını seçmek için, çalışma aşamasındaki elektrot düzenine ve hücre tipine bağlı olarak literatür ve enstrüman kılavuzlarına başvururuz. Genellikle algılama frekansı 4 kHz – 50 kHz aralığındadır. Burada U-373 MG hücreleri 250 m çapında dairesel çalışan elektrotlar üzerinde yetiştirildi ve 12 kHz'lik AC frekansında izlendi.- Tek ve birden çok frekanslı veri toplama modları varsa, maksimum zaman çözünürlüğü sağlamak için tek frekans modunu seçin. Ölçüm bu tek frekansta yapılacaktır. En yaygın olarak yayılan araçlar için, kullanılabilir frekans penceresi boyunca önceden ayarlanmış frekanslar vardır.
- İncelenen kuyu sayısı düşükse veya zaman çözünürlüğü kritik değilse, bunun yerine birden çok frekans kaydı seçin. Daha sonra derinlemesine analiz için her kuyu için belirli sayıda frekansta empedans okumaları kaydedilecektir.
NOT: Kuyu başına kaydedilen frekans sayısının artması ve kuyu sayısının artmasıyla zaman çözünürlüğü azalır. Sıklık ve veri toplama modu seçimi seçenekleri enstrüman türüne ve sürümüne göre değişir.
- Zaman ders verilerinin edinimi başlatın.
- Empedans stabilize olana kadar hücre tabakası empedansını (en az 2 saat) takip edin. Bu arada agonist çözümleri hazırlayın.
- Hücre katmanları kararlı bir empedans düzeyine ulaştığında, (i) aynı deneydeki seri agonist eklemeye devam edin veya (ii) veri toplamayı sonlandırın ve agonist kaynaklı reseptör aktivasyonunu izlemek için yeni bir veri kümesi başlatın.
4. Agonist modda deneyler için agonist çözeltilerin hazırlanması
- (1) denklemine göre seri dosingin her adımı için gerektiği gibi agonist çözeltilerin konsantrasyonu hesaplayın. n, 1'den seri eklemelerin toplam sayısına kadar değişmektedir i. x, n. y adımdaki kuyudaki konsantrasyon ve hacim, adım n'deki "eklenecek çözeltinin" konsantrasyonu ve hacmini gösterir.
NOT: Çoğaltma sayısını göz önünde bulundurun ve her konsantrasyon adımı için "eklenecek çözüm" toplam hacmini hesaplayın. Tipik bir hesaplamanın sonuçları Tablo 1-4'teverilmiştir. Seri ekleme sırasında uygulanacak porsiyon konsantrasyonlarını ve sayısını tanımladığı için, agonist konsantrasyon aralığı hakkında genel bir fikir gerekir. Seri agonist ekleme protokolü kullanılarak agonist konsantrasyonu adım adım artar. Bu nedenle, bir sonraki doz eklendiğinde kuyuda zaten agonist miktarı dikkate alınmalıdır. Kuyuda zaten mevcut olan agonist moleküllerin sayısı nx = cx (akım konsantrasyonu cx ve hacim Vx)ve bir sonraki ilaveden sonra kuyudaki molekül sayısı nx+yolduğunda, ny eklenecek molekül sayısı, çözeltinin cy ve hacim Vy konsantrasyonu ile belirlenir (ny = cy » Vy). Agonistin bir kısmını ekledikten sonra, kuyudaki agonist moleküllerin yeni miktarı: cx+y • Vx+y = cx • V x + c y • Vx + cy • Vy. Bu hesaplama sonraki her adım için geçerlidir. Kuyudaki agonist konsantrasyonun karşılıklı bağımlılığı ve her adımda eklenecek porsiyonlarda agonist miktarı nedeniyle, her adımdan sonra nihai konsantrasyonları önceden tanımlamak önemlidir.
Mod 1: Sıvı sürekli olarak eklendikçe kuyudaki hacim her adımda artacaktır.
Bu modu ve 8-iyi formatı kullanarak Vx1 = 200 μL ve Vy1 .... Vyi = 30 μL kullanın.
Mod 2: Her adımla eklenen hacim sonraki eklemeden hemen önce kaldırıldığından, kuyudaki hacim sabittir.
Bu modu ve 96-iyi formatı kullanarak Vx1 = 150 μL ve Vy1 .... Vyi = 75 μL kullanın.
- Veri sayfasını konsantrasyon başına toplam hacim ve pipetleme için ayrıntılı talimatlar içeren yazdırın.
- Tüm çözümleri istenilen miktarda hazırlayın. Hücrelerin dengeiçin kullanılan aynı serum içermeyen ortamda tüm agonist çözümler olun.
DİkKAT: Histamin dihidroklorür 2012 OSHA Tehlike İletişim Standardı (29 CFR 1910.1200) tarafından tehlikeli kabul edilir. Histamin cilt tahrişine, ciddi göz tahrişine neden olur, alerjik bir cilt reaksiyonuna, alerjiye, astım semptomlarına veya solunduğunda solunum güçlüğüne neden olabilir ve solunum tahrişine neden olabilir. Lütfen güvenlik veri sayfasını göz önünde bulundurun.
NOT: Agonist çözümleri mümkün olduğunca taze yapın. Çözümde agonistlerin kararlılığı önemli ölçüde değişebilir. Deneyde kullanıma kadar çözümleri 4 °C veya altında saklayın. Bazı moleküller için ek stabilizasyon katkı maddeleri, Peptit bazlı veya lipid bazlı moleküller kullanırken BSA gibi, kuyu ve tüplerin duvarlarına adsorpsiyon önlemek için düşünülebilir. - Deneyi 96 iyi formatta gerçekleştirecekseniz, çözümleri geleneksel 96 kuyulu bir plakaya (elektrot yok) aktarın ve elektrot dizisine hızlı sıvı transferi için 8(veya 12-) kanallı pipet kullanın.
5. Antagonist modda deney için agonist çözümlerin hazırlanması
NOT: Antagonist çözeltiyi(ler) boyunca uygulanacak konsantrasyonla hazırlayın. Antagonist çözeltinin hacmi ve konsantrasyonu agonist ekleme nin moduna bağlıdır (1 veya 2). Ek mod 2'de 8 kuyulu veya 96 iyi formattaki deneylere örnekler: (A) 8-iyi format (Vx1 = 200 μL, VAntagonist = 200 μL); (B) 96-iyi format (Vx1 = 150 μL, VAntagonist = 75 μL).
- 4.1 adımda açıklandığı gibi seri dosingin her adımı için gereken her agonist çözeltinin konsantrasyonunun hesaplanacağını hesaplayın.
- Hücrelerin dengede kullanılan aynı serum içermeyen ortamda tüm agonist çözümleri yapın ve antagonisti deneydeki ilgili kuyular için planlandığı gibi aynı son konsantrasyonda ekleyin.
NOT: Bu durumda histamin stok çözeltisi (10 mM) L-15 ortamda hazırlanır. Agonistler diğer çözücülerde (örneğin, dimetil sülfoxid (DMSO) çözündüğünde, her bir ilave adımda artan çözücü yükünü hesaba katmak için bir çözücü kontrolü eklenmelidir.
6. Seri ekleme protokolünü agonist modda gerçekleştirmek
- 3.1 - 3.5 adımlarında açıklandığı gibi veri toplamayı başlatın.
- Eklemeden önce yaklaşık 10 -15 dk kala kuvöze yerleştirerek agonist çözümleri kullanmadan önce ısıtın.
NOT: Termo-labile maddeler kullanılırken çözeltiler 37 °C'de çok uzun süre tutulmamalıdır. 10 - 15 dk için ön ısınma kritik kabul edilirse, bir su banyosuna ilave edilmeden kısa bir süre önce 37 °C'ye çözeltiler getirin. - Seçili ekleme moduna bağlı olarak agonist seri dosing çalıştırın. Aşağıdaki mod 1 kuyudaki toplam hacim bir sonraki dozun her eklenmesiyle artar. Mod2'de her adımla eklenen aynı hacim de bir sonraki yüksek dozu eklemeden hemen önce tekrar kaldırılır.
NOT: Hücre tabakasının sonraki iki agonist dozda dengelemi için gereken süre, hücrelerin yanıt süresine bağlıdır. Paralel modda yapılan bir ilk deney (bir kuyu – bir konsantrasyon) (i) hücre yanıt sürelerini farklı agonist konsantrasyonlar için ve (ii) en hassas eğri parametresini (örn. empedans maksimum, zaman x'ten sonra empedans) ortaya çıkarır.
C: Mod 1 / 8-iyi biçim
- Serumsuz ortamda 200 μL'lik bir ortamda dengelendirilen hücrelere en düşük agonist konsantrasyonuna sahip ilk çözeltinin 30 μL'sini ekleyin.
- Hücrelerin yanıt vermesine ve önceden tanımlanmış bir süre için dengede durmasına izin verin (örn. 15 dk).
- Bir sonraki yüksek konsantrasyonla ikinci çözeltinin 30 000'ini ekleyin.
- Üçüncü, dördüncü ve benzeri agonist çözümle 6.3.1-6.3.3 adımlarını tekrarlayın.
NOT: 10 konsantrasyon adımı ile çalışmak, deney sonunda toplam 500 μL hacim sağlayacaktır, bu da ~ 550 μL'lik bu kuyuların maksimum geçerli hacminin hemen altındadır.
B: Mod 2 / 96-iyi format
NOT: 96-iyi formatta denemeler çalıştırırken empedans aletinin yazılımı aracılığıyla her sıvı işleme adımında veri toplamayı duraklatın (ekleme/kaldırma). Daha ayrıntılı sıvı işleme veri toplama engelleyebilir. Çok kanallı pipet kullanın.
- Veri toplamayı duraklatın.
- Serumsuz ortamda 150 μL'lik bir ortamda dengelendirilen hücrelere en düşük agonist konsantrasyonuna sahip ilk çözeltinin 75 μL'sini ekleyin.
- Veri toplamayı devam ettirin.
- Hücrelerin yanıt vermesine ve önceden tanımlanmış bir süre için dengede durmasına izin verin (örn. 15 dk).
- Normal denge süresi nin sona ermeden yaklaşık 1 – 2 dakika önce, ölçümü duraklatın ve her kuyudan 75°L çıkarın.
NOT: Çözeltinin çıkarılması gereken zaman noktası paralel olarak izlenen kuyu sayısına ve borulama hızına bağlıdır. Çözümlerin kaldırılması için gereken süre sonraki adımlar arasındaki süreyi aşmamalıdır. - Bir sonraki yüksek konsantrasyonla ikinci çözeltinin 75 0L'sini ekleyin ve ölçüme devam edin.
- Üçüncü, dördüncü ve benzeri agonist çözümle 6.3.8-6.3.10 adımlarını tekrarlayın.
7. Antagonest modda seri ekleme protokolünün gerçekleştirilmesi
- 3.1 - 3.5 adımlarında açıklandığı gibi ölçümü başlatın.
- Hücre tabakalarının dengelenirken, antagonist çözelti (örneğin, 200 μL 1.5 μM difenhidramin hidroklorür L15 ortamda) hazırlayın.
DİkKAT: Difenhidramin hidroklorür potansiyel akut sağlık etkileri vardır. Yutulması veya solunması zararlıdır, göz ve cilt tahrişine neden olabilir. Solunum ve sindirim sistemi tahrişine neden olabilir. Lütfen güvenlik veri sayfasını göz önünde bulundurun. - Hücre kültürleri (cf. 6.2) eklemeden önce yaklaşık 10 - 15 dakika kuvözde yerleştirerek antagonist ve agonist çözeltileri önceden ısıtın. Antagonist içermeyen kuyular da tahtta yer alıyorsa, önceden ısınan serumsuz ortam da.
- Belirlenen kuyulara antagonist çözümü ekleyin. Hücreler 15 - 20 dakika boyunca antagonist ile dengeleyelim. Antagonist içermeyen kuyular da dahil sayılsa, bu kuyulara aynı miktarda serumsuz ortam ekleyin.
- Mod 2'dekiantagonist eklemeye göre, kuyulardan çözelti kaldırın
(A) 8 kuyu formatı (200 μL)
(B) 96-iyi format (75 μL) - Adım 6.3'te açıklandığı gibi agonist ekleme sırasını çalıştırın.
8. Veri ihracatı ve analizi
- Empedans aracının yazılımını kullanarak, kayıtlı tüm verileri ortak veri biçimlerine (örn. csv) dönüştürmek için veri aktarın. Bu adım, diğer yazılım paketleriyle verilerin yeniden düzenlenmesine ve sunulmasına olanak tanır.
- CSV biçimli verileri bilimsel veri analizi yazılımına yükleyin.
- Agonist çözeltinin ilk eklenmesinden önce son veri noktasının empedansını çıkararak ve t = 0'a ekleme süresini ayarlayarak empedans değerlerini normalleştirin. Normalleştirilmiş empedanszaman rotasını çizin.
- Her zaman derslerini çizin ve her ekleme adımından sonra empedansta maxima'yı tanımlayın. Bu değerlerle bir veri sayfası oluşturun.
- Agonist konsantrasyonun bir fonksiyonu olarak maksimum (veya varsa minimum) empedans değişikliklerinin değerlerini çizin. Bu bireysel kuyular veya ortalamalar (ortalama ± SD) için yapılabilir.
- Dört parametreli lojistik modeli (denklem 2) kullanarak yarı maksimal etkin konsantrasyonları (EC50)ve maksimum yanıt (EMax)belirlemek için veri uydurma yordamı kullanın:
NOT: c agonist konsantrasyonu gösterir, A1 minimum ve A2 sigmoidal doz-yanıt eğrisi maksimum asimptot olduğunu (A2 = EMax). EC50 eğrinin dönüm noktasındaki konsantrasyondur ve n Tepe eğimine karşılık gelir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çeşitli agonist çözümleri hazırlamak için tipik bir şema Tablolar 1-4agonist olarak histamin ile 8-iyi elektrot dizileri kullanarak bir deney için gösterilir. Tablo 1 ve Tablo 2, ek modu 1 (cf., Şekil 1)kullanılarak bir deney için mevcut hacimleri ve konsantrasyonları bulunurken, Tablo 3 ve Tablo 4 ek modu 2'yi izleyen bir deney için hacimleri ve konsantrasyonları sunar (cf., Şekil 1). Veriler denklem (1) kullanılarak hesaplanmıştır.
Histamin agonist olarak histamin kullanılarak çalışan elektrotile 8 kuyulu elektrot dizisinde yetiştirilen histamin 1 reseptörünü endojen olarak ifade eden U-373 MG hücrelerinin konfluent katmanları için Şekil 2'de temsili bir deney gösterilmiştir. Ölçüm 12 kHz tek frekansta yapıldı. Agonist konsantrasyon serisinin eklenmesi mod 1'densonra yapıldı. Seçilen deneyde histamin konsantrasyonunu artıran 10 çözelti (adım 4'e göre hazırlanır) her 15 dakikada bir sırayla eklenmiştir(Şekil 2A). Seri dosing şeması sekiz kuyunun yedisine uygulandı. Bir iyi agonist-free orta (L-15) on adımdokuz da negatif kontrol olarak sırayla eklendi. Bu kontrole son eklenen bir histamin çözeltisi kuyuda 100 μM histamin son konsantrasyonu sağlayan oldu. Veriler veri analizi yazılımı ile çizilmiştir ve empedans değişimi δ| Z| Deney boyunca 12 kHz / kΩ, empedans değişimi ve ilk eklemenin zaman noktası sıfıra ayarlanır. 2 saatlik deneysel arabellekteki ilk denge süresi bu çizimde gösterilmez. Agonist eklemenin zaman noktaları oklarla gösterilir.
Her konsantrasyon adımı bir veri imleci kullanılarak eğrilerden çıkarıldıktan sonra taban çizgisine göre empedans değişimi. Net bir maksimumu olmayan adımlarda, bir sonraki eklemeden önceki son veri noktası çözümleme için kullanılmıştır. Empedans değişiklikleri Δ| Z| 12 kHz histamin konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmiştir (cx+y) (Şekil 2B, semboller). Dört parametreli lojistik modelin aktarım işlevi (cf. adım 8.6) yedi kuyudan(Şekil 2B, çizgiler) gelen deneysel veri noktalarına takıldı. Uyum sonuçları Tablo 5'tegösterilmiştir. Şekil 2C ve Şekil 2D, Şekil 2A ve Şekil 2B'dekiverilerin ortalamasını gösteren ± SD ortalamasını yedi kuyu için göstermektedir. Ortalama ders verileri Şekil 2C'deözetlenirken, ortalama doz-yanıt eğrisi Şekil 2D'deverilmiştir.
Şekil 2B,D'degösterildiği gibi doz-yanıt ilişkilerinde, montaj prosedürü EC50 = (0.86 ± 0.13) μM dönen tüm konsantrasyon aralığına uygulandı. Empedans tepkisi son iki konsantrasyon adımı (30 μM, 100 μM son konsantrasyon) dışında histamin konsantrasyonunu artırarak monoton olarak artar. Bu yanıt muhtemelen histamin reseptörünün aşağıregülasyonu, duyarsızlaştırma veya hücrelerin aşırı uyarılması ile açıklanır (bkz. tartışma). Bu etkiyi hesaba katmak için, tek bir seri dosing deneyi(Şekil 3; kuyu 1) şekil 2'degösterilen verilerden seçildiği gibi analiz için veri aralığı azaltılmıştır. Ayrıca, 0 μM histamin yanıt hiçbir empedans değişikliği varsayarak en az kare optimizasyon sırasında alt asimptot ayarı(A1) sıfıra iyi haklı. Bu üç parametre optimizasyonu uygulanarak BIR EC50 sağlar (0.75 ± 0.12) μM (cf., Şekil 3B). EC50 değerlerinin veri analizi modlarının her ikisi için de duyarsız olduğu ve önemli ölçüde farklı olmadığı bulunmuştur.
96 kuyulu bir plaka deneyinin tipik sonuçları Şekil 4'teözetlenmiştir. U-373 MG hücreleri yukarıda açıklandığı gibi 96-iyi elektrot dizileri üzerinde yetiştirilen edildi. Ölçüme 32 kuyu dahil edildi. 8 kuyu agonist içermeyen kontroller olarak hizmet, sadece orta maruz. 24 kuyu, ek mod 2 için hesaplanan ve hazırlanan bir dizi artan histamin konsantrasyonuna maruz kalındı. Empedans değişiminin zaman dilimi Şekil 4A'daki32 ayrı kuyunun tümü için gösterilir. Eğrilerden biri (kırmızı ile vurgulanmış) alışılmadık bir zaman rotası gösterir ve daha fazla analiz dışında tutulmuştu. Buna göre, Şekil 4B'deortalama empedans değişiminin (ortalama ± SD) zaman dilimi olarak 23 kuyudan elde edilen veriler ortalamalanmış ve çizilmiştir. Her bir eğri doz-yanıt ilişkisi için yukarıda açıklandığı gibi analiz edildi. Veri noktaları son histamin konsantrasyonunun fonksiyonu olarak ortalamalanmış ve çizilmiştir(Şekil 4C). Doz-yanıt verileri, ortalama EC50 değeri (1.0 ± 0.3) μM olan dört parametreli lojistik model ile analiz edildi.
Antagonest modda seri agonist ekleme protokolü için tipik bir sonuç Şekil 5'tegösterilmiştir. Burada, bir kuyu ilk histamin eklenmeden önce histamin reseptör antagonisti difenhidraminin (kırmızı eğri) 20 dk 0.75 μM ile ön tedavi edildi(Şekil 5A). Kontrol antagonist içermeyen orta (mavi eğri) aldı. Antagonist, agonist seri uygulanmadan önce sonunda 400 μL'nin 200 μL'sinin çıkarıldığı anlamına gelen mod 2'yeaşağıdaki şekilde eklenmiştir. Agonist (histamin) yukarıdaki örneklerde açıklandığı gibi seri dosing modu 1 aşağıdaki eklendi. Antagonist modda yapılan deneylerde antagonist konsantrasyonun deney boyunca sabit tutulması önemlidir. Buna göre, kuyuya eklenen tüm agonist çözeltiler önceden tanımlanmış antagonist konsantrasyonu da içermelidir (bu durumda, 0.75 μM), kontrol antagonist içermez. Bir antagonistik etkisi bir hücre yanıtı ikna etmek için gerekli daha yüksek agonist konsantrasyonları karşılık gelen seri dozlama düzeni içinde empedans "gecikmiş" bir artış ile belirgin hale gelir. Doz-yanıt ilişkisinde antagonistin etkisi eğrilerin sağa kayması olarak ifade edilir, bu da EC50'dekiartışa karşılık gelir , antagonistin agoniste göre rekabetçi bir ligand olması koşuluyla (Şekil 5B). EC50, antagonist yokluğunda (0.92 ± 0.05) μM ve varlığında (14.7 ± 0.6) μM olarak belirlendi.
Şekil 1: Seri agonist ekleme modları. (A) Konsantrasyon hesaplamalarını gösteren şematik. Hacim Vx ve agonist konsantrasyon cxile bir kuyuya konsantrasyon cy ve hacim Vy agonist çözeltisi ekleyerek, hacim Vx+y artar ve konsantrasyon cx +yartar . (B) Seri agonist eklenmesi için iki farklı mod. Mod 1: Kuyu Vx+y'deki toplam hacim her eklemede artar. Mod 2: Her konsantrasyon adımında eklenen hacim, bir sonraki doz eklenmeden önce tekrar çıkarılır ve bu da toplam hacmi kuyudaki sabit tutar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tipik bir deneyin 8-iyi formatında sonuçları. (A) 250 m çapında dairesel çalışan elektrotlar üzerinde yetişen confluent U-373 MG hücre tabakaları için 12 kHz empedans değişimi zaman değişimi. Sekiz kuyunun yedisinde histamin seri ilavesi uygulandı. 100 μM histamin pozitif kontrol olarak eklendiğinde son adım dışında, her adımda (mod 1) histaminiçermeyen tampon ile bir kuyu (gri eğri) sırayla yüklendi. (B) Her konsantrasyon adımından sonra yedi kuyunun taban çizgisine göre maksimum empedanstan oluşan doz-yanıt ilişkileri. (C) Empedans değişiminin ortalama zaman seyri (ortalama ± SD) yedi ayrı kuyudan(A)gösterildiği gibi oluşturulur. ( D )(B)olarak gösterildiği gibi tektek veri kümelerinden oluşturulan ortalama doz-yanıt ilişkileri . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Veri analizi modlarının uyarlamı. (A) 250 μm çapındaki dairesel çalışan elektrotlar üzerinde yetişen tek bir konfluflufluent U-373 MG hücre tabakası için 12 kHz'de tipik zaman değişimi. (B) Her konsantrasyon artışından sonra taban çizgisine göre maksimum empedanstan oluşan deneysel doz-yanıt ilişkisi (dolgulu semboller). Ya tam veri seti montaj prosedürüne (siyah ve gri eğri) tabi tutuldu ya da son veri noktası - reseptör duyarsızlaştırma ve/veya içselleştirmenin başlangıcını gösteren - nicel analizden (kırmızı ve macenta eğrisi) çıkarıldı. Dört parametre de en az kare optimizasyonu (siyah ve kırmızı eğri) veya alt asimptot'u temsil eden A1 parametresi sırasında ayarlandı ve sıfıra sabitlendi (gri ve macenta eğrisi). İKI veri analizi modu için EC50 değerleri önemli ölçüde farklı değildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 96-iyi formatında tipik deney. (A) 96 kuyulu elektrot dizisinde yetişen u-373 MG hücre tabakaları için 12 kHz olarak ölçülen empedans değişiminin zaman akışı. Veriler 32 kuyu için gösterilir. 24 kuyu, her adım arasında 15 dk'lık bir denge süresiyle eklenen bir dizi artan histamin konsantrasyonuna maruz kaldı. Kırmızı ile vurgulanan eğri ortalamanın dışında tutuldu. Sekiz kuyu (kontrol) ek her zaman noktada histaminiçermeyen orta ile tedavi edildi. (B) Histamin seri ilavesine yanıt olarak 23 ayrı kuyu ve(A)gösterildiği gibi sekiz kontrol kuyusu için ortalama empedans değişiminin zaman dilimi . (C) Her konsantrasyon artışından sonra taban çizgisine göre maksimum empedans değişiminden oluşan ortalama doz-yanıt ilişkisi (ortalama ± SD). Veriler dört parametrelojistik fonksiyonu ile donatılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Antagonist modda tipik deney. (A) Histamin reseptör antagonistdimi difenhidramin infilak ı veya histamin konsantrasyonlarının artması üzerine 250 μm çapındaki dairesel çalışan elektrotlar üzerinde yetişen konfluent U-373 MG hücre tabakaları için 12 kHz'de empedans değişimi süresi. Difenhidramin (0.75 μM) veya antagonistsiz ortam (L15) agonist seri dosing başlamadan 20 dakika önce eklendi. (B) (A)'da gösterilen verilerden her konsantrasyon artışından sonra taban çizgisine göre maksimum empedanstan oluşan doz-yanıt ilişkileri. 0,75 μM Difenhidramin varlığı EC50'yi (0,92 ± 0,05) μM'den (14,7 ± 0,6) μM'ye yükseltti.
| Çözüm # | cx+y (μM) | cx (μM) | Vx (3L) | Vx+y (3L) | Vy (3L) | cy (μM) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 230 | 30 | 0.08 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 230 | 260 | 30 | 0.79 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 260 | 290 | 30 | 2.03 |
| 4 | 1 | 0.3 | 290 | 320 | 30 | 7.77 |
| 5 | 3 | 1 | 320 | 350 | 30 | 24.33 |
| 6 | 10 | 3 | 350 | 380 | 30 | 91.67 |
| 7 | 30 | 10 | 380 | 410 | 30 | 283.33 |
| 8 | 100 | 30 | 410 | 440 | 30 | 1056.67 |
Tablo 1: Ek mod 1'i takip eden 8 kuyulu elektrot dizileri kullanılarak yapılan deneyler için konsantrasyon hesaplama şeması.
| Çözüm # | cy (μM) | Vy (3L) | dan yapmak | c (μM) | seyreltme faktörü | toplam V (3l) yapmak | kullanımı (3l) | V ekle (3l) |
| 1 | 0.08 | 30 | 3 | 2.03 | 26.52 | 600 | 22.6 | 577.4 |
| 2 | 0.79 | 30 | 4 | 7.77 | 9.83 | 600 | 61 | 539 |
| 3 | 2.03 | 30 | 5 | 24.33 | 11.97 | 600 | 50.1 | 549.9 |
| 4 | 7.77 | 30 | 6 | 91.67 | 11.8 | 600 | 50.8 | 549.2 |
| 5 | 24.33 | 30 | 7 | 283.33 | 11.64 | 600 | 51.5 | 548.5 |
| 6 | 91.67 | 30 | 8 | 1056.67 | 11.53 | 600 | 52.1 | 547.9 |
| 7 | 283.33 | 30 | 8 | 1056.67 | 3.73 | 600 | 160.9 | 439.1 |
| 8 | 1056.67 | 30 | 10 mM Stok | 10000 | 9.46 | 800 | 84.5 | 715.5 |
Tablo 2: Ek mod 1'i takip eden 8 kuyulu elektrot dizileri kullanılarak yapılan deneyler için pipetleme şeması.
| Çözüm # | cx+y (μM) | cx (μM) | Vx (3L) | Vx+y (3L) | Vy (3L) | cy (μM) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 400 | 200 | 0.02 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 200 | 400 | 200 | 0.19 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 200 | 400 | 200 | 0.5 |
| 4 | 1 | 0.3 | 200 | 400 | 200 | 1.7 |
| 5 | 3 | 1 | 200 | 400 | 200 | 5 |
| 6 | 10 | 3 | 200 | 400 | 200 | 17 |
| 7 | 30 | 10 | 200 | 400 | 200 | 50 |
| 8 | 100 | 30 | 200 | 400 | 200 | 170 |
Tablo 3: Ek mod 2'yi takip eden 8 kuyulu elektrot dizileri kullanılarak yapılan deneyler için konsantrasyon hesaplama şeması.
| Çözüm # | cy (μM) | Vy (3L) | dan yapmak | c (μM) | seyreltme faktörü | toplam V (3l) yapmak | kullanımı (3l) | V ekle (3l) |
| 1 | 0.02 | 200 | 3 | 0.5 | 25 | 1000 | 40 | 960 |
| 2 | 0.19 | 200 | 4 | 1.7 | 8.95 | 1000 | 111.8 | 888.2 |
| 3 | 0.5 | 200 | 5 | 5 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 4 | 1.7 | 200 | 6 | 17 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 5 | 5 | 200 | 7 | 50 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 6 | 17 | 200 | 8 | 170 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 7 | 50 | 200 | 8 | 170 | 3.4 | 1000 | 294.1 | 705.9 |
| 8 | 170 | 200 | 200 μM Stok | 200 | 1.18 | 1300 | 1105 | 195 |
Tablo 4: Ek mod 2'yi takip eden 8 kuyulu elektrot dizileri kullanılarak yapılan deneyler için pipetleme şeması.
| Şey, | EC50 | Emax (=A2) | A1 | n |
| (μM) | (kΩ) | (Ω) | ||
| 1 | 0.9 ± 0.1 | 1680 ± 70 | 150 ± 80 | 1.9 ± 0.5 |
| 2 | 0.7 ± 0.2 | 1770 ± 90 | 200 ±140 | 1.3 ± 0.4 |
| 3 | 0.6 ± 0.2 | 1700 ± 100 | 60 ± 250 | 1.1 ± 0.5 |
| 4 | 0.6 ± 0.2 | 2000 ± 100 | 140 ± 180 | 1.3 ± 0.4 |
| 5 | 0.9 ± 0.1 | 1810 ± 60 | 160 ± 80 | 1.4 ± 0.3 |
| 6 | 0.8 ± 0.1 | 1950 ± 70 | 200 ± 110 | 1.3 ± 0.3 |
| 7 | 0.6 ± 0.3 | 1700 ± 200 | 260 ± 250 | 1.6 ± 1.0 |
| 1 – 7 | 0.7 ± 0.2 | 1900 ± 100 | 100 ± 100 | 1.1 ± 0.2 |
Tablo 5: Tipik doz-yanıt verilerine uygulanan dört parametreli lojistik krizden elde edilen sonuçlar. Analiz için kullanılan doz-yanıt verileri Şekil 2'devetifada sunulmuştur. Tam konsantrasyon aralığı, 1'den 7'ye kadar olan kuyuların analizine(Şekil 2B)ve 1'den 7'ye kadar olan kuyulardan elde edilen ortalama veriler için(Şekil 2D)uygulanmıştır. Lojistik fonksiyonunun parametrelerinin hiçbiri en az kare optimizasyonu sırasında düzeltilmedi. Uygun sonuçlar, değerin hatadan daha küçük olması dışında, hatanın on yılı için yuvarlandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, aynı reseptör için özel antagonistlerin yokluğunda veya varlığında agonist indüklenen GPCR aktivasyonunun doz-yanıt ilişkisini belirlemek için etiketsiz empedans ölçümleri için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu yöntemin kavramının kanıtı yeni bir yayındasunulmuştur 12. Bilgimiz için in vitro tek bir hücre tabakası kullanarak agonist aracılı GPCR aktivasyonu tam doz-yanıt eğrisi kurulması açıklayan ilk çalışmadır. Bu yaklaşım kaçınılmaz olarak etiketsiz hücre izleme yaklaşımlarının kullanılmasını gerektirir ve uç nokta tahlillerine uygulanmaz.
Protokol U-373 MG hücreleri örneğinde gösterilmiştir, hangi endojen insan histamin ifade 1 reseptörü (hHR1) hücrelerin empedans sürekli kaydedilir iken onun endojen agonist histamin artan konsantrasyonları bir dizi ile uyarılır. Protokolün antagonist çalışmalara uygulanabilirliğini göstermek için deneyler, hH1R'ın rekabetçi bir antagonisti olan sabit bir difenhidramin konsantrasyonu karşısında tekrarlandı. Empedans kayıtları da başarıyla diğer H1R agonistleri (örneğin, UR-KUM53011, bireysel ve adım sallayarak) ve antagonistler (örneğin, Mepyramine)12 burada gösterilen örneklere ek olarak çalışma için kullanılmıştır. Ayrıca protokol diğer hücre hatlarına ve reseptörlere de uygulanmıştır, örneğin dopamin D2 reseptörünü ifade eden CHO-D2R (D2R) veya BAEC ß2-adrenerjik reseptörü (ß2AR)12 doz-yanıt verilerinin çok verimli üretimi için genel bir şema sunduğunu gösteren. U373-MG ve BAEC hücreleri ilgili h1R ve ß2AR reseptörlerini endojen düzeylerde ifade ederken, CHO-D2R rekombinant hücre modeline örnektir. Birlikte ele alındığında, seri protokol genel olarak endojen veya ektopik GPCR ekspresyonu olan hücre tipleri için geçerlidir, farklı kaplin tipleri Gq (örneğin, H1R), Gs (örneğin, ß2AR),G i (örneğin, D2R) yanı sıra farklı ligand türleri (agonist/antagonist) ile GpCR' ler. Yukarıda bahsedilen tüm bu hücre/reseptör tiplerinde empedans artan agonist konsantrasyonu ile artar. Ancak, bazı hücreler bir empedans azalma gpcr aktivasyonu yanıt. Protokolü böyle bir durum için test ettik (HaCaT/histamin) ve aynı zamanda konsantrasyona bağlı bir adımsal düşüş bulduk, bu da ters empedans değişiklikleri ile uyumlu genel olarak uygulanabilir bir yaklaşım kavramını destekleyen. Empedans verilerinin ayrıntılı zaman seyrinin belirli bir reseptörün G-protein kaplininin türünü gösterdiği öne sürülmuştur. Konsept çekici olsa da, veri havuzu, empedans zaman profilini belirli bir GPCR6'nınG-protein kaplini ile ilişkilendiren genel olarak uygulanabilir bir kuralı desteklemez.
Seri ekleme protokolü, farklı türde elektrot düzenleri ve çok kuyulu biçimlere uyarlanabilir. Bu, genellikle bir konsantrasyon için test edilmesi için tek bir hücre katmanı gerektiren birçok etiket tabanlı yaklaşımlar üzerinde önemli bir avantaj dır on-chip perfüzyon sistemleri için geçerlidir. Buna göre, seri dozlama şeması organ-on-a çip ve hatta insan-on-a-chip yaklaşımlar gibi daha karmaşık biyolojik modellerde doz-yanıt çalışmaları için yol açabilir. Empedans ölçümleri, hücrelerin reseptör aktivasyonuna entegre, distal yanıtını algılar ve bu da hücre morfolojisi değişikliklerine neden olur. Bu oldukça genel ve spesifik olmayan ama aynı zamanda tarafsız okuma GPCR ile sınırlı değildir ama aynı zamanda hedef olarak hücre yüzey reseptörleri, sitoplazmik reseptörleri ve hatta hücre içi proteinlerin diğer sınıflar için çalışabilir geniş uygulanabilirlik için temelidir.
Seyrek kültürler duyarlılık, tekrarlanabilirlik ve veri yorumlanması ile müdahale edecek gibi, elektrotlar üzerinde confluent hücre katmanları ile çalışmak için üvey agonist ek protokolü için önemlidir. Konfluent hücre monokatmanlarında bile reseptör aktivasyonunun başarılı bir şekilde izlenmesi için ek bir ön koşul sinyal transdüksiyon kaskad boyunca hücre şeklinde bir değişikliktir. Eğer çalışma altındaki hücreler deney boyunca morfolojilerini değiştirmezlerse, empedans tabanlı okumalar kördür ve reseptör aktivitesinde herhangi bir değişiklik rapor etmezler. Seri ekleme protokolünü düzgün bir şekilde düzene sokabilmek için, geleneksel bir-iyi bir konsantrasyon modunda ilk ön test, agonistin konsantrasyon aralığını kabaca ve sonraki agonist eklemeler arasındaki zaman aralığını belirlemek için önerilir. Agonistin ardışık dozları arasındaki zaman aralıkları, sistemin bir sonraki nden önce yeni bir dengeyi benimseyecek şekilde uyarlanmalıdır, daha yüksek doz eklenir. Buna göre, yöntem hücrelerin çok hızlı ve sadece geçici yanıt veya tamamlamak için saat sürebilir çok yavaş bir yanıt tetikleyen reseptörler için daha az yararlı olabilir. İkinci durum, denemenin toplam süresini artıracak ve laboratuvar süresini kısaltmak için paralel ekleme protokolleri çağrısında bulunacaktır. Yukarıda sunulan örneklerde, deneyin toplam çalışma süresi konsantrasyon sayısına (8 veya 10) ve antagonist ile potansiyel bir ön kuluçkaya bağlı olarak 2,5 - 3,5 saat idi. Konvansiyonel paralel agonist ekleme modunda aynı deney sadece aynı hücre reseptör modeli için ~ 1 saat alacak ama çok daha küçük bir iş kolu ile. Seri yaklaşımın açık bir avantajı, tam doz-yanıt ilişkisi için test edilmesi gereken konsantrasyonların sayısımevcut kuyu sayısı ile sınırlı değildir. Daha yüksek agonist konsantrasyonları gerekiyorsa, deney kolayca uzatılabilir ve herhangi bir ek hücre kültürü çalışması olmadan tamamlanır. Bazı hücreler kesme stresine duyarlı olduğundan ve sadece sıvı işlemenin dayattığı mekanik stimülasyon nedeniyle önemli empedans değişiklikleriyle yanıt verdiğinden, agonist eklemenin kendisi dikkatle yapılmalıdır. Hücreler elektrottan bile çıkabilir. Ancak bu sorun empedans tabanlı hücre takibine özgü değildir, ancak diğer teknikler için de geçerlidir. Hassas hücreler için toplama modu 1 hücrelerüzerindeki mekanik yükün azalması nedeniyle önerilir. Ancak, bu mod, yoğun ajitasyon belirli olmayan hücre yanıtları önlemek için tavsiye edilmez beri eksik karıştırma riskini yükseltir ek sırasında düşük sıvı hacimleri ile çalışır.
Toplama modu 1 kuyudaki toplam hacmin adım adım artmasıyla birlikte giderken, mod 2, eşit miktarda çözelti sırayla kaldırıldığından toplam hacmi sabit tutar. Bunlar sadece iki ekstrem stratejidir ve özel hücre tipleri, çok iyi biçimler veya herhangi bir ara yoldaki elektrot düzenleri için uyarlanabilir. U373-MG/H1R modelinde seri ekleme modu için seri ekleme modu için geleneksel paralel ekleme moduna göre EC50 ve EMax değerlerinde hafif farklılıklar gözlenmiştir (seri, N = 30: EC50: (0.8 ± 0.3) μM, EMax: (1.9 ± 0.2) kΩ; paralel, N = 15: EC50: (0.5 ± 0.2) μM, EMax: (1.3 ± 0.3) kΩ), diğer hücre/reseptör modelleri ise herhangi bir fark göstermedi. EC50 ve EMax değerlerindeki değişimler, reseptörler agonisine daha uzun süre maruz kaldığında oluşma olasılığı daha yüksek olan reseptör duyarsızlaşmasından kaynaklanabilir. Duyarsızlaştırma etkisi kuvvetle reseptör ve çalışma altında ligand bağlıdır. Seri ve paralel agonist eklenmesinin ayrıntılı bir analizinin reseptör duyarsızlaştırmasını incelemek için yeni bir araç sağlayıp sağlayamadığı açıklığa kavuşturulacak.
Doz-yanıt eğrilerinde olası değişimleri test etmek için geleneksel paralel mod agonist ekiyle bir kontrol deneyi yapmanızı öneririz. Diğer kontroller, orta ilave üzerine solvent yükü veya mekanik stres nedeniyle oluşabilecek etkileri çözmek için uygun dozlarda sadece orta/çözücü ile işlenmiş bir numuneiçermelidir. Ligand'ın stok çözeltisi orta dan başka çözücülerde (örneğin, DMSO, etanol) hazırlanırsa bu özellikle önemlidir. Farklı ligandların etkisini araştırırken standart bir agonist referans olarak eklenmelidir.
Gelecekteki yönler, tamamen otomatik dozlama veya titrasyona izin verebilecek otomatik sıvı işleme ünitelerini içermelidir. Perfüzyon sistemlerinde seri ekleme modunun uygulanması, talaş üzerine laboratuvar ve çip üzerine organ yaklaşımlarının yanı sıra sıvı kesme stresi altında yapılan deneyler için de büyük bir potansiyele sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Barbara Goricnick ve Nadja Hinterreiter'e hücre culturing ve deneysel çözümlerin hazırlanması nda yardımcı olan lara teşekkür ederiz. Yazarlar minnetle Araştırma Eğitim Grubu 1910 "seçici GPCR ligands tıbbi kimya" Alman Araştırma Vakfı (DFG) hibe numarası 222125149 altında finanse mali destek kabul. JAS özellikle Bavyera Cinsiyet Eşitliği Programı tarafından verilen bir burs için minnettar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | |
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 - 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 - 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) | \ |
References
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs. Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).
- Kaitin, K. I. Deconstructing the drug development process: The new face of innovation. Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).
- Kenakin, T. P. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).
- Scott, C. W., Peters, M. F. Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening. Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophysical Journal. 91, 16 (2006).
- Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).
- Lieb, S., et al. Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor. Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).
- Stolwijk, J. A., et al. Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol. Integrative Biology. 11, 10 (2019).
