Summary
記述されたアプローチは、実験的な尾静脈転移アッセイと生体内生動物イメージングを組み合わせることで、肺の転移数と大きさの定量に加えて、乳癌転移の形成と増殖をリアルタイムでモニタリングすることを可能にする。
Abstract
転移は癌関連死の主な原因であり、転移性疾患患者の治療選択肢は限られている。転移性疾患のより良い治療法の開発を促進する新規治療標的の同定および検査は、生体内モデルにおける前臨床を必要とする。ここで実証された乳癌転移性コロニー形成とその後の増殖をアッジャーするための同系マウスモデルである。転移性癌細胞は、ホタルルシフェラーゼおよびZsGreenタンパク質をコードするウイルスベクターを安定して形質転換される。候補遺伝子は、ルシフェラーゼ/ZsGreen発現癌細胞で安定して操作され、その後、細胞は転移性コロニー形成および増殖をアッセイするために横尾静脈を介してマウスに注入される。その後、生体内イメージング装置を使用して、生きている動物の腫瘍細胞の生物発光または蛍光を測定し、時間の経過に続く転移性の変化を定量化する。蛍光タンパク質の発現により、断面染色や組織染色を必要とせずに、実験終了時に肺の転移の数と大きさを定量することができます。このアプローチは、転移性コロニー形成および増殖における候補遺伝子の役割をテストする比較的迅速かつ容易な方法を提供し、従来の尾静脈転移アッセイよりもはるかに多くの情報を提供する。このアプローチを用いて、乳癌細胞におけるPDZ結合モチーフ(TAZ)を用いたYes関連タンパク質(YAP)と転写共活性化剤の同時ノックダウンは、肺における転移性負担の軽減につながり、転移性コロニー形成の著しい低下と転移の増殖の減少の結果であることを示す。
Introduction
癌は世界第2位の死因1であり、転移はこれらの死亡の大部分を担っている2,3.しかし、転移性コロニー形成とその後の増殖を支配する分子機構の理解が限られており、転移性疾患に対する有効な治療法の開発を妨げている。新規治療標的の同定には、候補遺伝子の発現または機能が転移の形成と増殖にどのような影響を与えるかを試験するためのアッセイが必要である。オートクトンマウスモデルには利点がありますが、生成には時間とコストがかかり、ターゲット検出ではなくターゲット検証に適しています。候補遺伝子がインビトロの癌細胞で摂動し、転移電位に及ぼす影響が生体内で評価される移植モデルシステムは、オートクトンモデルよりも安価でスループットが高い。さらに、RNAi、CRISPR/CAS9、およびトランスジーンを安定的に送達するためのウイルスベクターが広く利用可能であり、癌細胞株に存在する遺伝子や遺伝子を比較的容易に摂動させることが容易です。このアプローチは、細胞を免疫不全またはヒト化マウスに移植することによってヒト癌細胞株における転移性コロニー形成および増殖における候補遺伝子の役割をアッセイするためにも使用できる。
生体内の移植癌細胞による転移形成を検査するために用いられる2種類のアッセイは、自発的転移アッセイと実験的転移アッセイである。自発的転移アッセイ4,5では、癌細胞をマウスに注入し、原発腫瘍を形成させ、次いで自発的転移形成およびその後の増殖がアッセイされる。このモデルの強みは、転移性腫瘍を形成するために細胞が転移過程のすべてのステップを完了しなければならないことである。しかしながら、多くの癌細胞株は自発的転移モデルでは効率的に転移せず、原発性腫瘍増殖に影響を与える細胞の操作は転移アッセイの結果を混乱させることができる。がん細胞を循環に直接注射する実験的転移アッセイは、これらの落とし穴を避けるために用いられる。一般的な実験的転移アッセイは、尾静脈注射6、7、8(およびここで実証)、心内注射9、および門脈注射10を含む。
ここで提示されるプロトコルの目的は、研究者が転移の形成と成長をリアルタイムで監視し、同じマウスの肺における終点転移数と大きさを定量化することを可能にする生体内実験転移アッセイを提供することです。これを達成するために、従来の実験的な尾静脈転移アッセイ6、7、8は、生体内撮像装置9、11、12、13、14を用いて生体イメージングと組み合わされる。ルシフェラーゼと蛍光タンパク質の両方を安定して発現する腫瘍細胞を横尾静脈を介してマウスに注入し、その後、インビボイメージング装置を使用して、経時の肺の転移性負担の変化を測定する(図1)。しかしながら、生体内生きている動物イメージング装置は、個々の転移の大きさを区別または測定することができない。したがって、実験の終わりに、蛍光立体顕微鏡を使用して、断面化や組織学または免疫組織化学を必要とせずに、肺内の蛍光転移の数をカウントし、サイズを測定する(図1)。このプロトコルは、候補遺伝子の発現または機能を変更することが転移の形成および増殖にどのように影響するかをテストするために使用することができる。小分子または機能遮断抗体などの潜在的な治療化合物も試験することができる。
このアプローチを実証するために、まず、必須の複製因子である複製タンパク質A3(RPA3)が転移性マウス乳癌細胞でノックダウンされる概念実証実験を行いました。我々は、RPA3ノックダウン細胞を注射したマウスは、対照細胞を注射したマウスと比較して、毎回有意に転移性の負担が少ないことを示している。転移を含む肺の分析は、この転移性負担の減少は、転移性コロニー形成を著しく減少させ、形成する転移の増殖を損なった結果であることを示している。さらにこの技術を実証するために、PDZ結合モチーフ(TAZ)を用いたYes関連タンパク質(YAP)と転写共活性化剤の同時ノックダウンが転移性コロニー形成またはその後の増殖を損なうかどうかを試験した。YAPとTAZは、カバ経路の重要な下流エフェクターである2つの関連する転写共活性化剤である。我々15、16および他のは転移にYAPおよびTAZを関与させ(17、18、19で検討)、これらのタンパク質が良好な治療標的であることを示唆している。一貫して、YAP/TAZノックダウン細胞を注射したマウスは転移性負担を有意に軽減していることがわかりました。肺の分析は、YAP/TAZノックダウン細胞が多くのより少ない転移を形成し、形成した転移が小さいことを示した。これらの実験は、実験的な転移アッセイが、転移の形成と増殖における候補遺伝子の役割を迅速かつ安価にテストすることを可能にする方法を実証する。さらに、肺全体の転移の生きた動物イメージングと蛍光定量を組み合わせることで、転移性コロニー形成中の工程をよりよく理解する方法を示す。
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Protocol
このプロトコルは、マウスやバイオ危険物の使用を含み、適切な機関安全委員会の承認を必要とします。ここで説明されている生体内の仕事のすべては、アルバニー医科大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。
注: プロトコルの概要については、図1の概略を参照してください。
1. 必要なレトロウイルスとレンチウイルスをすべて包装する
注:記載されたプロトコルは、ルシフェラーゼ酵素および蛍光タンパク質を安定して発現し、候補遺伝子の発現を操作するためにレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用する。これらのウイルスは、以下に説明するようにHEK-293FT細胞にパッケージ化される。
- 1日目:完全増殖媒体の2mL(ペニシリン/ストレプトマイシン1%と2mM L-グルタミンを有するDMEMの10%FBS)の6ウェルプレート上のプレートHEK-293FT細胞は、2日目に40〜60%のコンフルエントになるようにする。37°でインキュベートし、5%CO2を一晩で行う。
- 2日目:各ウイルスベクターを包装するために、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターとウイルスコートおよび包装タンパク質をコードする適切なベクターを有するHEK-293FT細胞の40〜60%のコンフルエントウェルをトランスフェクトする。
注:このプロトコルは、コートタンパク質としてVSVG、レンチウイルス包装のためのpsPAX2、およびレトロウイルス包装のためのgag-polを使用します(ベクターリストの補足表1を参照)。 - 次のように、それぞれのウェルのコトランスフェクション混合物を作成します。
- トランスフェクション用の脂質溶液4μL(材料表参照)と96°Lのトランスフェクションバッファを組み合わせ、5分間インキュベートします。
- ウイルスベクター1μg、コートタンパク質ベクター(VSVG)0.5μg、包装タンパク質ベクター(psPAX2またはgag-pol)を0.5μg加え、20分間インキュベートします。
- ステップ1.3.2のコトランスフェクション混合物をステップ1.1でめっきしたHEK-293FT細胞に軽く加え、37°、5%CO2で一晩インキュベートします。
- 3日目:トランスフェクション含有媒体を各ウェルから取り出し、各ウェルに2mLの完全成長媒体をそっと加えます。37°Cでインキュベートし、約24時間5%CO2。
- 4日目:3 mLシリンジを使用して各ウェルからウイルス上清を収集し、0.45μmフィルターを通して2mLマイクロ遠心管にフィルターを入れます。
- オプション: ウイルスの2番目のバッチの収集が必要な場合は、各ウェルに2mLの完全な成長媒体を穏やかに追加し、37°でインキュベートし、約24時間5%CO2をインキュベートします。
- 5日目(オプション):ステップ1.5のようにウイルス上清の第2ラウンドを収集します。
メモ:プロトコルは、ウイルス上清を凍結することによって一時停止され得る。
2. ルシフェラーゼと蛍光タンパク質を安定発現する癌細胞の生成
注:以下のプロトコルは、ユニークな選択遺伝子を持つ2つのベクターを使用して、ホタルルシフェラーゼと蛍光タンパク質(ZsGreen)で4T1細胞を安定的に標識する方法を説明しています。次いで、第3のウイルスベクターを使用して、候補遺伝子の発現を操作する。しかしながら、蛍光タンパク質と遺伝子操作を同時に送り出すウイルスベクターは、代替手段としても用いることができる(以下の代表的な実験のように)。他の癌細胞も使用できますが、細胞番号はステップ2.1および2.7.1に最適化する必要があります。
- プレート4T1細胞を1.5 x 105細胞/ウェルで12ウェルプレート内の完全成長媒体(1%ペニシリン/ストレプトマイシンと2mM L-グルタミンを有するDMEMの10%FBS)で、37°、5%CO2で一晩インキュベートする。
- 4T1細胞を、ステップ1で生成したウイルス上清に次のように感染させる。
- 細胞から増殖媒体を吸引し、ルシフェラーゼウイルス上清500μLと蛍光タンパク質ウイルス上清500μLを加え、ルシフェラーゼと蛍光タンパク質ウイルス上清の両方で細胞に同時に感染させる。
- 臭化ヘキサジダジメトリンを1μL加える(材料表を参照)。
- 細胞を37°Cでインキュベートし、75〜90%のコンフルエント(典型的には24〜48時間)まで5%である。
- トリプシンの500 μLで4T1細胞を2〜5分間トリプシン化します(細胞は井戸の底から自由にすすぐるする必要があります)。すべての細胞を4mLの選択媒体(適切な抗生物質を含む完全な増殖媒体)で6cm皿に移し、それによってトリプシンをクエンチする。同じ選択媒体で非感染対照細胞の6cm皿をプレートする。
注:適切な抗生物質濃度は、いくつかの用量をテストすることによって、事前に決定する必要があります。さらに、蛍光活性化細胞選別は、薬物選択の代わりに蛍光標識細胞を選択するためにも使用することができる。 - 細胞を37°C、5%CO2で選択媒体にインキュベートし、感染していないすべてのコントロール細胞が死ぬまで必要に応じて細胞を分割する(選択遺伝子および細胞株に依存する)。
- 感染した4T1細胞が、50~100倍の倍率で反転蛍光顕微鏡に設定された緑色励起(450~490nm)/放出(500~550nm)フィルターを用いてZsGreen蛍光タンパク質を発現していることを確認します。
- 感染した4T1細胞が市販のルシフェラーゼ活性キットを用いてルシフェラーゼを発現していることを以下のように確認する。
- 1xパッシブリシスバッファーの最小ボリュームを使用して、ルシフェラーゼ発現4T1細胞をリゼし、ルシフェラーゼを発現しない4T1細胞を制御し、30分間穏やかに振とうします。
- 白底96ウェルプレートに20μLの細胞リサートを加え、ルシフェラーゼ活性キットからルシフェラーゼアッセイ試薬を50°L添加します。
- プレートリーダーを使用して、発光設定を使用してスペクトル内のすべての波長の細胞からの発光を測定します。
メモ:プロトコルは、安定して転写された細胞を凍結することによって一時停止することができます。
- 候補遺伝子の発現を次のように操作する。
- プレート6 x 105は、ステップ2.6から4T1細胞を4mLの完全成長媒体で60mm皿に標識し、37°でインキュベートし、一晩で5%CO2を行う。
- 各ウェルから成長媒体を吸引し、8 mg/mLヘキサジデメトリン臭化物の4 μLを含む完全な成長媒体の2 mLを追加します。
- ステップ2.7.2からめっきした細胞にステップ1から2mLのウイルス上清を加え、37°でインキュベートし、一晩5%CO2でインキュベートする。
- トリプシンの500 μLで4T1細胞を2〜5分間トリプシン化します(細胞は井戸の底から自由にすすぐるする必要があります)。すべての細胞を10mLの選択媒体(適切な抗生物質を含む完全な増殖媒体)で10cm皿に移し、それによってトリプシンをクエンチンする。同じ選択媒体内の4T1細胞とラベル付けされたいくつかの非感染制御をプレートする。
- 細胞を37°C、5%CO2で選択媒体にインキュベートし、感染していない細胞がすべて死ぬまで必要に応じて細胞を分割する。
- 候補遺伝子の発現がウェスタンブロット20またはqPCR21などの標準的なアプローチを用いて改変されることを確認する。
- ステップ2.5~2.6のようにアッセイ発光と蛍光は、それらが制御細胞とノックダウン細胞にどれだけ類似しているかを判断します(ディスカッションを参照)。
メモ:プロトコルは、安定して転写された細胞を凍結することによって一時停止することができます。
3. 生体内実験計画の最適化
- 所望の転移負担に対して適切な細胞数と実験期間を次のように最適化します。
- 完全な増殖媒体のステップ2.6から蛍光および生物発光4T1細胞を拡張し、注射の希望日に余分な細胞が利用可能になるようにします。
- ステップ4.2の説明に従って、尾静脈注射用の細胞を準備します。注射に最適な細胞数を決定するには、1x PBSの100 μLでいくつかの異なる濃度で細胞を再中断します。
注: 25,000 から 500,000 までのセル番号/マウスの範囲をテストすることをお勧めします。 - 注射まで細胞懸濁液を氷の上に置く。
- ステップ3.1.2から4T1細胞の各希釈を、ステップ4.3で説明した横尾静脈を介して3〜4匹のマウスに注入する(下記参照)。
- マウスをケージに戻し、15分間監視して完全な回復を確認します。マウスは、痛みや苦痛の兆候を毎週3倍チェックする必要があります。
- 生体内生動物イメージング装置を用いて3〜6週間の転移形成および増殖(細胞株およびマウス株依存性)のマウスを監視する(ステップ5および6を参照)。
- 標準的な制度ガイドラインに従って尾静脈注射の3〜6週間後にマウスを安楽死させる。
- 肺を準備し、ステップ7で説明した転移のサイズと数を評価する。
- 望ましい転移負担に対して転移が大きくなるのに適切な時間の長さを選択します(議論を参照)。
4. 標識癌細胞の尾静脈注射
注:ステップ4.2.4は、同種BALB/cマウスで増殖する4T1細胞用に最適化されています。他の癌細胞株およびマウス株を使用する場合、注入される細胞の数、およびアッセイの長さはまず最適化されるべきである。
- 注射の日に余分な細胞が利用可能になるように、完全な成長媒体の2つの15cm皿のステップ2で生成された4T1細胞株を展開します。
- 次のように尾静脈注射のための細胞を準備します。
- 媒体を吸引し、1x PBSで細胞プレートをすすすします。
- 15cmプレートあたり5mLのトリプシンで細胞を2〜5分間トリプシン化します(細胞は井戸の底から自由にすすいでください)。すべての細胞を円錐管に移します。トリプシンをクエンチし、同じ円錐形チューブに洗浄を追加するのに十分な完全な成長媒体で組織培養皿から残りの細胞を洗浄します。
- 自動セル カウンタを使用してセルをカウントし、セルの総数を調えます。
- 細胞を122xgで3分間遠心分離し、上清を吸引し、所望の濃度で1x PBSで細胞を再中断する。ここでは、2.5 x 104個の細胞を100μLのPBSで各マウスに注入するので、2.5 x 105セル/mLで細胞を再サスペンドします。注射まで細胞懸濁液を氷の上に置く。
注:細胞のトリプシン化と尾静脈注射の間の時間を約1時間に制限することが重要です。
- 次のように、ステップ 4.2.5 から 4T1 細胞を横尾静脈を介してマウスに注入します。
- 動物施設でフードで作業し、チューブを反転するか、1 mLの注射器を使用して細胞を穏やかに混合し、それらが均一に再懸濁されるようにします。シリンジをロードする前に、必ず細胞が再懸濁していることを確認してください。
- セルサスペンションで1 mLルアーロックシリンジをロードし、余分な気泡を排出します。ベベルを上にした注射器に1インチ、30ゲージの針を置き、気泡を排出します。
- げっ歯類の拘束器にマウスをそっと置きます。
- 横尾静脈は目に見え、拡張されるべきである。そうでない場合は、尾のベースを軽くつまみ、暖かい水道水に尾を浸して静脈を拡張します。
注:静脈の拡張は、マウスケージを加熱ランプの下や加熱パッドの上に置くことによっても達成され得る。 - アルコールワイプを使用して尾を掃除します。針を尾静脈に差し込み、ベベル側を上にして、100μLの細胞懸濁液を注入します。
メモ:針が静脈に正しく挿入されている場合は、わずかに前後にスライドしやすく、プランジャーを押しても抵抗があってはならない。注射が成功すると、静脈の青色が注射後数秒間白くなる「フラッシュ」も生じるはずです。
- 針をゆっくりと取り出し、滅菌ガーゼを使用して、注射部位に圧力をかけて出血を止めます。
- マウスをケージに戻し、15分間監視して完全な回復を保証します。マウスは、痛みや苦痛の兆候を毎週3倍チェックする必要があります。
- 生体内生動物イメージング装置を用いて3〜6週間の転移形成および増殖(細胞株およびマウス株依存性)のマウスを監視する(ステップ5および6を参照)。
5. 生体内生動物イメージング装置による蛍光による転移負担のモニタリング
メモ:活性発光信号で蛍光のために動物を画像化しないでください。
- イメージング生物発光のみの場合は、ステップ6に進みます。
- インビボ生きている動物のイメージング装置をオンにします。
- in vivo生きている動物イメージング麻酔システムを、麻酔室とイメージングチャンバーに1.5%から2%のイソフルランを送り出すためのメーカーのガイドラインに従って設定します。
- ステップ4から蛍光標識転移を有するマウスを麻酔室に入れ、1.5〜2.5%のイソフルランを送出することにより、マウスを麻酔する。
- イメージ ソフトウェアを開き (マテリアルの表を参照)、ログインします。
- [初期化] ボタンをクリックし、コンピューターが初期化されるのを待ちます。
- [視野]をDに変更します。
注:視野C は、マウスをより近くで表示する必要がある場合にも使用できますが、これにより同時にイメージできるマウスの数が制限されます。 - カメラが適切な温度に達したことを示したソフトウェアが表示されたら、[イメージングウィザード]ボタンをクリックし、[蛍光]を選択して、ドロップダウン メニューから適切なフィルタ ペアを選択します。
メモ:使用している蛍光色素がオプションでない場合は、[入力 EX/EM]を選択し、必要な励起と放出を入力します。 - ステップ3.2.4の説明に従って、マウスをチャンバーに置きます。
- [シーケンスの取得] をクリックします。
- イメージング後、マウスをケージに戻し、15分間監視して完全な回復を保証します。
- 転移を含まないマウスを少なくとも 1 つ指定して、手順 5.2 と手順 5.7~ 5.9 を繰り返します。注:このマウスは、解析中にバックグラウンド信号を定量化して減算するために使用されます(ステップ8)。
- 実験期間中の画像は週2~3回。
6. 生体内生動物イメージング装置による生物発光による転移負担のモニタリング
- in vivo生きている動物のイメージング装置をオンにし、次のようにプログラムをセットアップします。
- イメージ ソフトウェアを開き (マテリアルの表を参照)、ログインします。[初期化] ボタンをクリックし、コンピューターが初期化されるのを待ちます。[視野]をDに変更します。
注: ビュー Cのフィールドは、マウスのボディ全体をイメージするために近いビューに使用できます。ただし、これにより、一度に画像化できるマウスの数が制限されます。 - 初めて使用する場合は、次のように露出設定を編集します。環境設定 |買収 |[自動露出]をクリックし、最大露出時間を既定の 60 秒から 300 秒に変更して、[OK]をクリックします。
注: [自動露出]タブで他のパラメータを変更しないでください。
- イメージ ソフトウェアを開き (マテリアルの表を参照)、ログインします。[初期化] ボタンをクリックし、コンピューターが初期化されるのを待ちます。[視野]をDに変更します。
- 麻酔室およびイメージ下の部屋に1.5%と2%のイソフルランの間を提供するために製造業者のガイドラインに従って麻酔システムを設定する。
- 手順 6.4 に進む前に、カメラが適切な温度に達していることを確認します。
- ステップ4から転移を含むマウスを麻酔室に入れ、1.5〜2.5%のイソフルランを送出することによって、転移を含むマウスを麻酔する。
- 生物発光イメージング用のマウスを以下のように調製する。
- D-ルシフェリン(D-PBSで30 mg/mL)で1 mLの注射器をロードし、シリンジに1/2インチの30ゲージ針を追加し、気泡を排出します。
- 麻酔されたマウスの質量を測定し、記録します。
- 親指とポインタの指を使って首の擦り傷をつまみ、ピンキーフィンガーと手のベースの間の尾をつかみ、マウスを拘束します。頭を下向きにして、マウスを 45 度の角度で反転します。
- 針をベベル側に上に挿入し、マウスの腹腔内(IP)空間に挿入します。小さなボリュームを取り戻して、IP スペースへの入力を確認します。IP空間に戻るときに、針の底に色が付いてはいけません。
- 150 mg/kg の用量の D-ルシフェリンの適切なボリュームを注入します。.
- D-ルシフェリン投与直後に、タイマーを開始し、鼻コーンに鼻を付けてイメージングデバイスの背面にマウスを平らに置き、1.5〜2.5%のイソフルランが投与されていることを確認します。複数のマウスをイメージングする場合は、各マウス間に分け器を置きます。マウスが可能な限り平らに配置されていることを確認します(つまり、片側に傾いていない)。
- [ルミネッセンス] ボックスと [写真] ボックスをクリックし、[取得]コントロール パネルの [取得] をクリックします。
- ピーク信号が達成されるまで、生物発光画像を継続的に取得し、解析のためにピーク生物発光信号で画像を使用します。
- イメージング後、マウスをケージに戻し、15分間監視して完全な回復を保証します。
- 実験期間中の画像は週2~3回。
7. 転移の数と大きさの定量化
注:転移が増殖できる時間の長さは、細胞株およびマウス株ごとに決定されるべきであり、注入される細胞の数の影響を受ける。
- 標準的な制度ガイドラインに従ってマウスを安楽死させる。
- 各マウスから肺を分離して取り出し、1x PBSですすいで余分な血液を取り除きます。
- 肺をゆっくりとローブに分けます。
- GFP広帯域フィルター(励起470/40x)を用いた蛍光ステレオスコープを用いて、明視野と蛍光の10倍のローブにおけるZsGreen転移の画像を取得します。
注: すべてのサンプルで同じ倍率と明るさを維持します。使用される倍率は、転移の大きさ、数、明るさ、および使用する顕微鏡の視野によって異なる場合があります。 - 画像解析ソフトウェアを使用して、画像からの転移のサイズと数を定量化します。
注:画像解析のプロトコルはソフトウェアに依存しており、ステップ3の腫瘍で最適化することができます。あるいは、蛍光ステレオスコープを用いて各肺の転移数を手動で数える。プロトコルはここで一時停止することができ、ステップ8は、すべての生体内画像が収集された後、任意の時点で行うことができます。
8. 生体内生動物イメージング装置で取得した画像からのデータの処理と解析
- イメージ ソフトウェアでマウスごとにすべてのイメージ ファイルを開きます。
注:解析には、ピーク生物発光信号で画像を使用します。 - 画像ウィンドウの左上にある矢印をクリックし、適切な単位に変更することで、蛍光データの[生物発光データ]と[効率]の単位がラディアンスであることを確認します。
- 最後のタイムポイントの画像を使用して、次のように対象地域 (ROI) を作成します。
- [ツール パレット]ウィンドウで[ROI ツール]をクリックします。矢印をクリックし、[1]を選択して、1 つの ROI を挿入します。
- ROIの境界線をクリックし、マウスの胸の上に移動します。ROIのサイズを調整して、マウスの胸を覆い、信号を除外しないようにします。
- [メジャー ROI] をクリックし、生の数値を Excel シートにコピーまたは入力します。
注:生物発光データの場合、ROI内のすべての輝度の合計である総フラックス(フォトン/秒)を選択します。転移は必ずしも均一に成長するとは限らないので、転移負担の合計を測定するので平均輝度よりも総フラックスが好ましい。同様に、蛍光データの場合は、平均効率の代わりに総効率%(発光光(光子/秒)/励起光(フォトン/秒))を使用する必要があります。 - イメージ ファイルを右クリックして、手順 8.3 で使用した ROI をコピーし、すべてのイメージ ファイルに貼り付けます。
注:蛍光画像を定量する場合は、転移なしで画像化したマウス上の同じ領域を定量します。この信号をバックグラウンド信号として使用し、取得した各蛍光転移含有マウス画像から差し引きます。 - 貼り付けた ROI を、各イメージの手順 8.3.4 で選択したリージョンに移動し、手順 8.4 を繰り返します。
- 生データを次のようにプロットして分析します (補足表 2を参照)。
- 示された式 (補足表 2)を使用して各マウスの生データのログ10変換を行い、図 2Dおよび図 4Fのようにプロットします。log10変換は、幾何学的になりがちな成長曲線を線形化し、不均一分散を最小化します。
- 線形回帰を使用して、ステップ 8.7.1 でプロットされた各マウスの対数10変換データに適合線の傾きを計算します (補足表 2)。補助表 2の数式を参照して線分をフィットさせ、1 ステップで勾配を計算します。
- 図 2Eおよび図 4Gのように、勾配の数値をプロットします。スチューデントのt検定または一方向ANOVA(2グループ以上)を使用して、統計的有意性を決定します。
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Representative Results
上記のアプローチを実証するために、重要な複製因子であるRPA3を転移マウス乳腺癌細胞株(4T122)でノックダウンした概念実証実験を行った。このプロトコルは、遺伝子操作の前にルシフェラーゼと蛍光タンパク質の両方で細胞を標識することを記述しているが、RNAiベクターもZsGreenを提供するので、我々は改変されたアプローチを用いた(図2A)。まず、4T1細胞をホタルルシフェラーゼおよびハイグロマイシン耐性(pHAGE-ルシフェラーゼ-IRES-Hygro)をコードするレンチウイルス構築物で安定に形質転換した。ハイグロマイシン選択後、ホタルルシフェラーゼの安定な発現を確認するためにルシフェラーゼアッセイを行った(図2A)。次に、4T1-ルシフェラーゼ細胞に、ZsGreenおよび対照miR30ベースのshRNAを発現するレトロウイルスベクター、またはmiR30系shRNAを用いて安定に誘導し、マウスRPA316、23、24を効果的に標的とすることが以前に示された。次いで、細胞を横尾静脈を介してマウスに注入し、生体内生物発光シグナルを週2回測定し、転移性負担をモニタリングした(図2B,C)。各マウスの対数10変換信号を経時の転移負担としてプロットし(図2D)、各プロットの傾きを決定した(図2E)。これらのデータは、制御セルと比較してRPA3ノックダウンによって転移負担の変化率が有意に減少することを示す。違いは顕著ですが、これらのデータだけでは転移の負担が減少したか、転移の増加が遅い結果なのかを判断することはできません。したがって、肺のZsGreen標識転移も実験終了時に分析された。RPA3ノックダウン細胞を注射したマウスは肺にはほとんど転移がなかったのに対し、対照マウスは多数の大きな転移を有していた(図3)。さらに、RPA3ノックダウン細胞から形成された転移は、コントロール4T1転移よりも明らかに小さかった(図3A)。私たちの手動カウント(図3B)と一致して、画像解析ソフトウェアは、RPA3ノックダウンマウスにおける有意に少ない転移をカウントしました(図3C)。さらに、肺の転移負担の合計(各転移の面積をミリメートル単位で合計)もRPA3ノックダウンによって大幅に減少した(図3D)。最後に、RPA3ノックダウンマウスに形成された個々の転移のサイズは、一般に対照マウスのそれよりもはるかに小さくした(図3E)。対照マウスの大きな転移に加えて、多数の小さな転移も観察したが、これらは肺を播種して増殖しなかった腫瘍細胞なのか、それとも肺を新しい場所に再播種した大きな転移の1つから流出した腫瘍細胞なのかを判断できない(図3E)。これらのデータをまとめて、4T1細胞による転移形成にはRPA3が必要であることを示している。これらの発見は、我々の以前の研究は、RPA3ノックダウン細胞が尾静脈注射16に続いて肺の転移を形成する能力を有意に低下させたことを示したので期待された。しかし、この実験は、転移数と大きさの生きた動物イメージングと蛍光定量を使用して、転移性コロニー形成または増殖の違いによる転移性負担の変化があるかどうかを判断する方法を示しています。
このアプローチを使用して、より生物学的に関連する質問に答える方法を実証するために、乳癌のこの同系モデルにおける転移性コロニー形成とその後の増殖にYAPとTAZが必要かどうかを尋ねた。YAPまたはTAZの発現および活性は、正常組織と比較して多くの癌において増加し、これは、患者の結果が悪い25、26、27、28、29の予測である。さらに、いくつかの研究は、転移15、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、42、42、重要なYAP/TAZ結合パートナーに関与しています。 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52 。このデータを考えると、転移の形成と増殖にYAPとTAZが必要かどうかをテストするアプローチを使用しました。このために、YAPとTAZの両方を対象としたタンデムmiR30ベースのshRNAを発現するレトロウイルスベクターを使用する。図に示すように、このタンデムshRNAは、4T1細胞におけるYAPおよびTAZタンパク質発現および転写活性を効果的に低下させる(図4A,B)。4T1-ルシフェラーゼ細胞を、このタンデムYAP/TAZ shRNAベクターまたは対照miR30ベースのshRNA(図4C)のZsGreen発現バージョンで安定に形質導入し、次いで、同系BALB/cマウスにおける尾静脈注射によってアッセイした。図4に示すように、YAP/TAZノックダウン細胞を注入したマウスと比較して、コントロール細胞を注射したマウスでは転移負担が増加する速度が有意に速かった(図4D-F)。YAP/TAZノックダウン細胞を注射したマウスに形成される転移は、手動でカウントするか(図5A、B)、または画像解析ソフトウェアを用いて対照細胞を有するマウスと比較して有意に少ない(図5C)。対照マウスではより多くの転移が形成されただけでなく、一般的に大きかった(図5E)。一貫して、肺の転移負担(mmの全転移領域)もYAP/TAZノックダウンによって大幅に減少した(図5D)。転移が大きく、近い場合、ソフトウェアは個別の転移を区別できない可能性があることに注意してください。これは、対照マウス(マウス3およびマウス7)におけるいくつかの転移に対する当例であった。したがって、画像解析ソフトウェアの出力をチェックして、単一腫瘍の面積を正確に測定していることを確認することが重要です。また、注入される細胞の数と実験の長さを最適化することが重要な理由でもあります。総称して、これらのデータは、転移性乳癌の均一マウスモデルにおいて転移性負担が増加する速度を維持するためにYAPおよびTAZが必要であり、これは転移が形成できず、形成された少数の転移の成長の減少に起因することを示している。
図 1: プロトコルの概略図必要なすべてのウイルスは、最初にHEK-293FT細胞にパッケージ化されます。研究のために望ましい細胞は、それぞれがユニークな哺乳動物の薬物選択遺伝子を発現するルシフェラーゼおよび蛍光ウイルスに同時に感染する。感染した細胞は、その後、両方の薬物を含む適切な媒体中で拡張され、ルシフェラーゼおよび花生タンパク質の両方を発現する安定的に形質転換された細胞を選択する。両方のラベルの式は、プロトコルに記載されているように確認される。標識された細胞は、次いで、遺伝子操作(miR30 shRNA)および第3のユニークな薬物選択遺伝子を含む第3のウイルスで形質転換される。第3の薬物で選択した後、細胞は横尾静脈を介してマウスに注入される。転移性負担は、生体内生動物イメージングシステムを用いた実験を通じてマウスで監視される。実験の終わりに、マウスを安楽死させ、肺全体の画像を蛍光解剖顕微鏡で撮影し、転移の数と大きさを測定するために使用されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ルシフェラーゼベースの生体内生動物イメージングは、RPA3ノックダウンが乳癌転移負担を軽減することを示す。(A)生体内研究のために細胞がどのように生成されたかを示す概略図。4T1細胞をルシフェラーゼおよびハイグロマイシン耐性をコードするレンチウイルスで安定に形質転換した。感染した細胞を600μg/mLのハイグロマイシンBで1週間選択し、次いでルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼレポーターキットおよびプレートリーダーを用いて親または4T1-ルシフェラーゼ細胞で測定した(n=1実験は平均した複製ウェルを用いた実験)。4T1-ルシフェラーゼ細胞は、その後、mCherry(対照)またはmRPA3のいずれかを標的とするZsGreenおよびmiR30 shRNAを送り出すレトロウイルスに感染した。3日間のプロマイシン選択(2.5μg/mL)を用いて、ウイルスの安定した統合を選択した。(B-E)4T1-ルシフェラーゼ細胞は、ZsGreenおよび対照(sh-mCherry)またはmRPA3(sh-mRPA3-431)を安定に発現し、プロトコルに記載されているように示された日にマウスに注入し、生物発光を画像化した。(損益)示された日のポスト注入(D)プロット上の各群の代表的なマウスに対する生物発光画像は、実験の過程で各マウスについて測定されたログ10変換ルシフェラーゼシグナルのプロットである。(E)D の各マウスの勾配に対する平均 (実線) を持つ散布図 (sh 制御の場合は n = 6、sh-mRPA3-431 の場合は 8)。統計的有意性は、スチューデントのt検定を使用してテストされました。*p ≤ 0.05。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:蛍光転移の定量は、RPA3ノックダウンが転移性コロニー形成および乳癌細胞のその後の増殖を防止することを明らかにする。(A)蛍光(左)および明視野(右)は、注射後21日の図21で注入された各マウスからの代表的な葉の画像である。アスタリスク(*)は緑色の自己蛍光気管支を示した。(C-E)画像解析ソフトウェア(材料表を参照)は、強度しきい値 25 ~ 100、サイズしきい値 0.01 mm2から無限大を使用してオブジェクトを識別および測定するために使用されました。(損益)画像解析ソフトウェア(C)によりカウントした各マウスの肺における転移の総数の平均(実線)を有する散布図。(D)画像解析ソフトウェアで測定した肺の総面積(mm)は、固体棒で示される平均を伴う転移負担としてプロットされる。(E) 各転移の大きさは、マウスごとにプロットされます。対照マウスは、赤色ドットによって青色の点およびmRPA3ノックダウンマウスによって示される。注:スケールバーは1mmで分離され、小さな転移のサイズと数を視覚化しやすくしています(n = 6 sh制御、8 sh-mRPA3-431)。統計的有意性は、スチューデントのt検定を使用してテストされました。p = 0.06;** p ≤ 0.01.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:YAP/TAZノックダウンは乳癌転移負担を軽減する。(A&B)miR30ベースの制御(mCherry)またはタンデムYAP/TAZ shRNA(sh-mYAP1/mTAZ6)を安定に発現する4T1細胞をウェスタンブロット分析(A)またはトランスで分析した。 YAP/TAZ-TEADルシフェラーゼレポーターコンストラクトに感染し、前述のYAP/TAZ-TEAD転写活性についてアッセイした15,16 (B) (制御の場合は n = 5、YAP1/TAZ6 の場合は 4)。(C)in vivo研究のために細胞がどのように生成されたかを示す概略図。4T1-ルシフェラーゼ細胞は、ZsGreenを送り出すレトロウイルスに感染し、mYAPとmTAZの両方を標的とするmiR30 shRNAを標的とするmCherry(対照)またはタンデムmiR30 shRNAのいずれかに感染した。感染細胞をプロマイシン(2.5μg/mL)で3日間選択した。4T1-ルシフェラーゼ細胞は、ZsGreenおよびコントロール(sh-mCherry)またはYAP/TAZ(sh-mYAP1/mTAZ1)shRNAをマウスに注入し、注射された日までに生物発光を画像化した。(D&E)示された日事後注射における各群の代表的マウスに対する生物発光画像。(F)実験の過程でマウス毎に測定したログ10変換ルシフェラーゼ信号のプロット。(G) Fの各マウスの勾配に対する平均 (実線) を持つ散布図 (sh 制御の場合は n = 7、sh-mRPA3-431 の場合は 8)。平均は実線で示されます。統計的有意性は、スチューデントのt検定を使用してテストされました。p = 0.06;#, p ≤ 0.01;***.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:転移性乳癌細胞が肺をコロニー形成するためには、YAPおよびTAZが必要である。(A)蛍光(左)および明視野(右)は、注射後21日後の図4に注入された各マウスからの代表的な葉の画像である。(C-E)画像は、図3に示すように画像解析ソフトウェアで処理した。(損益)手動で数えた場合の各マウスの肺内の転移の総数の平均(実線)を有する散布図(B)または画像解析ソフトウェア(C)による。(D)全ての転移(mm)の総面積を画像解析ソフトウェアで測定し、平均(実線)で転移負担としてプロットした。(E) 各転移の大きさは、マウスごとにプロットされます。対照マウスは、赤色の点によって青色の点およびsh-mYAP1/mTAZ6ノックダウンマウスによって示される。注、スケールバーは1mmで分離され、小さな転移のサイズと数をよりよく視覚化します(n = 7 sh制御、8 sh-mYA1/mTAZ6)。平均は実線で示されます。統計的有意性は、スチューデントのt検定を使用してテストされました。*p ≤ 0.05, **, p ≤ 0.01;**.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足表 1: ベクトルの表使用されるすべてのベクトルがリストされ、新しいベクトルが記述されます。標準的な分子生物学技術は、新たに記述された97-mer shRNAの新しいベクターおよび配列のクローンを作成するために使用されたが、含まれる。引用文献は参照してください: [1]53, [2]16, [3]54この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表2:生体内生動物イメージングデータ処理および分析の例。手順 6.7 および 6.8 で説明されているように、生体内の生きている動物の画像からの生データが分析のために変換される方法を示すスプレッドシート。生体内生動物イメージングから取得した生データは、log10変換を用いて変換した。転移負担の変化率は、ログ10変換データによって生成された傾きを計算することによって、マウス毎に算出される。例としては、図2のルシフェラーゼ分析が挙げられる。列は色分けされ、各勾配値の生成に使用されたデータが示され、数式がスプレッドシートに埋め込まれます。ウェルをダブルクリックすると、データの処理に使用される数式が表示されます。このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
メソッドの重要な手順
これは、形成する転移の数と実験の長さに大きく影響を与えることができるので、特定の細胞株とマウス株のために注入される細胞の数を最適化することが重要です(ステップ3)。あまりにも多くの細胞が注入されたり、転移が長時間増殖したりすると、転移を数え難しくして遺伝子操作の効果を評価することが困難になる可能性があります。しかし、注入される細胞が少なすぎると、転移はほとんどあるいは全く形成されないことがある。したがって、異なる数の細胞を使用して予備実験を行い、最適な数と転移が成長する時間の長さを決定する必要があります。グループ内の一貫した数の転移を保証するには、各マウスに等しい数の生存細胞を注入することが重要です。細胞はチューブとシリンジの両方に沈殿するので、細胞は注射器をロードする前に穏やかに再懸濁し、細胞懸濁液はシリンジに長時間放置してはならない(ステップ4.3.2)。細胞生存率は、細胞が懸濁液中である時間が長いほど減少するので、細胞のトリプシン化と注射の間の時間は1時間以下でなければならない(ステップ4.2.5)。気泡や細胞の大きな塊は、マウスを殺す塞栓を引き起こす可能性があるため、注入してはいけません。また、針を通して細胞を引き上げるので、注射器は針なしでロードする必要があります。比較的同数の細胞が注入されたことを確認するために、生体内の生きた動物画像は、注射直後に撮影することができる(図2B、図4D)。
生物発光シグナルの正確かつ一貫した定量は重要であり、D-ルシフェリンを取り上げ代謝する細胞に依存する。これは、D-ルシフェリンの用量、注射のタイミング、マウスの体温、マウスを注入したときの麻酔方法、およびイメージング前にマウスが麻酔室にどのように配置されるかを含む多くの変数の影響を受けることができます。したがって、これらのステップはすべてのマウスとイメージングセッションで一貫した状態を保つことが重要です。麻酔室で一貫したマウス体温を維持するために加熱パッドを使用しました。シグナルは生物発光検出と蛍光検出の両方のために組織を貫通しなければならないため、マウスの位置を各画像に対して一貫した状態に保つことも重要です(背中の平らさは肺のイメージングに最適です)。生体内生動物イメージングからの蛍光画像の定量は、画像間の適切な比較を可能にするので、常に効率%単位を使用して行われるべきである。同様に、生物発光画像を定量する際には、常に総フラックス(フォトン/秒)を使用する必要があります。転移負担の分析のために、対数10変換は、成長曲線(最大信号に達する前)を、傾斜解析に必要な線形プロットに変換します。
変更、および方法のトラブルシューティング
提示されたプロトコルでは、細胞の集団は、まず蛍光タンパク質およびルシフェラーゼで安定に形質導入され、次いで、その集団は、目的の遺伝子を標的とする対照ベクターまたはベクターのいずれかで形質転換される。これにより、両方の細胞集団が類似した蛍光タンパク質とルシフェラーゼ発現を有することを保証します。しかしながら、代替として、これらの成分のうちの2つを同時に送り出すウイルスベクターを利用することができる。実際、代表的な実験では、4T1-ルシフェラーゼ細胞でshRNAを発現するためにレトロウイルスベクターを発現するZsGreenを用いた。ルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質の発現は、目的の遺伝子が改変された後、すべての細胞群でアッセイすることが推奨される。グループ間の発現レベルが異なると、データの解釈が複雑になるので、異なるグループが蛍光タンパク質とルシフェラーゼの両方の類似した発現を有する場合に最適です。さらに、赤血球は自己蛍光であり、肺の蛍光転移を可視化することが困難になる可能性があります。この場合、赤血球は、自己蛍光の背景を減らすために安楽死中にPBS灌流によって肺から取り除くことができる(適切な安楽死技術とガイドラインに従うべきである)。代表的な実験における対照群とノックダウン群の違いは劇的であるが、生体内転移アッセイにしばしば存在するマウスからマウスへの固有の変動は、対照マウスにおいて明らかである(図3B及び図5B)。この変動性が高いと、ノックダウン効果の大きさを判断することが困難になる場合があります。この変動性を低減するために使用できる別のアプローチは、コントロール細胞とノックダウン細胞に異なる蛍光タンパク質と明確なルシフェラーゼ酵素を標識し、2つの集団を等しい数で混合して混合物を注入することです。例えば、トマトとレニラルシフェラーゼを安定に発現する対照細胞は、ZsGreenおよびホタルルシフェラーゼを発現するノックダウン細胞と混合することができる。生体内の動物イメージング装置は、ルニラルシフェラーゼとホタルルシフェラーゼ、トマトをZsGreenと区別できるため、蛍光または発光を使用して各細胞集団を独立して定量することができます。実際、生きている動物の原発性腫瘍として増殖する4T1細胞のデュアルルシフェラーゼイメージングは、生体内生動物イメージング装置4を用いて実証されている。ただし、蛍光シグナルに重複する可能性があることに注意することが重要であるため、スペクトルの混合解除ステップ(メーカーのガイドラインを参照)をこのアプローチに含める必要があります。さらに、レニラルシフェラーゼとホタルルシフェラーゼは、第2のルシフェラーゼ信号を2回目のイメージング前に検出できなくなる適切な時間遅延で別々に画像化する必要があります。明確な蛍光性を使用すると、肺の転移の数と大きさを定量化することが可能である 16.肺以外の他の器官における転移性コロニー形成および増殖を試験するために、このプロトコルは、心内および門脈静脈注射9、10に改変され、使用することができる。
メソッドの制限事項
生体内生動物イメージング装置を使用して、蛍光標識癌細胞と共にリアルタイム転移負担を獲得し、転移性コロニー形成とその後の増殖をアッセイする強力な方法を提供する。ただし、この方法には制限があります。一部の遺伝子は、転移において特異的な役割ではなく、自然な細胞増殖に必要とされる場合がある。in vitro細胞増殖アッセイは、インビボ実験の前に行うことができ、遺伝子がインビトロ増殖を破壊するかどうかを決定する。生きている動物をイメージングする場合、転移からの生物発光または蛍光シグナルは、組織を通過するのに十分な強さでなければならない。加えて、組織の光学特性(すなわち、吸収および散乱)も検出55に影響を与える。励起光源は、蛍光標識癌細胞を励起するために組織を通過できなければならないし、生物発光は蛍光よりも大きなダイナミックレンジを有する。従って、蛍光は生きた動物イメージングに用いることができるが、内臓のシグナルを検出するために生物発光が好ましい。さらに、一部の免疫担当マウス株は、蛍光タンパク質を発現する細胞を拒絶し得る。実際、トマト、GFP、またはmCherryを発現する細胞は、BALB/cマウスで増殖する際に蛍光色素を拒絶または調節することが分かった(データは示されていないが15)。しかしながら、ここで示したように(図3および図5)および以前の15、16、ZsGreen標識細胞は、これらのマウスにおいて検出可能である。蛍光タンパク質発現が検出不能になった場合には、相対的な転移コロニー形成を定量する別の方法は、qPCRを使用して、統合ウイルスベクター15内の蛍光遺伝子または別の遺伝子のいずれかを定量することである。生体内生動物イメージング装置は転移性負担の変化を検出することができますが、これらの変化が変化したサイズまたは転移の数によるものかどうかを判断することはできません。また、転移の位置に関する空間情報も提供しません。さらに、シグナルの強度は、組織の深さによって影響を受けることができます。
メソッドの意義と将来の応用可能性
この方法を変更して、より多くの情報や異なる情報を取得する方法は多数あります。ヒト癌細胞株または患者由来の異種移植片を含む様々な癌細胞株をこのアッセイに使用することができる。他のマウスモデルは、間質細胞によって作られた標的タンパク質が、注射された癌細胞の転移性コロニー形成および増殖にどのように影響するかをテストするために設計されたトランスジェニックまたはノックアウトマウスを含む、他のマウスモデルを使用することもできる。テストする候補遺伝子が複数ある場合、生体内の動物イメージングデバイスは広範囲の蛍光色素を検出して区別できるため、このアプローチは多重化される可能性があります。これにより、必要なマウスの数が減り、テストできるターゲットの数が増えます。生体内生動物イメージングは、X線またはCT9イメージングと組み合わせて、転移の位置に関するより多くの空間情報を提供することもできる。最後に、このアプローチは、転移性コロニー形成カスケード内のより具体的なステップをアッセイするように変更することができる。例えば、腫瘍細胞播種に関与する工程(血管内生存、贅沢、および後の外挿生存)は、注射後の最初の3日以内のいくつかの時点で肺内の腫瘍細胞の数を定量することによって区別することができる(例えば、ここで16を行う)。この場合、肺を血管マーカーで染色し、ex vivoを画像化して、各時点で贅沢した癌細胞の割合を決定することもできる。
要約すると、尾静脈注射後の蛍光および発光癌細胞の生体内生動物イメージングをリアルタイムで使用することで、候補遺伝子または遺伝子が転移コロニー形成とその後の増殖にどのように影響するかをより詳細に分析することができます。このアプローチは、オートクトンマウスモデルよりも高速かつ安価であり、自発的な転移モデルの注意事項の一部を回避します。転移を検出および定量する手段として蛍光と発光の両方を使用することで、研究者は結果に対する信頼を向上させ、実験計画の柔軟性を高める独立した読み出しを提供します。転移のサイズと数を定量化するために蛍光を使用すると、時間がかかり、潜在的にコストのかかる組織学的処理と分析の必要性を回避し、組織全体の追加使用を可能にします。このプロトコルは、RNAi、トランスジーン発現、CRISPR/Cas媒介編集などの候補遺伝子の発現または機能を操作するために多くの異なる技術と共に使用することができ、また、小分子、機能遮断抗体、または他の潜在的な治療化合物をテストするために使用することができます。前述のように、アッセイを強化し、追加情報を提供するために、いくつかの簡単な変更を行うことができます。このアプローチは、癌の治療の可能性を有する転移性遺伝子を同定し、検査する理想的な方法である。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
私たちは、ウイルス感染と原稿の批判的な読書を支援してくれたエミリー・ノートンに感謝します。また、ライアン・カネイは、肺の画像を取得し、ケイト・E・タブベシングが肺の緑色転移の画像解析を支援してくれたことに感謝します。動物研究施設のスタッフのサポートと、このビデオの準備に関する支援に感謝します。この作品は、J.M.L.(#CCR17477184)に授与されたスーザン・G・コーメンキャリア触媒助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% SDS-PAGE Gel | For western blot | ||
| 2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | Trypsin for tissue culture |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Alcohol wipes | For sterolizing the injection site before tail vein injecitons | ||
| BALB/C mice (female, 6 weeks) | Taconic | BALB-F | For tail vein metastatic colonization and burden assays |
| BSA regular | VWR Ameresco | 97061-416 | For western blot |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling | For collecting protien samples | |
| Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm | Celltreat | 40-229749-CS | For filtering viral supernatant |
| CO2 and euthanasia chamber | For euthanasing the mice | ||
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1960 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Dulbecco&39;s phosphate buffered saline | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA | VWR | 97061-406 | Used to dilute trypsin for tissue culture |
| FBS 100% US origin | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Fujifilm LAS-3000 gel imager | Fujifilm | For western blot | |
| GAPDH(14C10) Rabibit mAb | Cell Signaling | 2118 | For western blot |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo Scientific | 31460 | For western blot |
| Human embryonic kidney cells, HEK-293FT | Invitrogen | R70007 | Cell line used for packging virus |
| HyClone DMEM/High clucose | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| Hygromycin B, Ultra Pure Grade | VWR Ameresco | 97064-810 | For antibiotic selection of infected cells |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells | |
| Imagej | Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100 | ||
| Immuno-Blot PVDF Membrane | Biorad | 1620177 | For western blot |
| Isoflurane | For mouse anesthesia | ||
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) | PerkinElmer | CLS136340 | For in vivo imaging of metastatic burden |
| Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) | Leica Microsystems | Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 | Life technologies | L3000008 | For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection |
| Living Image 3.2 (image software program) | PerkinElmer | Software for IVIS | |
| Mouse breast cancer cells, 4T1 | Karmanos Cancer Institute | Aslakson, CJ et al.,1992 | Mouse metastatic breast cance cell line |
| Multi-Gauge version 3.0 | Fujifilm | Software for quantifying western blot band intensity | |
| Opti-MEM (transfection buffer) | Gibco | 31985-062 | For packaging virus and transfection |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | For quantifying protein concentration |
| Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32957 | Added to cell lysis buffer |
| Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32953 | Added to cell lysis buffer |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For infection |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection of infected cells |
| Rodent restrainer | For restraining mice during tail vein injeciton | ||
| SDS-PAGE running buffer | For western blot | ||
| TAZ (V3886) Antibody | Cell Signaling | 4883 | For western blot |
| TBST buffer | For western blot | ||
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For counting cells | |
| Vectors | See Table 1 for complete list of vectors | ||
| VWR Inverted Fluorescence Microscope | VWR | 89404-464 | For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells |
| Western transfer buffer | For western blot | ||
| XenoLight D-Luciferin K+ Salt | PerkinElmer | 122799 | Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) | Roche | 6365787001 | For packaging virus |
| YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 14074 | For western blot |
References
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