Summary
기술된 접근법은 실험적인 꼬리 정맥 전이 실험과 생체 내 살아있는 동물 화상 진찰을 결합하여 폐에 있는 전이 수 그리고 크기의 정량화 이외에 유방암 전이 대형 및 성장의 실시간 감시를 허용합니다.
Abstract
전이는 암 관련 죽음의 주요 원인이고 전이성 질병을 가진 환자를 위한 한정된 치료 선택권이 있습니다. 전이성 질병에 대한 더 나은 치료법의 개발을 용이하게 하는 새로운 치료 표적의 식별 및 테스트에는 생체 내 전임상 모델이 필요합니다. 여기에서 입증된 것은 유방암 전이성 식민지화 및 후속 성장을 위한 합성 마우스 모델이다. 전이성 암 세포는 반딧불 루시퍼라제 및 ZsGreen 단백질을 코딩하는 바이러스 벡터로 안정적으로 변환됩니다. 후보 유전자는 그 때 luciferase/ZsGreen 발현암세포에서 그 후에 세포가 전이성 식민지화 및 성장을 분석하기 위하여 측방 꼬리 정맥을 통해 마우스로 주입됩니다. 생체 내 이미징 장치는 살아있는 동물의 종양 세포의 생물 발광 또는 형광을 측정하여 시간이 지남에 따라 전이성 부담의 변화를 정량화하는 데 사용됩니다. 형광 단백질의 발현은 절편 또는 조직학적 염색없이 실험이 끝날 때 폐에서 전이의 수와 크기를 정량화할 수 있게 한다. 이 접근법은 전이성 식민지화 및 성장에서 후보 유전자의 역할을 테스트하는 비교적 빠르고 쉬운 방법을 제공하며, 전통적인 꼬리 정맥 전이 분석보다 훨씬 더 많은 정보를 제공합니다. 이 접근법을 사용하여, 우리는 유방암 세포에 있는 PDZ 결합 모티프 (TAZ)를 가진 예 연관된 단백질 (YAP) 및 전사 공동 활성제의 동시 녹다운이 폐에 있는 감소된 전이성 부담으로 이끌어 내고 이 감소된 부담이 현저하게 손상한 전이성 식민지 및 전이성의 감소된 성장의 결과이다는 것을 보여줍니다.
Introduction
암은 전 세계적으로 사망의 두 번째 주요 원인 남아1 전이 이 죽음의 대부분에 대한 책임이2,3. 그러나, 전이성 식민지및 후속 성장을 통제하는 분자 기계장치의 한정된 이해는 전이성 질병을 위한 효과적인 처리의 발달을 방해했습니다. 새로운 치료 표적의 확인은 후보 유전자의 교란된 발현 또는 기능이 전이 형성 및 성장에 미치는 영향을 테스트하기 위한 분석법을 필요로 한다. autochthonous 마우스 모델은 장점이 있지만 생성하는 데 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들기 때문에 대상 검색보다는 대상 유효성 검사에 더 적합합니다. 후보 유전자가 시험관 내 암세포에서 교란되고 전이성 전위전위에 대한 영향이 생체 내에서 평가되는 이식 모델 시스템은 자가 진단모델보다 비용이 적게 들고 처리량이 높다. 또한, RNAi, CRISPR/CAS9 및 트랜스유전자의 안정한 전달을 위한 바이러스 벡터가 널리 이용가능하여, 암 세포주에서 관심 있는 거의 모든 유전자 또는 유전자를 비교적 쉽게 교란할 수 있다. 이 접근법은 또한 세포를 면역 타협 또는 인간화 된 마우스로 이식함으로써 인간 암 세포주에서 전이성 식민지화 및 성장에서 후보 유전자의 역할을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
생체 내에서 이식된 암세포에 의한 전이 형성을 테스트하는 데 사용되는 두 가지 유형의 실험은 자발적전이성 전이 검정 및 실험전이이다. 자발적 전이분석4,5에서,암세포는 마우스로 주입되고, 원발성 종양을 형성하도록 허용한 다음, 자발적전이 형성 및 후속 성장이 분석된다. 이 모형의 힘은 세포가 전이성 종양을 형성하기 위하여 전이성 프로세스의 모든 단계를 완료해야 한다는 것입니다. 그러나, 많은 암 세포주는 자발적인 전이 모델에서 효율적으로 전이되지 않으며, 원발성 종양 성장에 영향을 미치는 세포의 조작은 전이 분석의 결과를 혼동할 수 있다. 암세포가 순환에 직접 주입되는 실험적 전이 실험은 이러한 함정을 피하기 위해 사용됩니다. 일반적인 실험전이검사는꼬리정맥주사6,7,8(여기서 입증됨), 심내주사9,및 문맥주사(10)를 포함한다.
여기에 제시된 프로토콜의 목적은 연구원이 실시간으로 전이 형성 및 성장을 모니터링할 수 있도록 하는 생체 내 실험 전이 분석실험을 제공할 뿐만 아니라 동일한 마우스의 폐에서 종점 전이 수 및 크기를 정량화하는 것이다. 이를 달성하기 위해, 전통적인 꼬리 정맥 전이 검소6,7,8은 생체 내 이미징 장치9,11,12,13,14를사용하여 살아있는 동물 이미징과 결합된다. 루시퍼라제와 형광 단백질을 모두 안정적으로 발현하는 종양 세포는 측면 꼬리 정맥을 통해 마우스내로 주입된 후 생체내 이미징 장치는 시간이 지남에 따라 폐의 전이성 부담의 변화를 측정하는데 사용된다(그림1). 그러나, 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치는 개별 전이의 크기를 구별하거나 측정할 수 없다. 따라서, 실험의 끝에서, 형광 입체 현미경은 절편 및 조직학 또는 면역 조직화학의 필요없이 폐에서 형광 전이의 크기를 카운트하고 측정하기 위해 사용된다(그림 1). 이 프로토콜은 후보 유전자의 발현 또는 기능을 변경하는 것이 전이 형성 및 성장에 미치는 영향을 테스트하는 데 사용될 수 있다. 항체를 차단하는 작은 분자 또는 기능과 같은 잠재적인 치료 화합물도 시험될 수 있습니다.
이 접근법을 설명하기 위하여는, 우리는 먼저 필수적인 복제 인자, 복제 단백질 A3 (RPA3)가 전이성 마우스 유방암 세포에서 쓰러지는 개념 실험의 증명을 수행했습니다. 우리는 RPA3 녹다운 세포로 주입된 마우스가 대조군 세포로 주입된 마우스에 비해 매 시점에서 현저한 전이성 부담을 가지고 있음을 보여준다. 전이 함유 폐의 분석은 이러한 전이성 부담 감소가 전이성 식민지화 및 형성되는 전이의 성장을 크게 감소시킨 결과임을 보여준다. 이 기술을 추가로 설명하기 위하여는, 우리는 PDZ 결합 모티프 (TAZ)를 가진 예 관련 단백질 (YAP) 및 전사 공동 활성제의 동시 노크가 전이성 식민지화 또는 후속 성장을 손상하는지 여부를 시험했습니다. YAP 와 TAZ는 하마 통로의 중요한 하류 이펙터인 두 개의 관련 전사 공동 활성제입니다. 우리15,16 및 그 외는 전이에 YAP와 TAZ를 연루했습니다(17,18,19에서검토), 이 단백질이 좋은 치료 표적이다는 것을 건의합니다. 일관되게, 우리는 YAP/TAZ 녹다운 세포로 주입된 마우스가 전이성 부담을 현저하게 감소시켰음을 발견했습니다. 폐의 분석은 YAP/TAZ 녹다운 세포가 더 적은 전이를 형성하고 양식한 전이가 더 작다는 것을 보여주었습니다. 이 실험은 실험적인 전이 실험이 어떻게 연구원이 전이 형성 및 성장에 있는 후보 유전자의 역할을 신속하고 저렴하게 시험하는 것을 허용하는지 보여줍니다. 그(것)들은 또한 살아있는 동물 화상 진찰의 결합한 사용 및 전체 폐에 있는 전이의 형광 정량화가 전이성 식민지 도중 단계를 더 잘 이해하는 것을 허용하는 방법을 보여줍니다.
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Protocol
이 프로토콜은 마우스 및 생체 유해 물질의 사용을 포함하고 적절한 기관 안전 위원회의 승인을 필요로한다. 여기에 설명된 모든 생체 내 작업은 알바니 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인됩니다.
참고: 프로토콜 개요는 그림 1의회로도를 참조하십시오.
1. 필요한 모든 레트로 바이러스 및 렌티 바이러스 포장
참고: 기재된 프로토콜은 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 루시퍼라아제 효소 및 형광 단백질을 안정적으로 발현하고 후보 유전자의 발현을 조작한다. 이러한 바이러스는 아래에 설명된 바와 같이 HEK-293FT 세포에서 패키징된다.
- 1일차: 완전한 성장 매체의 2 mL에서 6웰 플레이트에 있는 PLATE HEK-293FT 세포(1% 페니실린/스트렙토마이신과 2mML-글루타민을 가진 DMEM의 10% FBS)를 2일째에 40-60% 수렴합니다. 37°C, 5%CO2에서 하룻밤 동안 배양한다.
- 일 2: 패키징되는 각 바이러스 벡터에 대해, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 및 바이러스 코팅 및 패키징 단백질을 코딩하는 적절한 벡터를 사용하여 HEK-293FT 세포의 40-60% 웰웰을 트랜스펙트한다.
참고: 이 프로토콜은 VSVG를 코트 단백질로, 렌티바이러스 포장을 위한 psPAX2, 레트로바이러스 포장을 위한 개그폴을 사용합니다(벡터 목록에 대한 보충 표 1 참조). - 다음과 같이 각각에 대한 공동 형질 전환 혼합물을 만듭니다.
- 4 μL의 지질 용액을 형질감염(재료 표참조)과 96 μL의 형질전환 완충액을 결합하고 5분 동안 배양합니다.
- 바이러스 벡터 1 μg, 코트 단백질 벡터 0.5 μg(VSVG), 0.5 μg의 포장 단백질 벡터(psPAX2 또는 개그폴)를 넣고 20분 동안 배양합니다.
- 1.3.2단계에서 1.3.2단계에서 의 혼혈 혼합물을 1.1단계에서 도금된 HEK-293FT 세포에 부드럽게 첨가하고 37°C, 5%CO2에서 하룻밤 동안 배양한다.
- 3일차: 각 웰에서 형질전환 함유 매체를 제거하고 각 웰에 2 mL의 완전한 성장 매체를 부드럽게 추가합니다. 약 24시간 동안 37°C, 5%CO2에서 배양합니다.
- 일 4: 3 mL 주사기를 사용하여 각 우물에서 바이러스 상구제를 수집하고 2 mL 미세 원심 분리튜브로 0.45 μm 필터를 통해 필터링합니다.
- 선택 사항: 바이러스의 두 번째 배치의 수집이 필요한 경우, 각 웰에 2 mL의 완전한 성장 매체를 부드럽게 추가하고 약 24 시간 동안 37 °C, 5 %CO2에서 배양하십시오.
- 5일차(선택 사항): 1.5단계에서와 같이 두 번째 바이러스 성 상급제를 수집합니다.
참고: 프로토콜은 바이러스 상한을 동결시킴으로써 일시 중지될 수 있다.
2. 루시퍼라제와 형광 단백질을 안정적으로 발현하는 암세포의 생성
참고: 다음 프로토콜은 독특한 선택 유전자를 가진 2개의 벡터를 사용하여 반딧불 루시퍼라아제와 형광 단백질(ZsGreen)으로 4T1 세포를 안정적으로 라벨하는 방법을 설명합니다. 이어서3rd 바이러스 벡터는 후보 유전자의 발현을 조작하는데 사용된다. 그러나, 형광 단백질 및 유전 적 조작을 동시에 전달하는 바이러스 벡터는 또한 대안으로 사용될 수 있다 (아래 대표적인 실험에서와 같이). 그밖 암세포는 이용될 수 있습니다, 그러나 세포 수는 단계 2.1 및 2.7.1를 위해 최적화되어야 합니다.
- 플레이트 4T1 세포는 1.5 x 105 세포에서 12 웰 플레이트에서 완전한 성장 매체 (1% 페니실린/스트렙토마이신과 2 mM L-글루타민을 가진 DMEM에서 10% FBS)를 37°C, 5%CO2하룻밤에서 배양한다.
- 1단계에서 생성된 바이러스 상상염으로 4T1 세포를 감염시다.
- 세포로부터 성장 매체를 흡인하고 루시퍼라제 바이러스 상판및 500 μL의 루시퍼라제 바이러스 상판및 500 μL의 형광 단백질 바이러스 상류제를 첨가하여 동시에 루시퍼라제 및 형광 단백질 바이러스 성 초온제 모두로 세포를 감염시킨다.
- 8 mg/mL 헥사디메트린 브로마이드 1 μL을 첨가합니다(재료 표참조).
- 37 °C에서 세포를 배양, 75-90 % confluent까지 5 % (일반적으로 24-48 시간).
- 트립시네이드 4T1 세포와 함께 500 /5 분 동안 트립신의 μL (세포는 우물의 바닥을 자유롭게 헹구어야한다). 모든 세포를 4 mL의 선택 매체(적절한 항생제를 함유하는 완전한 성장 매체)에서 6 cm 접시로 옮겨 트립신을 담금질한다. 동일한 선택 매체에 비감염 대조군 세포의 6 cm 접시를 플레이트.
참고: 적절 한 항생제 농도 여러 복용량을 테스트 하 여 미리 결정 해야 합니다. 추가적으로, 형광 활성화 세포 선별은 또한 약물 선택 대신에 형광 표지된 세포를 선택하는 것을 이용될 수 있다. - 37°C, 5%CO2에서 세포를 선택 매체에 배양하고 모든 비감염 대조구세포가 죽을 때까지 필요한 경우 세포를 분할한다(선택 유전자 및 세포주에 의존).
- 감염된 4T1 세포가 50-100x 배율로 반전형광 현미경상에 설정된 녹색 여기(450-490 nm)/방출(500-550 nm) 필터를 사용하여 ZsGreen 형광 단백질을 발현하고 있는지 확인합니다.
- 감염된 4T1 세포가 시판되는 루시퍼라제 활성 키트를 이용하여 루시퍼라제를 발현하고 있는지 는 다음과 같다.
- 1x 수동 용해 버퍼의 최소 볼륨을 사용하여 루시퍼라제를 발현하는 4T1 세포를 용해시키고 루시퍼라제를 발현하지 않는 4T1 세포를 제어하고 30분 동안 부드럽게 흔들어 보냅니다.
- 20 μL의 세포 용해액을 백색 바닥 96 웰 플레이트에 첨가한 다음 루시퍼라아제 활성 키트로부터 루시페라아제 분석 시약의 50 μL을 첨가한다.
- 플레이트 리더를 사용하여 발광 설정을 사용하여 스펙트럼의 모든 파장에서 세포의 발광을 측정합니다.
참고: 프로토콜은 안정적으로 변환된 셀을 동결하여 일시 중지될 수 있습니다.
- 후보 유전자의 발현을 다음과 같이 조작한다.
- 플레이트 6 x 105는 완전한 성장 매체의 4 mL에서 60 mm 접시상에 2.6단계로부터 4T1 세포를 표지하고 37°C, 5%CO2에서 밤새 배양한다.
- 각각의 웰로부터 성장 매체를 흡인하고 8 mg/mL 헥사디메트린 브로마이드의 4 μL을 함유하는 완전한 성장 매체2 mL를 첨가한다.
- 1단계에서 2 mL의 바이러스 상구제를 단계 2.7.2로부터 도금된 세포에 넣고 37°C, 5%CO2에서 밤새 배양한다.
- 트립시네이드 4T1 세포와 함께 500 /5 분 동안 트립신의 μL (세포는 우물의 바닥을 자유롭게 헹구어야한다). 모든 세포를 10 mL의 선택 매체(적절한 항생제를 함유하는 완전한 성장 매체)에서 10 cm 접시로 옮겨 트립신을 담금질한다. 플레이트 일부 비감염 대조군은 동일한 선택 매체에 4T1 세포를 표지하였다.
- 선택 매체에 37°C, 5%CO2에서 세포를 배양하고 모든 비감염 세포가 죽을 때까지 필요한 경우 세포를 분할합니다.
- 후보 유전자의 발현이 웨스턴 블롯20 또는 qPCR21과같은 표준 접근법을 사용하여 변경되는지 확인한다.
- 분석 발광 및 형광 단계 2.5-2.6에서와 같이 그들은 제어 및 녹다운 세포에 얼마나 유사한지 결정하기 위해, 이것은 변경 될 수 있습니다 (토론 참조).
참고: 프로토콜은 안정적으로 변환된 셀을 동결하여 일시 중지될 수 있습니다.
3. 생체 내 실험 설계의 최적화
- 원하는 전이성 부담에 대해 적절한 세포 수 및 실험 기간을 다음과 같이 최적화한다.
- 완전한 성장 매체에서 2.6 단계에서 형광 및 생물 발광 4T1 세포를 확장하여 주입 당일에 과잉 세포를 사용할 수 있도록하십시오.
- 4.2단계에서 설명한 바와 같이 꼬리 정맥 주사를 위한 세포를 준비한다. 주사에 대한 최적의 세포 수를 결정하기 위해 1x PBS의 100 μL에서 여러 다른 농도로 세포를 다시 일시 중단하십시오.
참고: 25,000에서 최대 500,000까지 다양한 셀 번호/마우스를 테스트하는 것이 좋습니다. - 주입 될 때까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
- 단계 3.1.2에서 3-4 마우스로 4.3 단계에서 기재된 측면 꼬리 정맥을 통해 4T1 세포의 각 희석을 주입합니다(아래 참조).
- 마우스를 케이지로 되돌리고 15분 동안 모니터링하여 완전한 회복을 보장합니다. 마우스는 고통 또는 고민의 표시를 매주 3 배 검사해야 합니다.
- 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치를 사용하여 3-6주 동안 전이 형성 및 성장을 위한 마우스 모니터링(세포주 및 마우스 변형 의존성)(단계 5 및 6 단계 참조).
- 표준 기관 지침에 따라 꼬리 정맥 주사 후 3-6 주 동안 마우스를 안락사시.
- 폐를 준비하고 7단계에서 기재된 전이 크기 및 수를 평가한다.
- 전이가 원하는 전이 부담에 대해 성장할 적절한 시간을 선택합니다(토론 참조).
4. 표지된 암세포의 꼬리 정맥 주입
참고: 4.2.4 단계는 4T1 세포가 동기화 BALB/c 마우스에서 자라는 것에 최적화되었습니다. 그밖 암 세포주 및 마우스 긴장이 이용되는 경우에, 주입된 세포의 수 및 분석법의 길이는 첫째로 최적화되어야 합니다.
- 2단계에서 생성된 4T1 세포주를 완전한 성장 매체에서 2개의 15cm 접시에 확장하여 주사 당일에 초과 세포를 사용할 수 있도록 합니다.
- 꼬리 정맥 주입을 위한 세포를 준비하십시오:
- 용지를 흡인하고 1x PBS로 셀 플레이트를 헹구습니다.
- 트립시니화 5 트립신 의 mL 당 트립신 15 cm 플레이트 당 2-5 분 (세포는 자유롭게 우물의 바닥을 헹구어야한다). 모든 세포를 원유관으로 옮김을 옮김으로 옮김. 트립신을 담금질하고 동일한 원추형 튜브에 세척을 추가하기에 충분한 완전한 성장 매체로 조직 배양 접시에서 남은 세포를 세척합니다.
- 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산하여 총 셀 수를 결정합니다.
- 세포를 122 x g에서 3분 동안 원심분리하고, 상월체를 흡인하고, 원하는 농도로 1x PBS로 세포를 재중단한다. 여기서, 2.5 x 104 세포는 PBS의 100 μL에서 각 마우스에 주입되므로 2.5 x 105 세포/mL에서 세포를 다시 중단한다. 주입 될 때까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
참고: 세포의 트립시니화와 꼬리 정맥 주사 사이의 시간을 약 1 시간으로 제한하는 것이 중요합니다.
- 4.2.5단계에서 부터 횡꼬리 정맥을 통해 마우스로 4T1 세포를 다음과 같이 주입한다.
- 동물 시설에서 후드에서 작업, 부드럽게 하지만 철저 하 게 튜브를 반전 하 여 세포를 혼합 또는 1 mL 주사기를 사용 하 여 그들은 균일 하 게 다시 일시 중단 되도록. 주사기를 적재하기 전에 항상 셀을 다시 매달아 두도록 하십시오.
- 셀 서스펜션으로 1 mL Luer-lock 주사기를 적재하고 여분의 기포를 배출하십시오. 경사를 위로 하고 기포를 배출하는 주사기 위에 1/2 인치, 30 게이지 바늘을 놓습니다.
- 마우스를 설치류 절제기안에 부드럽게 놓습니다.
- 측면 꼬리 정맥이 보이고 넓혀져야 합니다. 그렇지 않은 경우 꼬리 의 밑부분을 부드럽게 꼬집고 꼬리를 따뜻한 수돗물에 담그어 정맥을 넓히십시오.
참고: 정맥의 팽창은 또한 가열 램프 및/또는 가열 패드 의 상단에 마우스 케이지를 두면 달성될 수 있습니다. - 알코올 닦음기를 사용하여 꼬리를 청소하십시오. 바늘을 꼬리 정맥에 넣고, 옆으로 베블하고, 100 μL의 세포 현탁액을 주입합니다.
참고 : 바늘이 정맥에 제대로 삽입되면 약간 앞뒤로 쉽게 미끄러져야하며 플런저를 밀때 저항이 없어야합니다. 성공적인 주사는 또한 정맥의 푸른 색이 주입 후 몇 초 동안 흰색으로 변하는 "플러시"를 초래해야합니다.
- 천천히 바늘을 제거하고 멸균 거즈를 사용하여, 어떤 출혈을 중지 주사 부위에 압력을 가한다.
- 마우스를 케이지에 넣고 15분 동안 모니터링하여 완전한 회복을 보장합니다. 마우스는 고통 또는 고민의 표시를 매주 3 배 검사해야 합니다.
- 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치를 사용하여 3-6주 동안 전이 형성 및 성장을 위한 마우스 모니터링(세포주 및 마우스 변형 의존성)(단계 5 및 6 단계 참조).
5. 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치로 형광에 의한 전이성 부담 모니터링
참고: 활성 발광 신호로 형광에 대한 동물을 이미지화하지 마십시오.
- 만 이미징 생물 발광경우, 단계 6로 건너 뜁니다.
- 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치를 켭니다.
- 마취 챔버와 이미징 챔버에 1.5 %와 2 %의 이소플루란을 제공하기 위해 제조업체의 지침에 따라 생체 내 살아있는 동물 이미징 마취 시스템을 설정합니다.
- 4단계에서 형광표지된 전이를 마취실로 생쥐를 마취챔버에 넣고 1.5-2.5% 이소플루란을 전달한다.
- 이미지 소프트웨어(재질 표참조)를 열고 로그인합니다.
- 초기화 단추를 클릭하고 기기가 초기화될 때까지 기다립니다.
- 뷰 필드를 D로변경합니다.
참고: 마우스의 가까이보기가 필요한 경우 보기 C 필드도 사용할 수 있지만 동시에 이미지화할 수 있는 마우스 의 수가 제한됩니다. - 소프트웨어가 카메라가 적절한 온도에 도달했다고 표시되면 이미징 마법사 버튼을 클릭하고 형광을 선택한 다음 드롭다운 메뉴에서 적절한 필터 쌍을 선택합니다.
참고: 사용 중인 형광단이 옵션이 아닌 경우 입력 EX/EM을 선택하고 필요한 여기 및 방출을 입력합니다. - 3.2.4단계에서 설명한 대로 마우스를 챔버에 놓는다.
- 시퀀스 획득을 클릭합니다.
- 이미징 후 마우스를 케이지로 되돌리고 15분 동안 모니터링하여 완전한 회복을 보장합니다.
- 5.2 단계 및 5.7-5.9 단계를 전이를 포함하지 않는 마우스를 하나 이상 반복합니다. 참고: 이 마우스는 분석 중에 배경 신호를 정량화하고 빼는 데 사용됩니다(8단계).
- 실험 기간 동안 매주 2-3회 이미지.
6. 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치로 생물 발광에 의한 전이성 부담 모니터링
- 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치를 켜고 다음과 같이 프로그램을 설정합니다.
- 이미지 소프트웨어(재질 표참조)를 열고 로그인합니다. 초기화 단추를 클릭하고 기기가 초기화될 때까지 기다립니다. 뷰 필드를 D로변경합니다.
참고: 시야 C 필드는 전체 마우스 본체를 자세히 볼 때 사용할 수 있습니다. 그러나, 이것은 한 번에 이미지화될 수 있는 마우스의 수를 제한합니다. - 처음 사용하려면 노출 설정을 다음과 같이 편집합니다. 환경 설정 | 취득 | 자동 노출및 최대 노출 시간을 기본 60초에서 300초로 변경하고 OK를클릭합니다.
참고: 자동 노출 탭에서 다른 매개변수를 변경하지 마십시오.
- 이미지 소프트웨어(재질 표참조)를 열고 로그인합니다. 초기화 단추를 클릭하고 기기가 초기화될 때까지 기다립니다. 뷰 필드를 D로변경합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 마취 시스템을 설정하여 마취 챔버와 이미징 챔버에 1.5 %와 2 %의 이소플루란을 전달합니다.
- 6.4단계로 진행하기 전에 카메라가 적절한 온도에 도달했는지 확인합니다.
- 마취-함유 마우스를 마취 챔버에 넣고 1.5-2.5% 이소플루란을 전달함으로써 4단계에서 전이 함유 마우스를 마취시다.
- 생물 발광 이미징을 위한 마우스를 다음과 같이 준비시다.
- D-루시페린(D-luciferin)으로 1mL 주사기를 적재한 다음 1/2인치 30인치 바늘을 주사기에 넣고 기포를 배출합니다.
- 마취된 마우스의 질량을 측정하고 기록합니다.
- 엄지손가락과 포인터 손가락을 사용하여 목 덜미를 꼬집고 핑키 핑거와 손의 밑면 사이의 꼬리를 잡고 마우스를 억제하십시오. 머리가 아래쪽을 가리키는 45도 각도로 마우스를 반전합니다.
- 바늘을 마우스의 왼쪽 복강 내(IP) 공간에 삽입합니다. 작은 볼륨을 다시 그려 IP 공간으로 항목을 확인합니다. IP 공간에서 다시 그릴 때 바늘의 베이스에 색상이 없어야합니다.
- 의 복용량에 대 한 D-luciferin의 적절 한 볼륨을 주입 150 mg/kg.
- D-luciferin 관리 직후, 타이머를 시작하고 코 콘에 코를 가진 화상 진찰 장치에 그것의 뒤쪽에 그것의 뒤의 마우스를 평평하게 놓고 1.5-2.5% 이소플루란이 관리되고 있는지 확인하십시오. 여러 마우스를 이미징하는 경우 각 마우스 사이에 분배기를 놓습니다. 마우스가 가능한 한 평평하게 배치되었는지 확인합니다(즉, 한쪽으로 기울지 않음).
- 발광 및 사진 상자를 클릭한 다음 획득 제어판에서 획득을 클릭합니다.
- 피크 신호가 달성될 때까지 생물 발광 이미지를 지속적으로 획득하고 분석을 위해 피크 생물 발광 신호와 함께 이미지를 사용합니다.
- 이미징 후 마우스를 케이지로 되돌리고 15분 동안 모니터링하여 완전한 회복을 보장합니다.
- 실험 기간 동안 매주 2-3회 이미지.
7. 전이의 수와 크기의 정량화
참고: 전이가 증가하는 시간은 각 세포주 및 마우스 변형에 대해 결정되어야 하며, 주입된 세포 수에 의해 영향을 받습니다.
- 표준 기관 지침에 따라 마우스를 안락사.
- 각 마우스에서 폐를 분리하고 제거하고 1x PBS로 헹구어 과잉 혈액을 제거하십시오.
- 폐를 로브로 부드럽게 분리합니다.
- GFP 광대역 필터(여기 470/40x)를 사용하여 밝은 필드에서 10배 의 로브와 형광에 있는 ZsGreen 전이의 이미지를 획득합니다.
참고: 모든 샘플에 대해 동일한 배율과 밝기를 유지합니다. 사용되는 배율은 사용되는 현미경의 시야뿐만 아니라 전이의 크기, 수 및 밝기에 따라 달라질 수 있습니다. - 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지에서 전이의 크기와 수를 정량화합니다.
참고: 이미지 분석을 위한 프로토콜은 소프트웨어에 따라 달라지며 step3의 종양으로 최적화될 수 있습니다. 양자택일로, 형광 입체 스코프를 사용하여 각 폐에 있는 전이의 수를 수동으로 계산하십시오. 프로토콜은 여기에서 일시 중지될 수 있으며 8단계는 모든 생체 내 이미지가 수집된 후 임의의 시점에서 수행될 수 있다.
8. 생체 내 라이브 동물 이미징 장치로 획득 한 이미지의 데이터 처리 및 분석
- 이미지 소프트웨어에서 각 마우스에 대한 모든 이미지 파일을 엽니다.
참고: 분석을 위해 피크 생물 발광 신호와 함께 이미지를 사용하십시오. - 이미지 창의 왼쪽 상단에 있는 화살표를 클릭하고 해당 장치로 변경하여 장치가 생물 발광 데이터의 방사및 형광 데이터의 효율성에 있는지 확인합니다.
- 마지막 시점의 이미지를 사용하여 다음과 같이 관심 영역(ROI)을 만듭니다.
- 도구 팔레트 창에서 ROI 도구를 클릭합니다. 화살표를 클릭하고 1을선택하여 ROI 를 하나 삽입합니다.
- ROI의 테두리를 클릭하고 마우스 가슴 위로 이동합니다. 마우스 의 가슴을 덮고 신호를 배제하지 않도록 ROI의 크기를 조정합니다.
- ROI 측정을 클릭하고 원시 번호를 Excel 시트에 복사하거나 입력합니다.
참고: 생물 발광 데이터의 경우 총 플럭스(광자/초)를 선택하면 ROI의 모든 광채의 합계가 합산됩니다. 전이가 반드시 균일하게 성장하지 않기 때문에, 전이성 부담의 합을 측정하기 때문에 총 플럭스는 평균 광도보다 우선합니다. 마찬가지로 형광 데이터의 경우 총 효율 %(방출 광도(광자/초)/여기광(광자/초))을 평균 효율 대신 사용해야 합니다. - 이미지 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 8.3단계에서 사용된 ROI를 복사하고 모든 이미지 파일에 붙여넣습니다.
참고: 형광 이미지를 정량화할 때 전이 없이 이미지화된 마우스에서 동일한 영역을 정량화합니다. 이 신호를 배경 신호로 사용하고 획득한 각 형광 전이를 포함하는 마우스 이미지에서 빼내입니다. - 각 이미지에 대해 8.3.4 단계에서 선택한 동일한 영역에 붙여넣은 ROI를 이동하고 8.4 단계를 반복합니다.
- 원시 데이터를 플롯하고 분석하는 것은 다음과 같습니다(보충 표 2참조).
- 도 2D 및 도4F에서와같이 표시된 수식(보충표 2)을사용하여 각 마우스에 대한 원시 데이터의로그(10) 변환을 수행한다. 로그10 변환은 기하학적 경향이 있는 성장 곡선을 선형화하고 이종성을 최소화합니다.
- 선형 회귀를 사용하여 8.7.1단계(보충 표 2)에서플롯된 각 마우스에 대해 변형된 데이터를 로그10에 맞게 피팅된 선의 기울기를 계산합니다. 선에 맞게 한 단계에서 경사를 계산하려면 보충 표 2의 수식을 참조하십시오.
- 그림 2E 및 그림 4G에서와같이 경사의 숫자 값을 플로팅합니다. 학생의 t-검정 또는 단방향 ANOVA(2개 이상의 그룹)를 사용하여 통계적 유의를 결정합니다.
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Representative Results
상기 접근법을 입증하기 위해, 우리는 중요한 복제 인자인 RPA3가 전이성 마우스 유방 암종 세포주에서 쓰러졌던 개념 증명 실험을 수행하였다(4T122). 프로토콜은 유전자 조작 전에 루시퍼라제 및 형광 단백질로 세포를 표지하는 것을 설명하지만, RNAi 벡터는 ZsGreen(그림 2A)을제공하기 때문에 변형 된 접근 법을 사용했습니다. 먼저, 4T1 세포는 반딧불 루시퍼라아제 및 히그로마이신 저항성(pHAGE-Luciferase-IRES-Hygro)을 인코딩하는 렌티바이러스 구조체로 안정적으로 변환하였다. 히그로마이신 선택 후, 반딧불 루시퍼라아제의 안정적인 발현을 확인하기 위해 루시페라아아제 분석이 수행되었다(도2A). 다음으로, 4T1-루시퍼라제 세포는 ZsGreen 및 대조군 miR30 계질 shRNA, 또는 이전에 마우스 RPA316,23,24를효과적으로 표적화하는 것으로 나타난 miR30-기반 shRNA를 발현하는 레트로바이러스 벡터로 안정적으로 변환되었다. 세포를 횡꼬리 정맥을 통해 마우스 내로 주입한 후 생체 발광 신호를 일주일에 두 번 측정하여 전이성 부담을 모니터링하였다(도2B,C). 각 마우스에 대한로그(10) 형형파 신호는 시간이 지남에 따라 전이성 부담으로 플롯되었고(도2D)각 플롯의 기울기를 결정하였다(도2E). 이러한 데이터는 제어 셀에 비해 RPA3 녹다운으로 전이성 부담의 변화율이 현저히 감소한다는 것을 보여준다. 차이점은 눈에 띄는, 이러한 데이터 만으로는 감소 된 전이 부담이 더 적은 전이의 결과 또는 전이의 느린 성장으로 인한 것인지 를 확인할 수 없습니다. 따라서, 폐에서 ZsGreen 표지된 전이또한 실험의 끝에서 분석되었다. RPA3 녹다운 세포로 주입된 마우스는 폐에 거의 전이가 없었던 반면, 대조군 마우스는 수많은 큰 전이를가졌다(그림 3). 더욱이, RPA3 녹다운 세포로부터 형성된 전이는 대조군 4T1 전이보다 명확하게 작하였다(도3A). 당사의 수동 개수(그림3B)와일치하여, 이미지 분석 소프트웨어는 RPA3 녹다운 마우스에서 현저히 적은 전이를 계산하였다(그림3C). 추가적으로, 폐에 있는 총 전이성 부담 (밀리미터에 있는 각 전이의 지역의 합계)는 또한 RPA3 녹다운에 의해 크게 감소되었습니다(그림 3D). 마지막으로, RPA3 녹다운 마우스에서 형성된 개별 전이의 크기는 일반적으로 대조군 마우스에 있는 것보다 훨씬 작하였다(도3E). 대조군 마우스에 있는 큰 전이 이외에, 우리는 수많은 작은 전이 또한 관찰했습니다, 그러나 이들이 폐를 씨를 뿌리고 성장하지 않은 종양 세포인지 또는 새로운 위치에서 폐를 다시 씨를 뿌린 더 큰 전이의 한에서 흘러나온 종양 세포인 경우에 결정할 수 없습니다(그림 3E). 이러한 데이터는 RPA3가 4T1 세포에 의한 전이 형성에 필요하다는 것을 보여준다. 이 사실 인정은 우리의 이전 일이 RPA3가 세포를 노크하는 것이 꼬리 정맥 주입 다음 폐에 있는 전이를 형성하는 능력을 현저하게 감소시켰다는 것을 보여주었기 때문에 예상되었습니다16. 그러나, 본 실험은 전이성 부담의 변화가 전이성 식민지화 또는 성장의 차이에 기인하는지 여부를 결정하기 위해 살아있는 동물 이미징 및 형광 정량화를 어떻게 사용할 수 있는지를 보여준다.
이 접근이 더 생물학적으로 관련있는 질문에 대답하기 위하여 이용될 수 있는 방법을 설명하기 위하여는, 우리는 YAP와 TAZ가 유방암의 이 syngeneic 모형에 있는 전이성 식민지 및 연속적인 성장을 위해 요구되는지 물었습니다. YAP 또는 TAZ의 발현 및 활성은 정상 조직에 비해 많은 암에서 증가하며 이것은 가난한 환자 결과25,26,27,28,29의예측이다. 또한, 여러 연구는 YAP, TAZ, 또는 TEADs, 중요한 YAP / TAZ 바인딩 파트너를 연루, 전이15,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42, 43,44,45,46,47 ,48,49,50,51,52. 이 데이터를 감안할 때 우리는 YAP와 TAZ가 전이 형성 및 성장에 필요한지 테스트하기 위해 우리의 접근 방식을 사용했습니다. 이를 위해, 우리는 YAP 및 TAZ 둘 다를 표적으로 하는 탠덤 miR30 기반 shRNAs를 표현하는 레트로바이러스 벡터를 사용한다. 도시된 바와 같이, 이러한 탠덤 슈RNA는 4T1 세포에서 YAP 및 TAZ 단백질 발현 및 전사 활성을 효과적으로 감소시킨다(도4A,B). 4T1-루시퍼라아제 세포는 이러한 탠덤 YAP/TAZ shRNA 벡터또는 대조군 miR30-기반 shRNA(도4C)의ZsGreen 발현 버전으로 안정적으로 변환한 다음, 합성 BALB/c 마우스에서 꼬리 정맥 주사에 의해 분석하였다. 도 4에나타낸 바와 같이, 전이성 부담이 증가하는 속도는 YAP/TAZ 녹다운 세포를 주사한 마우스에 비해 대조군 세포를 주입한 마우스에서 유의하게 더 빨랐다(도4D-F). YAP/TAZ 녹다운 세포를 주입한 마우스에서 형성된 전이수가 수동으로 카운트되었는지 여부(도 5A, B)또는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하는 지 여부에 비해 현저히 적다(도5C). 대조군 마우스에서 더 많은 전이가 형성되었을 뿐만 아니라 일반적으로 더 컸다(도5E). 일관되게, 폐에 있는 전이성 부담 (mm에 있는 총 전이 지역)는 또한 YAP/TAZ 녹다운에 의해 급격하게 감소되었습니다(그림 5D). 전이가 크고 서로 가까우면 소프트웨어가 뚜렷한 전이를 구별하지 못할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 이것은 대조군 마우스(마우스 3 및 마우스 7)에서 몇 가지 전이에 대한 경우였다. 따라서, 단일 종양의 면적을 정확하게 측정하고 있는지 확인하기 위해 이미지 분석 소프트웨어의 출력을 확인하는 것이 중요하다. 이것은 또한 주입 되는 세포의 수와 실험의 길이 최적화 하는 것이 중요 하다. 종합적으로, 이 데이터는 YAP와 TAZ가 전이성 유방암의 syngeneic murine 모형에 있는 전이성 부담이 증가하는 비율을 유지하기 위하여 요구되고 이것이 형성한 몇몇 전이의 형성하고 감소된 성장을 형성하기 위하여 전이의 무능력 때문이 것을 보여줍니다.
그림 1: 프로토콜의 회로도. 필요한 모든 바이러스는 HEK-293FT 세포에서 먼저 포장됩니다. 연구를 위한 바람직한 세포는 각각 독특한 포유류 약물 선택 유전자를 발현하는 루시퍼라아제 및 형광 바이러스에 동시에 감염된다. 감염된 세포는 루시퍼라제와 형광 단백질을 모두 발현하는 안정적으로 변형된 세포를 선택하기 위해 두 약물을 모두 포함하는 적절한 매체에서 확장된다. 두 라벨의 발현은 프로토콜에 기재된 바와 같이 확인된다. 표지된 세포는 그 때 제 3 바이러스를 포함하는 유전 조작 (miR30 shRNA) 및 제 3 유일한 약 선택 유전자로 변환됩니다. 제 3 약물을 선택 한 후, 세포는 측면 꼬리 정맥을 통해 마우스내로 주입됩니다. 전이성 부담은 생체 내 살아있는 동물 이미징 시스템을 가진 실험 전반에 걸쳐 마우스에서 모니터링된다. 실험의 끝에서, 마우스는 안락사되고, 전체 폐의 심상은 형광 해부 현미경을 사용하여 취하고, 그 때 전이의 수 그리고 크기를 측정하기 위하여 이용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 루시퍼라제 기반 생체 내 살아있는 동물 이미징은 RPA3 녹다운이 유방암 전이성 부담을 감소시킨다는 것을 보여준다. (a)생체내 연구를 위해 세포가 어떻게 생성되었는지를 보여주는 도식. 4T1 세포는 루시퍼라제 및 히그로마이신 내성을 코딩하는 렌티바이러스로 안정적으로 변환하였다. 감염된 세포는 1주일 동안 600 μg/mL의 히그로마이신 B를 선택한 후 루시퍼라제 활성을 루시퍼라제 리포터 키트 및 플레이트 리더를 사용하여 부모 또는 4T1-루시퍼라아제 세포에서 측정하였다(n=1 복제 웰을 이용한 실험 평균). 4T1-루시퍼라아제 세포는 zsGreen 및 miR30 shRNAs를 전달하는 레트로바이러스에 감염된 후 mCherry(제어) 또는 mRPA3 중 하나를 표적으로 하였다. 3일 동안 푸로마이신 선택(2.5 μg/mL)을 사용하여 바이러스의 안정적 통합을 선택하였다. (B-E)4T1-루시퍼라아제 세포를 안정적으로 발현하는 ZsGreen 및 대조군(sh-mCherry) 또는 mRPA3(sh-mRPA3-431) shRNA를 마우스에 주입하고 프로토콜에 기재된 바와 같이 지시된 날에 생물발광을 위해 이미지화하였다. (B&C) 지시된 일 후주사(D)로그(10)의 플롯에 각 그룹의 대표 마우스에 대한 생체 발광 이미지는 실험의 과정을 통해 각 마우스에 대해 측정된 변형된 루시퍼라제 신호이다. (E)D에서 각 마우스의 경사에 대한 평균(실선)을 가진 분산도(sh-mRPA3-431의 경우 n = 6) 통계적 유의는 학생의 t 시험을 사용하여 테스트되었다; *p ≤ 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 형광 전이의 정량화는 RPA3 녹다운이 전이성 식민지화 및 유방암 세포의 후속 성장을 방지한다는 것을 보여줍니다. (a)주사 후 21일 후에 각 마우스에서 각 마우스의 대표적인 로브의 형광(왼쪽) 및 브라이트필드(오른쪽) 이미지. 별표 (*)는 녹색 자기 형광 기관지를 표시했다. (C-E) 이미지 분석 소프트웨어(재료 표참조)는 25~100의 강도 임계값과 0.01 mm2~ 무한대의 크기 임계값을 사용하여 물체를 식별하고 측정하는 데 사용되었습니다. (B&C) 각 마우스의 폐내 의 총 전이 수의 평균(solid bar)을 가진 산란플롯(B)을 이미지 분석 소프트웨어(C)에 의해 계산한다. (D)이미지 분석 소프트웨어로 측정된 폐의 총 면적(mm)은 고체 막대로 표시된 평균을 가진 전이성 부담으로 플롯된다. (E)각 전이의 크기는 모든 마우스에 대해 플롯됩니다. 대조군 마우스는 붉은 점에 의해 청색 점 및 mRPA3 녹다운 마우스에 의해 지시된다. 참고로, 스케일 막대는 작은 전이의 크기와 수를 쉽게 시각화할 수 있도록 1mm로 구분됩니다(n = 6 sh-control, 8 sh-mRPA3-431). 통계적 유의는 학생의 t 시험을 사용하여 테스트되었다; p = 0.06; ** p ≤ 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: YAP/TAZ 녹다운은 유방암 전이성 부담을 감소시킵니다. (A&B)4T1 세포를 안정적으로 발현하는 miR30 기반 제어(mCherry) 또는 탠덤 YAP/TAZ shRNAs(sh-mYAP1/mTAZ6)를 웨스턴 블롯 분석(A) 또는 트랜스로 분석하였다. YAP/TAZ-TEAD 루시퍼라제 리포터 구성으로 감염되고 앞서설명한바와 같이 YAP/TAZ-TEAD 전사 활성에 대해 분석하였다(n=5 대조군 및 YAP1/TAZ6에 대한 4). (C)생체내 연구를 위해 세포가 어떻게 생성되었는지를 보여주는 개략적. 4T1-루시퍼라아제 세포는 ZsGreen및 mYAP 및 mTAZ 둘 다를 표적으로 하는 miR30 shRNA 표적화 mCherry (제어) 또는 탠덤 miR30 shRNAs를 전달하는 레트로바이러스에 감염되었다. 감염된 세포를 3일 동안 푸로마이신(2.5 μg/mL)에서 선택하였다. ZsGreen 및 대조군(sh-mCherry) 또는 YAP/TAZ(sh-mYAP1/mTAZ1) shRNA를 안정적으로 발현하는 4T1-루시퍼라아제 세포를 마우스에 주입하고 주입된 날에 의해 생물 발광을 위해 이미지화하였다. (D&E) 지시된 날 사후 주사에 각 그룹의 대표 마우스에 대한 생체 발광 이미지. (f)로그(10)의 플롯은 실험의 과정을 통해 각 마우스에 대해 측정된 변형된 루시퍼라제 신호이다. (G) F에서 각 마우스의 경사에 대한 평균(솔리드 막대)이 있는 분산도(n = 7의 경우 sh-mRPA3-431). 평균은 실선으로 표시됩니다. 통계적 유의는 학생의 t 시험을 사용하여 테스트되었다; p = 0.06; #, p ≤ 0.01; ***. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: YAP 및 TAZ는 폐를 식민지화하기 위하여 전이성 유방암 세포를 위해 요구됩니다. (a)주사 후 21일 후에 각 마우스에서 각 마우스의 대표적인 로브의 형광(왼쪽) 및 브라이트필드(오른쪽) 이미지. (C-E) 도 3에설명된 바와 같이 이미지를 이미지 분석 소프트웨어로 처리했습니다. (B&C) 각 마우스의 폐내 전이총 수의 평균(솔리드 바)을 수동으로계수(B)또는 이미지 분석소프트웨어(C)로계산할 때 산란플롯을 한다. (D)모든 전이(mm)의 총 면적을 이미지 분석 소프트웨어로 측정하고 평균(solid bar)을 가진 전이성 부담으로 플롯하였다. (E)각 전이의 크기는 모든 마우스에 대해 플롯됩니다. 대조군 마우스는 붉은 점에 의해 청색 점 및 sh-mYAP1/mTAZ6 녹다운 마우스에 의해 지시된다. 참고로, 스케일 바는 작은 전이의 크기와 수를 더 잘 시각화하기 위해 1mm로 분리됩니다(n = 7 sh-control, 8 sh-mYA1/mTAZ6). 평균은 실선으로 표시됩니다. 통계적 유의는 학생의 t 시험을 사용하여 테스트되었다; *p ≤ 0.05, **, p ≤ 0.01; **. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 벡터 표. 사용되는 모든 벡터가 나열되고 새 벡터가 설명됩니다. 표준 분자 생물학 기술은 새로 기술된 97-mer shRNA에 대한 새로운 벡터 및 서열을 복제하는 데 사용되었다. 인용문은 [1]53, [2]16, [3]54이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: 생체 내 살아있는 동물 이미징 데이터 처리 및 분석의 예. 스프레드시트는 생체 내 살아있는 동물 이미지로부터의 원시 데이터가 6.7 단계 및 6.8단계에 설명된 바와 같이 분석을 위해 변환되는 방법을 보여줍니다. 생체 내 살아있는 동물 이미징으로부터 획득한 원시 데이터는 로그10 변환을 사용하여 변형되었다. 전이성 부담의 변화율은 로그10 변환 된 데이터에 의해 생성 된 기울기를 계산하여 각 마우스에 대해 계산됩니다. 그림 2의루시퍼라제 해석을 예로 들 수 있습니다. 열은 각 경사 값을 생성하는 데 사용된 데이터를 나타내기 위해 색상으로 구분되며 수식은 스프레드시트에 포함됩니다. 우물을 두 번 클릭하면 데이터를 처리하는 데 사용되는 수식이 표시됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
메서드의 중요한 단계
주어진 세포주 및 마우스 균주에 대해 주입된 세포수(단계 3)를 최적화하는 것이 중요하며, 이는 실험의 형태및 길이에 크게 영향을 미칠 수 있다. 너무 많은 세포가 주입되거나 전이가 너무 오래 증가하는 경우에, 전이가 평가하기 어려운 유전 조작의 효력을 만드는 계산하기 어려울 지도 모릅니다. 그러나, 너무 적은 세포가 주입되는 경우에, 몇몇 또는 전혀 전이가 형성될 수 있습니다. 따라서, 예비 실험은 전이가 성장하는 최적의 수와 시간의 길이를 결정하기 위해 세포의 다른 숫자를 사용하여 수행해야합니다. 그룹 내에서 전이의 일관된 수를 보장 하기 위해, 각 마우스에 실행 가능한 세포의 동일한 수를 주입 하는 것이 중요 하다. 세포는 튜브와 주사기 모두에 정착 할 수 있기 때문에, 세포는 주사기를 적재하기 전에 부드럽게 다시 중단되어야하며, 세포 현탁액은 너무 오래 주사기에 방치되어서는 안됩니다 (단계 4.3.2). 세포 생존력은 세포가 현탁액에 오래 있을수록 감소하므로 세포의 트립시네이션과 주사 사이의 시간은 1시간 이상이어야 한다(단계 4.2.5). 기포와 세포의 큰 덩어리는 마우스를 죽이는 색전증을 일으킬 수 있기 때문에 주입해서는 안됩니다. 또한 바늘을 통해 셀을 끌어 올려 전단 할 수 있으므로 주사기는 바늘없이로드해야합니다. 비교적 동일한 수의 세포가 주입되었다는 것을 확인하기 위해, 생체 내 살아있는 동물 이미지는 주사 직후에 촬영될 수있다(도 2B, 도 4D).
생물 발광 신호의 정확하고 일관된 정량화는 중요하며 D-루시페린을 취하고 대사하는 세포에 의존한다. 이것은 D-luciferin의 복용량, 주입의 타이밍, 마우스의 체온, 마우스를 주입할 때 어떻게 마취되는지, 그리고 마우스가 화상 진찰의 앞에 마취 약실에 위치하는 방법 등 많은 변수에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 따라서 모든 마우스 및 이미징 세션에 대해 이러한 단계를 일관되게 유지하는 것이 중요합니다. 우리는 마취 챔버에있는 동안 일관된 마우스 체온을 유지하기 위해 가열 패드를 사용했다. 신호는 생물 발광 및 형광 검출 을 위해 조직을 관통해야하기 때문에 각 이미지에 대해 마우스 위치를 일관되게 유지하는 것이 중요합니다 (뒷면의 플랫은 폐의 이미징에 가장 적합합니다). 생체 내 살아있는 동물 이미징에서 형광 이미지의 정량화는 항상 이미지 간의 적절한 비교를 허용하므로 효율성 % 단위를 사용하여 수행해야합니다. 마찬가지로, 생물 발광 이미지를 정량화할 때 총 플럭스(광자/초)를 항상 사용해야 합니다. 전이성 부담 해석을 위해 로그10 변환은 성장 곡선(최대 신호에 도달하기 전)을 경사 해석에 필요한 선형 플롯으로 변환합니다.
메서드의 수정 및 문제 해결
제시된 프로토콜에서 세포의 집단은 먼저 형광 단백질 및 루시퍼라제로 안정적으로 변환되고, 그 집단은 관심 있는 유전자를 표적으로 하는 대조군 벡터 또는 벡터로 변환된다. 이것은 두 세포 집단이 유사한 형광 성 단백질 및 luciferase 발현이 있다는 것을 확인합니다. 그러나, 대안으로서, 이들 성분 중 두 가지를 동시에 전달하는 바이러스 벡터가 활용될 수 있다. 실제로, 대표적인 실험에서 우리는 4T1-루시퍼라아제 세포에서 shRNA를 발현하기 위해 레트로바이러스 벡터를 발현하는 ZsGreen을 사용하였다. 관심 유전자가 변경된 후 모든 세포 그룹에서 루시퍼라제 및 형광 단백질의 발현을 분석하는 것이 좋습니다. 그룹 간의 발현 수준이 상이하면 데이터의 해석이 복잡해질 수 있으므로, 다른 그룹이 형광 단백질과 루시퍼라아제 둘 다의 유사한 발현을 하는 것이 가장 좋습니다. 추가적으로, 적혈구는 자동 형광성이 될 수 있고 폐에 있는 형광 전이를 구상하는 것을 어렵게 만들 수 있습니다. 이 경우, 적혈구는 자가 형광 배경을 줄이기 위해 안락사 동안 PBS 관류에 의해 폐에서 제거 될 수있다 (적절한 안락사 기술과 지침을 따라야한다). 우리의 대표적인 실험에서 대조군과 녹다운군 사이의 차이는 극적이지만, 생체 내 전이 실험에 자주 존재하는 내재된 마우스 대 마우스 가변성은 대조군 마우스에서분명하다(도 3B 및 도 5B). 이 가변성이 높으면 녹다운 효과의 크기를 결정하기 어려울 수 있습니다. 이 가변성을 감소시키기 위하여 이용될 수 있는 대안 적인 접근은 명백한 형광성 단백질 및 명백한 luciferase 효소로 통제 세포 및 녹다운 세포를 표시하고 그 때 동등한 수로 2개의 인구를 섞고 혼합물을 주입하는 것입니다. 예를 들어, 토마토와 레닐라 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 제어 세포는 ZsGreen 및 반딧불 루시퍼라아제를 발현하는 녹다운 셀과 혼합될 수 있다. 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치는 반딧불 루시퍼라아제와 ZsGreen의 토마토에서 레닐라 루시퍼라아제를 구별할 수 있으므로 형광 또는 발광을 사용하여 각 세포 집단을 독립적으로 정량화할 수 있습니다. 실제로, 살아있는 동물에서 원발성 종양으로서 성장하는 4T1 세포의 이중 루시퍼라제 이미징은 생체내 살아있는 동물 이미징 장치4를사용하여 입증되었다. 그러나 형광 신호에 중복될 수 있으므로 스펙트럼 혼합 단계(제조업체 지침 참조)가 이 접근법에 포함되어야 합니다. 또한, 레닐라 루시퍼라아제와 반딧불 루시퍼라아제는 두 번째 루시퍼라아제 신호를 이미징하기 전에 더 이상 감지할 수 없는 적절한 시간 지연으로 별도로 이미지화되어야 합니다. 뚜렷한 형광단의 사용은 여전히 폐에서 전이의 수와 크기를 정량화 할 수 있게한다 16. 폐 외에 다른 장기에서 전이성 식민지화 및 성장을 테스트하기 위해이 프로토콜은 심장 내 및 문맥 주사9,10에수정및 사용될 수 있다.
방법의 제한 사항
형광표지된 암세포와 함께 실시간 전이성 부담을 획득하기 위해 생체내 살아있는 동물 영상 장치를 사용하여 전이성 식민지화 및 후속 성장을 분석하는 강력한 방법을 제공하는 단계; 그러나 이 방법의 제한사항이 있습니다. 몇몇 유전자는 전이에 있는 특정 역할 보다는 오히려 선천적인 세포 증식을 위해 요구될 수 있습니다. 시험관내 세포 증식 시험은 유전자가 시험관내 성장을 방해하는지 확인하기 위해 생체내 실험 이전에 수행될 수 있었다. 살아있는 동물을 이미징할 때, 전이에서 생물 발광 또는 형광 신호는 조직을 통과할 만큼 충분히 강해야 합니다. 부가적으로, 조직의 광학적 성질(즉, 흡수 및 산란)도 검출에 영향을미친다(55). 여기 광원은 형광표지된 암세포를 자극하기 위해 조직을 통과할 수 있어야 하며, 생물발광은 형광보다 더 큰 동적 범위를 갖는다. 따라서, 형광은 살아있는 동물 화상 진찰을 위해 이용될 수 있더라도, 생물 발광은 내부 기관에서 신호를 검출하기 위해 바람직하다. 또한, 일부 면역 적격 마우스 균주는 형광 단백질을 발현하는 세포를 거부 할 수 있습니다. 실제로, 우리는 토마토, GFP, 또는 mCherry를 발현하는 세포가 BALB/c 마우스에서 성장할 때 불소를 거부하거나 아래로 조절하였다는 것을 발견하였다(데이터는 도시되지 않고15). 그러나, 여기서 입증된 바와같이(도 3 및 도 5)및 이전15,16,ZsGreen 표지된 세포는 이들 마우스에서 검출될 수 있다. 형광 단백질 발현이 탐지되지 않는 경우, 상대전이성 콜로니화를 정량화하는 또 다른 방법은 qPCR을 사용하여 통합 된 바이러스벡터(15)에서형광 유전자 또는 다른 유전자를 정량화하는 것이다. 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치는 전이성 부담의 변화를 감지 할 수 있지만, 이러한 변화가 변경 된 크기 또는 전이수로 인한 것인지 여부를 결정하는 것은 허용되지 않습니다. 또한 전이의 위치에 대한 공간 정보를 제공하지 않습니다. 또한, 신호의 강도는 조직이 얼마나 깊은지에 의해 영향을 받을 수 있습니다.
방법 및 잠재적인 향후 응용 프로그램의 중요성
이 방법을 수정하여 더 많거나 다른 정보를 얻을 수 있는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 인간 암 세포주 또는 환자 유래 이종이식을 포함한 다양한 암 세포주들이 이 분석에서 사용될 수 있었다. 그밖 마우스 모형은 또한 기질 세포에 의해 만들어진 단백질을 표적으로 하는 것이 주입된 암세포의 전이성 식민지 화 그리고 성장에 어떻게 영향을 미치는지 시험하기 위하여 디자인된 형질전환 또는 녹아웃 마우스를 포함하여 이용될 수 있었습니다. 시험할 여러 후보 유전자가 있는 경우, 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치가 광범위한 형광포를 검출하고 구별할 수 있기 때문에 이 접근법은 다중화될 수 있다. 이것은 요구되는 마우스의 수를 감소시키고 시험될 수 있는 표적의 수를 증가할 것입니다. 생체 내 살아있는 동물 이미징은 또한 X 선 또는 CT9 이미징과 결합되어 전이의 위치에 대한 많은 공간 정보를 제공 할 수 있습니다. 마지막으로, 이 접근법은 전이성 식민지화 캐스케이드 내에서 보다 구체적인 단계를 분석하도록 수정될 수 있다. 예를 들어, 종양 세포 파종에 관여하는 단계(혈관 내 생존, 외래, 및 사후 외래 생존)는 주사 후 처음 3일 이내에 폐 내의 종양 세포의 수를 정량화함으로써 구별될 수 있다(예: 여기서수행된 16). 이 경우, 폐는 또한 혈관 마커로 염색될 수 있고 생체내 를 이미지화하여 각시점56,57에서사치화한 암세포의 백분율을 결정할 수 있다.
요약하면, 꼬리 정맥 주입 다음형광 및 발광 암 세포의 생체 내 실시간 살아있는 동물 이미징의 사용은 후보 유전자 또는 유전자가 전이성 식민지화 및 후속 성장에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 보다 상세한 분석을 가능하게 한다. 이 접근법은 자동 마우스 모델보다 빠르고 저렴하며 자발적전이변 모델의 주의 사항 중 일부를 방지합니다. 형광과 발광을 전이를 감지하고 정량화하는 수단으로 사용하면 연구원에게 결과에 대한 신뢰도를 높이고 실험 설계의 유연성을 허용하는 독립적인 판독을 제공합니다. 형광을 사용하여 전이 크기와 수를 정량화하면 시간이 오래 걸리고 잠재적으로 비용이 많이 드는 조직학적 처리 및 분석이 필요하지 않으며 전체 조직의 추가 사용을 허용합니다. 프로토콜은 RNAi, 이식유전자 발현, 또는 CRISPR/Cas 매개 편집과 같은 후보 유전자의 발현 또는 기능을 조작하기 위해 다양한 기술과 함께 사용될 수 있으며, 또한 작은 분자, 기능 차단 항체, 또는 다른 잠재적인 치료 화합물을 테스트하는데 사용될 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 몇 가지 간단한 수정은 분석을 강화하고 추가 정보를 제공하기 위해 이루어질 수 있다. 이 접근은 암의 처리를 위한 치료 잠재력이 있는 전이성 유전자를 확인하고 시험하는 이상적인 쪽입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 바이러스 감염과 원고의 비판적 독서를 지원에 대한 에밀리 노턴 감사합니다. 우리는 또한 폐에 있는 녹색 전이의 심상 분석에 도움을 위한 폐와 케이트 E. Tubbesing의 심상을 취득하는 것을 도움을 위한 라이언 카나이 에게 감사합니다. 동물 연구 시설 직원의 지원과 이 비디오 작성에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 J.M.L.에 수여 수잔 G. 코멘 경력 촉매 그랜트에 의해 지원되었다 (#CCR17477184).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% SDS-PAGE Gel | For western blot | ||
| 2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | Trypsin for tissue culture |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Alcohol wipes | For sterolizing the injection site before tail vein injecitons | ||
| BALB/C mice (female, 6 weeks) | Taconic | BALB-F | For tail vein metastatic colonization and burden assays |
| BSA regular | VWR Ameresco | 97061-416 | For western blot |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling | For collecting protien samples | |
| Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm | Celltreat | 40-229749-CS | For filtering viral supernatant |
| CO2 and euthanasia chamber | For euthanasing the mice | ||
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1960 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Dulbecco&39;s phosphate buffered saline | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA | VWR | 97061-406 | Used to dilute trypsin for tissue culture |
| FBS 100% US origin | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Fujifilm LAS-3000 gel imager | Fujifilm | For western blot | |
| GAPDH(14C10) Rabibit mAb | Cell Signaling | 2118 | For western blot |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo Scientific | 31460 | For western blot |
| Human embryonic kidney cells, HEK-293FT | Invitrogen | R70007 | Cell line used for packging virus |
| HyClone DMEM/High clucose | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| Hygromycin B, Ultra Pure Grade | VWR Ameresco | 97064-810 | For antibiotic selection of infected cells |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells | |
| Imagej | Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100 | ||
| Immuno-Blot PVDF Membrane | Biorad | 1620177 | For western blot |
| Isoflurane | For mouse anesthesia | ||
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) | PerkinElmer | CLS136340 | For in vivo imaging of metastatic burden |
| Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) | Leica Microsystems | Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 | Life technologies | L3000008 | For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection |
| Living Image 3.2 (image software program) | PerkinElmer | Software for IVIS | |
| Mouse breast cancer cells, 4T1 | Karmanos Cancer Institute | Aslakson, CJ et al.,1992 | Mouse metastatic breast cance cell line |
| Multi-Gauge version 3.0 | Fujifilm | Software for quantifying western blot band intensity | |
| Opti-MEM (transfection buffer) | Gibco | 31985-062 | For packaging virus and transfection |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | For quantifying protein concentration |
| Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32957 | Added to cell lysis buffer |
| Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32953 | Added to cell lysis buffer |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For infection |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection of infected cells |
| Rodent restrainer | For restraining mice during tail vein injeciton | ||
| SDS-PAGE running buffer | For western blot | ||
| TAZ (V3886) Antibody | Cell Signaling | 4883 | For western blot |
| TBST buffer | For western blot | ||
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For counting cells | |
| Vectors | See Table 1 for complete list of vectors | ||
| VWR Inverted Fluorescence Microscope | VWR | 89404-464 | For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells |
| Western transfer buffer | For western blot | ||
| XenoLight D-Luciferin K+ Salt | PerkinElmer | 122799 | Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) | Roche | 6365787001 | For packaging virus |
| YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 14074 | For western blot |
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