Summary
We presenteren een assay voor eenvoudige kwantificering van metalen geïntroduceerd voor monsters bereid met behulp van geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie. De methode maakt gebruik van hydroxynaphthol blauw als de colorimetrische metalen indicator en een UV-VIS-spectrofotometer als de detector.
Abstract
Besmetting van enzymen met metalen uit geïmmobiliseerde metalen affiniteits chromatografie (IMAC) kolommen vormt een belangrijke zorg voor enzymologen, omdat veel van de gemeenschappelijke di-en trivalente kationen die worden gebruikt in IMAC-harsen een remmende werking op enzymen hebben. De omvang van het uitlogen van metaal en de impact van verschillende eluering-en reducerende reagentia zijn echter slecht begrepen voor een groot deel vanwege de afwezigheid van eenvoudige en praktische overgangs metaalkwantificerings protocollen die gebruikmaken van apparatuur die gewoonlijk beschikbaar is in Biochemie Labs. Om dit probleem aan te pakken, hebben we een protocol ontwikkeld om snel de hoeveelheid metaalverontreiniging te kwantificeren in monsters die worden bereid met behulp van IMAC als zuiveringsstap. De methode maakt gebruik van hydroxynaphthol Blue (HNB) als een colorimetrische indicator voor metaal CATIE-inhoud in een monsteroplossing en UV-VIS-spectroscopie als middel om de hoeveelheid metaal aanwezig te kwantificeren, in het nanomolair-bereik, gebaseerd op de verandering in het HNB-spectrum bij 647 nm. Hoewel het metaalgehalte in een oplossing historisch is bepaald met behulp van atomische Absorptie spectroscopie of inductief gekoppelde plasma technieken, vereisen deze methoden gespecialiseerde apparatuur en training buiten het bereik van een typisch biochemie laboratorium. De hier voorgestelde methode biedt een eenvoudige en snelle manier voor biochemici om het metaalgehalte van monsters te bepalen met behulp van bestaande apparatuur en kennis, zonder in te boeten op nauwkeurigheid.
Introduction
Sinds de oprichting door Porath en co-workers1, geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie (iMac) is uitgegroeid tot een methode van keuze om snel te scheiden van eiwitten op basis van hun vermogen om te binden met overgangsmetalen ionen zoals Zn2 +, ni2 +, Cu2 +, en co2 +. Dit wordt meestal gedaan via engineered poly-histidine Tags en is nu een van de meest voorkomende chromatografische zuivering technieken voor de isolatie van recombinant eiwitten2. IMac heeft ook toepassingen gevonden die verder gaan dan recombinant-eiwit zuivering als een manier om quinolonen, tetracyclines, aminoglycosiden, macroliden en β-lactams voor voedsel monsteranalyse3 te isoleren en als een stap in het identificeren van bloed-serumeiwit markers voor lever-en pancreaskanker4,5. Niet verrassend, iMac is ook uitgegroeid tot een methode van keuze voor de isolatie van een aantal inheemse Bioenergetics enzymen6,7,8,9,10. De succesvolle toepassing van deze zuiverings methoden voor studies op enzymatisch actieve bioenergetische eiwitten is echter afhankelijk van de aanwezigheid van verwaarloosbare metaal kationen uit de kolom matrix in het eluaat. De divalente metaal kationen die gewoonlijk in iMac worden gebruikt, hebben een pathologisch biologisch belang, zelfs bij lage concentraties11,12. Het fysiologische effect van deze metalen is het meest uitgesproken in bioenergetische systemen, waar ze dodelijk kunnen blijken als remmers van cellulaire ademhaling of fotosynthese13,14,15. Vergelijkbare problemen zijn onvermijdelijk voor de meerderheid van de eiwit klassen waar rest verontreiniging metalen kunnen interfereren met de biologische functies van een eiwit of karakterisering met biochemische en biofysische technieken.
Terwijl het gehalte aan metaalverontreiniging onder oxiderende omstandigheden en het gebruik van imidazol als eluant doorgaans laag is16, eiwit isolaties uitgevoerd in de aanwezigheid van cysteïne reducerende agentia (DTT, β-mercaptoethanol, enz.) of met sterkere chelatoren zoals histidine17,18 of ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) resulteren in veel hogere niveaus van metaalverontreiniging19,20. Evenzo, aangezien metaalionen in IMAC-harsen vaak worden gecoördineerd door Carbon groepen, hebben eiwit eluties die onder zure omstandigheden worden uitgevoerd waarschijnlijk ook veel hogere niveaus van metaalverontreiniging. Metaalgehalte in oplossingen kan worden beoordeeld met behulp van atomische Absorptie spectroscopie (aas) en inductief gekoppeld plasma-massaspectrometrie (ICP-MS) tot een aantoonbaarheidsgrens in het ppb-ppt-bereik21,22,23,24. Helaas, AAS en ICP-MS zijn niet realistisch middelen voor detectie in een traditionele biochemie Lab omdat deze methoden toegang tot gespecialiseerde apparatuur en training zou vereisen.
Vorig werk van Brittain25,26 onderzocht het gebruik van hydroxynaphthol Blue (hnb) als een manier om de aanwezigheid van overgangsmetalen in oplossing te identificeren. Er waren echter verschillende interne contradicties in de data20 en die werken hebben geen adequaat protocol kunnen bieden. Studies van Temel et al.27 en Ferreira et al.28 verbreiden het werk van Brittain met hnb als een potentiële metalen indicator. Echter, Temel ontwikkelde een protocol dat gebruik maakt van AAS voor monsteranalyse, met behulp van HNB alleen als een chelerende agent. De studie van Ferreira gebruikte de verandering in het HNB extinctie Spectra bij 563 nm, een gebied van de Free-Dye HNB spectra die zwaar overlapt met de spectra van HNB-Metal complexen bij pH 5,7, waardoor de gevoeligheid van de assay vrij laag is en ook resulteert in relatief zwakke metaalbinding affiniteit20. Om problemen in ons eigen lab met ni2 + uitspoeling van iMac aan te pakken, hebben we het werk van Brittain25,26 en Ferreria28 uitgebreid om een eenvoudige assay te ontwikkelen die in staat is om nanomolaire niveaus van verschillende overgangsmetalen te detecteren. We toonden aan dat HNB nikkel bindt en andere vaak voor IMAC-metalen met sub-nanomolaire bindende affiniteiten en Form 1:1 complex over een breed scala aan pH-waarden20. De hier gerapporteerde assay is gebaseerd op deze bevindingen en maakt gebruik van absorptie veranderingen in het HNB-spectrum bij 647 nm voor metaal kwantificering. De test kan worden uitgevoerd in de fysiologische pH-reeks met behulp van gemeenschappelijke buffers en instrumentatie gevonden in een typische biochemie Lab met behulp van colorimetrische detectie en kwantificering van metaal-Dye complexen en de bijbehorende verandering in de extinctie van de vrije-kleurstof wanneer het bindt aan metaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparaat van de test component
- Bepaal de chromatografie fracties die moeten worden getest met optische extinctie bij 280 nm of alternatieve methoden voor eiwit kwantificering om de eiwit verrijkte fracties te identificeren.
Opmerking: voor dit werk gebruikten we een diode array UV-VIS spectrofotometer. Om de doorvoer te verhogen, kan een plaat lezer worden gebruikt die geschikt is voor het meten van de UV/VIS-extinctie. - Bereiding van de noodzakelijke assay componenten
- Bereid of verkrijg 10-100 mM buffer ("sample buffer") met een pH tussen 7 en 12.
Opmerking: gemeenschappelijke biochemische buffers zoals Tris, HEPES, MOPS en fosfaat in neutrale of basis pH zijn allemaal aanvaardbaar voor de bepaling. Tricine en histidine kunnen worden gebruikt, maar zullen kalibratie curven vereisen, omdat ze beide metaalionen substantieel cheleren. Een voorbeeld van kalibratie voor histidine wordt weergegeven in verwijzing20. - Bereid een 12% g/v (20-voudige geconcentreerde) oplossing van hydroxynaphthol Blue (HNB) dispersie in de monster buffer met 120 mg HNB-reagens voor elke milliliter van de voorbereide stamoplossing.
Let op: blootstelling van HNB aan het oog kan ernstige schade en irritatie veroorzaken. Oogbescherming moet worden gebruikt bij het hanteren van HNB en de handen moeten grondig worden gewassen na het hanteren.
Opmerking: HNB wordt verkocht als een spreiding op KCl door grote leveranciers van wetenschappelijke reagentia. Als zodanig, werkelijke concentratie in oplossing zal variëren van verschillende fabrikanten, batches, en waar in de fles de HNB dispersie wordt genomen van. Idealiter moet een extinctie tussen 0,5-0,8 bij 647 nm na 20-voudige verdunning van de kolf worden bereikt.
- Bereid of verkrijg 10-100 mM buffer ("sample buffer") met een pH tussen 7 en 12.
2. monstervoorbereiding en-meting
- Voorbereiding van de spectrofotometer voor het verzamelen van gegevens
- Schakel de UV-VIS-spectrofotometer in en warm deze op. Stel de spectrofotometer in om gegevens te verzamelen bij 647 nm.
Opmerking: als de spectrofotometer dit toelaat, moet u bovendien gegevens verzamelen bij 850 nm, of een andere golflengte zonder significante wijzigingen in verband met het kleurstof-metaal en de kleurstof spectra, die moeten worden gebruikt voor een basislijn correctie. - Leeg de spectrofotometer met behulp van de monster buffer.
Opmerking: er mogen kwarts of wegwerp plastic cuvettes worden gebruikt. Kwarts cuvettes hebben de voorkeur voor kwantitatieve analyse, omdat ze een hogere nauwkeurigheid en precisie mogelijk maken dan wegwerp plastic cuvettes. Echter, plastic cuvettes blokkeren UV-licht, die aanwezig kunnen zijn in de meet balken van sommige diode-array spectrofotometers. Blootstelling van HNB aan intens UV-licht veroorzaakt opmerkelijke vermindering van de kleurstof en een ongewenste langzame absorptie daling die kan worden verward met langzame metaalbinding (zie bijvoorbeeld Figuur 1 in ondersteunende informatie van referentie 20).
- Schakel de UV-VIS-spectrofotometer in en warm deze op. Stel de spectrofotometer in om gegevens te verzamelen bij 647 nm.
- Voorbereiding en extinctie meting van de controle
- Bereid een controleoplossing met 50 μL HNB-kolf per milliliter van het totale volume van de assay. Pipetteer eerst de kleine volumes om een goede menging van alle monsters te garanderen en voeg vervolgens de monster buffer toe, gevolgd door mengen door pipetteren. Verdunde HNB-oplossing moet vers worden bereid, maar HNB-voorraden kunnen gedurende weken worden opgeslagen bij 4 °C en worden afgeschermd van licht zonder significante degradatie.
- Laat de controle gedurende minimaal 3 minuten bij kamertemperatuur inbroed.
Opmerking: een langere incubatietijd kan nodig zijn voor monsters met een alkalische pH of in de aanwezigheid van fosfaat als gevolg van de vorming van slecht oplosbare metaalcomplexen, resulterend in een tragere evenwichts fase. - Meet en noteer de extinctie bij 647 nm voor het controlemonster.
- Voorbereiding en extinctie meting van monsters
- Bereid de test monsters door 50 μL HNB-kolf te mengen met 950 μL van naar behoren verdunde eiwit fracties met de monster buffer.
Opmerking: aangezien de in de literatuur gerapporteerde metaalverontreinigings niveaus met een factor van meer dan 1000 variëren, afhankelijk van de elutie-condities16,20, kan het nodig zijn om enkele verdunningen van de onderzochte proteïne fracties met de monster buffer te proberen (zie stap 1.2.1 hierboven) om absorptie veranderingen binnen het dynamische bereik van de assay te bereiken.
Let op: nikkel en andere metalen die in IMAC worden gebruikt, zijn bekend als irriterend voor de huid, vermoedelijk kankerverwekkend en kunnen de nieren en het bloed beschadigen na langdurige blootstelling. Handschoenen en oogbescherming moeten worden gebruikt bij het hanteren van eiwit monsters bereid met IMAC. - Laat het monster inbroed gedurende minimaal 3 minuten bij kamertemperatuur en meet gemiddelde bij 647 nm.
Opmerking: de beperkende stap van de test in termen van tijd geïnvesteerd is de incubatie stap. De gegevens voor dit papier werden verzameld met behulp van een enkele kwarts kuvette die zorgvuldig werd gewassen tussen elk monster. Zelfs met de toegevoegde wastijd en voorbereiding van de HNB voorraad, gegevensverzameling voor 14 monsters en de controle duurde ongeveer anderhalf uur en als zodanig, het protocol kan gemakkelijk worden voltooid zonder de noodzaak van onderbreking. - Herhaal stap 2.3.1 en 2.3.2 voor elke breuk die wordt gemeten.
Opmerking: als er meerdere cuvetten worden gebruikt voor meervoudige monsters, moeten monsters worden bereid op een manier die een vergelijkbare incubatietijd en blootstelling aan omgevingslicht mogelijk maakt.
- Bereid de test monsters door 50 μL HNB-kolf te mengen met 950 μL van naar behoren verdunde eiwit fracties met de monster buffer.
3. metaal kwantificering
- Bepaling van de concentratie van metaal in elk monster
- Zoek het verschil van elke monster extinctie bij 647 nm van de HNB-besturing.
- Bepaal de metaal concentratie (in μM) met behulp van de onderstaande formule:
waarbij DF de verdunningsfactor is voor de assay Fractie, δabs647 is de extinctie verandering bij 647 nm, 3,65 X10-2 staat voor de uitsterving coëfficiënt van hnb (ε = 36,5 mm-1· cm-1 Zie referentie20 voor meer details) en l is het optische pad van Cuvette in cm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het spectrum van vrije HNB bij neutrale pH (zwarte lijn) en representatieve spectra van fracties die zijn aangevallen voor ni2 + uit de isolatie van MSP1E3D129 zijn weergegeven in Figuur 2. Een succesvolle assay-serie moet een verminderde extinctie vertonen bij 647 nm in vergelijking met de HNB-controle, die overeenkomt met de vorming van HNB-complexen in de aanwezigheid van een overgangsmetaal. Een mislukte test zou worden aangegeven door een toename van de extinctie bij 647 nm. Als alternatief zou meer dan 90% afname van de initiële absorptie bij 647 nm duiden op een te hoog metaalgehalte en de noodzaak om meer verdunde fracties te testen. Een test zonder extinctie wijzigingen van de kosteloze controle van HNB duidt niet noodzakelijkerwijs op een storing. Het is mogelijk dat monsters in wezen geen Looi metalen bevatten. Dit is echter onwaarschijnlijk en elk monster dat geen absorptie verandering vertoont, dient opnieuw te worden bereid en gemeten, bij voorkeur met minder verdunning, om het resultaat te bevestigen. In totaal kunnen de meeste defecten om de verwachte extinctie te observeren worden toegeschreven aan onjuist pipetteren tijdens de monstervoorbereiding, een ontoereikende incubatietijd voorafgaand aan de meting of pH-waarden buiten het aanbevolen 7-12-bereik.
Om de toepassing van deze test aan te tonen, analyseerden we 2 zijn-tag membraan steiger eiwitten MSP1E3D1 (geïsoleerd zoals in Denisov, I. G. et al.29), MSP2N2 (geïsoleerd zoals in Grinkova, Y. V.30), en een roman 3-Heem c-type cytochroom GSU0105 van Geobacter sulfurreducens, die werd recombinantly uitgedrukt in E. coli en met 500 mm imidazol. De elutie profielen van ni2 + uit een ni-NTA hars kolom (Zie tabel van de materialen) en de bijbehorende eiwit elutie profielen voor deze 3 eiwitten zijn weergegeven in Figuur 3. Elk eiwit zal een unieke nikkel-elutie hebben die al dan niet in overeenstemming is met het eiwitelutie profiel zoals gemeten bij 280 nm. Figuur 3C toont bijvoorbeeld aan dat het eiwit en het ni2 + gehalte van elke fractie voor GSU0105 aanzienlijk van elkaar verschoven zijn, terwijl de fracties voor MSP1E3D1 en MSP2N2 (Figuur 3A, B) die de meeste eiwitten bevatten ook het hoogste ni2 + gehalte hebben. Figuur 3A, B illustreren ook dat het metaalgehalte niet gelijkmatig verdeeld kan worden over fracties die met iMac worden verzameld. Afhankelijk van de kolom verpakking, de samenstelling van de elutie buffer, de pompapparatuur en de omstandigheden, is het mogelijk om metalen Elueer in opeenvolgende fracties te hebben bij zeer verschillende concentraties, onafhankelijk van het eiwitgehalte van die fracties.
Figuur 1: structuur van hydroxynaphthol blauw (HNB). In het functionele pH-bereik van de test worden alle sulfonaatgroepen en een van de hydroxylgroepen geïoniseerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: extinctie Spectra voor geselecteerde MSP1E3D1 breuken en HNB. De relatieve extinctie van drie fracties van MSP1E3D1 (kleuren) vergeleken met een HNB-besturingselement (zwarte dikke lijn) worden weergegeven. Monsters werden bereid in 20 mM Tris, pH 7,5. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: ni2 + kwantificering voor 3 representatieve zijn-tag eiwitten. Eiwit-en ni2 + elutie-profielen voor (a) MSP1E3D1, (B) MSP2N2, en (C) GSU0105. Eiwitelutie werd uitgevoerd met respectievelijk 300 mM, 300 mM en 500 mM imidazol. Ni2 + kwantificering werd uitgevoerd in 20 mm tris, pH 7,5. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Colorimetrische detectie van metalen met behulp van HNB biedt een eenvoudige manier om de mate van eiwit verontreiniging te kwantificeren door overgangsmetalen ionen van IMAC-harsen. Zoals we gevestigd in Ref. 20, ni2 + bindt aan hnb met 1:1 Stoichiometrie en de dissociatieconstante voor de ni-hnb complex veranderingen met pH. Het complex Kd bevindt zich echter in het Sub-nm-bereik voor alle aanbevolen (7-12) pH-waarden. Praktisch gezien betekent dit dat alle ni2 + in alle geteste fracties zal binden aan hnb zolang er geen andere sterke chelerende reagentia, zoals EDTA, aanwezig zijn. Al deze eigenschappen samen resulteren in lineaire ni2 + titratie curven, die we experimentaal waargenomen. In dat rapport20hebben we ook vastgesteld dat de spectrale veranderingen als gevolg van metaal-Dye complexe formatie hetzelfde zullen zijn over het hele 7-12 pH-bereik. De detectie wordt beperkt door de minimale betrouwbare extinctie-veranderings metingen (10-4 – 10-3 od afhankelijk van de gebruikte spectrofotometer) overeenkomend met 2,7-27 nm ni2 +. Het bovenste bereik wordt beperkt door de hoeveelheid HNB aanwezig. In ons werk gebruiken we ~ 15 μM, overeenkomend met ~ 0,6 OD bij 647 nm. Echter, dit kan worden verhoogd tot 50-80 μM HNB, indien nodig. Praktisch gezien hebben we ni2 + besmettingsniveaus waargenomen in chromatografische fracties vergelijkbaar of hoger dan de bovengrens die ons dwingt om 10-tot 50-voudige verdunningen van geassageerde fracties te maken. Deze extra verdunningsstap kan echter relatieve fouten verhogen bij het bepalen van de nikkel concentratie in een fractie.
Hoewel we de details niet hebben onderzocht, bleek dat binding van andere metalen die worden gebruikt in IMAC Resins (Co, Zn, Fe) ook sub-μM dissociatieconstanten heeft en vrijwel geen overlapping tussen kleurstof en kleurstof-metaal extinctie Spectra bij 647 nm, de piek golflengte van vrije Hnb. Daarom kan volledige metaalbinding aan de kleurstof en de bijbehorende spectrale veranderingen van de kleurstof worden gebruikt voor absolute metaal bepaling over het gehele aanbevolen pH-bereik.
Uitvoering van het protocol is eenvoudig en hangt het meest af van de juiste laboratorium techniek. Moderne spectrofotometers hebben zeer lineaire responsen en dynamische reeksen van 3-4 ordes van grootte. Daarom is de meest waarschijnlijke plaats voor de invoering van fout in de methode via de Pipetteer stappen voor monstervoorbereiding. Zoals beschreven in deze tekst, de methode is gebaseerd op de kwantificering van metaalgehalte op basis van het verschil in de HNB extinctie piek op 647 nm van een gratis HNB controle en monsters met HNB gecomplexeerd met een metaal. Als de zorg niet wordt genomen om de HNB-aliquots of de buffer volumes nauwkeurig te Pipetteer, wordt de vergelijking van het besturingselement en het monster gemiddelde bij 647 nm een punt van fout. Evenzo kan een slechte Pipetteer van eiwit fracties voor monstervoorbereiding de waargenomen concentratie van metaal in een fractie scheeftrekken. Het wordt aanbevolen om, vanwege de gevoeligheid van de test, alle pipetten die worden gebruikt voor analyses waarbij nauwkeurige kwantificering vereist is, vóór gebruik gekalibreerd te worden.
De primaire beperkingen van de methode komen met het functionele pH-bereik van de assay en de aanwezigheid van sterke chelerende agentia. De assay wordt het best gebruikt in een pH-bereik van 7-12. Onder pH 7, het spectrum van de gratis HNB kleurstof verandert, het verliezen van de piek bij 647 nm gebruikt voor kwantificering20. Boven pH 12 beginnen veel metalen hydroxiden neer te slaan, inclusief die van metalen die vaak voorkomen in IMAC-harsen, waardoor kwantificering langzamer en minder reproduceerbaar wordt. Hoewel het alkalische maximum geen significant probleem oplevert omdat zuiverings procedures zelden een dergelijke hoge pH-waarde oproepen, is het zure minimum eerder een beperkende factor. Aangezien de detectiegrenzen voor ni2 + en andere overgangsmetalen ongeveer 1000-voudige lager zijn dan de metaal besmettingsniveaus die hierboven zijn aangetoond (Figuur 3), kan de lage pH-grens voor de test worden omzeild door verdunning van de geassageerde zure eiwit fracties in buffers met neutrale pH-waarden en voldoende hoge buffercapaciteit. Als alternatief kan de pH van geanalyseerde fracties worden aangepast of kan de HNB-stamoplossing meer sterk worden gebufferd om de gewenste pH na het mengen te behouden.
Indien de isolatie procedure voor het gezuiverde eiwit vereist het gebruik van reagentia met bekende of vermoedelijke overgangsmetalen chelatie-eigenschappen, zou een wijziging van de methode nodig zijn om de juiste kwantificering van aangelende metalen mogelijk te maken. Een standaard curve zou moeten worden bereid met behulp van de chelatiemiddel gebruikt voor eiwit elutie en bekende concentraties van metalen normen om nauwkeurig kwantificeren van de concentratie van leachte metaal in de aanwezigheid van de chelator. Een voorbeeld van metaal kwantificering in de aanwezigheid van histidine is beschikbaar in Kokhan & Marzolf20.
Nauwkeurige kwantificering van metalen in biologische monsters is nog grotendeels afhankelijk van het gebruik van analytische technieken en instrumentatie, zoals Aas en ICP-MS, die buiten het gebied van de typische biochemicus31,32blijven. Bonta et al. heeft de eenvoudige bereiding van biologische monsters op gemeenschappelijk filtreerpapier voor analyse door ICP-MS beschreven, maar hun methode is nog steeds gebaseerd op niet-standaard instrumentatie voor een biochemicus31. De methode die we beschrijven maakt het mogelijk om metaal inhoud in een steekproef te meten zonder extra training over nieuwe instrumentatie of outsourcing aan anderen. Vergelijkbare colorimetrische protocollen zijn ontwikkeld voor metaal analyse in biologische monsters33. Echter, de methode beschreven door Shaymal et al.33 is gebaseerd op een fluorescentie test met behulp van een commercieel onbeschikbare fluorescerende sonde die een hogere aantoonbaarheidsgrens geeft dan die in dit papier. Gezien het relatieve gemak waarmee de beschreven methode kan worden uitgevoerd en de recente belangstelling voor de ontwikkeling van draagbare metaaldetectie protocollen voor waterige monsters34,35, kan deze gemakkelijk worden aangepast voor veld testen van watermonsters. Als draagbare test kan onze methode worden aangepast voor gebruik met een draagbare spectrofotometer voor kwantificering of als een kwalitatieve maatstaf om monsters te identificeren voor verdere analyse op een vaste testlocatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit materiaal is gebaseerd op het werk ondersteund door de National Science Foundation onder Grant MCB-1817448 en door een Award van de Thomas F. en Kate Miller Jeffress Memorial Trust, Bank of America, trustee en de gespecificeerde donor Hazel Thorpe Carman en George Gay Carman Vertrouwen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT broth | Fisher Scientific | BP9743-500 | media for E.coli growth |
| HEPES, free acid | BioBasic | HB0264 | alternative buffer |
| HisPur Ni-NTA resin | Thermo Scientific | 88222 | |
| Hydroxynaphthol blue disoidum salt | Sigma-Aldrich | 219916-5g | |
| Imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | |
| Imidazole | BioBasic | IB0277 | |
| MOPS, free acid | BioBasic | MB0360 | alternative buffer |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | alternative buffer |
| Tricine | Gold Bio | T870-100 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 |
References
- Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Block, H., et al. Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review. Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).
- Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs. Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).
- Felix, K., et al. Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia. Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).
- Wu, C., et al. Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).
- Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).
- Guergova-Kuras, M., et al. Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides. Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).
- Mitchell, D. M., Gennis, R. B. Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography. FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).
- Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex. Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).
- Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex. Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).
- Louie, A. Y., Meade, T. J. Metal complexes as enzyme inhibitors. Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).
- Tamás, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation. Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).
- Gerencser, L., Maroti, P. Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues. Biochemistry. 40 (6), 1850-1860 (2001).
- Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).
- Link, T. A., von Jagow, G. Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group. Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).
- Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Schäfer, F. Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy. Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).
- Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding. Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).
- Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies. Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).
- Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).
- Kokhan, O., Marzolf, D. R. Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue. Analytical Biochemistry. 582, 113347 (2019).
- Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol. Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).
- Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B. Inorganic Chemical Biology. Gasser, G. , (2014).
- Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS. Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).
- Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS. Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).
- Brittain, H. G. Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes. Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).
- Brittain, H. G. Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue. Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).
- Temel, N. K., Sertakan, K., Gürkan, R. Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry. Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).
- Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue. Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).
- Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size. Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).
- Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).
- Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples. Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).
- Olmedo, P., et al. Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry. Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).
- Shyamal, M., et al. Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature. ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).
- Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration. Micromachines. 8 (4), 127 (2017).
- Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water. Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).
