Summary
Wir präsentieren einen Test zur einfachen Quantifizierung von Metallen, die in Proben eingeführt werden, die mit der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie hergestellt werden. Das Verfahren verwendet Hydroxynaphtholblau als farbmetrischemetallanzeige und ein UV-Vis Spektralphotometer als Detektor.
Abstract
Die Kontamination von Enzymen mit Metallen, die aus immobilisierten Metallaffinitätschromatographiesäulen (IMAC) ausgelaugt werden, bereitet Enzymologen große Sorgen, da viele der in IMAC-Harzen verwendeten di- und trivalenten Kationen eine hemmende Wirkung auf Enzyme haben. Das Ausmaß der Metallauslaugung und die Auswirkungen verschiedener elutierender und reduzierender Reagenzien sind jedoch weitgehend schlecht verstanden, da einfache und praktische Übergangsprotokolle zur Metallquantifizierung fehlen, die Geräte verwenden, die typischerweise in Biochemielabore. Um dieses Problem anzugehen, haben wir ein Protokoll entwickelt, um die Menge der Metallkontamination in Proben, die mit IMAC als Reinigungsschritt hergestellt wurden, schnell zu quantifizieren. Das Verfahren verwendet Hydroxynaphthol-Blau (HNB) als kolorimetrischen Indikator für den Metallkationsgehalt in einer Probenlösung und UV-Vis-Spektroskopie als Mittel zur Quantifizierung der metallenen Metallmenge im Nanomolar-Bereich, basierend auf der Veränderung des HNB-Spektrums bei 647 nm. Während der Metallgehalt in einer Lösung in der Vergangenheit mit Hilfe von Atomabsorptionsspektroskopie oder induktiv gekoppelten Plasmatechniken bestimmt wurde, erfordern diese Methoden spezielle Ausrüstung und Schulungen außerhalb des Rahmens eines typischen Biochemielabors. Die hier vorgeschlagene Methode bietet Biochemikern eine einfache und schnelle Möglichkeit, den Metallgehalt von Proben mit vorhandenen Geräten und Kenntnissen zu bestimmen, ohne dabei auf Genauigkeit zu verzichten.
Introduction
Seit seiner Gründung durch Porath und seine Mitarbeiter1ist die immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) zu einer Methode der Wahl geworden, um Proteine schnell zu trennen, basierend auf ihrer Fähigkeit, sich mit Übergangsmetallionen wie Zn2+,Ni2+, Cu2+und Co2+zu verbinden. Dies geschieht am häufigsten über technisch hergestellte Polyhistidin-Tags und ist heute eine der häufigsten chromatographischen Reinigungstechniken zur Isolierung rekombinanter Proteine2. IMAC hat auch Anwendungen jenseits der rekombinanten Proteinreinigung gefunden, um Chinolone, Tetracycline, Aminoglykoside, Makrolide und Lactams für die Lebensmittelprobenanalyse3 zu isolieren und als einen Schritt zur Identifizierung von Blutserumproteinmarkern für Leber- und Bauchspeicheldrüsenkrebs4,5. Es überrascht nicht, dass IMAC auch eine Methode der Wahl für die Isolierung einer Reihe von nativen Bioenergetik-Enzyme6,7,8,9,10geworden ist. Die erfolgreiche Umsetzung dieser Reinigungsmethoden für Studien an enzymatisch aktiven bioenergetischen Proteinen hängt jedoch davon ab, dass vernachlässigbare Mengen an Metallkationen aus der Säulenmatrix in das Eluat ausgelaugt sind. Die in IMAC gebräuchlichen divalenten Metallkationen haben eine pathologische biologische Signifikanz, selbst bei niedrigen Konzentrationen11,12. Die physiologische Wirkung dieser Metalle ist am ausgeprägtesten in bioenergetischen Systemen, wo sie sich als Inhibitoren der zellulären Atmung oder Photosynthese13,14,15als tödlich erweisen können. Ähnliche Probleme sind für die meisten Proteinklassen unvermeidbar, bei denen Restkontaminanten metallen die biologischen Funktionen eines Proteins oder die Charakterisierung mit biochemischen und biophysikalischen Techniken beeinträchtigen können.
Während die Konzentrationen der Metallkontamination unter oxidierenden Bedingungen und der Verwendung von Imidazol als Eluant in der Regel niedrigsind 16, Proteinisolationen in Gegenwart von Cystein-Reduzierenden (DTT, Mercaptoethanol, etc.) oder mit stärkeren Chelatoren wie Histidin17,18 oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) führen zu viel höheren Konzentrationen von Metallkontamination19,20. Da Metallionen in IMAC-Harzen häufig von Carboxylgruppen koordiniert werden, sind Proteinelutionen, die unter sauren Bedingungen durchgeführt werden, wahrscheinlich auch eine viel höhere Metallkontamination. Der Metallgehalt in Lösungen kann mit Hilfe der Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) und der induktiv gekoppelten Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) bis zu einer Nachweisgrenze im ppb-ppt-Bereich21,22,23,24bewertet werden. Leider sind AAS und ICP-MS keine realistischen Mittel zur Detektion in einem herkömmlichen Biochemielabor, da diese Methoden den Zugang zu spezialisierter Ausrüstung und Schulung erfordern würden.
Frühere Arbeiten von Brittain25,26 untersuchten die Verwendung von Hydroxynaphthol blau (HNB) als eine Möglichkeit, das Vorhandensein von Übergangsmetallen in Lösung zu identifizieren. Allerdings gab es mehrere interne Widersprüche in den Daten20, und diese Arbeiten haben kein angemessenes Protokoll geboten. Studien von Temel et al.27 und Ferreira et al.28 erweiterten Brittains Arbeit mit HNB als potenziellem Metallindikator. Temel entwickelte jedoch ein Protokoll, das AAS für die Probenanalyse verwendet und HNB nur als Chelatbildner verwendet. Ferreiras Studie verwendete die Veränderung der HNB-Absorptionsspektren bei 563 nm, einer Region der Freifärbung HNB-Spektren, die sich stark mit den Spektren von HNB-Metallkomplexen bei pH 5,7 überschneidet, wodurch die Assayempfindlichkeit relativ gering ist und eine relativ schwache Metallbindungsaffinität20ergibt. Um Probleme in unserem eigenen Labor mit Ni2+-Auslaugung von IMAC zu lösen, haben wir die Arbeit von Brittain25,26 und Ferreria28 erweitert, um einen einfachen Test zu entwickeln, der nanomolaren Konzentrationen mehrerer Übergangsmetalle detektieren kann. Wir zeigten, dass HNB Nickel und andere gemeinsame für IMAC-Metalle mit subnanomolaren Bindungsaffinitäten bindet und 1:1 Komplex über einen breiten Bereich von pH-Werten20bildet. Der hier berichtete Test basiert auf diesen Erkenntnissen und nutzt Absorptionsänderungen im HNB-Spektrum bei 647 nm für die Metallquantifizierung. Der Test kann im physiologischen pH-Bereich mit gemeinsamen Puffern und Instrumenten durchgeführt werden, die in einem typischen Biochemielabor gefunden werden, indem kolorimetrische Detektion und Quantifizierung von Metall-Farbstoff-Komplexen und die damit verbundene Veränderung der Absorption des Freifarbstoffs bei der Bindung an Metall verwendet wird.
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Protocol
1. Assay-Komponentenvorbereitung
- Bestimmen Sie die chromatographischen Fraktionen, die mit optischer Absorption bei 280 nm oder alternativen Methoden der Proteinquantifizierung ermittelt werden sollen, um die proteinangereicherten Fraktionen zu identifizieren.
HINWEIS: Für diese Arbeit haben wir ein Diodenarray UV-Vis Spektralphotometer verwendet. Um den Durchsatz zu erhöhen, kann ein Plattenleser verwendet werden, der die UV-Vis-Absorption messen kann. - Vorbereitung der notwendigen Assay-Komponenten
- Vorbereiten oder erhalten Sie 10-100 mM Puffer ("Sample Buffer") mit einem pH-Wert zwischen 7 und 12.
HINWEIS: Häufige biochemische Puffer wie Tris, HEPES, MOPS und Phosphat bei neutralem oder grundlegendem pH-Wert sind für den Test akzeptabel. Tricin und Histidin können verwendet werden, erfordern aber Kalibrierungskurven, da beide im Wesentlichen Metallionen chelatieren. Ein Beispiel für die Kalibrierung von Histidin ist in Referenz20dargestellt. - Bereiten Sie eine 12% w/v (20-fach konzentrierte) Lösung der Hydroxynaphthol-Blau (HNB)-Dispersion im Probenpuffer unter Verwendung von 120 mg HNB-Reagenz für jeden aufbereiteten Milliliter Der Stammlösung vor.
VORSICHT: Die Exposition von HNB gegenüber dem Auge kann zu schweren Schäden und Reizungen führen. Der Augenschutz sollte beim Umgang mit HNB verwendet werden und die Hände sollten nach der Handhabung gründlich gewaschen werden.
HINWEIS: HNB wird als Dispersion auf KCl von großen Anbietern wissenschaftlicher Reagenzien verkauft. Daher variiert die tatsächliche Konzentration in lösungsweise von verschiedenen Herstellern, Chargen und wo in der Flasche die HNB-Dispersion entnommen wird. Idealerweise sollte eine Absorption zwischen 0,5-0,8 bei 647 nm nach 20-facher Verdünnung des Bestands erreicht werden.
- Vorbereiten oder erhalten Sie 10-100 mM Puffer ("Sample Buffer") mit einem pH-Wert zwischen 7 und 12.
2. Probenvorbereitung und -messung
- Vorbereitung des Spektralphotometers für die Datenerfassung
- Schalten Sie das UV-Vis Spektralphotometer ein und wärmen Sie es auf. Stellen Sie das Spektralphotometer so ein, dass Daten auf 647 nm gesammelt werden.
HINWEIS: Wenn das Spektralphotometer es zulässt, zusätzlich Daten bei 850 nm oder eine andere Wellenlänge ohne signifikante Änderungen im Zusammenhang mit den Farbmetall- und Farbstoffspektren zu sammeln, um für eine Basiskorrektur verwendet zu werden. - Leeren Sie das Spektralphotometer mit dem Probenpuffer.
HINWEIS: Es können Quarz- oder Einweg-Kunststoffküvetten verwendet werden. Quarzküvetten werden für die quantitative Analyse bevorzugt, da sie eine höhere Genauigkeit und Präzision gegenüber Einweg-Kunststoffküvetten ermöglichen. Kunststoffküvetten blockieren jedoch UV-Licht, das in den Messstrahlen einiger Dioden-Array-Spektrophotometer vorhanden sein kann. Die Exposition von HNB gegenüber intensivem UV-Licht führt zu einem spürbaren Farbabbau und einer unerwünschten langsamen Absorptionsabnahme, die mit einer langsamen Metallbindung verwechselt werden kann (siehe Abbildung 1 in Unterstützende Informationen zu Referenz 20).
- Schalten Sie das UV-Vis Spektralphotometer ein und wärmen Sie es auf. Stellen Sie das Spektralphotometer so ein, dass Daten auf 647 nm gesammelt werden.
- Vorbereitungs- und Absorptionsmessung der Steuerung
- Bereiten Sie eine Steuerungslösung vor, die 50 L HNB-Bestand pro Milliliter Gesamttestvolumen enthält. Um eine gute Durchmischung aller Proben zu gewährleisten, pipette die kleinen Volumina zuerst fügen Sie dann den Probenpuffer gefolgt durch Mischen durch Pipettieren. Verdünnte HNB-Lösung sollte frisch zubereitet werden, aber HNB-Bestände können bei 4 °C gelagert und wochenlang ohne nennenswerte Verschlechterung vor Licht geschützt werden.
- Lassen Sie die Steuerung für mindestens 3 min bei Raumtemperatur inkubieren.
HINWEIS: Für Proben bei alkalischem pH-Wert oder in Gegenwart von Phosphat kann eine längere Inkubationszeit erforderlich sein, da schlecht lösliche Metallkomplexe entstehen, was zu einem langsameren Gleichgewicht führt. - Messen und erfassen Sie die Absorption bei 647 nm für die Kontrollprobe.
- Aufbereitung und Absorptionsmessung von Proben
- Bereiten Sie die Assay-Proben vor, indem Sie 50 l HNB-Bestand mit 950 l entsprechend verdünnten Proteinfraktionen mit dem Probenpuffer mischen.
ANMERKUNG: Da die in der Literatur gemeldeten Metallkontaminationswerte je nach Elutionsbedingungen16,20um den Faktor 1000 variieren, kann es notwendig sein, einige Verdünnungen der untersuchten Proteinfraktionen mit dem Probenpuffer (siehe Schritt 1.2.1 oben) auszuprobieren, um Absorptionsänderungen innerhalb des dynamischen Bereichs des Assays zu erreichen.
VORSICHT: Nickel und andere metalle, die in IMAC verwendet werden, sind bekannt hautreizend, im Verdacht, krebserregend zu sein, und sind in der Lage, die Nieren und das Blut nach längerer Exposition zu schädigen. Handschuhe und Augenschutz sollten bei der Handhabung von Proteinproben verwendet werden, die mit IMAC hergestellt wurden. - Lassen Sie die Probe für mindestens 3 min bei Raumtemperatur inkubieren und die Absorptionen bei 647 nm messen.
HINWEIS: Der begrenzende Schritt des Assays in Bezug auf die investierte Zeit ist der Inkubationsschritt. Die Daten für dieses Papier wurden mit einer einzigen Quarzküvette gesammelt, die sorgfältig zwischen jeder Probe gewaschen wurde. Selbst mit der zusätzlichen Waschzeit und der Vorbereitung des HNB-Bestandes, der Datenerfassung für 14 Proben und der Kontrolle dauerte es etwa anderthalb Stunden und als solches kann das Protokoll ohne Unterbrechung problemlos abgeschlossen werden. - Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1 und 2.3.2 für jeden gemessenen Anteil.
HINWEIS: Wenn mehrere Küvetten für mehrere Proben verwendet werden, sollten Proben so vorbereitet werden, dass eine vergleichbare Inkubationszeit und die Exposition gegenüber Umgebungslicht ermöglicht werden.
- Bereiten Sie die Assay-Proben vor, indem Sie 50 l HNB-Bestand mit 950 l entsprechend verdünnten Proteinfraktionen mit dem Probenpuffer mischen.
3. Metallquantifizierung
- Bestimmung der Metallkonzentration in jeder Probe
- Finden Sie den Unterschied der einzelnen Probenabsorptionen bei 647 nm von der HNB-Steuerung.
- Bestimmen Sie die Metallkonzentration (in M) nach der folgenden Formel:
wobei DF der Verdünnungsfaktor für die Assay-Fraktion ist,ist die Absorptionsänderungbei 647 nm, 3,65x10-2 den Aussterbekoeffizienten von HNB (=36,5 mM-1cm-1 siehe Referenz20 für weitere Details) und l ist der optische Pfad der Küvetten in cm.
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Representative Results
Das Spektrum der freien HNB bei neutralem pH-Wert (schwarze Linie) und repräsentative Spektren von Fraktionen, die für Ni2+ aus der Isolierung von MSP1E3D129 untersucht wurden, sind in Abbildung 2dargestellt. Eine erfolgreiche Assay-Serie sollte eine verminderte Absorption bei 647 nm im Vergleich zur HNB-Steuerung aufweisen, was der Bildung von HNB-Komplexen in Gegenwart eines Übergangsmetalls entspricht. Ein fehlgeschlagener Test würde durch eine Erhöhung der Absorption bei 647 nm angezeigt. Alternativ würde eine Abnahme von mehr als 90 % gegenüber der anfänglichen Absorption bei 647 nm auf einen zu hohen Metallgehalt und die Notwendigkeit hindeuten, mehr verdünnte Fraktionen zu prüfen. Ein Assay ohne Absorptionsänderungen von der freien HNB-Steuerung deutet nicht unbedingt auf einen Fehler hin. Es ist möglich, dass Proben im Wesentlichen keine ausgelaugten Metalle enthalten. Dies ist jedoch unwahrscheinlich, und jede Probe, die keine Absorptionsänderung zeigt, sollte vorbereitet und erneut gemessen werden, vorzugsweise mit weniger Verdünnung, um das Ergebnis zu bestätigen. Insgesamt können die meisten Fehler bei der Beobachtung der erwarteten Absorptionsänderung auf unsachgemäße Pipettierung während der Probenvorbereitung, eine unzureichende Inkubationszeit vor der Messung oder pH-Werte außerhalb des empfohlenen 7-12-Bereichs zurückgeführt werden.
Um die Anwendung dieses Assays zu demonstrieren, analysierten wir 2 His-Tag Membrangerüstproteine MSP1E3D1 (isoliert wie in Denisov, I. G. et al.29), MSP2N2 (isoliert wie in Grinkova, Y. V.30), und ein neuartiges 3-Häm-c-Typ Cytochrom GSU0105 von Geobacter schwefelreduzieren, das rekombinant in E.coli exprimiert und mit 500 mM Imidazol eluiert wurde. Die Elutionsprofile von Ni2+ aus einer Ni-NTA-Harzsäule (siehe Materialtabelle)und die zugehörigen Proteinelutionsprofile für diese 3 Proteine sind in Abbildung 3dargestellt. Jedes Protein hat eine einzigartige Nickelelution, die mit dem Protein-Elutionsprofil, gemessen bei 280 nm, übereinstimmen kann oder auch nicht. Abbildung 3C zeigt beispielsweise, dass der Protein- und Ni2+-Gehalt jeder Fraktion für GSU0105 signifikant voneinander verschoben wird, während die Fraktionen für MSP1E3D1 und MSP2N2 ( Abbildung3A,B), die das meiste Protein enthalten, auch den höchsten Ni2+-Gehalt aufweisen. Abbildung 3A,B zeigt auch, dass der Metallgehalt möglicherweise nicht gleichmäßig auf die mit IMAC gesammelten Fraktionen verteilt ist. Je nach Säulenpackung, Zusammensetzung des Elutionspuffers, Pumpanlagen und Bedingungen ist es möglich, Metallelute in aufeinanderfolgenden Fraktionen in sehr unterschiedlichen Konzentrationen unabhängig vom Proteingehalt dieser Fraktionen zu haben.
Abbildung 1: Struktur von Hydroxynaphtholblau (HNB). Im funktionellen pH-Bereich des Assays werden alle Sulfonatgruppen und eine der Hydroxylgruppen ionisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Absorptionsspektren für ausgewählte MSP1E3D1-Fraktionen und HNB. Die relative Absorption von drei Fraktionen von MSP1E3D1 (Farben) im Vergleich zu einem HNB-Steuerelement (schwarze dicke Linie) wird angezeigt. Die Proben wurden in 20 mM Tris, pH 7,5, hergestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Ni2+ Quantifizierung für 3 repräsentative His-Tag-Proteine. Protein- und Ni2+-Elutionsprofile für ( A ) MSP1E3D1, (B) MSP2N2 und (C) GSU0105. Die Proteinelution wurde mit 300 mM, 300 mM bzw. 500 mM Imidazol durchgeführt. Ni2+ Quantifizierung wurde in 20 mM Tris, pH 7,5 durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die farbmetrische Detektion von Metallen mit HNB bietet eine einfache Möglichkeit, den Grad der Proteinkontamination durch Übergangsmetallionen aus IMAC-Harzen zu quantifizieren. Wie wir in Ref. 20 festgestellt haben, bindet Ni2+ an HNB mit 1:1 Stoichiometrie und der Dissoziationskonstante für den Ni-HNB-Komplex mit pH-Wert. Der komplexe Kd liegt jedoch im sub-nM-Bereich für alle empfohlenen (7-12) pH-Werte. In der Praxis bedeutet dies, dass alle Ni2+ in allen getesteten Fraktionen an HNB binden, solange keine anderen starken chelatisierenden Reagenzien wie EDTA vorhanden sind. Alle diese Eigenschaften ergeben zusammen lineare Ni2+ Titrationskurven, die wir experimentell beobachtet haben. In diesem Bericht20haben wir auch festgestellt, dass die spektralen Veränderungen aufgrund der Metall-Färbe-Komplexbildung über den gesamten pH-Bereich von 7-12 gleich sein werden. Die Detektion wird durch die minimalen zuverlässigen Absorptionsänderungsmessungen (10-4 – 10-3 OD je nach verwendetem Spektralphotometer) entsprechend 2,7-27 nM Ni2+begrenzt. Der obere Bereich wird durch die Menge an HNB begrenzt. Bei unserer Arbeit verwenden wir 15 M, was 0,6 OD bei 647 nm entspricht. Dies kann jedoch bei Bedarf auf bis zu 50-80 M HNB erhöht werden. Praktisch beobachteten wir Ni 2+-Kontaminationswerte in chromatographischen Fraktionen, die vergleichbar oder höher als die obere Grenze waren und uns dazu zwangen, 10- bis 50-fache Verdünnungen von assatierten Fraktionen vorzunehmen. Dieser zusätzliche Verdünnungsschritt kann jedoch relative Fehler erhöhen und gleichzeitig die Nickelkonzentration in einem Bruchteil bestimmen.
Obwohl wir die Details nicht untersucht haben, stellte sich heraus, dass die Bindung anderer Metalle, die in IMAC-Harzen (Co, Zn, Fe) verwendet werden, auch Sub-M-Dissoziationskonstanten aufweist und praktisch keine Überlappung zwischen Farbstoff- und Farbstoff-Metall-Absorptionsspektren bei 647 nm aufweist, die Maximale Wellenlänge von Hnb. Daher kann die vollständige Metallbindung an den Farbstoff und die damit verbundenen spektralen Veränderungen des Farbstoffs zur absoluten Metallbestimmung über den gesamten empfohlenen pH-Bereich verwendet werden.
Die Ausführung des Protokolls ist einfach und hängt am stärksten von der richtigen Labortechnik ab. Moderne Spektralphotometer haben hochgradig lineare Antworten und dynamische Bereiche von 3-4 Größenordnungen. Folglich ist der wahrscheinlichste Ort für die Einführung von Fehlern in der Methode durch die Pipettierschritte für die Probenvorbereitung. Wie in diesem Text beschrieben, basiert das Verfahren auf der Quantifizierung des Metallgehalts basierend auf dem Unterschied in der HNB-Absorptionsspitze bei 647 nm von einer kostenlosen HNB-Steuerung und Proben mit HNB, die mit einem Metall komplexiert sind. Wenn nicht darauf geachtet wird, die HNB-Aliquots oder die Puffervolumina genau zu pipetten, wird der Vergleich der Kontroll- und Probenabsorptionen bei 647 nm zu einem Fehlerpunkt. In ähnlicher Weise kann eine schlechte Pipettierung von Proteinfraktionen zur Probenvorbereitung die wahrgenommene Metallkonzentration in einem Bruchteil verzerren. Es wird empfohlen, aufgrund der Empfindlichkeit des Assays alle Pipetten, die für Analysen verwendet werden, bei denen eine genaue Quantifizierung erforderlich ist, vor der Verwendung zu kalibrieren.
Die primären Einschränkungen der Methode kommen mit dem funktionellen pH-Bereich des Assays und dem Vorhandensein von starken Chelatbildnern. Der Assay wird am besten in einem pH-Bereich von 7-12 verwendet. Unterhalb von pH 7 ändert sich das Spektrum des freien HNB-Farbstoffs undverliert den Für quantifizierbaren Peak bei 647 nm. Oberhalb des pH 12 beginnen viele Metallhydroxide auszubrechen, einschließlich der Metalle, die häufig in IMAC-Harzen zu finden sind, wodurch die Quantifizierung langsamer und weniger reproduzierbar wird. Während das alkalische Maximum kein signifikantes Problem darstellt, da Reinigungsverfahren selten einen so hohen pH-Wert erfordern, ist das saure Minimum eher ein begrenzender Faktor. Da die Nachweisgrenzwerte für Ni2+ und andere Übergangsmetalle etwa 1000-fach niedriger sind als die oben gezeigten Metallkontaminationswerte(Abbildung 3),kann der niedrige pH-Grenzwert für den Assay durch Verdünnung der assayed acidic protein fractions in Puffern mit neutralen pH-Werten und ausreichend hoher Pufferkapazität umgangen werden. Alternativ kann der pH-Wert der analysierten Fraktionen eingestellt oder die HNB-Lagerlösung stärker gepuffert werden, um den gewünschten pH-Wert nach dem Mischen aufrechtzuerhalten.
Wenn das Isolierungsverfahren für das zu reinigende Protein die Verwendung von Reagenzien mit bekannten oder vermuteten Übergangsmetall-Chelatationseigenschaften erfordert, wäre eine Änderung des Verfahrens erforderlich, um eine ordnungsgemäße Quantifizierung von ausgelaugten Metallen zu ermöglichen. Eine Standardkurve müsste mit hilfe des für die Proteinelution verwendeten Chelatbildners und der bekannten Konzentrationen von Metallnormen erstellt werden, um die Konzentration von ausgelaugten Metallen in Gegenwart des Chelators genau zu quantifizieren. Ein Beispiel für Metallquantifizierung in Gegenwart von Histidin ist in Kokhan & Marzolf20verfügbar.
Die genaue Quantifizierung von Metallen in biologischen Proben hängt noch weitgehend vom Einsatz von Analysetechniken und Instrumenten wie AAS und ICP-MS ab, die außerhalb des Bereichs des typischen Biochemikers31,32bleiben. Bonta etal. haben die einfache Herstellung von biologischen Proben auf gängigem Filterpapier für die Analyse durch ICP-MS beschrieben, ihre Methode beruht jedoch nach wie vor auf einer nicht standardisierten Instrumentierung für einen Biochemiker31. Die von uns beschriebene Methode ermöglicht es, die Messung des Metallgehalts in einer Probe ohne zusätzliche Schulung zu neuen Instrumenten oder Outsourcing an andere durchzuführen. Ähnliche farbmetrische Protokolle wurden für die Metallanalyse in biologischen Proben33entwickelt. Die von Shaymal et al.33 beschriebene Methode beruht jedoch auf einem Fluoreszenztest mit einer kommerziell nicht verfügbaren Fluoreszenzsonde, die eine höhere Nachweisgrenze als die in diesem Papier ergibt. In Anbetracht der relativen Leichtigkeit, mit der die beschriebene Methode durchgeführt werden kann, und des jüngsten Interesses an der Entwicklung von tragbaren Metalldetektionsprotokollen für wässrige Proben34,35könnte sie leicht für Feldversuche von Wasserproben angepasst werden. Als tragbarer Test könnte unsere Methode für die Verwendung mit einem tragbaren Spektralphotometer zur Quantifizierung oder als qualitative Maßnahme zur Identifizierung von Proben für weitere Analysen an einem festen Testort modifiziert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Dieses Material basiert auf Arbeiten, die von der National Science Foundation unter Grant MCB-1817448 unterstützt wurden, und auf einer Auszeichnung des Thomas F. und Kate Miller Jeffress Memorial Trust, Bank of America, Trustee und der spezifizierten Spender Hazel Thorpe Carman und George Gay Carman. Vertrauen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT broth | Fisher Scientific | BP9743-500 | media for E.coli growth |
| HEPES, free acid | BioBasic | HB0264 | alternative buffer |
| HisPur Ni-NTA resin | Thermo Scientific | 88222 | |
| Hydroxynaphthol blue disoidum salt | Sigma-Aldrich | 219916-5g | |
| Imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | |
| Imidazole | BioBasic | IB0277 | |
| MOPS, free acid | BioBasic | MB0360 | alternative buffer |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | alternative buffer |
| Tricine | Gold Bio | T870-100 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 |
References
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