Summary
Vi presentiamo un saggio per una facile quantificazione dei metalli introdotti nei campioni preparati utilizzando la cromatografia dell'affinità dei metalli immobilizzati. Il metodo utilizza il blu idxynaphthol come indicatore di metallo colorimetrico e uno spettrofotometro UV-Vis come rivelatore.
Abstract
La contaminazione di enzimi con metalli lisciviati da colonne di affinità dei metalli immobilizzati (IMAC) rappresenta una grande preoccupazione per gli enziologi, poiché molte delle cazioni di-e trivalenti comuni utilizzate nelle resine IMAC hanno un effetto inibitorio sugli enzimi. Tuttavia, l'entità della lisciviazione dei metalli e l'impatto di vari reagenti di eluizione e riduzione sono scarsamente compresi in gran parte a causa dell'assenza di protocolli di quantificazione dei metalli di transizione semplici e pratici che utilizzano apparecchiature tipicamente disponibili in laboratori di biochimica. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un protocollo per quantificare rapidamente la quantità di contaminazione da metalli nei campioni preparati utilizzando iMAC come fase di purificazione. Il metodo utilizza il blu idxynaphthol (HNB) come indicatore colorimetrico per il contenuto di metalli in una soluzione campione e la spettroscopia UV-Vis come mezzo per quantificare la quantità di metallo presente, nella gamma nanomolar, in base alla modifica dello spettro HNB a 647 nm. Mentre il contenuto di metalli in una soluzione è stato storicamente determinato utilizzando la spettroscopia atomica di assorbimento o tecniche plasmatiche accoppiate induttivamente, questi metodi richiedono attrezzature specializzate e formazione al di fuori dell'ambito di un tipico laboratorio di biochimica. Il metodo qui proposto fornisce un modo semplice e veloce per i biochimici di determinare il contenuto di metalli dei campioni utilizzando attrezzature e conoscenze esistenti senza sacrificare la precisione.
Introduction
Fin dalla sua nascita da Porath e collaboratori1, la cromatografia di affinità del metallo immobilizzato (IMAC) è diventata un metodo di scelta per separare rapidamente le proteine in base alla loro capacità di legarsi con gli ioni metallici di transizione come n2, Ni2, Cu2e Co2 . Questo è più comunemente fatto tramite tag poli-istidina ingegnerizzati ed è ora una delle tecniche di purificazione cromatografica più comuni per l'isolamento delle proteine ricombinanti2. L'IMAC ha anche trovato applicazioni che vanno oltre la purificazione ricombinante delle proteine come un modo per isolare quinolones, tetracicline, aminoglitrali, macrolidi e latcombe z per l'analisi dei campioni alimentari3 e come passo nell'identificazione dei marcatori proteici del siero del sangue per il fegato e i tumori del pancreasco4,5. Non sorprende, IMAC è diventato anche un metodo di scelta per l'isolamento di un certo numero di enzimi bioenergetici nativi6,7,8,9,10. Tuttavia, la riuscita dell'implementazione di questi metodi di purificazione per studi sulle proteine bioenergetiche enzimaticamente attive dipende dalla presenza di livelli trascurabili di cazioni metalliche lisciviate dalla matrice della colonna all'eluato. Le cazioni di metalli divalenti comunemente utilizzate nell'IMAC hanno conosciuto significato biologico patologico, anche a basse concentrazioni11,12. L'effetto fisiologico di questi metalli è più pronunciato nei sistemi bioenergetici, dove possono rivelarsi letali come inibitori della respirazione cellulare o fotosintesi13,14,15. Problemi simili sono inevitabili per la maggior parte delle classi proteiche in cui i metalli contaminanti residui possono interferire con le funzioni biologiche di una proteina o la caratterizzazione con tecniche biochimiche e biofisiche.
Mentre i livelli di contaminazione dei metalli in condizioni ossidanti e che utilizzano l'imidazolo come eluant sono tipicamente bassi16,gli isolamenti proteici eseguiti in presenza di agenti di riduzione dei cistein (DTT, Il mercaptoetanolo, ecc.) o con chelatori più forti come la istidina17,18 o acido etilenediaminetra (EDTA) provocano livelli molto più elevati di contaminazione da metalli19,20. Analogamente, poiché gli ioni metallici nelle resine IMAC sono spesso coordinati da gruppi carboxilici, è probabile che anche le eluzioni proteiche eseguite in condizioni acide abbiano livelli molto più elevati di contaminazione da metalli. Il contenuto di metalli nelle soluzioni può essere valutato utilizzando la spettroscopia atomica di assorbimento (AAS) e la spettrometria plasma-massa induttivamente accoppiata (ICP-MS) fino a un limite di rilevamento nell'intervallo ppb-ppt21,22,23,24. Sfortunatamente, AAS e ICP-MS non sono mezzi realistici per il rilevamento in un laboratorio di biochimica tradizionale in quanto tali metodi richiederebbero l'accesso a attrezzature specializzate e formazione.
Precedenti lavori di Brittain25,26 hanno studiato l'uso di idxynaphthol blu (HNB) come un modo per identificare la presenza di metalli di transizione in soluzione. Tuttavia, vi sono state diverse contraddizioni interne nei dati20 e tali opere non hanno offerto un protocollo adeguato. Gli studi di Temel et al.27 e Ferreira et al.28 hanno ampliato il lavoro di Brittain con HNB come potenziale indicatore metallico. Tuttavia, Temel ha sviluppato un protocollo che utilizza AAS per l'analisi dei campioni, usando HNB solo come agente chelante. Lo studio di Ferreira ha utilizzato il cambiamento degli spettri di assorbimento HNB a 563 nm, una regione degli spettri HNB a tintura libera che si sovrappone fortemente agli spettri dei complessi HNB-metal a pH 5.7, rendendo la sensibilità di analisi abbastanza bassa e con conseguente affinità di legame metallico relativamente debole20. Per affrontare i problemi nel nostro laboratorio con l'lisciviazione Ni 2 oda IMAC, abbiamo ampliato il lavoro svolto da Brittain25,26 e Ferreria28 per sviluppare un semplice saggio in grado di rilevare i livelli nanomolari di diversi metalli di transizione. Abbiamo dimostrato che l'HNB lega il nichel e altri metalli iMAC con affinità di legame sub-nanomolari e formano un complesso 1:1 su un'ampia gamma di valori di pH20. Il test riportato qui si basa su questi risultati e utilizza cambiamenti di assorbimento nello spettro HNB a 647 nm per la quantificazione dei metalli. Il saggio può essere eseguito nella gamma fisiologica del pH utilizzando tamponi e strumentazione comuni trovati in un tipico laboratorio di biochimica utilizzando il rilevamento colorimetrico e la quantificazione dei complessi di tintura metallica e il cambiamento associato nell'assorbimento del colorante libero quando si lega al metallo.
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Protocol
1. Preparazione dei componenti di analisi
- Determinare le frazioni cromatografiche da esaminare utilizzando l'assorbimento ottico a 280 nm o metodi alternativi di quantificazione delle proteine per identificare le frazioni arricchite di proteine.
NOTA: Per questo lavoro, abbiamo usato uno spettrofotometro UV-Vis array a diodi. Per aumentare la produttività, è possibile utilizzare un lettore di lastre in grado di misurare l'assorbimento UV-Vis. - Preparazione dei componenti di ssay necessari
- Preparare o ottenere un buffer da 10-100 mM ("Buffer campione") con un pH compreso tra 7 e 12.
NOTA: buffer biochimici comuni come Tris, HEPES, MOPS e fosfato a pH neutro o di base sono tutti accettabili per il saggio. Tricine and histidine can be used but will require calibration curves as they both substantially chelate metal ions. Un esempio di calibrazione per l'istidina è mostrato nel riferimento20. - Preparare una soluzione di 12% w/v (20 volte concentrata) di dispersione blu idrossiaphthol (HNB) nel buffer campione utilizzando 120 mg di reagente HNB per ogni millilitro di soluzione di stock preparato.
AVVISO: L'esposizione di HNB all'occhio può causare gravi danni e irritazioni. La protezione degli occhi deve essere utilizzata quando si maneggia l'HNB e le mani devono essere lavate accuratamente dopo la manipolazione.
NOTA: HNB è venduto come una dispersione su KCl dai principali fornitori di reagenti scientifici. Come tale, la concentrazione effettiva in soluzione varierà da diversi produttori, lotti, e dove in bottiglia viene prelevata la dispersione HNB. Idealmente, dovrebbe essere ottenuta un'assorbimento tra 0,5-0,8 a 647 nm dopo 20 volte la diluizione dello stock.
- Preparare o ottenere un buffer da 10-100 mM ("Buffer campione") con un pH compreso tra 7 e 12.
2. Preparazione e misurazione del campione
- Preparazione dello spettrofotometro per la raccolta dei dati
- Accendere e riscaldare lo spettrofotometro UV-Vis. Impostare lo spettrofotometro per raccogliere i dati a 647 nm.
NOTA: se lo spettrofotometro lo consente, raccogliere inoltre dati a 850 nm o altre lunghezze d'onda senza modifiche significative relative agli spettri di tintura metallica e colorazione, da utilizzare per una correzione della linea di base. - Svuotare lo spettrofotometro utilizzando il buffer di esempio.
NOTA: possono essere utilizzati cuvette di plastica monouso o monouso. Le cuvette al quarzo sono preferite per l'analisi quantitativa in quanto consentiranno una maggiore precisione e precisione rispetto alle cuvette di plastica usa e getta. Tuttavia, le cuvette di plastica bloccano la luce UV, che può essere presente nei fasci di misura di alcuni spettrofotometri a matrice di diodiodi. L'esposizione di HNB a un'intensa luce UV provoca una notevole degradazione dei tinture e una riduzione indesiderato di assorbimento lento che può essere confusa con un'associazione metallica lenta (ad esempio, vedere la figura 1 in Informazioni di supporto di riferimento 20).
- Accendere e riscaldare lo spettrofotometro UV-Vis. Impostare lo spettrofotometro per raccogliere i dati a 647 nm.
- Preparazione e misurazione dell'assorbimento del controllo
- Preparare una soluzione di controllo che contenga 50 o più scorte di HNB per millililatore del volume totale del saggio. Per garantire una buona miscelazione di tutti i campioni, pipette i piccoli volumi prima poi aggiungere il buffer di esempio seguito dalla miscelazione da pipettatura. La soluzione HNB diluita deve essere preparata fresco, ma gli stock HNB possono essere immagazzinati a 4 gradi centigradi e schermati dalla luce per settimane senza degrado significativo.
- Lasciare il controllo inincubare per un minimo di 3 min a temperatura ambiente.
NOTA: Un tempo di incubazione più lungo può essere necessario per i campioni a pH alcalino o in presenza di fosfato a causa della formazione di complessi metallici scarsamente solubili con conseguente equissezione più lenta. - Misurare e registrare l'assorbimento a 647 nm per il campione di controllo.
- Misurazione di preparazione e assorbimento dei campioni
- Preparare i campioni di prova mescolando 50 - L di stock HNB con 950 - L di frazioni proteiche opportunamente diluite con il buffer di campionamento.
NOTA: Poiché i livelli di contaminazione dei metalli riportati nella letteratura variano di un fattore superiore a 1000 a seconda delle condizioni di elusione16,20, potrebbe essere necessario provare alcune diluizioni delle frazioni proteiche punette con il buffer campione (vedi passo 1.2.1 sopra) per ottenere cambiamenti di assorbimento all'interno dell'intervallo dinamico del saggio.
AVVISO: Il nichel e altri metalli utilizzati nell'IMAC sono noti irritanti per la pelle, sospettati di essere cancerogeni, e sono in grado di danneggiare i reni e il sangue dopo un'esposizione prolungata. I guanti e la protezione degli occhi devono essere utilizzati quando si maneggiano campioni proteici preparati con IMAC. - Lasciare il campione incubare per un minimo di 3 min a temperatura ambiente e misurare le assorbimenti a 647 nm.
NOTA: Il passo limitante del saggio in termini di tempo investito è la fase di incubazione. I dati di questa carta sono stati raccolti utilizzando una singola cuvette di quarzo che è stata accuratamente lavata tra ogni campione. Anche con l'aggiunta del tempo di lavaggio e la preparazione dello stock HNB, la raccolta dei dati per 14 campioni e il controllo ha richiesto circa un'ora e mezza e come tale, il protocollo può essere facilmente completato senza la necessità di interruzioni. - Ripetere i passaggi 2.3.1 e 2.3.2 per ogni frazione che verrà misurata.
NOTA: Se verranno utilizzate più cuvette per più campioni, i campioni devono essere preparati in modo da consentire tempi di incubazione comparabili e l'esposizione alla luce ambientale.
- Preparare i campioni di prova mescolando 50 - L di stock HNB con 950 - L di frazioni proteiche opportunamente diluite con il buffer di campionamento.
3. Quantificazione dei metalli
- Determinazione della concentrazione di metallo in ogni campione
- Trova la differenza di ogni assorbimento del campione a 647 nm dal controllo HNB.
- Determinare la concentrazione di metalli (in M) utilizzando la formula riportata di seguito:
dove DF è il fattore di diluizione per la frazione di analisi, lafrazione di analisi647 è il cambiamento di assorbimento a 647 nm, 3,65x10-2 rappresenta il coefficiente di estinzione di HNB (36,5 mM-1cm-1 vedi Riferimento20 per maggiori dettagli) e l è il percorso ottico della cuvette in cm.
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Representative Results
Lo spettro di HNB libero al pH neutro (linea nera) e spettri rappresentativi delle frazioni analizzate per Ni2, dall'isolamento di MSP1E3D129 sono mostrati nella Figura 2. Una serie di analisi di successo dovrebbe dimostrare una minore assorbimento a 647 nm rispetto al controllo HNB, che corrisponde alla formazione di complessi HNB in presenza di un metallo di transizione. Un test fallito sarebbe indicato da un aumento dell'assorbimento a 647 nm. In alternativa, una diminuzione di oltre il 90% rispetto all'assorbimento iniziale a 647 nm indicherebbe un contenuto di metalli troppo elevato e la necessità di esaminare le frazioni più diluite. Un saggio senza modifiche di assorbimento rispetto al controllo HNB gratuito non indica necessariamente un guasto. È possibile che i campioni non contengano essenzialmente metalli lisciviati. Tuttavia, questo è improbabile e qualsiasi campione che non mostri alcun cambiamento di assorbimento dovrebbe essere preparato e misurato di nuovo, preferibilmente con meno diluizione, per confermare il risultato. In totale, la maggior parte dei fallimenti nell'osservare il cambiamento di assorbimento previsto può essere attribuita a pipettaggio improprio durante la preparazione del campione, a un tempo di incubazione inadeguato prima della misurazione o a valori di pH al di fuori dell'intervallo consigliato di 7-12.
Per dimostrare l'applicazione di questo saggio, abbiamo analizzato 2 proteine di scaffold a membrana His-tag MSP1E3D1 (isolate come in Denisov, I. G. et al.29), MSP2N2 (isolato come in Grinkova, Y. V.30),e un nuovo GSU0105 di tipo c. 3 eme da Geobacter sulfurreducens, che è stato espresso in modo ricombinante in E.coli ed eluito con imidazolo di 500 mM. I profili di eluizione di Ni2, da una colonna di resina Ni-NTA (vedi Tabella dei materiali) e i profili di eluizione delle proteine associati per queste 3 proteine sono mostrati nella Figura 3. Qualsiasi proteina avrà un'eluione unica del nichel che può o non può allinearsi con il profilo di eluizione della proteina misurato a 280 nm. Ad esempio, la figura 3C mostra che la proteina e il contenuto di Ni 2o più di ogni frazione per GSU0105 sono significativamente spostati l'uno dall'altro, mentre le frazioni per MSP1E3D1 e MSP2N2 ( Figura3A,B) che contengono il maggior numero di proteine hanno anche il più alto contenuto di Ni2. La figura 3A,B illustra inoltre che il contenuto di metalli potrebbe non essere distribuito in modo uniforme tra le frazioni raccolte tramite IMAC. A seconda dell'imballaggio della colonna, della composizione del tampone di eluizione, delle attrezzature di pompaggio e delle condizioni, è possibile avere il metallo eluito in frazioni consecutive a concentrazioni molto diverse indipendentemente dal contenuto proteico di tali frazioni.
Figura 1: Struttura dell'idxynaphthol blu (HNB). Nella gamma di pH funzionale del saggio, tutti i gruppi solfati e uno dei gruppi idrossili sono ionizzati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Spettri di assorbimento per le frazioni MSP1E3D1 selezionate e HNB. Viene mostrata l'assorbimento relativo di tre frazioni di MSP1E3D1 (colori) rispetto a un controllo HNB (linea spessa nera). I campioni sono stati preparati in 20 mM Tris, pH 7.5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Quantificazione di Ni2 per 3 proteine His-tag rappresentative. I profili di eluizione di proteine e Ni2 per (A) MSP1E3D1, (B) MSP2N2 e (C) GSU0105. L'eluizione proteica è stata eseguita utilizzando rispettivamente 300 mM, 300 mM e 500 mM di imidazole. La quantificazione Ni2 è stata eseguita in 20 mM Tris, pH 7.5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il rilevamento colorimetrico dei metalli che utilizzano HNB fornisce un modo semplice per quantificare il grado di contaminazione delle proteine mediante ioni metallici di transizione da resine IMAC. Come abbiamo stabilito in Ref. 20, Ni2 si lega ad HNB con stoichiometria 1:1 e la costante di dissociazione per i cambiamenti complessi Ni-HNB con pH. Tuttavia, il complesso Kd è nell'intervallo sub-nM per tutti i valori di pH raccomandati (7-12). In termini pratici, significa che tutti i Ni2 in tutte le frazioni testate si legheranno ad HNB finché non sono presenti altri forti reagenti di chelatazione, come EDTA. Tutte queste proprietà insieme si traducono in curve lineari di titolazione Ni2, che abbiamo osservato sperimentalmente. In tale rapporto20, abbiamo anche stabilito che i cambiamenti spettrali dovuti alla formazione complessa di metalli-dye saranno gli stessi su tutta la gamma 7-12 pH. Il rilevamento è limitato dalle misure minima affidabili di cambiamento di assorbimento (10-4 – 10-3 OD a seconda dello spettrofotometro utilizzato) corrispondenti a 2.7-27 nM Ni2. L'intervallo superiore è limitato dalla quantità di HNB presente. Nel nostro lavoro, usiamo 15 dollari, corrispondenti a 0,6 OD a 647 nm. Tuttavia, questo può essere aumentato fino a 50-80 M HNB, se necessario. In pratica, abbiamo osservato livelli di contaminazione di Ni2 o più in frazioni cromatografiche paragonabili o superiori al limite superiore costringendoci a fare diluizioni da 10 a 50 volte delle frazioni analizzate. Tuttavia, questa fase di diluizione aggiuntiva può aumentare gli errori relativi determinando la concentrazione di nichel in una frazione.
Anche se non abbiamo studiato i dettagli, è emerso che l'associazione di altri metalli utilizzati nelle resine IMAC (Co, n, Fe) ha anche costanti di dissociazione sub-M e praticamente nessuna sovrapposizione tra spettri di assorbimento tintura e colorante-metallo a 647 nm, la lunghezza d'onda di picco di lunghezza d'onda L'HNB. Pertanto, il legame metallico completo con il tinrito e i cambiamenti spettrali associati del tincolo può essere utilizzato per la determinazione assoluta del metallo su tutta la gamma di pH consigliata.
L'esecuzione del protocollo è semplice e dipende maggiormente dalla corretta tecnica di laboratorio. Gli spettrometri moderni hanno risposte altamente lineari e gamme dinamiche di 3-4 ordini di grandezza. Di conseguenza, il luogo più probabile per l'introduzione dell'errore nel metodo è attraverso le fasi di pipettaggio per la preparazione del campione. Come descritto in questo testo, il metodo si basa sulla quantificazione del contenuto di metallo in base alla differenza nel picco di assorbimento HNB a 647 nm da un controllo HNB gratuito e campioni con HNB complessi con un metallo. Se non si fa attenzione a pipettare accuratamente gli HNB o i volumi di buffer, il confronto delle assorbenti di controllo e campione a 647 nm diventa un punto di errore. Allo stesso modo, una scarsa pipettatura delle frazioni proteiche per la preparazione del campione può alterare la concentrazione percepita di metallo in una frazione. Si raccomanda di calibrare prima l'uso, a causa della sensibilità del saggio, qualsiasi pipetta utilizzata per analisi in cui è richiesta una quantificazione precisa.
Le limitazioni primarie del metodo sono dotate della gamma di pH funzionale del saggio e della presenza di forti agenti chelanti. Il saggio è meglio utilizzato in una gamma di pH da 7-12. Al di sotto del pH 7, lo spettro del tintura HNB gratuito cambia, perdendo il picco a 647 nm utilizzato per la quantificazione20. Sopra il pH 12, molti idrossidi metallici iniziano a precipitare, compresi quelli dei metalli che si trovano comunemente nelle resine IMAC, rendendo la quantificazione più lenta e meno riproducibile. Mentre il massimo alcalino non rappresenta un problema significativo in quanto le procedure di purificazione raramente richiedono un pH così elevato, il minimo acido è più probabile che sia un fattore limitante. Poiché i limiti di rilevazione per Ni2 e altri metalli di transizione sono inferiori di circa 1000 volte rispetto ai livelli di contaminazione dei metalli sopra indicati (Figura 3), il limite di pH basso per il saggio può essere aggirata con la diluizione delle frazioni proteiche acide analizzate in buffer con valori di pH neutri e una capacità di buffering sufficientemente elevata. In alternativa, il pH delle frazioni analizzate può essere regolato o la soluzione di stock HNB può essere memorizzata più fortemente nel buffer per mantenere il pH desiderato dopo la miscelazione.
Se la procedura di isolamento per la proteina da purificare richiede l'uso di reagenti con proprietà di chelating del metallo di transizione note o sospette, sarebbe necessaria una modifica del metodo per consentire una corretta quantificazione dei metalli lisciviati. Una curva standard dovrebbe essere preparata utilizzando l'agente di chelante utilizzato per l'eluzione proteica e le concentrazioni note di norme metalliche per quantificare con precisione la concentrazione di metallo lisciviato in presenza del chelatore. Un esempio di quantificazione dei metalli in presenza di istidina è disponibile in Kokhan & Marzolf20.
La quantificazione accurata dei metalli nei campioni biologici dipende ancora in gran parte dall'uso di tecniche analitiche e strumentazione, come AAS e ICP-MS, che rimangono al di fuori del regno del biochimico tipico31,32. Bonta et al. hanno descritto la semplice preparazione di campioni biologici su carta filtrante comune per l'analisi da parte di ICP-MS, tuttavia, il loro metodo si basa ancora su strumentazione non standard per un biochimico31. Il metodo che descriviamo consente di effettuare la misurazione del contenuto metallico in un campione senza ulteriori corsi di formazione su nuova strumentazione o outsourcing ad altri. Protocolli colorimetrici simili sono stati sviluppati per l'analisi dei metalli in campioni biologici33. Tuttavia, il metodo descritto da Shaymal et al.33 si basa su un saggio di fluorescenza utilizzando una sonda fluorescente commercialmente non disponibile che dà un limite di rilevamento più alto rispetto a quello in questo documento. Considerando la relativa facilità con cui il metodo descritto può essere eseguito e il recente interesse per lo sviluppo di protocolli di rilevamento di metalli portatili per campioni acquosi34,35, potrebbe essere facilmente adattato per il test sul campo di campioni d'acqua. Come test portatile, il nostro metodo potrebbe essere modificato per l'uso con uno spettrometro portatile per la quantificazione o come misura qualitativa per identificare i campioni per ulteriori analisi in un luogo di prova fisso.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo materiale è basato sul lavoro sostenuto dalla National Science Foundation sotto Grant MCB-1817448 e da un premio del Thomas F. e Kate Miller Jeffress Memorial Trust, Bank of America, Trustee e il donatore specificato Hazel Thorpe Carman e George Gay Carman e George Gay Carman Fiducia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT broth | Fisher Scientific | BP9743-500 | media for E.coli growth |
| HEPES, free acid | BioBasic | HB0264 | alternative buffer |
| HisPur Ni-NTA resin | Thermo Scientific | 88222 | |
| Hydroxynaphthol blue disoidum salt | Sigma-Aldrich | 219916-5g | |
| Imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | |
| Imidazole | BioBasic | IB0277 | |
| MOPS, free acid | BioBasic | MB0360 | alternative buffer |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | alternative buffer |
| Tricine | Gold Bio | T870-100 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 |
References
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