Summary
İmmobilize metal afinite kromatografisi kullanılarak hazırlanan numunelere tanıtılan metallerin kolay ölçülmesi için bir test salıyoruz. Yöntem, kolorimetrik metal göstergesi olarak hidroksinaphthol mavisi ve dedektör olarak UV-Vis spektrofotometresi kullanır.
Abstract
IMAC reçineler kullanılan yaygın di-ve trivalent katyonların çoğu enzimler üzerinde inhibitör etkisi olduğu gibi, immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) sütunlarından leached metaller ile enzimlerin kontaminasyonu, enzimler için önemli bir endişe teşkil eder. Ancak, metal yıkamanın kapsamı ve çeşitli eluting ve azaltıcı reaktiflerin etkisi, genellikle mevcut ekipmanları kullanan basit ve pratik geçiş metal kantifikasyon protokollerinin olmaması nedeniyle büyük ölçüde yeterince anlaşılamamıştır. biyokimya laboratuarları. Bu sorunu gidermek için, IMAC kullanılarak bir arınma adımı olarak hazırlanan numunelerde metal kontaminasyon miktarını hızlı bir şekilde ölçmek için bir protokol geliştirdik. Yöntem, hidroksinaphthol mavisini (HNB) numune çözeltisindeki metal katyon içeriği için kolorimetrik bir gösterge olarak ve UV-Vis spektroskopisini, 647 nm'deki HNB spektrumundaki değişikliğe bağlı olarak nanomolar aralığına, mevcut metal miktarını ölçmek için bir araç olarak kullanır. Bir çözeltideki metal içeriği tarihsel olarak atomik soğurma spektroskopisi veya endüktif olarak birleştirilmiş plazma teknikleri kullanılarak belirlenirken, bu yöntemler tipik bir biyokimya laboratuvarının kapsamı dışında özel ekipman ve eğitim gerektirir. Burada önerilen yöntem, biyokimyacıların doğruluktan ödün vermeden mevcut ekipman ve bilgileri kullanarak numunelerin metal içeriğini belirlemeleri için basit ve hızlı bir yol sağlar.
Introduction
Porath ve iş arkadaşları tarafından kuruluşundan bu yana1, immobilize metal afinite kromatografi (IMAC) hızlızn2 + gibi geçiş metal iyonları ile bağ yeteneğine dayalı proteinleri ayırmak için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir + Ni 2+, Cu2 +ve Co 2+. Bu en yaygın olarak tasarlanmış poli-histidin etiketleri ile yapılır ve şimdi rekombinant proteinlerin izolasyonu için en yaygın kromatografik arıtma tekniklerinden biridir2. IMAC ayrıca kinolonlar izole etmek için bir yol olarak rekombinant protein arıtma ötesinde uygulamalar buldu, tetrasiklinler, aminoglikozitler, makrolidler, ve gıda örnek analizi için β-laktamlar3 ve karaciğer ve pankreas kanserleri için kan-serum protein belirteçleri belirlenmesinde bir adım olarak4,5. Beklendiği gibi, IMAC da yerli biyoenerjit enzimleri6,7,8,9,10bir dizi izolasyon için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. Ancak, enzimatik olarak aktif biyoenerjik proteinler üzerinde yapılan çalışmalarda bu arınma yöntemlerinin başarılı bir şekilde uygulanması, sütun matrisinden eluate doğru leached metal katyonlar ihmal edilebilir düzeyde varlığına bağlıdır. IMAC'te yaygın olarak kullanılan divalent metal katyonlar, düşük konsantrasyonlarda bile patolojik biyolojik önemi bilinmektedir11,12. Bu metallerin fizyolojik etkisi en biyoenerjetik sistemlerde belirgindir, onlar hücresel solunum veya fotosentez inhibitörleri olarak ölümcül kanıtlayabilirim13,14,15. Kalıntı kirletici metallerin bir proteinin biyolojik işlevlerini veya biyokimyasal ve biyofiziksel tekniklerle karakterizasyonunu engelleyebildiği protein sınıflarının çoğunda benzer sorunlar kaçınılmazdır.
Oksitleyici koşullar altında metal kontaminasyon düzeyleri ve eluant olarak imidazol kullanarak genellikle düşükiken 16, protein izolasyonları sistein azaltıcı ajanlar varlığında yapılan (DTT, β-mercaptoetanol, vb) veya histidin gibi güçlü şelatörler ile17,18 veya etilendirinamintetraasetik asit (EDTA) metal kontaminasyon çok daha yüksek seviyelerde neden19,20. Benzer şekilde, IMAC reçinelerindeki metal iyonları karboksilik gruplar tarafından sıklıkla koordine edildiğinden, asidik koşullarda yapılan protein elutions da metal kontaminasyonçok daha yüksek düzeyde olması muhtemeldir. Çözeltilerde metal içeriği atomik absorpsiyon spektroskopisi (AAS) ve endüktif plazma kütle spektrometresi (ICP-MS) ppb-ppt aralığında algılama sınırına kadar bir araya gelen21,22,23,24kullanılarak değerlendirilebilir. Ne yazık ki, AAS ve ICP-MS bu yöntemler özel ekipman ve eğitim erişim gerektirecek gibi geleneksel bir biyokimya laboratuvarında algılama için gerçekçi araçlar değildir.
Brittain tarafından önceki çalışma25,26 hidroksinaphthol mavi kullanımı araştırılmış (HNB) çözeltide geçiş metallerin varlığını belirlemek için bir yol olarak. Ancak, veri20'de birkaç iç çelişki vardı ve bu çalışmalar yeterli bir protokol sunamadı. Temel ve ark.27 ve Ferreira ve ark.28'in çalışmaları Brittain'in HNB ile olan çalışmalarını potansiyel bir metal göstergesi olarak genişletti. Ancak Temel, HNB'yi sadece şelat aracı olarak kullanarak AAS'ı numune analizi için kullanan bir protokol geliştirdi. Ferreira'nın çalışmasında 563 nm de HNB emici spektrumdeğişikliği kullanılan, pH 5.7 HNB metal kompleksleri spektrumları ile ağır örtüşen serbest boya HNB spektrumbir bölge, oldukça düşük yanı sıra nispeten zayıf metal bağlama afinite20sonuçlanan. IMAC'ten Ni2+ leaching ile kendi laboratuvarımızda ki sorunları çözmek için, Brittain25,26 ve Ferreria28 tarafından yapılan çalışmaları genişleterek çeşitli geçiş metallerinin nanomolar düzeylerini tespit edebilen kolay bir teşbit geliştirdik. Biz HNB alt nanomolar bağlayıcı yakınlıkları ile IMAC metaller için nikel ve diğer ortak bağlar ve pH değerleri geniş bir yelpazede 1:1 karmaşık20. Burada bildirilen test bu bulgulara dayanmaktadır ve metal niceleme için 647 nm'de HNB spektrumundaki emici değişiklikleri kullanır. Test, tipik bir biyokimya laboratuvarında bulunan ortak tamponlar ve enstrümantasyon kullanılarak, metal boya komplekslerinin kolorimetrik tespiti ve nicelemi kullanılarak ve metale bağlandığında serbest boyanın absorbe edilmesindeki ilgili değişiklik kullanılarak fizyolojik pH aralığında yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tsay bileşeni hazırlama
- 280 nm'de optik absorbans veya protein zenginleştirilmiş fraksiyonları tanımlamak için alternatif protein nicelemesi yöntemleri kullanılarak taltılacak kromatografi fraksiyonlarını belirleyin.
NOT: Bu çalışma için UV-Vis spektrofotometre diyot dizilimi kullandık. İş bünyesini artırmak için UV-Vis emiciliğini ölçebilen bir plaka okuyucu kullanılabilir. - Gerekli numune parçalarının hazırlanması
- 7 ile 12 arasında bir pH ile 10-100 mM arabellek ("Örnek Arabellek") hazırlayın veya edinin.
NOT: Nötr veya temel pH'da Tris, HEPES, MOPS ve fosfat gibi yaygın biyokimyasal tamponlar kabul edilebilir. Trikin ve histidin kullanılabilir ancak her ikisi de önemli ölçüde chelate metal iyonları olarak kalibrasyon eğrileri gerektirir. Histidin için kalibrasyon örneği referans20'degösterilmiştir. - Hazırlanan her bir mililitre lik itken için 120 mg HNB reaktifi kullanarak Numune Tamponunda Hidroksinaphthol mavisi (HNB) dağılımlarının %12 w/v (20 kat konsantre) çözeltisini hazırlayın.
DİkKAT: HNB'nin göze maruz kalmaları ciddi hasar ve tahrişe neden olabilir. HNB kullanılırken göz koruması kullanılmalı ve eller elletedildikten sonra iyice yıkanmalıdır.
NOT: HNB bilimsel reaktiflerin büyük tedarikçileri tarafından KCl bir dağılım olarak satılmaktadır. Bu nedenle, çözeltideki gerçek konsantrasyon farklı üretimlerden, gruplardan ve şişede HNB dağılımının alındığı yerden değişir. İdeal olarak, hisse senedinin 20 kat seyreltilmesinden sonra 647 nm'de 0.5-0.8 arasında bir absorbans elde edilmelidir.
- 7 ile 12 arasında bir pH ile 10-100 mM arabellek ("Örnek Arabellek") hazırlayın veya edinin.
2. Numune hazırlama ve ölçme
- Veri toplama için spektrofotometrenin hazırlanması
- UV-Vis spektrofotometresini açın ve ısıtın. Spektrofotometreyi 647 nm'de veri toplamak için ayarlayın.
NOT: Spektrofotometre izin veriyorsa, temel düzeltme için kullanılacak boya-metal ve boya spektrumları ile ilgili önemli değişiklikler olmadan 850 nm veya başka bir dalga boyunda veri toplamak. - Örnek Arabelleği'ni kullanarak spektrofotometreyi boşaltın.
NOT: Kuvars veya tek kullanımlık plastik cuvettes kullanılabilir. Kuvars cuvettes tek kullanımlık plastik cuvettes üzerinde daha yüksek doğruluk ve hassasiyet sağlayacak gibi nicel analiz için tercih edilir. Ancak, plastik cuvettes bazı diyot-dizi spektrofotometreölçüm kirişlerinde mevcut olabilir UV ışık, blok. HNB'nin yoğun UV ışığına maruz kalma, belirgin boya bozulmasına ve yavaş metal bağlanması ile karıştırılabilecek istenmeyen yavaş emiciliğe neden olur (örneğin, Bkz. Referans 20'nin Destekleyici Bilgileri'nde Şekil 1).
- UV-Vis spektrofotometresini açın ve ısıtın. Spektrofotometreyi 647 nm'de veri toplamak için ayarlayın.
- Kontrolün hazırlanması ve emilmesi ölçümü
- Toplam elekhacminin mililitresi başına 50 μL HNB stokiçeren bir kontrol çözeltisi hazırlayın. Tüm numunelerin iyi karıştırılmasını sağlamak için, pipet önce küçük hacimleri sonra pipetleme ile karıştırma ardından Örnek Arabellek ekleyin. Seyreltilmiş HNB çözeltisi taze olarak hazırlanmalı ancak HNB stokları 4 °C'de saklanabilir ve önemli bir bozulma olmaksızın haftalarca ışıktan korunabilir.
- Kontrol oda sıcaklığında en az 3 dakika kuluçka ya da izin verin.
NOT: Alkali pH'daki numuneler için veya zayıf çözünen metal komplekslerinin oluşması nedeniyle fosfat varlığında daha uzun bir kuluçka süresi gerekebilir ve bu da daha yavaş dengelenmeyle sonuçlanabilir. - Kontrol numunesi için emiciliği 647 nm'de ölçün ve kaydedin.
- Numunelerin hazırlanması ve emilmesi ölçümü
- Numune Tamponu ile uygun şekilde seyreltilmiş protein fraksiyonları 950 μL ile 50 μL HNB stoku karıştırarak test numunelerini hazırlayın.
NOT: Literatürde bildirilen metal kontaminasyon düzeyleri elüsyon koşullarına bağlı olarak 1000'den fazla bir faktöre göredeğiştiğinden,16,20, testin dinamik aralığında absorbans değişiklikleri elde etmek için Örnek Tampon ile test edilen protein fraksiyonlarının birkaç seyreltmesini denemek gerekebilir (yukarıdaki adım 1.2.1'e bakınız).
DİkKAT: IMAC'te kullanılan nikel ve diğer metaller, kanserojen olduğundan şüphelenilen cilt tahriş edici olarak bilinir ve uzun süreli maruzkaldıktan sonra böbreklere ve kana zarar verebilir. IMAC ile hazırlanan protein örnekleri nin işlenmesinde eldiven ve göz koruması kullanılmalıdır. - Numunenin oda sıcaklığında en az 3 dakika kuluçkaya yatmasını bekleyin ve 647 nm'de emicilikleri ölçün.
NOT: Yatırılan zaman açısından tsedin sınırlayıcı adımı kuluçka adımıdır. Bu makalenin verileri, her numune arasında dikkatlice yıkanan tek bir kuvars cuvette kullanılarak toplanmıştır. HNB stokunun ilave yıkama süresi ve hazırlanmasına rağmen, 14 numune için veri toplama ve kontrol yaklaşık bir buçuk saat sürdü ve bu nedenle protokol kesintiye gerek kalmadan kolayca tamamlanabilir. - Ölçülecek her kesir için 2.3.1 ve 2.3.2 adımlarını tekrarlayın.
NOT: Birden fazla örnek için birkaç cuvette kullanılacaksa, numuneler karşılaştırılabilir kuluçka süresive ortam ışığına maruz kalma sağlayacak şekilde hazırlanmalıdır.
- Numune Tamponu ile uygun şekilde seyreltilmiş protein fraksiyonları 950 μL ile 50 μL HNB stoku karıştırarak test numunelerini hazırlayın.
3. Metal niceleme
- Her numunedeki metal konsantrasyonunun belirlenmesi
- Her numune emicisinin HNB kontrolünden 647 nm'deki farkını bulun.
- Aşağıdaki formülü kullanarak metal konsantrasyonu (μM içinde) belirleyin:
DF'nin test fraksiyonu için seyreltme faktörü olduğu yerde ΔAbs647 647 nm'deki emici değişimdir, 3.65x10-2 HNB'nin yok olma katsayısını temsil eder (ε=36.5 mM-1·cm-1 daha fazla ayrıntı için Referans20'ye bakınız) ve l cuvette'nin cm'deki optik yoludur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nötr pH'daki serbest HNB spektrumu (siyah çizgi) ve MSP1E3D129'un izolasyonundan Ni2+ için titreşen kesirlerin temsili spektrumu Şekil 2'degösterilmiştir. Başarılı bir teşp serisi, hnb kontrolüne kıyasla 647 nm'de azalmış bir emicilik göstermelidir, bu da bir geçiş metalinin varlığında HNB komplekslerinin oluşumuna karşılık gelir. Başarısız bir tsay 647 nm emicilik bir artış ile gösterilir. Alternatif olarak, 647 nm'de ilk absorbanstan %90'dan fazla azalma çok yüksek metal içeriğine ve daha seyreltilmiş fraksiyonları değerlendirme ihtiyacını gösterir. Ücretsiz HNB denetiminden emici değişiklik olmayan bir töz mutlaka bir hata göstermez. Numunelerin esasen leached metal içermemesi mümkündür. Ancak, bu olası değildir ve hiçbir emicideğişiklik gösteren herhangi bir örnek hazırlanmalı ve tekrar ölçülmelidir, tercihen daha az seyreltme ile, sonucu onaylamak için. Toplamda, beklenen emici lik değişimini gözlemlemedeki hataların çoğu, numune hazırlama sırasında yanlış pipetleme, ölçümden önce yetersiz kuluçka süresi veya önerilen 7-12 aralığının dışındaki pH değerlerine bağlanabilir.
Bu testin uygulamasını göstermek için, 2 adet Etiket membran iskele proteinini analiz ettik MSP1E3D1 (Denisov'da olduğu gibi izole edilmiş, I. G. ve ark.29), MSP2N2 (Grinkova, Y. V.30'daizole edilmiş ) ve Geobacter sülfürden 3-heme c tipi sitokrom GSU0105, e.coli ile yeniden ifade edilmiş ve 500 mM imidazol ile eluted. Ni-NTA reçine sütunundan Ni2+'nın elüsyon profilleri (bkz. Malzemeler Tablosu)ve bu 3 protein için ilişkili protein elüsyonu profilleri Şekil 3'tegösterilmiştir. Herhangi bir protein, 280 nm olarak ölçülen protein elüsyon profili ile uyumlu olabilir veya olmayabilir benzersiz bir nikel elüsyonu olacaktır. Örneğin, Şekil 3C, GSU0105 için her fraksiyonun protein ve Ni2+ içeriğinin birbirinden önemli ölçüde kaydığını, en fazla proteini içeren MSP1E3D1 ve MSP2N2(Şekil 3A,B)kesirlerinin de en yüksek Ni2+ içeriğe sahip olduğunu göstermektedir. Şekil 3A,B ayrıca metal içeriğinin IMAC kullanılarak toplanan kesirler arasında eşit olarak dağıtılmayabileceğini göstermektedir. Kolon ambalajbağlı olarak, elüsasyon tampon bileşimi, pompalama ekipmanları ve koşullar, bu kesirlerin protein içeriğibağımsız çok farklı konsantrasyonlarda ardışık fraksiyonları metal eute olması mümkündür.
Şekil 1: Hidroksinaphthol mavisinin yapısı (HNB). İdmanın fonksiyonel pH aralığında tüm sülfonat grupları ve hidroksil gruplarından biri iyonize edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Seçilen MSP1E3D1 fraksiyonları ve HNB için absorbans spektrumları. BIR HNB denetimine (siyah kalın çizgi) göre MSP1E3D1'in (renklerin) üç fraksiyonunun göreli emilmesi gösterilir. Numuneler 20 mM Tris, pH 7.5 olarak hazırlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ni2+ 3 temsili His-tag proteinleriçin nicelik. Protein ve Ni2+ elüsyon profilleri için (A) MSP1E3D1, (B) MSP2N2, ve (C) GSU0105. Protein elüsasyonu sırasıyla 300 mM, 300 mM ve 500 mM imidazol kullanılarak gerçekleştirildi. Ni2+ niceleme 20 mM Tris, pH 7.5 olarak uygulandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HNB kullanan metallerin kolorimetrik tespiti, IMAC reçineklerinden geçiş metal iyonları ile protein kontaminasyon derecesini ölçmek için basit bir yol sağlar. Ref. 20'de belirlediğimiz gibi, Ni2+ 1:1 stoiyometri stoiyometri stoiyometrisi ve Ni-HNB kompleksi için kopma sabiti ile HNB'ye bağlanır. Ancak, karmaşık Kd önerilen tüm (7-12) pH değerleri için alt nM aralığındadır. Pratik açıdan, edta gibi başka güçlü şelatreler mevcut olduğu sürece herhangi bir test fraksiyonları tüm Ni2 + HNB bağlanacak anlamına gelir. Tüm bu özellikler birlikte doğrusal Ni2+ titrasyon eğrileri ile sonuçlanır, ki bunu deneysel olarak gözlemledik. Bu raporda20, biz de metal-boya karmaşık oluşumu nedeniyle spektral değişiklikler tüm 7-12 pH aralığında aynı olacağını kurdu. Algılama, 2,7-27 nM Ni2+'ya karşılık gelen minimum güvenilir emici değişim ölçümleri (kullanılan spektrofotometreye bağlı olarak 10-4 - 10-3 OD) ile sınırlıdır. Üst aralık mevcut HNB miktarı ile sınırlıdır. Çalışmamızda, 647 nm~0.6 OD'ye karşılık gelen ~15 μM kullanırız. Ancak, gerekirse bu 50-80 μM HNB'ye kadar arttırılabilir. Pratik olarak, üst sınırdan karşılaştırılabilir veya daha yüksek olan kromatografik fraksiyonlarda Ni2+ kontaminasyon düzeyleri gözlendi ve bizi 10 ila 50 kat seyreltme yapmaya zorladı. Ancak, bu ek seyreltme adımı nikel konsantrasyonu bir kısmını belirlerken göreli hataları artırabilir.
Detayları araştırmamış olsak da, IMAC reçinelerinde (Co, Zn, Fe) kullanılan diğer metallerin ciltlemesinin de alt μM ayrışma sabitlerine sahip olduğu ve 647 nm'de boya ve boya-metal emici spektrumlar arasında neredeyse hiç örtüşme olmadığı ortaya çıktı. HNB' ye göre. Bu nedenle, boyaya tam metal bağlanması ve boyanın ilişkili spektral değişimleri önerilen tüm pH aralığında mutlak metal tayini için kullanılabilir.
Protokolün uygulanması basittir ve en çok uygun laboratuvar tekniğine bağlıdır. Modern spektrofotometreler son derece doğrusal tepkilere ve 3-4 kadir lik dinamik aralıklara sahiptir. Sonuç olarak, yöntemde hata giriş için en olası yer örnek hazırlanması için pipetleme adımları geçer. Bu metinde açıklandığı gibi, yöntem, serbest HNB kontrolünden 647 nm'deki HNB emici tepe noktasındaki farka ve bir metalle komplekslenmiş HNB'li numunelere dayalı olarak metal içeriğinin ölçülmesine dayanmaktadır. HNB aliquots veya tampon hacimleri doğru pipet için bakım alınmazsa, 647 nm kontrol ve örnek emicilerin karşılaştırılması bir hata noktası haline gelir. Benzer şekilde, numune hazırlama için protein fraksiyonlarının kötü pipetleme bir kısmını metal algılanan konsantrasyon çarpık olabilir. Talın hassasiyeti nedeniyle, hassas nicelemenin gerekli olduğu analizler için kullanılan pipetlerin kullanımdan önce kalibre edilmesi önerilir.
Yöntemin birincil sınırlamaları, tsanın fonksiyonel pH aralığı ve güçlü şelat ajanlarının varlığı ile birlikte gelir. Tsay en iyi 7-12 bir pH aralığında kullanılır. pH 7 altında, serbest HNB boya değişimi spektrumu, sayısallaştırma20için kullanılan 647 nm de zirve kaybetme. pH 12'nin üzerinde, imac rekarnlerinde yaygın olarak bulunan metaller de dahil olmak üzere birçok metal hidroksit çökelmeye başlar, bu da nicelleştirmeyi daha yavaş ve daha az tekrarlanabilir hale getirir. Saflaştırma prosedürleri nadiren böyle yüksek bir pH için çağrı olarak alkali maksimum önemli bir sorun teşkil etmez iken, asidik minimum sınırlayıcı bir faktör olması daha olasıdır. Ni2+ ve diğer geçiş metalleri için algılama limitleri yukarıda gösterilen metal kontaminasyon seviyelerinden yaklaşık 1000 kat daha düşük olduğundan(Şekil 3),tsuriçin düşük pH sınırı nötr pH değerlerine ve yeterli yüksek tamponlama kapasitesine sahip tamponlarda tsalli asidik protein fraksiyonlarının seyreltilmesi yle atlatılabilir. Alternatif olarak, analiz edilen kesirlerin pH'ı ayarlanabilir veya HNB stok çözeltisi karıştırıldıktan sonra istenilen pH'ı korumak için daha güçlü bir şekilde arabelleğe alınabilir.
Saflaştırılan protein için izolasyon prosedürü bilinen veya şüpheli geçiş metal şelat özellikleri ile reaktiflerin kullanımını gerektiriyorsa, leached metallerin doğru nicelleştirilmesi için yöntemin bir değişiklik gerekli olacaktır. Standart bir eğri doğru şelatör varlığında leached metal konsantrasyonu ölçmek için protein elüsyon ve metal standartlarının bilinen konsantrasyonları için kullanılan şelat ajan kullanılarak hazırlanması gerekir. Histidin varlığında metal nicelik bir örnek Kokhan & Marzolf20mevcuttur.
Biyolojik numunelerde metallerin doğru nicelleştirilmesi hala büyük ölçüde analitik teknikler ve enstrümantasyon kullanımına bağlıdır, AAS ve ICP-MS gibi, tipik biyokimyacı31,32alan dışında kalır . Bonta ve ark. ICP-MS tarafından analiz için ortak filtre kağıt üzerinde biyolojik örneklerin basit hazırlanması açıklanan, ancak, onların yöntemi hala bir biyokimyacı için standart olmayan enstrümantasyon dayanır31. Açıkladığımız yöntem, bir numunedeki metal içeriğinin ölçülmesine, yeni enstrümantasyon veya başkalarına dış kaynak kullanımı konusunda ek bir eğitim verilmeden alınmasına olanak sağlar. Biyolojik numunelerde metal analizi için benzer kolorimetrik protokoller geliştirilmiştir33. Ancak, Shaymal ve ark.33 tarafından açıklanan yöntem, bu kağıtta daha yüksek bir algılama sınırı sağlayan ticari olarak kullanılamayan floresan sonda kullanarak bir floresan tayini dayanır. Açıklanan yöntemin hangi şekilde uygulanabileceği göreli kolaylığı ve sulu numuneler için taşınabilir metal algılama protokollerinin geliştirilmesine olan son ilgi göz önüne alındığında34,35, su numunelerinin saha testi için kolayca uyarlanabilir. Taşınabilir bir test olarak, yöntemimiz nicelleştirme için taşınabilir bir spektrofotometre ile veya sabit bir test yerinde daha fazla analiz için örnekleri tanımlamak için nitel bir ölçü olarak kullanılmak üzere değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu malzeme, Grant MCB-1817448 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen çalışma ve Thomas F. ve Kate Miller Jeffress Memorial Trust, Bank of America, Mütevelli ve belirtilen donör Hazel Thorpe Carman ve George Gay Carman bir ödül tarafından dayanmaktadır Güven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT broth | Fisher Scientific | BP9743-500 | media for E.coli growth |
| HEPES, free acid | BioBasic | HB0264 | alternative buffer |
| HisPur Ni-NTA resin | Thermo Scientific | 88222 | |
| Hydroxynaphthol blue disoidum salt | Sigma-Aldrich | 219916-5g | |
| Imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | |
| Imidazole | BioBasic | IB0277 | |
| MOPS, free acid | BioBasic | MB0360 | alternative buffer |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | alternative buffer |
| Tricine | Gold Bio | T870-100 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 |
References
- Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Block, H., et al. Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review. Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).
- Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs. Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).
- Felix, K., et al. Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia. Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).
- Wu, C., et al. Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).
- Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).
- Guergova-Kuras, M., et al. Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides. Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).
- Mitchell, D. M., Gennis, R. B. Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography. FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).
- Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex. Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).
- Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex. Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).
- Louie, A. Y., Meade, T. J. Metal complexes as enzyme inhibitors. Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).
- Tamás, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation. Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).
- Gerencser, L., Maroti, P. Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues. Biochemistry. 40 (6), 1850-1860 (2001).
- Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).
- Link, T. A., von Jagow, G. Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group. Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).
- Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Schäfer, F. Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy. Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).
- Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding. Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).
- Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies. Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).
- Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).
- Kokhan, O., Marzolf, D. R. Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue. Analytical Biochemistry. 582, 113347 (2019).
- Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol. Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).
- Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B. Inorganic Chemical Biology. Gasser, G. , (2014).
- Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS. Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).
- Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS. Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).
- Brittain, H. G. Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes. Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).
- Brittain, H. G. Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue. Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).
- Temel, N. K., Sertakan, K., Gürkan, R. Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry. Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).
- Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue. Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).
- Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size. Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).
- Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).
- Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples. Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).
- Olmedo, P., et al. Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry. Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).
- Shyamal, M., et al. Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature. ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).
- Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration. Micromachines. 8 (4), 127 (2017).
- Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water. Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).
