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Chemistry

Quantification du lixiviation des métaux dans la chromatographie d'affinité métallique immobilisée

Published: January 17, 2020 doi: 10.3791/60690

Summary

Nous présentons un analyse pour la quantification facile des métaux introduits aux échantillons préparés utilisant la chromatographie immobilisée d'affinité de métal. La méthode utilise le bleu hydroxynaphthol comme indicateur de métal colorimétrique et un spectrophotomètre UV-Vis comme détecteur.

Abstract

La contamination des enzymes avec des métaux lessiminés à partir de chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC) colonnes pose une préoccupation majeure pour les enzymologues, comme beaucoup de cations communes di-et trivalents utilisés dans les résines IMAC ont un effet inhibiteur sur les enzymes. Cependant, l'étendue du lessivage des métaux et l'impact de divers réactifs d'éluetation et de réduction sont mal compris en grande partie en raison de l'absence de protocoles simples et pratiques de quantification des métaux de transition qui utilisent l'équipement habituellement disponible dans laboratoires de biochimie. Pour résoudre ce problème, nous avons développé un protocole pour quantifier rapidement la quantité de contamination des métaux dans les échantillons préparés à l'aide de l'IMAC comme étape de purification. La méthode utilise le bleu hydroxynaphthol (HNB) comme indicateur colorimétrique de la teneur en cation métallique dans une solution d'échantillon et la spectroscopie UV-Vis comme moyen de quantifier la quantité de métal présent, dans la gamme nanomolaire, basée sur le changement du spectre HNB à 647 nm. Bien que la teneur en métaux d'une solution ait toujours été déterminée à l'aide de la spectroscopie d'absorption atomique ou de techniques plasmatiques couplées inductivement, ces méthodes nécessitent un équipement spécialisé et une formation en dehors du champ d'application d'un laboratoire de biochimie typique. La méthode proposée ici fournit un moyen simple et rapide pour les biochimistes de déterminer la teneur en métaux des échantillons en utilisant l'équipement et les connaissances existants sans sacrifier la précision.

Introduction

Depuis sa création par Porath et ses collègues1, la chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC) est devenue une méthode de choix pour séparer rapidement les protéines en fonction de leur capacité à se lier avec des ions métalliques de transition tels que Zn2 ,Ni2 ,Cu2, et Co2. Ceci est le plus souvent fait par l'intermédiaire des étiquettes de poly-histidine machinées et est maintenant l'une des techniques de purification chromatographique les plus communes pour l'isolement des protéines recombinantes2. IMAC a également trouvé des applications au-delà de la purification des protéines recombinantes comme un moyen d'isoler les quinolones, tétracyclines, aminoglycosides, macrolides, et les lactams pour l'analyse des échantillons alimentaires3 et comme une étape dans l'identification des marqueurs de protéines du sérum sanguin pour les cancers du foie et du pancréas4,5. Sans surprise, IMAC est également devenu une méthode de choix pour l'isolement d'un certain nombre d'enzymes bioénergétiques indigènes6,7,8,9,10. Cependant, la mise en œuvre réussie de ces méthodes de purification pour des études sur les protéines bioénergétiques enzymatiquement actives dépend de la présence de niveaux négligeables de cations métalliques lixiviées de la matrice de colonne dans l'éluate. Les cations métalliques divalentes couramment utilisées dans l'IMAC ont connu une signification biologique pathologique, même à de faibles concentrations11,12. L'effet physiologique de ces métaux est plus prononcé dans les systèmes bioénergétiques, où ils peuvent s'avérer mortels comme inhibiteurs de la respiration cellulaire ou de la photosynthèse13,14,15. Des problèmes similaires sont inévitables pour la majorité des classes de protéines où les métaux résiduels contaminants peuvent interférer avec les fonctions biologiques d'une protéine ou la caractérisation avec des techniques biochimiques et biophysiques.

Alors que les niveaux de contamination des métaux dans des conditions oxydantes et en utilisant l'imidazole comme éluant sont généralement faibles16, les isolements protéiques effectués en présence d'agents de réduction de la cystéine (TNT, mercaptoéthanol, etc) ou avec des chélateurs plus forts comme l'histidine17,18 ou l'acide éthylediaminetetraacetic (EDTA) se traduisent par des niveaux beaucoup plus élevés de contamination métallique19,20. De même, puisque les ions métalliques dans les résines IMAC sont fréquemment coordonnés par des groupes carboxyliques, les élutions protéiques effectuées dans des conditions acides sont également susceptibles d'avoir des niveaux beaucoup plus élevés de contamination des métaux. La teneur en métaux dans les solutions peut être évaluée à l'aide de la spectroscopie d'absorption atomique (AAS) et de la spectrométrie de masse plasmatique couplée inductive (ICP-MS) jusqu'à une limite de détection dans la gamme ppb-ppt21,22,23,24. Malheureusement, l'AAS et l'ICP-MS ne sont pas des moyens réalistes de détection dans un laboratoire de biochimie traditionnel, car ces méthodes nécessiteraient l'accès à de l'équipement spécialisé et à la formation.

Les travaux antérieurs de Brittain25,26 ont étudié l'utilisation du bleu hydroxynaphthol (HNB) comme un moyen d'identifier la présence de métaux de transition dans la solution. Cependant, il y avait plusieurs contradictions internes dans les données20 et ces travaux n'offrait pas un protocole adéquat. Des études de Temel et coll.27 et Ferreira etcoll. 28 ont porté sur le travail de Brittain avec HNB en tant qu'indicateur métallique potentiel. Cependant, Temel a développé un protocole qui utilise aAS pour l'analyse de l'échantillon, en utilisant HNB seulement comme un agent de chélage. L'étude de Ferreira a utilisé le changement des spectres d'absorption de HNB à 563 nm, une région des spectres HNB à colorant libre qui chevauche fortement les spectres des complexes hNB-métal au pH 5.7, ce qui rend la sensibilité d'analyse assez faible et a entraîné une affinité de liaison métallique relativement faible20. Pour résoudre les problèmes dans notre propre laboratoire avec Ni 2 'lixiviation de l'IMAC, nous avons élargi le travail effectué par Brittain25, 26 et Ferreria28 pour développer un test facile capable de détecter les niveaux de nanomolar de plusieurs métaux de transition. Nous avons montré que HNB lie le nickel et d'autres métaux communs pour IMAC avec des affinités de liaison sous-nanomolaires et la forme 1:1 complexe sur un large éventail de valeurs de pH20. L'analyse rapportée ici est basée sur ces résultats et utilise des changements d'absorption dans le spectre HNB à 647 nm pour la quantification des métaux. L'analyse peut être effectuée dans la plage de pH physiologique à l'aide de tampons et d'instruments communs trouvés dans un laboratoire de biochimie typique en utilisant la détection colorimétrique et la quantification des complexes de teinture métallique et le changement associé dans l'absorption du colorant libre lorsqu'il se lie au métal.

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Protocol

1. Préparation des composants d'essai

  1. Déterminer les fractions de chromatographie à déterminer à l'aide de l'absorption optique à 280 nm ou d'autres méthodes de quantification des protéines pour identifier les fractions enrichies en protéines.
    REMARQUE : Pour ce travail, nous avons utilisé un spectrophotomètre UV-Vis de tableau de diode. Pour augmenter le débit, un lecteur de plaque capable de mesurer l'absorption UV-Vis peut être utilisé.
  2. Préparation des composants d'essai nécessaires
    1. Préparer ou obtenir un tampon de 10 à 100 mm (« tampon d'échantillon ») avec un pH entre 7 et 12.
      REMARQUE : Les tampons biochimiques courants tels que Tris, HEPES, MOPS et phosphate au pH neutre ou de base sont tous acceptables pour l'analyse. Tricine et histidine peuvent être utilisés, mais il faudra des courbes d'étalonnage car ils ont tous deux essentiellement chélate ions métalliques. Un exemple d'étalonnage de l'histidine est montré en référence20.
    2. Préparer une solution de 12 % w/v (20 fois concentrée) de dispersion du bleu hydroxynaphthol (HNB) dans le tampon d'échantillon à l'aide de 120 mg de réactif HNB pour chaque millilitre de solution de stock préparée.
      CAUTION: L'exposition de HNB à l'œil peut causer de graves dommages et une irritation. La protection oculaire doit être utilisée lors de la manipulation hNB et les mains doivent être lavées à fond après la manipulation.
      REMARQUE: HNB est vendu comme une dispersion sur KCl par les principaux fournisseurs de réactifs scientifiques. En tant que tel, la concentration réelle dans la solution variera de différents fabricants, lots, et où dans la bouteille la dispersion HNB est prise à partir. Idéalement, une absorption comprise entre 0,5 et 0,8 à 647 nm après une dilution de 20 fois du stock devrait être atteinte.

2. Préparation et mesure de l'échantillon

  1. Préparation du spectrophotomètre pour la collecte de données
    1. Allumez et réchauffez le spectrophotomètre UV-Vis. Définir le spectrophotomètre pour recueillir des données à 647 nm.
      REMARQUE : Si le spectrophotomètre le permet, recueillir en outre des données à 850 nm, ou une autre longueur d'onde sans changements significatifs liés aux spectres de teinture-métal et de colorant, pour être utilisé pour une correction de base.
    2. Videz le spectrophotomètre à l'aide du tampon d'échantillon.
      REMARQUE : Des cuvettes en plastique de quartz ou jetables peuvent être employées. Les cuvettes de quartz sont préférées pour l'analyse quantitative car elles permettront une précision et une précision plus élevées au-dessus des cuvettes en plastique jetables. Cependant, les cuvettes en plastique bloquent la lumière UV, qui peut être présente dans les faisceaux de mesure de certains spectrophotomètres à diodes. L'exposition de HNB à la lumière UV intense entraîne une dégradation notable des colorants et une diminution non désirée de l'absorption lente qui peut être confondue avec une liaison métallique lente (par exemple, voir la figure 1 dans l'information à l'appui de la référence 20).
  2. Préparation et absorption de la mesure du contrôle
    1. Préparer une solution de contrôle contenant 50 L de stock HNB par millilitre de volume total d'assay. Pour assurer un bon mélange de tous les échantillons, pipette les petits volumes d'abord puis ajouter le tampon d'échantillon suivi par le mélange par pipetting. La solution HNB diluée doit être préparée fraîche, mais les stocks de HNB peuvent être stockés à 4 oC et protégés de la lumière pendant des semaines sans dégradation significative.
    2. Laisser le contrôle incuber pendant au moins 3 min à température ambiante.
      REMARQUE : Un temps d'incubation plus long peut être nécessaire pour les échantillons au pH alcalin ou en présence de phosphate en raison de la formation de complexes métalliques mal solubles entraînant un équilibre plus lent.
    3. Mesurer et enregistrer l'absorption à 647 nm pour l'échantillon témoin.
  3. Mesure de préparation et d'absorption des échantillons
    1. Préparer les échantillons d'analyse en mélangeant 50 oL de bouillon de HNB avec 950 l de fractions de protéines correctement diluées avec le tampon d'échantillon.
      REMARQUE : Étant donné que les niveaux de contamination des métaux signalés dans la littérature varient d'un facteur de plus de 1 000 selon les conditions d'élution16,20, il peut être nécessaire d'essayer quelques dilutions des fractions de protéines assayed avec le tampon d'échantillon (voir l'étape 1.2.1 ci-dessus) pour réaliser des changements d'absorption dans la plage dynamique de l'essai.
      CAUTION: Le nickel et d'autres métaux utilisés dans IMAC sont connus irritant sa peau, soupçonné d'être cancérogène, et sont capables d'endommager les reins et le sang après une exposition prolongée. Les gants et la protection oculaire doivent être utilisés lors de la manipulation d'échantillons de protéines préparés avec IMAC.
    2. Laisser l'échantillon incuber pendant au moins 3 min à température ambiante et mesurer les absorptions à 647 nm.
      REMARQUE : L'étape limitante de l'épreuve en termes de temps investi est l'étape d'incubation. Les données de cet article ont été recueillies à l'aide d'une cuvette à quartz unique qui a été soigneusement lavée entre chaque échantillon. Même avec le temps de lavage supplémentaire et la préparation du stock HNB, la collecte de données pour 14 échantillons et le contrôle a pris environ une heure et demie et en tant que tel, le protocole peut être facilement complété sans la nécessité d'interruption.
    3. Répétez les étapes 2.3.1 et 2.3.2 pour chaque fraction qui sera mesurée.
      REMARQUE : Si plusieurs cuvettes seront utilisées pour plusieurs échantillons, les échantillons doivent être préparés d'une manière qui permet te donne un temps d'incubation et une exposition comparables à la lumière ambiante.

3. Quantification des métaux

  1. Détermination de la concentration de métal dans chaque échantillon
    1. Trouvez la différence de chaque absorption d'échantillon à 647 nm du contrôle HNB.
    2. Déterminer la concentration de métal (en M) à l'aide de la formule ci-dessous :

      Equation 1

      le DF est le facteur de dilution pour la fraction d'analyse, les Abs647 est le changement d'absorption à 647 nm, 3,65x10-2 représente le coefficient d'extinction de HNB (36,5 mM-1cm-1 voir Référence20 pour plus de détails) et l'est la trajectoire optique de cuvette en cm.

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Representative Results

Le spectre de HNB libre au pH neutre (ligne noire) et les spectres représentatifs des fractions indiquées pour Ni2 ' de l'isolement de MSP1E3D129 sont indiqués dans la figure 2. Une série d'exemples réussies devrait démontrer une diminution de l'absorption à 647 nm par rapport au contrôle HNB, ce qui correspond à la formation de complexes HNB en présence d'un métal de transition. Un échec serait indiqué par une augmentation de l'absorption à 647 nm. Alternativement, une diminution de plus de 90 % par rapport à l'absorption initiale à 647 nm indiquerait une teneur en métaux trop élevée et la nécessité d'essayer des fractions plus diluées. Un résultat d'assiduation sans changement d'absorption par le contrôle gratuit de la HNB n'indique pas nécessairement une défaillance. Il est possible que les échantillons ne contiennent essentiellement pas de métaux lessiqués. Cependant, cela est peu probable et tout échantillon ne montrant aucun changement d'absorption doit être préparé et mesuré à nouveau, de préférence avec moins de dilution, pour confirmer le résultat. Au total, la plupart des omissions d'observer le changement d'absorption prévu peuvent être attribuées à un tuyauterie inadéquat pendant la préparation de l'échantillon, à un temps d'incubation inadéquat avant la mesure ou à des valeurs de pH en dehors de la plage recommandée de 7 à 12.

Pour démontrer l'application de cet analyse, nous avons analysé 2 protéines d'échafaudage membranaire saclaclites MSP1E3D1 (isolées comme dans Denisov, I. G. et coll.29), MSP2N2 (isolé comme dans Grinkova, Y. V.30), et un roman 3-heme c-type cytochrome GSU0105 de Geobacter sulfurreducens, qui a été recombinante exprimée en E. coli et éludé avec 500 mM imidazole. Les profils d'élution de Ni2 à partir d'une colonne de résine Ni-NTA (voir Tableau des matériaux) et les profils d'élution de protéines associés pour ces 3 protéines sont présentés à la figure 3. Toute protéine aura une élution de nickel unique qui peut ou ne peut pas s'aligner avec le profil d'élution de protéine tel que mesuré à 280 nm. Par exemple, la figure 3C montre que la teneur en protéines et en Ni2 de chaque fraction pour GSU0105 est significativement décalée les unes des autres, tandis que les fractions de MSP1E3D1 et de MSP2N2(figure 3A,B)qui contiennent le plus de protéines ont également la teneur la plus élevée en Ni2. Figure 3A,B illustre également que la teneur en métaux peut ne pas être répartie uniformément entre les fractions recueillies à l'aide de l'IMAC. Selon l'emballage de la colonne, la composition du tampon d'élution, l'équipement de pompage et les conditions, il est possible d'avoir le métal elute en fractions consécutives à des concentrations très différentes indépendamment de la teneur en protéines de ces fractions.

Figure 1
Figure 1 : Structure du bleu hydroxynaphthol (HNB). Dans la plage de pH fonctionnelle de l'analyse, tous les groupes de sulfonate et l'un des groupes d'hydroxyle sont ionisés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Spectres d'absorption pour certaines fractions MSP1E3D1 et HNB. L'absorption relative de trois fractions de MSP1E3D1 (couleurs) par rapport à un contrôle HNB (ligne épaisse noire) sont indiquées. Des échantillons ont été préparés dans 20 mM Tris, pH 7.5. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Quantification ni2 pour 3 protéines His-tag représentatives. Profils d'élution de protéines et de Ni2 pour (A) MSP1E3D1, (B) MSP2N2, et (C) GSU0105. L'élution protéique a été réalisée à l'aide de 300 mM, 300 mM et 500 mM d'imidazole, respectivement. La quantification de La ni2 a été réalisée dans 20 mM Tris, pH 7,5. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La détection colorimétrique des métaux à l'aide de HNB fournit un moyen simple de quantifier le degré de contamination des protéines par les ions métalliques de transition provenant des résines IMAC. Comme nous l'avons établi dans l'arbitre 20, Ni2 s'associe à HNB avec 1:1 stoichiométrie et la constante de dissociation pour le complexe Ni-HNB change avec le pH. Cependant, le complexe Kd est dans la gamme sous-nM pour toutes les valeurs recommandées (7-12) pH. Concrètement, cela signifie que tous les Ni2 dans toutes les fractions testées se lieront à HNB tant qu'aucun autre réactif de chélage solide, comme EDTA, n'est présent. Toutes ces propriétés ensemble donnent lieu à des courbes linéaires de titration Ni2, que nous avons observées expérimentalement. Dans ce rapport20, nous avons également établi que les changements spectrals dus à la formation complexe métal-teinture seront les mêmes sur l'ensemble de la gamme 7-12 pH. La détection est limitée par les mesures minimales fiables de changement d'absorption (10-4 - 10-3 OD selon le spectrophotomètre utilisé) correspondant à 2,7-27 nM Ni2. La plage supérieure est limitée par la quantité de HNB présente. Dans notre travail, nous utilisons 15 m, ce qui correspond à 0,6 OD à 647 nm. Toutefois, cela peut être augmenté jusqu'à 50-80 HNB M, si nécessaire. Pratiquement, nous avons observé des niveaux de contamination De2 degrés dans des fractions chromatographiques comparables ou supérieures à la limite supérieure, ce qui nous a forcés à faire des dilutions de 10 à 50 fois des fractions d'analyse. Cependant, cette étape de dilution supplémentaire peut augmenter les erreurs relatives tout en déterminant la concentration de nickel en une fraction.

Bien que nous n'ayons pas étudié les détails, il est apparu que la liaison d'autres métaux utilisés dans les résines IMAC (Co, Zn, Fe) a également des constantes de dissociation sous-M et pratiquement aucun chevauchement entre les spectres d'absorption de colorant et de colorant-métal à 647 nm, la longueur d'onde maximale de libre Hnb. Par conséquent, la liaison métallique complète au colorant et les changements spectrals associés du colorant peuvent être utilisés pour la détermination absolue du métal sur toute la plage de pH recommandée.

L'exécution du protocole est simple et dépend le plus fortement de la technique de laboratoire appropriée. Les spectrophotomètres modernes ont des réponses très linéaires et des plages dynamiques de 3-4 ordres de grandeur. Par conséquent, l'endroit le plus probable pour l'introduction de l'erreur dans la méthode est par les étapes de pipetage pour la préparation de l'échantillon. Comme décrit dans ce texte, la méthode est basée sur la quantification de la teneur en métaux basée sur la différence dans le pic d'absorption hNB à 647 nm d'un contrôle HNB gratuit et des échantillons avec HNB complexe avec un métal. Si l'on ne prend pas soin de pipette avec précision les aliquots HNB ou les volumes tampons, la comparaison du contrôle et des absorptions d'échantillons à 647 nm devient un point d'erreur. De même, un mauvais tuyauterie de fractions de protéines pour la préparation de l'échantillon peut fausser la concentration perçue de métal en une fraction. Il est recommandé de calibrer, en raison de la sensibilité de l'analyse, toutes les pipettes utilisées pour des analyses où une quantification précise est nécessaire avant l'utilisation.

Les principales limites de la méthode viennent avec la gamme de pH fonctionnelle de l'analyse et la présence d'agents de chélage forts. L'assay est mieux utilisé dans une gamme de pH de 7-12. En dessous du pH 7, le spectre du colorant HNB gratuit change, perdant le pic à 647 nm utilisé pour la quantification20. Au-dessus du pH 12, de nombreux hydroxydes métalliques commencent à se précipiter, y compris ceux des métaux que l'on trouve couramment dans les résines IMAC, ce qui rend la quantification plus lente et moins reproductible. Bien que le maximum alcalin ne pose pas un problème important que les procédures de purification appellent rarement pour un tel pH élevé, le minimum acide est plus susceptible d'être un facteur limitant. Étant donné que les limites de détection de Ni2 et d'autres métaux de transition sont environ 1000 fois inférieures aux niveaux de contamination des métaux démontrés ci-dessus (figure 3), la limite de pH faible pour l'analyse peut être contournée par dilution des fractions de protéines acides assoubées dans des tampons avec des valeurs de pH neutres et une capacité de mise en mémoire suffisamment élevée. Alternativement, le pH des fractions analysées peut être ajusté ou la solution de stock HNB peut être plus fortement tamponné pour maintenir le pH désiré après le mélange.

Si la procédure d'isolement de la protéine en cours de purification nécessite l'utilisation de réactifs ayant des propriétés de chélage de métaux de transition connues ou présumées, une modification de la méthode serait nécessaire pour permettre une quantification appropriée des métaux lessiqués. Une courbe standard devrait être préparée à l'aide de l'agent chélateur utilisé pour l'élution des protéines et des concentrations connues de normes métalliques pour quantifier avec précision la concentration de métal lixivié en présence du chélateur. Un exemple de quantification des métaux en présence d'histidine est disponible dans Kokhan et Marzolf20.

La quantification précise des métaux dans les échantillons biologiques dépend encore largement de l'utilisation de techniques analytiques et d'instruments, tels que l'AAS et l'ICP-MS, qui restent en dehors du domaine du biochimiste typique31,32. Bonta etcoll. ont décrit la simple préparation d'échantillons biologiques sur du papier filtre commun pour analyse par ICP-MS, cependant, leur méthode repose toujours sur l'instrumentation non standard pour un biochimiste31. La méthode que nous décrivons permet de mesurer la teneur en métal d'un échantillon sans formation supplémentaire sur les nouvelles instrumentations ou l'externalisation à d'autres. Des protocoles colorimétriques similaires ont été développés pour l'analyse des métaux dans des échantillons biologiques33. Cependant, la méthode décrite par Shaymal et coll.33 repose sur un test de fluorescence à l'aide d'une sonde fluorescente commercialement indisponible qui donne une limite de détection plus élevée que celle de cet article. Compte tenu de la facilité relative avec laquelle la méthode décrite peut être effectuée et de l'intérêt récent pour le développement de protocoles portatifs de détection des métaux pour les échantillons aqueux34,35, il pourrait être facilement adapté pour l'essai sur le terrain des échantillons d'eau. En tant que test portable, notre méthode pourrait être modifiée pour être utilisée avec un spectrophotomètre portatif pour la quantification ou comme mesure qualitative pour identifier les échantillons pour une analyse plus approfondie à un endroit d'essai fixe.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce matériel est basé sur des travaux soutenus par la National Science Foundation sous la fondation Grant MCB-1817448 et par un prix du Thomas F. et Kate Miller Jeffress Memorial Trust, Bank of America, Trustee et donateur spécifié Hazel Thorpe Carman et George Gay Carman Confiance.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2xYT broth Fisher Scientific BP9743-500 media for E.coli growth
HEPES, free acid BioBasic HB0264 alternative buffer
HisPur Ni-NTA resin Thermo Scientific 88222
Hydroxynaphthol blue disoidum salt Sigma-Aldrich 219916-5g
Imidazole Fisher Scientific O3196-500
Imidazole BioBasic IB0277
MOPS, free acid BioBasic MB0360 alternative buffer
Sodium chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium phosphate Fisher Scientific S369-500 alternative buffer
Tricine Gold Bio T870-100
Tris base Fisher Scientific BP152-500
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500

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References

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Chimie Numéro 155 chromatographie d'affinité métallique immobilisée bleu hydroxynaphthol HNB Ni-NTA contamination des métaux His-tag
Quantification du lixiviation des métaux dans la chromatographie d'affinité métallique immobilisée
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Swaim, C. M., Brittain, T. J.,More

Swaim, C. M., Brittain, T. J., Marzolf, D. R., Kokhan, O. Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography. J. Vis. Exp. (155), e60690, doi:10.3791/60690 (2020).

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