Summary
نقدم بروتوكولا ً للعزل والثقافة والحث الإديفيوجيني للخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الدهنية المشتقة من الخلايا الدهنية المشتقة من الخلايا الدهنية المحيطية لـ Wnt-1 Cre+/-؛ Rosa26RFP/ + الفئران. يمكن أن تكون NCADSCs مصدرًا يمكن الوصول إليه بسهولة من ADSCs لنمذجة الأديبوجينيسيس أو تكوين الدهون في المختبر.
Abstract
ترتبط الكمية المفرطة من الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية (الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية، والمعروفة أيضًا باسم PVAT) بارتفاع خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية. تظهر ADSCs المشتقة من الأنسجة الدهنية المختلفة ميزات متميزة ، ولم يتم توصيف تلك الموجودة في PVAT بشكل جيد. في دراسة حديثة، أبلغنا أن بعض ADSCs في الأنسجة الدهنية القوس المحيطي (PAAT) تنحدر من خلايا القمة العصبية (NCCs)، وهي مجموعة عابرة من الخلايا المهاجرة الناشئة من الخلايا الجذعية.
في هذه الورقة، نصف بروتوكول لعزل البروتين الفلوري الأحمر (RFP) المسمى NCCs من PAAT من Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP / + الفئران وحفز التمايز adipogenic في المختبر. باختصار ، يتم فصل كسر الأوعية الدموية المترفية (SVF) بشكل أنزيمي عن PAAT ، ويتم عزل RFP+ قمة العصبية المشتقة ADSCs (NCADSCs) عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS). وNCADSCs تفرق إلى كل من الخلايا الشحمية البني والأبيض، يمكن cryopreserved، والاحتفاظ إمكاناتها adipogenic ل ~ 3-5 الممرات. يمكن أن يولد بروتوكولنا ADSCs وفيرة من PVAT لنمذجة الخلايا الدهنية PVAT أو lipogenesis في المختبر. وهكذا، يمكن لهذه NCADSCs توفير نظام قيمة لدراسة مفاتيح الجزيئية المشاركة في التمايز PVAT.
Introduction
انتشار السمنة في تزايد في جميع أنحاء العالم، مما يزيد من خطر الأمراض المزمنة ذات الصلة، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية ومرض السكري1. PVAT تحيط الأوعية الدموية وهو مصدر رئيسي لعوامل الغدد الصماء والباراكرين المشاركة في وظيفة الأوعية الدموية. تظهر الدراسات السريرية أن نسبة PVAT العالية هي عامل خطر مستقل لأمراض القلب والأوعية الدموية2،3، وتعتمد وظيفتها المرضية على النمط الظاهري للخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية المكونة (ADSCs)4.
على الرغم من أن خطوط الخلايا ADSC مثل murine 3T3-L1, 3T3-F442A, وOP9 هي نماذج خلوية مفيدة لدراسة adipogenesis أو lipogenesis5,الآليات التنظيمية لadipogenesis تختلف بين خطوط الخلية والخلايا الأولية. وADSCs في كسر الخلية الوعائية سترومال (SVF) معزولة مباشرة من الأنسجة الدهنية والناجمة عن التفريق في الخلايا الدهنية على الأرجح خلاصة في الجسم الحي adipogenesis وlipogenesis6. ومع ذلك ، فإن هشاشة وطفو هاوية واختلافات في الحجم والأنماط المناعية للأنظمة المحاسبية الدولية للأنظمة تجعل عزلتها المباشرة صعبة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤثر إجراءات العزل المختلفة أيضًا بشكل كبير على النمط الظاهري والقدرة المحتملة الأيديجينية لهذه الخلايا7، مما يؤكد على الحاجة إلى بروتوكول يحافظ على سلامة ADSC.
عادة ما تصنف الأنسجة الدهنية إما الأنسجة الدهنية البيضاء متميزة شكليا ووظيفيا (وات)، أو الأنسجة الدهنية البني (BAT)8، الذي يؤوي ADSCsمتميزة 9. في حين أن ADSCs معزولة عن perigonadal والغناء تحت الجلد WATs وقد تميزت في الدراسات السابقة9،10،11،12، أقل من المعروف فيما يتعلق ADSCs من PVAT التي تتألف أساسا من BAT13.
في دراسة حديثة ، وجدنا أن جزءًا من ADSCs المقيم في الأنسجة الدهنية للقوس المحيطي (PAAT) مشتقة من خلايا القمة العصبية (NCCs) ، وهي مجموعة سكانية عابرة من خلايا السلف المهاجرة التي تنشأ من ectoderm14،15. تم استخدام الفئران المعدلة وراثيا Wnt1-Cre لتتبع تطور الخلايا العصبية كريست16،17. عبرنا Wnt1-Cre+ الفئران مع روزا26RFP / + الفئران لتوليد Wnt-1 كري+/-؛ روزا26RFP / + الفئران، التي يتم تسمية NCCs وذريتها مع البروتين الفلوري الأحمر (RFP) ويتم تعقبها بسهولة في vivo وفي المختبر15. هنا، ونحن نصف طريقة لعزل قمة العصبية المستمدة ADSCs (NC المشتقة ADSCs، أو NCADSCs) من PAAT الماوس وحث NCADSCs للتمييز إلى الخلايا الشحمية البيضاء أو الخلايا الشحمية البني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت مراجعة البروتوكول الحيوانى والموافقة عليه من قبل لجنة رعاية الحيوانات بجامعة جياو تونغ بشانغهاى .
1. جيل Wnt-1 كري+/-; Rosa26RFP/+ الفئران
- عبر Wnt-1 كري+/- الفئران16 مع روزا26RFP/+ الفئران18 لتوليد Wnt-1 كري+/-; Rosa26RFP/ + الفئران. الفئران المنزل تحت دورة 12 ساعة الضوء / الظلام في منشأة خالية من مسببات الأمراض في 25 درجة مئوية والرطوبة 45٪ حتى أنها 4-8 أسابيع من العمر.
2- تشريح البات
ملاحظة: انظر الشكل 1.
- تعقيم جميع الأدوات الجراحية (على سبيل المثال، المقص الجراحي، الملقط القياسية، ومقص الجراحة الدقيقة وملقط) عن طريق التعقيم في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إعداد وسط الهضم (ارتفاع الجلوكوز دولبيكو تعديل النسر المتوسط [HDMEM] التي تحتوي على 2 ملغ / مل الكولاجين من النوع الأول). إعداد الوسط الثقافة (HDMEM تحتوي على 10٪ مصل الأبقار الجنين [FBS] و 1٪ v/v البنسلين-ستريبتومسين [PS]). قم بتعقيم باستخدام فلتر حقنة 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام.
- قم بتعقيم كواشف زراعة الخلايا باستخدام الأشعة فوق البنفسجية أو الإيثانول أو الترشيح أو البخار، حسب الاقتضاء.
- إعداد طبق بيتري مع الحل المالحة متوازنة هانكس (HBSS) وأنبوب مخروطي 15 مل مع 10 مل من HBSS تستكمل مع 1٪ v / v من محلول PS. أبقي كلاهما على الجليد.
- تهوّن الفئران15 بالإيزوغلوران والتضحية بخلع عنق الرحم. تزج الهيئات في كوب مليئة 75٪ الكحول (200 مل) لمدة 5 دقيقة لتعقيم سطح الجلد.
- قص وفصل الجلد على البطن وقطع على طول خط الوسط البطني من الحوض إلى الرقبة. فتح البطن وتحريك الكبد لفضح الحجاب الحاجز19.
- قطع الحجاب الحاجز والأضلاع على جانبي خط الوسط وفضح القلب والرئتين عن طريق تقشير الأضلاع مرة أخرى.
- إزالة الرئة والغدة الصعترية واستخراج PAAT جنبا إلى جنب مع الأورطان والقلب.
- قطع الأبهر في الجذر الأبهر لإزالة القلب. جعل قطع بين القوس الأبهر والشريان الأورطي تنازلي وفصل بعناية الأنسجة الدهنية المحيطة بكل من الهياكل والشرايين السباتي اليسرى واليمنى الشائعة من جدار الصدر الخلفي. نقل الأنسجة إلى العازلة HBSS الجليد الباردة في طبق بيتري.
- باستخدام ملقط معقمة, إزالة أكبر قدر من الأوعية الدموية (على سبيل المثال, الشريان الأورطي, الشرايين السباتية المشتركة, وغيرها من الأوعية الدموية الصغيرة) واللفافة قدر الإمكان, ونقل الأنسجة الدهنية في أنابيب Eppendorf 2 مل تحتوي على 0.5 مل الجليد الباردة HBSS العازلة على الجليد.
3. عزل SVF
جمع PAAT من 5-6 الفئران في واحد 2 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على 1 مل أعدت حديثا الهضم المتوسطة والمفروم الأنسجة باستخدام مقص الجراحية في أنبوب Eppendorf في درجة حرارة الغرفة (RT).
- نقل المزيج إلى 50 مل أنابيب تحتوي على 9 مل من وسط الهضم. تجانس الأنسجة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مع 1 مل ماصة 10x.
- احتضان الأنابيب عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30-45 دقيقة والتحقق من كل 5-10 دقيقة لمنع الإفراط في الهضم. وهذا أمر بالغ الأهمية لتحسين قدرة الخلية على البقاء والعائد.
ملاحظة: سيؤدي هضم الأنسجة الجيدة إلى نسيج متجانس وأصفر فاتح للالدهنية يكون مرئيًا للعين المجردة على الدوران بلطف في الأنبوب. - وقف الهضم عن طريق إضافة 5 مل من HDMEM تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ v / v PS في RT وتخلط جيدا عن طريق الأنابيب.
- الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 × ز لمدة 5 دقيقة في RT. وسوف تكون مرئية SVF كما بيليه البني. يستنشق بعناية الخلايا الشحمية العائمة وdecant supernatant المتبقية دون إزعاج SVF. حل بيليه SVF في 10 مل من الثقافة المتوسطة والتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون.
- الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 × ز لمدة 5 دقيقة، وإزالة supernatant، وبلطف إعادة تعليق بيليه في 5 مل من العازلة الكريات الحمراء في أنبوب مخروطي 15 مل لمدة 10 دقيقة في RT.
- وقف رد الفعل عن طريق إضافة 10 مل من 1x PBS التي تحتوي على 1٪ FBS. الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية، وإزالة supernatant، وإعادة تعليق بيليه في 10 مل من 1x PBS التي تحتوي على FBS 1٪.
- الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 500 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية. إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه في 5 مل من وسط الثقافة في أنبوب مخروطي 15 مل في 4 درجة مئوية.
- بعد الجولة النهائية من الطرد المركزي (500 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجة مئوية) ، أعد تعليق الخلايا الحبيبات في 5 مل من العازلة FACS (PBS التي تحتوي على 10٪ FBS ، 100 وحدة / مل الحمض النووي الأول ، و 1 ٪ v / v PS) على الجليد ، وعد الخلايا مع مقياس الهيموسيتومتر.
4 - عزل اللجنة الوطنية لمكافحة اللاجئين من قبل القوات المسلحة الكونغولية
- قم بإعداد أداة فرز الخلايا وتحسينها باتباع دليل التعليمات. حدد فوهة 100 ميكرومتر، وتعقيم أنابيب جمع، وتثبيت جهاز جمع المطلوبة، وإعداد تيارات الجانب20.
- يوصى بليزر أصفر/أخضر 561 نانومتر وفلتر بصري 579/16 لفرز RFP+ الخلايا. تنفيذ التعويض باستخدام عنصر التحكم السلبي وعناصر التحكم الإيجابية الملطخة واحدة. انظر الشكل 2A لنظام الجاتينغ.
- تصفية الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر، والطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقيقة، وإعادة تعليق الخلايا في 2 مل من المخزن المؤقت FACS بكثافة 0.5-1 × 107/mL. نقل الخلايا إلى المسمى بوضوح 5 مل أنابيب البوليسترين القاع الجولة، وتحميل في الفرز.
- تشغيل أنبوب عينة تجريبية في 4 درجة مئوية، بدوره على لوحات انحراف، وفرز هافيل 15 مل أنبوب مخروطي المغلفة مع RPMI تحتوي على FBS 1٪ و 1٪ v/ v PS.
ملاحظة: حماية العينات من الضوء القوي لتقليل إخماد RFP.
5- ثقافة NCADSCs
- لوحة الخلايا فرزها بكثافة 5000 خلية / سم2 في لوحة ثقافة بئر 12 في وسط الثقافة الكاملة واحتضان في 37 درجة مئوية في جو رطب مع 5٪ CO2 لمدة 20-24 ساعة.
- إزالة الوسط الثقافة، وغسل الخلايا مع PREWARMED (37 درجة مئوية) PBS لإزالة حطام الخلية وإضافة وسيطة ثقافة جديدة.
- مرة واحدة في الخلايا هي 80-90٪ confluent، هضم أحادية باستخدام حل 0.25٪ التربسين EDTA في 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 3-5 دقيقة، وتحييد مع 2 مل من وسط الثقافة.
- الطرد المركزي الخلايا التي تم حصادها لمدة 15 دقيقة في 250 × ز في RT، وإزالة supernatant، وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسط الثقافة. عد الخلايا مع مقياس الهيموكيتوم.
- البذور الخلايا في 12 لوحة ثقافة بئر بكثافة 5000 خلية / سم2.
- إعادة تعليق الخلايا المتبقية في الوسط الثقافة التي تحتوي على 10٪ DMSO، وتجميد، وتخزينها في النيتروجين السائل.
6- تحريض Adipogenic من NCADSCs
- حث التمايز المُخَّل للNCADSCs عند 80-90% من الالتقاء والظروف الثقافية القياسية21.
- لتحريض adipogenic البني, أول علاج الخلايا المستزرعة مع البني adipogenic التعريفي المتوسطة (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0.5 mM/L IBMX, 0.1μM/L dexamethasone, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine, و 1 ميكروغرام/مل الأنسولين) لمدة 2 أيام. غسل الخلايا مع PBS 2x واستبدالها متوسطة جديدة (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine, و 1 ميكروغرام/مل الأنسولين). تغيير هذا المتوسط كل يومين لما مجموعه 3-5x.
- لتحريض الأdipogenic الأبيض، أولا علاج الخلايا مع متوسط التعريفي adipogenic الأبيض (HDMEM، 10٪ FBS، 1٪ v/v PS، 0.5 mM/L IBMX، 0.1 μM/L ديكساميثازون، و 1 ميكروغرام/مل الأنسولين) لمدة يومين. غسل الخلايا مع PBS 2x واستبدالها متوسطة جديدة (HDMEM، 10٪ FBS، 1٪ v/v PS، و 1 ميكروغرام / مل الأنسولين). تغيير هذا المتوسط كل 2 أيام لما مجموعه 3-5x.
- تحليل الخلايا الأيبوجينية حسب الاقتضاء.
ملاحظة: كن لطيفًا عند غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني. يمكن أن تغسل الخلايا الشحمية المتمايزة بسهولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه، حصلنا على ~ 0.5-1.0 × 106 ADSCs من 5-6 Wnt-1 Cre+/-; روزا26RFP/+ الفئران (48 أسابيع من العمر، ذكر اولا او أنثى).
يتم تقديم مخطط تدفق مجموعة PAAT من الفئران في الشكل 1. كان مورفولوجيا NCADSCs مشابهة لـ ADSC من الأنسجة الدهنية للفئران الأخرى. وصلت NCADSCs المثقف 80-90٪ التقاء بعد 7-8 أيام من الثقافة، وكان NCADSCs مورفولوجيا الليفية الموسعة مثل(الشكل 2B، C).
وللتأكيد على أن NCADSCs لديها إمكانات أسيبوجينية، تم التمييز بين NCADSCs إلى الخلايا الشحمية البيضاء أو البنية. تم استخدام تلطيخ الزيت الأحمر للكشف عن الخلايا الشحمية الناضجة(الشكل 2). أظهرت NCADSCs إمكانات قوية للأديبي الأبيض والبني بعد الاستقراء. لوحظت الخلايا الشحمية الناضجة بعد 8 أيام من الحث الأبيض أو البني adipogenic، مع أكثر من 60٪ من NCADSCs تظهر التمايز adipogenic(الشكل 2D، F، H). أدى إطالة وقت الاستقراء الأديبي إلى تحسين معدل حصاد الخلايا الشحمية الناضجة (البيانات غير الموضحة). NCADSCs قد خفضت إلى حد كبير إمكانات adipogenic بعد تمرير(الشكل 2E, G, H).
النفخ المناعي والكمي في الوقت الحقيقي PCR (qRT-PCR) (انظر الملف التكميلي 1 للالتمهيديات المستخدمة) أثبت أن مستويات التعبير من البروتينات والجينات النسبية الخاصة بالبثور (Perilipin، PPARο، Cebp/α) في NCADSCs المتمايزة بشكل ملحوظ بعد 8 أيام من تحريض الأوديبوجيني(الشكل 3A، B). وأظهرت نتائج qRT-PCR أن تحريض الجينات الخاصة بالخلايا الدهنية (Perilipin، PPARο، Cebp/α) والجينات الخالية من الخلايا الدهنية البنية (Pgc1α، UCP-1، PPARα، PRDM16) زادت بشكل كبير في 8 أيام من تحريض الاديبوجيني من NCADSCs(الشكل 3B، C، D).
الشكل 1: مخطط تدفق لجمع PAAT من الفئران. (أ)تهوّن وتضحّي الـ Wnt-1 Cre+/-؛ روزا26RFP / + الفئران وإجراء تشريح طولي من الماوس لفضح القلب والرئتين; (ب)إزالة الرئتين والغدة الصعترية؛ (C)فضح PAAT، قوس الأورتا، والقلب؛ (D)إزالة PVAT، الأورطان، والقلب في العازلة HBSS precooled؛ (E)حصاد PAAT ونقل هازو في العازلة HBSS precooled. H = القلب; AA = قوس أورتا; T = الغدة الصعترية; L = الرئة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تمايز Adipogenic من NCADSCs معزولة عن PAAT. (أ)مخطط عام للانتشار لتوصيف وفرز السكان NCADSCs (RFP). (ب)صور المجهر الفلوري تظهر أن NCADSCs انضمت وتوسعت بعد 96 ساعة البذر على 12 لوحة ثقافة البئر. (C-G) صور تمثيلية تبين أن النفط الأحمر O الملطخNCADSCs من PAAT بعد تحريض adipogenic. (C)التحكم (لا التعريفي). (D)NCADSCs الابتدائية و(E)3x-passaged NCADSCs بعد 10 أيام من تحريض adipogenic الأبيض. (واو)NCADSCs الابتدائية و(G)3x-passaged NCADSCs بعد 10 أيام من الحث البني adipogenic. (H)النتائج الإحصائية لمنطقة تلطيخ الزيت الأحمر من NCADSCs الأولية و3x الممر من PAAT بعد 8 أيام من تحريض adipogenic. ن = 6. يتم التعبير عن القيم كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD). مقياس شريط = 50 ميكرون. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توصيف الحث الإسديبوجيني الأبيض والبني للNCADSCs. (أ)المناعة تظهر مستويات التعبير من البروتينات الخالية من الخلايا الدهنية (Perilipin، PPARο، Cebp/α) في NCADSCs المتمايزة بشكل متباين الأبيض. (ب)نتائج qRT-PCR تظهر تحريض الجينات الخاصة بالخلايا الدهنية، Cebp/α، PPARο، Perilipin، Fabp4 في NCADSCs المتمايزة بشكل أبيض وبني. (C)نتائج qRT-PCR تظهر تحريض الجينات المحددة للشحمية البنية، Pgc1α، UCP-1، PPARα، PRDM16 في NCADSCs المتمايزة بشكل أبيض وبني. تم تطبيع مستويات التعبير مقابل HPRT وتم قياسها بواسطة طريقة Ct ().10. نتيجة تمثيلية لـ n = 3 تجارب مستقلة. يتم التعبير عن القيم كمتوسط ± SD. تم استخدام اختبار t-student غير المذيل للمقارنات بين المجموعتين. *P < 0.05. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملف تكميلي 1. الرجاء الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر على اليمين للتحميل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، نقدم طريقة موثوقة لعزل، والثقافة، والحث adipogenic من NCADSCs المستخرجة من PVAT من Wnt-1 كري+/-؛ روزا26RFP / + الفئران المعدلة وراثيا مصممة لإنتاج RFP+ ADSCs. تظهر التقارير السابقة أنه لا يوجد فرق كبير في التعبير عن الخلايا الجذعية المتوسطة المتعددة القدرات العامة (MSCs) في NCADSCs وغير NCADSCs22، وأن NCADSCs لديها إمكانات قوية للتمييز في الخلايا الشحمية في المختبر15،22،23. وبالتالي، ينبغي أن تكون المراكز الوطنية للتنمية المستدامة المعزولة مع هذا البروتوكول مناسبة لمعظم دراسات مركز أبوظبي للدراسات.
ميزة الطريقة الحالية هي أن المراسل الفلوري المتأصل في NCADSCs المعدلة وراثيا يجعل عملية العزل بسيطة واقتصادية دون الحاجة إلى الأجسام المضادة أو FACS المستندة إلى التحقيق ، أو فرز الخلايا المنشطالمغناطيسي24. وبالإضافة إلى ذلك، فإن كثافة الفلورسة في طلب تقديم العروض أقوى من نظام إدارة الأصول الميدانية، مما يزيد من تحسين كفاءة نظام مراقبة الأصول الميدانية.
مفتاح هذا البروتوكول هو استخدام الفئران الصغيرة. على الرغم من أن الفئران الأكبر سناً والأكبر حجماً يمكن أن تنتج كمية أكبر من الأنسجة الدهنية، فإن نسبة الخلايا الشحمية المشتقة من NC في PAAT تنخفض مع التقدم في العمر لأن البلدان المساهمة الصافية تساهم في المقام الأول في التطور المبكر للPAAT15. وهكذا ، فإن إمكانات adipogenic من هذه الخلايا تنخفض مع التقدم في السن. استنادًا إلى تجاربنا ، فإن النافذة الزمنية المثلى لعزل NCADSC في الفئران هي 4-8 أسابيع.
طريقتنا بسيطة وعملية، ويمكن أن تولد ADSCs وفيرة لدراسة الخلايا الدهنية PVAT أو lipogenesis في المختبر، واختبار أدوية جديدة ضد السمنة وأمراض القلب والأوعية الدموية. وعلاوة على ذلك، فإن NCADSCs من Wnt-1 كري+/-; يمكن أن تكون فأرة Rosa26RFP/+ أيضًا نظامًا فعالًا في المختبر لمجالات البحث الأخرى. ومع ذلك ، لا تزال هناك العديد من المحاذير: أولاً ، هذه الخلايا أكثر حساسية وهشاشة من الخطوط المطهرة الخالدة. ثانياً، يتم التصدي لارتفاع معدل انتشارها وتمايزها adipogenic من حقيقة أنها تميل إلى فقدان إمكاناتها adipogenic بعد أقصاه خمسة ممرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
قدم البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2018YFC1312504)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81970378، 81670360، 81870293)، ولجنة العلوم والتكنولوجيا في بلدية شنغهاي (17411971000، 17140902402) الأموال اللازمة لهذه الدراسة .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
References
- Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
- Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Tan, P., Pepin, É, Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).
- Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).
