Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolation, Kultur og adipogen induktion af neuralcrest original fedt-afledte stamceller fra periaortisk fedtvæv

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60691
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer en protokol for isolation, kultur og adipogen induktion af neurale crest afledte stamceller (NCADSCs) fra det periaortiske fedtvæv af Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus. NCADSCs kan være en let tilgængelig kilde til Adscs til modellering adipogenesis eller lipogenese in vitro.

Abstract

En overdreven mængde fedtvæv omkring blodkarrene (perivaskulær fedtvæv, også kendt som PVAT) er forbundet med en høj risiko for hjerte-kar-sygdom. FSO'er, der stammer fra forskellige fedtvæv, viser forskellige funktioner, og dem fra PVAT har ikke været velkarakteriseret. I en nylig undersøgelse, vi rapporterede, at nogle AdsCs i den periaortiske arch fedtvæv (PAAT) nedstammer fra neurale crest celler (NCCs), en forbigående population af migrerende celler fra ektoderiet.

I dette dokument beskriver vi en protokol til isolering af rødt fluorescerende protein (RFP)-mærket NCC'er fra PAAT af Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus og fremkalde deres adipogenic differentiering in vitro. Kort, den stromale vaskulære fraktion (SVF) er enzymatisk adskilt fra PAAT, og RFP+ neurale crest afledt ADSCs (NCADS' er) isoleres af fluorescens aktiveret cellesortering (FACS). Ncadscs differentiere i både brune og hvide adipocytter, kan kryoreserveret, og bevare deres adipogene potentiale for ~ 3-5 passager. Vores protokol kan generere rigelige ADSCs fra PVAT til modellering PVAT adipogenesis eller lipogenese in vitro. Således kan disse NADS'er give et værdifuldt system til at studere de molekylære switche, der er involveret i PVAT differentiering.

Introduction

Forekomsten af fedme er stigende på verdensplan, hvilket øger risikoen for relaterede kroniske sygdomme, herunder hjerte-kar-sygdom og diabetes1. PVAT omgiver blodkarrene og er en vigtig kilde til endokrine og paracrine faktorer, der er involveret i vaskulatur funktion. Kliniske undersøgelser viser, at højt PVAT-indhold er en uafhængig risikofaktor for hjerte-kar-sygdomme2,3, og dets patologiske funktion afhænger af fænotypen af de bestanddele fedtafledte stamceller (FDC'er)4.

Selvom ADSC cellelinjer som murine 3T3-L1, 3T3-F442A, og OP9 er nyttige cellulære modeller til at studere adipogenesis eller lipogenesis5, regulerende mekanismer for adipogenesis varierer mellem cellelinjer og primære celler. FDC'erne i den stromale vaskulære cellefraktion (SVF) isoleret direkte fra fedtvæv og induceret til at differentiere sig i adipocytter sandsynligvis opsummere in vivo adipogenesis og lipogenesis6. Men skrøbelighed, opdrift, og variationer i størrelse og immunophenotyper af AdsC'er gør deres direkte isolation udfordrende. Desuden kan de forskellige isolationsprocedurer også i væsentlig grad påvirke dissecellersphenotype og adipogene potentielle evne til at understrege behovet for en protokol, der fastholder ADSC's integritet.

Fedtvæv er typisk klassificeret som enten morfologisk og funktionelt særskilt hvidt fedtvæv (WAT), eller den brune fedtvæv (BAT)8, som huser forskellige AdsCs9. Mens AdsC'er isoleret fra perigonadal og inguinale subkutane WAT'er har været karakteriseret i tidligere undersøgelser9,10,11,12, er der mindre kendt med hensyn til FDC'er fra PVAT , som hovedsagelig består af BAT13.

I en nylig undersøgelse, fandt vi, at en del af de hjemmehørende Adsik i den periaortiske arch fedtvæv (PAAT) er afledt af neurale crest celler (NCCs), en forbigående population af vandrende stamceller celler, der stammer fra ektoderm14,15. Wnt1-Cre transgene mus blev brugt til sporing neurale crest celle udvikling16,17. Vi krydsede Wnt1-Cre+ mus med Rosa26RFP/+ mus til at generere Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus, hvor NCC'er og deres efterkommere er mærket med rødt fluorescerende protein (RFP) og let spores in vivo og in vitro15. Her beskriver vi en metode til isolering af neurale crest-afledte ADSCs (NC-afledte ADSCs eller NCADS'er) fra musePAAT og tilskynde ncadscs til at differentiere sig til hvide adipocytter eller brune adipocytter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreprotokollen er blevet gennemgået og godkendt af Animal Care Committee of Shanghai Jiao Tong University.

1. Generation af Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Mus

  1. Kryds Wnt-1 Cre+/- mus16 med Rosa26RFP/+ mus18 til at generere Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus. Husmus under en 12 timers lys/mørk cyklus i et patogenfrit anlæg ved 25 °C og 45% fugtighed, indtil de er 4-8 uger gamle.

2. Dissektion af PAAT

BEMÆRK: Se figur 1.

  1. Steriliser alle kirurgiske værktøjer (f.eks. kirurgisk saks, standardpincet og mikrokirurgisk saks og pincet) ved autoklavering ved 121 °C i 30 min.
  2. Forbered fordøjelsesmediet (Højglukose Dulbecco's Modified Eagle Medium [HDMEM] indeholdende 2 mg/ml kollagen type I). Kulturmediet (HDMEM indeholdende 10 % føtal kvægserum [FBS] og 1 % v/v penicillin-streptomycin [PS]). Steriliser ved hjælp af et 0,22 μm sprøjtefilter før brug.
  3. Steriliser cellekulturreagenser ved hjælp af UV, ethanol, filtrering eller damp, alt efter hvad der er relevant.
  4. Forbered en petriskål med Hanks' Balanced Saline Solution (HBSS) og et 15 ml konisk rør med 10 ml HBSS suppleret med 1% v/v PS-opløsning. Hold begge på is.
  5. Bedøve musene15 med isofluran og offer ved cervikal dislokation. Nedsænk kroppene i et bægerglas fyldt med 75% alkohol (200 ml) i 5 minutter for at sterilisere hudoverfladen.
  6. Klip og adskille huden på maven og skæres langs ventrale midterlinjen fra bækkenet til halsen. Åbn maven og flytte leveren til at udsætte mellemgulvet19.
  7. Skær mellemgulvet og ribbenene på begge sider af midterlinjen og eksponere hjerte og lunger ved at skrælle tilbage ribbenene.
  8. Fjern lunge og thymus og udtræk PAAT sammen med aorta og hjerte.
  9. Skær aortaen af ved aortaroden for at fjerne hjertet. Lav et snit mellem den aortiske bue og faldende aorta og omhyggeligt adskille fedtvæv omkring både strukturer og venstre og højre fælles halspulsårer fra den bageste brystvæg. Overfør vævet til den iskolde HBSS-buffer i petriskålen.
  10. Ved hjælp af sterile pincet fjernes så meget af vaskulaturen (f.eks. aorta, fælles halspulsårer og andre små vaskulature) og fascia som muligt, og overfør fedtvævet i 2 mL Eppendorf-rørene indeholder 0,5 ml iskold HBSS-buffer på is.

3. Isolering af SVF

Saml PAAT af 5-6 mus i en 2 ml mikrocentrifuge rør, der indeholder 1 ml frisklavet fordøjelse medium og hakke vævet ved hjælp af kirurgisk saks i en Eppendorf rør ved stuetemperatur (RT).

  1. Blandblandingen overføres til 50 ml rør, der indeholder 9 ml af fordøjelsesmediet. Homogeniser væv ved at pibe op og ned med en 1 ml pipette 10x.
  2. Inkuberrørene ved 37 °C med konstant omrystning ved 100 omdrejninger i 30-45 min og kontroller hver 5-10 min. for at forhindre overdigestion. Dette er afgørende for at forbedre cellelevedygtigheden og udbyttet.
    BEMÆRK: God vævsfordøjelse vil resultere i et homogent, lysgult fedtvæv, der er synligt for det blotte øje, når det forsigtigt hvirvler røret.
  3. Stop fordøjelsen ved at tilføje 5 ml HDMEM indeholdende 10% FBS og 1% v/v PS på RT og bland godt ved pipetting.
  4. Celleaffjedringen centrifugeres ved 500 x g i 5 min ved RT. SVF vil være synlig som en brunlig pellet. Forsigtigt aspirere de flydende adipocytter og dekantere de resterende supernatant uden at forstyrre SVF. SVF pellet i 10 ml kultur medium og filtrere gennem en 70 μm celle si.
  5. Celleaffjedringen centrifugeres ved 500 x g i 5 min., fjern supernatantet, og pelletlen forsigtigt opslæm i 5 ml erythrocyt lysisbuffer i et 15 ml konisk rør i 10 min. ved RT.
  6. Stop reaktionen ved at tilføje 10 ml 1x PBS indeholdende 1% FBS. Celleaffjedringen centrifugeres ved 500 x g i 5 min ved 4 °C, fjern supernatanten, og pelleten skal suspenderes igen i 10 ml 1x PBS med 1% FBS.
  7. Cellerne centrifugeres igen ved 500 x g i 5 min ved 4 °C. Det supernatant fjernes, og pelletlen skal ophænges igen i 5 ml kulturmedium i et konisk rør på 15 ml ved 4 °C.
  8. Efter en sidste centrifugeringsrunde (500 x g i 5 min ved 4 °C) skal de pelleterede celler i 5 ml FACS-buffer (PBS indeholdende 10 % FBS, 100 enheder/ml DNA I og 1 % v/v PS) på is en optilkning, og cellerne tælles med et hæmitivt.

4. Facs' isolation af Nicadsc'er

  1. Konfigurer og optimer cellesorteringen efter brugsanvisningen. Vælg 100 μm dysen, steriliser opsamlingsrørene, installer den nødvendige opsamlingsenhed, og konfigurer sidestrømmene20.
  2. En 561 nm gul/ grøn laser og optisk filter 579/16 anbefales til sortering RFP+ celler. Udfør kompensationen ved hjælp af det negative kontrolelement og de enkeltfarvede positive kontrolelementer. Se figur 2A for gatingordningen.
  3. Cellerne filtreres gennem en 40 μm si, centrifugeres ved 500 x g i 5 min. og ophæng cellerne igen i 2 ml FACS-buffer ved en tæthed på 0,5-1 x 107/ml. Overfør cellerne til tydeligt mærket 5 ml runde bund polystyren rør, og belastning i sorteringsområdet.
  4. Forsøgsprøverøret køres ved 4 °C, tænd for afbøjningspladerne, og sorter i et konisk rør på 15 ml, der er forbelagt med RPMI, der indeholder 1% FBS og 1% v/v PS.
    BEMÆRK: Beskyt prøverne mod stærkt lys for at minimere RFP-dæmpning.

5. Kulturen i Nicadscs

  1. Plade de sorterede celler ved en tæthed på 5.000 celler/cm2 i en 12 brøndkulturplade i komplet dyrkningsmedium og inkuber ved 37 °C i fugtig atmosfære med 5% CO2 for 20-24 timer.
  2. Fjern dyrkningsmediet, vask cellerne med forvarmet PBS (37 °C) for at fjerne celleaffald og tilføje frisk kulturmedium.
  3. Når cellerne er 80-90% sammenflydende, fordøje monolayer ved hjælp af en 0,25% trypsin EDTA opløsning ved 37 °C i en inkubator i 3-5 min, og neutralisere med 2 ml kultur medium.
  4. Centrifuger de høstede celler i 15 min ved 250 x g ved RT, fjern supernatantet, og ophæng cellerne igen i 1 ml kulturmedium. Tæl cellerne med et hæmocytometer.
  5. Frø cellerne i en 12 brøndkulturplade ved tætheden af 5.000 celler/cm2.
  6. Gensuspendere de resterende celler i dyrkningsmedium, der indeholder 10% DMSO, fryses og opbevares i flydende nitrogen.

6. Adipogenic Induktion af NPC'er

  1. Fremkalde adipogene differentiering af NCADS'erne ved 80-90 % sammenløb og standardkulturforhold21.
  2. For brun adipogen induktion skal de kulturdyrkede celler først behandles med brun adipogeninduktionsmedium (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1 μM/L dexamethason, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine og 1 μg/mL insulin) i 2 dage. Cellerne vaskes med PBS 2x og udskiftes med frisk medium (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine og 1 μg/ml insulin). Skift dette medie hver 2 dage for i alt 3-5x.
  3. For hvid adipogen induktion skal cellerne først behandles med hvidt adipogent induktionsmedium (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1 μM/L dexamethason og 1 μg/mL insulin) i 2 dage. Cellerne vaskes med PBS 2x og udskiftes med frisk medium (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS og 1 μg/ml insulin). Skift dette medie hver 2 dage for i alt 3-5x.
  4. Analysere adipogenic celler efter behov.
    BEMÆRK: Vær skånsom, når du vasker cellerne med PBS. Differentierede adipocytter kan nemt vaskevæk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af den protokol, der er beskrevet ovenfor, fik vi ~0,5-1,0 x 106 AdsCs fra 5-6 Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus (48 uger gammel, mand eller kvinde).

Strømningsdiagrammet for indsamling af PAAT fra mus er præsenteret i figur 1. De ntac'ers morfologi svarede til ADSC fra andre mus fedtvæv. De kultiverede NDC'er nåede 80-90% sammenløb efter 7-8 dages kultur, og NCADSCs havde en udvidet fibroblast-lignende morfologi(Figur 2B, C).

For yderligere at bekræfte, at Nicadscs havde adipogene potentiale, differentiering af NDC'er i hvide eller brune adipocytter blev induceret. Olierød farvning blev anvendt til at detektere de modne adipocytter (figur 2). NCADSC'erne udviste et stærkt adipogent potentiale for både hvide og brune adipocytter efter induktion. Modne adipocytter blev observeret efter 8 dage med hvid eller brun adipogen induktion, med over 60% af NCADSCs viser adipogenic differentiering(figur 2D,F,H). Forlængelse af adipogen induktionstid forbedrede høsthastigheden for modne adipocytter (data, der ikke er vist). NCADSCs havde i høj grad reduceret adipogene potentiale efter passaging(Figur 2E, G, H).

Immunblotting og kvantitativ REAL-time PCR (qRT-PCR) (se supplerende fil 1 for anvendte primere) viste, at ekspressionsniveauerne for adipocytespecifikke relative proteiner og gener (Perilipin, PPARγ, Cebp/α) i de adipogent differentierede NPC'er steg betydeligt efter 8 dages hvid adipogen induktion (figur 3A, B). QRT-PCR-resultaterne viste, at induktionen af adipocyte-specifikke gener (Perilipin, PPARγ, Cebp/α) og brune adipocytespecifikke gener (Pgc1α, UCP-1, PPARα, PRDM16) steg betydeligt i 8 dage med brun adipogen induktion af NCADSCs (Figur 3B,C,D).

Figure 1
Figur 1: Flowdiagram over indsamling af PAAT fra mus. A) Bedøve og ofre Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus og udføre langsgående dissektion af musen for at afsløre hjerte og lunger; B) Fjern lungerne og thymus; (C) Eksponere PAAT, aorta bue, og hjerte; (D) Fjern PVAT, aorta og hjerte i forkølet HBSS Buffer; E) HøstPAAT og overføres til forkølet HBSS buffer. H = Hjerte; AA = Aorta bue; T = Thymus; L = Lunge. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Adipogenic differentiering af NDC'er isoleret fra PAAT. (A) Generel gatingordning for karakterisering og sortering af NSP-populationer(RFP). (B) Fluorescens mikroskop billeder viser, at NCADSCs klæbede og udvidet efter 96 h såning på en 12 godt kultur plade. (C-G) Repræsentative billeder, der viser, at olie rød O farvede NCADSCs fra PAAT efter adipogenic induktion. C) Kontrol (ingen induktion). (D) Primære NDC'er ogE) 3x-passaged NCADSCs efter 10 dage med hvid adipogenic induktion. (F) Primære NDC'er ogG) 3x-passaged NCADSCs efter 10 dage med brun adipogen induktion. H) Statistiske resultater af det olierøde farvningsområde for primær og 3x passagen NDC'er fra PAAT efter 8 dages adipogen induktion. n = 6. Værdierne udtrykkes som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Karakterisering af den hvide og brune adipogene induktion af NPC'er. (A) Immunoblot med udtryksniveauer for adipocytespecifikke proteiner (Perilipin, PPARγ, Cebp/α) i de hvide adipogenically differentierede NDC'er. B) qRT-PCR-resultater, der viser induktion af adipocytespecifikke gener, Cebp/α, PPARγ, Perilipin, Fabp4 i de hvide og brune adipogenically differentierede NDC'er. C) qRT-PCR-resultater, der viser induktion af brune adipocytespecifikke gener, Pgc1α, UCP-1, PPARα, PRDM16 i de hvide og brune adipogenically differentierede NDC'er. Udtryksniveauerne blev normaliseret i forhold til HPRT og målt efter Ct-metoden (▲▲Ct). Repræsentativt resultat af n = 3 uafhængige eksperimenter. Værdierne udtrykkes som middelværdi ± SD. Ikke-parret 2-tailed Student t-test blev anvendt til sammenligninger mellem de to grupper. *P < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1. Klik her for at se denne fil (højreklik for at downloade).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse præsenterer vi en pålidelig metode til isolation, kultur og adipogen induktion af NPC'er udvundet af PVAT af Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ transgene mus designet til at producere RFP+ AdsCs. Tidligere rapporter viser , at der ikke er nogen væsentlig forskel i ekspressionen af generelle multipotente mesenkymale stamceller (MFC'er) markører i NCADS'er og ikke-NDC'er22, og at Nicadscs har et stærkt potentiale til at differentiere sig til adipocytter in vitro15,22,23. De nicadsc'er, der er isoleret med denne protokol, bør derfor være egnede til de fleste ADSC-undersøgelser.

Fordelen ved den nuværende metode er, at den iboende fluorescerende reporter i transgene NDC'er gør isolationsprocessen enkel og økonomisk uden behov for antistoffer eller sondebaseret FACS eller magnetisk aktiveret cellesortering24. Desuden er rfp'ens fluorescensintensitet stærkere end FITC, hvilket yderligere forbedrer effektiviteten af FACS.

Nøglen til denne protokol er udnyttelsen af unge mus. Selv om ældre og større mus kan give en større mængde fedtvæv, andelen af NC-afledte adipocytter i PAAT falder med alderen, fordi NCC'erne primært bidrager til den tidlige udvikling af PAAT15. Således adipogene potentiale af disse celler falder med alderen. Baseret på vores eksperimenter er det optimale tidsvindue for NCADSC-isolation i mus 4-8 uger.

Vores metode er enkel, praktisk, og kan generere rigelige ADSCs til studiet af PVAT adipogenesis eller lipogenese in vitro, og at teste nye lægemidler mod fedme og hjerte-kar-sygdom. Desuden er de nationale kontaktpunkter for Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus kan også være et effektivt in vitro-system til andre forskningsområder. Men flere forbehold tilbage: For det første er disse celler mere følsomme og skrøbelige end udødeliggjorte adipocyte linjer. For det andet modvirkes deres høje spredningsprocent og adipogene differentiering af det faktum, at de har tendens til at miste deres adipogene potentiale efter højst fem passager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

National Key R&D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293), og Videnskab og Teknologi Kommissionen i Shanghai Kommune (17411971000, 17140902402) forudsat midler til denne undersøgelse .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% PFA BBI life sciences E672002-0500 Lot #: EC11FA0001
Agarose ABCONE (China) A47902 1% working concentration
Anti-cebp/α ABclonal A0904 1:1000 working concentration
Anti-mouse IgG, HRP-linked CST 7076 1:5000 working concentration
Anti-perilipin Abcam AB61682 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54
Anti-PPARy SANTA CRUZ sc-7273 0.2 μg/mL working concentration
Anti-rabbit IgG, HRP-linked CST 7074 1:5000 working concentration
Anti-β-Tubulin CST 2146 1:1000 working concentration
BSA VWR life sciences 0332-100G 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008
Collagenase, Type I Gibco 17018029
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902 0.1 µM working concentration
Erythrocyte Lysis Buffer Invitrogen 00-4333
FBS Corning R35-076-CV 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS
HBSS Gibco 14025092
HDMEM Gelifesciences SH30243.01 Lot #: AD20813268
IBMX Sigma-Aldrich I7018 0.5 mM working concentration
Insulin Sigma-Aldrich I3536 1 μg/mL working concentration
Microsurgical forceps Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-F201A-1
Microsurgical scissor Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-H121A
Oil Red O solution Sigma-Aldrich O1516 0.3% working concentration
PBS (Phosphate buffered saline) ABCONE (China) P41970
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PrimeScript RT reagent Kit TAKARA RR047A Lot #: AK4802
RNeasy kit TAKARA 9767 Lot #: AHF1991D
Rosa26RFP/+ mice JAX No.007909 C57BL/6 backgroud; male and female
Rosiglitazone Sigma-Aldrich R2408 1 μM working concentration
Standard forceps Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-F424
Surgical scissor Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-S231
SYBR Premix Ex Taq TAKARA RR420A Lot #: AK9003
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T2877 10 nM working concentration
Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice JAX No.009107 C57BL/6 backgroud; male and female

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
  2. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  3. Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).
  4. Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
  5. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
  6. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
  7. Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
  8. Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
  9. Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
  10. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  11. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
  12. Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).
  13. Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
  14. Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
  15. Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
  16. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
  17. Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
  18. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  19. Tan, P., Pepin, É, Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).
  20. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  21. Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
  22. Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).
  23. Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
  24. Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).

Tags

Udviklingsmæssige Biologi neurale crest celle Wnt-1 mus periaortisk fedtvæv fedt-afledte stromale celler stromale vaskulære fraktion cellekultur adipogenic induktion
Isolation, Kultur og adipogen induktion af neuralcrest original fedt-afledte stamceller fra periaortisk fedtvæv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qi, Y., Miao, X., Xu, L., Fu, M.,More

Qi, Y., Miao, X., Xu, L., Fu, M., Peng, S., Shi, K., Li, J., Ye, M., Li, R. Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (157), e60691, doi:10.3791/60691 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter